專利名稱：：用于無蛋白無血清培養細胞的培養基的制作方法
技術領域：
：本發明涉及用于無蛋白無血清培養細胞的培養基。
背景技術：
：細胞、尤其是真核細胞或哺乳動物細胞的培養一直需要應用特殊的培養基，所迷培養基使得所述細胞可獲得有效生長和生產所需蛋白質需要的營養物質和生長物質。通常，在該方面，血清或源自血清(例如牛血清)的化合物用作所述培養基的組分。然而，在細胞培養中使用源自人或動物來源的血清或蛋白質添加劑的清況下，存在許多問題，尤其是在用于制備給予人的藥物的原材料是通過細胞培養而獲得時。因此，就這類血清制劑而論，所述組合物和質量已經是每批都不同，這正是因為用于這類制劑的供體生物的相異性所致。這是一個相當大的問題，尤其是對于細胞生產標準化以及在建立這類細胞的標準生長條件時。然而，在所有情況下都要求對所用血清材料進行廣泛而恒定的質量控制。然而，這是相當耗時及昂貴的，尤其是在象血清這樣復雜的成分的情況下。此外，這類復雜制劑含有多種可以以破壞方式起作用的蛋白質，尤其是在用于從細胞培養物中回收的重組蛋白的純化過程的情況下。這尤其適用于與待回收的蛋白質同源或相似的那些蛋白質。不用說，這些問題尤其急待解決，因為在純化過程中僅可以通過十分專一的差別純化(例如用僅特異性抗重組蛋白而不抗牛蛋白的抗體)可靠地去除培養基中所用的生物附屬物(例如牛蛋白)(Bj。rck,L.,J.Immunol.,1988,第140巻，第1194-1197頁；Nilson等，丄Immunol.Meth,1993,164，第33-40頁)。然而，在培養基中應用血清或源自血清的化合物時一個明顯的問題也是有支原體、病毒或BSE因子污染的危險。關于來源于人血的制劑，在該方面必須特別強調被病毒(例如肝炎病毒或fflV)污染的危險。就血清或源自牛材料的血清組分而論，尤其存在BSE污染的危險。除此之外，所有血清來源的材料又可能被尚未知的致病因子污染。為了保證細胞適當地表面粘附以及保證從細胞適當生產所需的物質，除了少數例外外，加入血清組分先前一直被認為對于在固體表面培養細胞確實是必需的。因此，例如用描述于WO91/09935的方法，已有可能通過無血清無蛋白培養表面依賴型永久細胞、最好是vero細胞(參見WO96/1S"1)來獲得無血清無蛋白培養FSME病毒/病毒抗原的方法。然而，這些細胞不是重組細胞，而是用來在裂解過程中生產病毒抗原的宿主細胞。與此相反，主要用于重組制劑的細胞(例如CHO細胞)能夠只在有限程度上貼壁。因此，一直通過常規方法培育的CHO細胞只在含血清的條件下與光滑微載體和多孔微載體結合(參見US4,973,616;Cytotechnology9(1992)，247-253)。然而，如果在無血清的條件下培育這類細胞，它們則喪失這一特性并且不粘附于光滑載體，或者如果在培養基中沒有提供其它粘著促進添加劑，例如纖連蛋白、胰島素或運鐵蛋白，則它們變得容易地從栽體中脫落下來。然而，這些粘著促進添加劑也是源自血清的蛋白。要不然，可以采用懸浮培養技術以及例如采用分批法或采用連續培養技術培養細胞。進行培養最好采用恒化方法(OzturkS.S.等，1996,Abstr.Pap.Am.Chem.Soc.，BIOT164,PayneG.F.等，載于"LargeScaleCellCultureTechnology,"1987，LydersenB.K.編著，Hauserpublishers;第206-212頁)。KattingerH.等(AdvancesMol.Cell.Biology,1996,15A,193-207)描述了在無蛋白培養基中長期培養細胞，但這些細胞必需在載體上進行培養，并且沒有例如連續培養技術的可供選擇的方法。據說這些細胞當貼壁于載體表面時僅顯示長期穩定性，因為生長減少所致，并且因此對生長因子的需求減少。另外，為了使細胞適應始于含血清條件的無蛋白培養基，現有技術已經屢次進行了嘗試。然而，關于這種適應，已經重復地發現，與含血清的條件相比，在適應后，在無蛋白培養基中已表達蛋白的得率和重組細胞的生產率顯著降低(Appl.Microbiol.Biotechnol.40(l994),691-658)。也已經發現，在高細胞密度的情況下，重組蛋白的生產有時受到相當大的限制。在試圖使細胞適應無蛋白或無血清培養基期間，也重復發現所用細胞的不穩定性，伴隨生長減少，使得產生表達減少的細胞，或甚至產生非生產性細胞，從而這些細胞在無蛋白無血清培養基中具有相對于生產細胞的生長優勢，這導致這樣一個事實這些細胞的生長超過生產細胞，然后，最終，全部培養物于是產生非常低的產物得率。
發明內容因此，本發明的一個目的是提高無蛋白無血清培養重組細胞以及制備藥物的可能性，以及改進現有的可以用來以無血清或無蛋白方式有效培養重組細胞的方法。此外，應該因此有可能不僅培養表面依賴型細胞，而且有可能應用懸浮培養技術，因此需要盡可能地抑制細胞生產率的不穩定性。另外，本發明的再一個目的是有效提高重組細胞的產量。最后，按照本發明，需要改進重組細胞對無血清無蛋白培養基的適應并JU吏其配置更有效。按照本發明，借助無蛋白無血清培養細^<、尤其是哺乳動物細胞的培養基完成了這些工作，所述培養基的特征在于所述培養基含有一定比例的大豆水解產物。令人驚奇的是，已有可能表明，通過在含有大豆水解產物的培養基中培養細胞可以達到上述目的，而不必忍受現有技術描述的無血清培養的缺點。與現有技術已知的其它7K解產物(例如小麥水解產物、水稻水解產物或酵母水解產物)相反，已經發現僅大豆水解產物介導按照本發明的特性，并且導致例如顯著提高重組靶蛋白的得率。當論及這些術語時，可以使用或者術語大豆水解產物或者術語大豆蛋白胨，而沒有不同的含義。按照本發明的培養基最好含有基于所述培養基總干重的10%(重量)以上的大豆水解產物。通常，以4-40%的量提供培養基中的大豆水解產物。按照本發明，特定大豆水解產物的選擇并不重要。按照本發明可以使用市場上將找到的許多大豆制品，例如，來自大豆粉經酶消化(例如用木瓜蛋白酶)的蛋白胨，其pH值為6.5-7.5，總含氮量為9%-9.7%,灰分含量為8-15%。這些是本領域專家一般用于細胞培養的形式的來自大豆的蛋白胨。按照一個優選形式的實施方案，在按照本發明的培養基中使用大豆水解產物或其粗制級分的純化制劑。在這種純化過程中最好消除可能干擾有效培養的雜質，或提高所述水解產物的精確度，例如就分子量而論。按照本發明，實際上已經證明在該純化過程中提供超濾步驟尤其重要；為此，在按照本發明的培養基中尤其優選使用經超濾的大豆水解產物。超濾可以按照現有技術中全面描述的方法來進行，例如，使用具有已知截留限的薄膜濾器。借助"凝膠層析，例如，借助S印hadex層析，例如，用SephadexG25或SephadexG10或等同材料，借助離子交換層析、親和層析、大小排阻層析或"反相"層析，可以進行經超濾的大豆蛋白胨的純化。這些是得自現有技術的方法，并且是本領域專家熟悉的。采用該方法，可以選擇含有已知分子量的大豆水解產物的那些級分，所述分子量例如《1000道爾頓、優選《500道爾頓、更優選《350道爾頓。因此，本發明也包括用于生產無血清無蛋白細胞培養基的方法，所述方法包括獲得一種大豆水解產物，采用超濾法超濾所述大豆水解產物，采用大小排阻層析純化所述大豆水解產物的級分并且選擇由分子量《1000道爾頓、優選《500道爾頓、更優選《350道爾頓的大豆水解產物組成的大豆水解產物級分。尤其有利的大豆水解產物的特征在于，其游離氨基酸含量為10.3-15.6%、或優選12-13.5%，總含氮量為7.6-11.4%、或優選8.7-9.5%，內毒素含量為<500U/g;并且由此大豆水解產物中至少40%、或優選至少50%、或尤其優選至少55%的分子量為200-500道爾頓，大豆水解產物中至少10%、或優選至少15%的分子量為500-1000道爾頓。最優選的是，大豆水解產物中至少90%的分子量為<500道爾頓。這種大豆水解產物非常好地適合于工業化生產重組蛋白，這是由于其特殊的特性所致，可以特別容易地對其進行標準化，并且它可用于常M^方法中。除大豆水解產物外，按照本發明的培養基也可以以某種方式含有本身已知的合成培養基，例如DMEM/HAM，sF12、Medium199或RPMI,從文獻中對這些已有相當的了解。此外，按照本發明的培養基也最好含有氨基酸，所述氨基酸最好選自L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酰胺或其混合物。在按照本發明的培養基中最好也加入以下氨基酸L-天冬酰胺(其量為每升培養基0.001-1g，優選0.1-0.05g/L、尤其優選0.015-0.03g/L)、L-半胱氨酸(0.001-lg/L、優選0.005-0.05g/L、尤其優選0.01-0,03g/L)、L-胱氨酸(0.001-lg/L、優選0.01-0.05g/L、尤其優選0.015-0.03g/L)、L-脯氨酸(0.001-1.5g/L、優選0.01-0.07g/L、尤其優選0.02-0.05g/L)、L-色氨酸(0.001-lg/L、優選0.01-0.05g/L、尤其優選0.015-0.03g/L)和L-谷氨酰胺(0.05-lg/L、優選0.1-1g/L)。在按照本發明的培養基中可以單獨或聯合加入上述氨基酸。尤其優選聯合加入含有所有上述氨基酸的氨基酸混合物。在一個特定形式的實施方案中使用無血清無蛋白培養基，從而該培養基另外含有上述氨基酸混合物與經純化的超濾大豆蛋白胨的組合。意想不到的是，例如，已經發現為了滅活病毒或其它病原體，所述培養基可以于70-95°C、或優選85-95。C加熱約5-20分鐘、或優選15分鐘，而沒有負面效應。按照本發明，每種已知的合成培養基都可以與所述大豆水解產物聯合使用。常規的合成培養基可以含有無機鹽、氨基酸、維生素、碳源和水。例如，可以使用DMEM/HAM，sF12培養基。培養基中大豆汁的濃度可能最好為0.1-100g/L、尤其優選l-5g/L。4安照一個尤其優選形式的實施方案，可以使用大豆蛋白胨，所迷大豆蛋白胨就其分子量而論已經被標準化。該大豆蛋白胨的分子量最好小于50kD、尤其優選小于10kD、最優選小于1kD。已經證明超濾大豆蛋白胨的加入對于重組細胞系的生產率尤其有利，從而所述大豆蛋白胨的平均分子量為350道爾頓(QuestCompany)。這是一種這樣的大豆分離物，其總含氮量為約9.5%，游離氨基酸含量為約13%。尤其優選使用分子量為<1,000道爾頓、優選《500道爾頓、尤其優選《350道爾頓的純化超濾大豆蛋白胨。按照本發明的培養基也最好含有輔助物質，例如，緩沖物質、氧化穩定劑、對抗機械應力的穩定劑或蛋白酶抑制劑。尤其使用具有以下組成的培養基合成的基本培養基(1-25g/L)、大豆蛋白胨(0.5-50g/L)、L-谷氨酰胺(0.05-lg/L)、NaHC03(0.1-10g/L)、抗壞血酸(0.0005-0.05g/L)、乙醇胺(0.0005-0.05g/L)和亞硒酸鈉(1-15嗎/L)。如有需要，按照本發明的培養基中可以加入作為消泡劑的非離子型表面活性劑，例如，聚丙二醇(PLURONICF-61、PLURONICF-68、SYNPERONICF-68、PLUROMCF-71或PLURONICF-108)。由于在沒有加入表面活性劑的情況下，上升和爆裂的氣泡可能導致位于這些氣泡("發泡")表面的那些細胞損傷，因此為了保護細胞免受通氣的負面效應，通常使用該試劑(Murhammer和Goochee,1990,Biotechnol.Prog.6:142-148)。雖然非離子型表面活性劑的量可以因此為0.05-10g/L，但是尤其優選可能的最低量為0.1-5g/L。另外，按照本發明的培養基也可以含有環糊精或其衍生物。所述無血清無蛋白培養基最好含有蛋白酶抑制劑，例如，絲氨酸蛋白酶抑制劑，它們適用于組織培養并且可以來源于合成或植物。已經適應的細胞最好用作在按照本發明的培養基中培養的細胞，即已經適應在無蛋白無血清培養基中生長的細胞。已經發現，通過應用按照本發明的培養基，用這類預適應的細胞不僅可以達到得率增加，而且也明顯提高它們對于無血清無蛋白培養的穩定性。然而，按照本發明，已經證明重組細胞克隆尤其具有價值，從而這些重組細胞克隆在無血清無蛋白培養基中從開頭穩定至少40個世代、優選至少50個世代，并且表達重組產物。這樣的細胞克隆可得自重組的原始細胞克隆在含血清的培養基中培養并且使所述細胞再適應無血清無蛋白培養基后獲得的細胞培養物。術語"原始細胞克隆，，可以理解為是指在用重組核苷酸序列轉染宿主細胞后以穩定的方式在實驗室條件下表達重組產物的重組細胞克隆轉染子。在含血清的培養基中培育原始克隆，以便使其生長最佳。為了提高原始克隆的生產率，任選地在選擇劑的存在下，用選擇標記和/或擴增標記進行選擇，來培育所述原始克隆。對于大規模工業化生產，在含血清的培養條件下，使所述原始細胞克隆增殖至高細胞密度，然后使其恰好在生產期之前再適應無血清或無蛋白培養基。在這種情況下，培養最好在無選擇壓力時進行。可以從一開始就在無血清無蛋白培養基中進行重組原始細胞克隆的培養；結果是，再適應不再是必需的。在這種情況下，如有需要，也可以使用選擇劑，并且可以用選擇標記和/或擴增標記來進行選擇。所述方法描述于例如EP0711835。對再適應無血清無蛋白培養基后獲得的細胞培養物，測試細胞群體中以穩定的方式在無血清無蛋白條件、任選地在不存在選擇壓力下產生產物的那些細胞克隆。這可以例如借助用經標記的抗所述重組多肽或蛋白的特異性抗體的免疫熒光來進行。從所述細胞培養物分離出被鑒定為產物生產者的細胞，并且將其在最好與生產條件等同的無血清無蛋白條件下進行再培育。所述細胞的分離可以由此通過分離所述細胞并對其測試產物生產者來進行。可以再測試含有所述穩定細胞的細胞培養物的穩定重組克隆，從所述細胞培養物分離這些克隆并將其亞克隆。然后可以再在無血清無蛋白條件下培育在無血清無蛋白條件下獲得的穩定的重組細胞克隆。以這種方法在按照本發明的培養基中制備的重組細胞克隆或細胞群體，尤其由于其特征為它們穩定至少40個世代、優選穩定至少50個世代、尤其穩定超過60個世代，并且表達重組產物，因此勝過其它重組細胞克隆或細胞群體。這種重組穩定的細胞克隆或細胞群體的一個實例已經根據布達佩斯條約提交了保藏，ECACC(UK)保藏號為98012206。將按照本發明進行培養的細胞培養物最好來源于重組哺乳動物細胞。因此，重組哺乳動物細胞可以是所有的含有編碼重組多肽或蛋白的序列的那些細胞。在這一方面包括所有或者貼壁或者不貼壁生長的連續生長中的細胞。尤其優選重組CHO細月包或BHK細胞。重組多肽或蛋白可以是血液因子、生長因子或其它生物醫學相關制品。"^照本發明，優選含有重組血液因子(例如因子II、因子v、因子vn、因子vni、因子ix、因子x、因子xi)、s蛋白、c蛋白、這些因子之一的活化形式或vWF的編碼序列并且能夠在數個世代內以穩定的方式表達這些蛋白的細胞克隆。在該方面尤其優選表達vWF或具有vWF活性的多肽、因子VIII或具有VIII活性的多肽、vWF和因子VIII、因子IX或因子II的重組CHO細胞。需要30個世代以建立主細胞庫。至少需要約40個世代以進行1000-L規模的普通分批式培養。從單個細胞克隆開始，有可能用按照本發明的培養基制備"主細胞庫，，(MCB)和具有約8-10個世代的"工作細胞庫"(WCB)，并且因此在生產M^莫(產量-生物量)下在無蛋白無血清條件下制備具有至多20-25個世代的細胞培養物，而與此相反，在用先前的細胞克隆和培養基在無血清或無蛋白培養基上生長后有些世代變得不穩定，結果是a)具有產物生產者的均一細胞培養物是不可能得到的和b)在延長的時間內穩定的產物生產率是不可能達到的。然而，對比起來，甚至與已經在含血清的培養基中培養的原始細胞克隆相比，按照本發明甚至也有可能發現產物生產率4是高。按照再一方面，本發明也涉及用于培養細胞、尤其是哺乳動物細胞的方法，其特征在于這些細胞已經被接種到按照本發明的培養基中，然后將其在該培養基中進行培養。因此，本發明也涉及應用按照本發明的培養基培養重組細胞、優選真核細胞、尤其是哺乳動物細胞。因此本發明的主題也是細胞培養物，所述細胞培養物包括按照本發明的培養基和細胞、優選真核細胞、尤其是哺乳動物細胞。通過以下實施例以及附圖將更詳細地闡述本發明，但不是用來限制本發明。圖1顯示rFVin-CHO細胞克隆在10-L灌注式生物反應器中的培養結果。a)42天內因子VIII的活性(毫單位/mL)及灌流速度(l-5/天)。b)灌注式生物反應器中的容積生產率(volumetricproductivity)(因子VIII的單位/L/天)。圖2顯示在采用分批法在各種培養基中培養表達重組因子(rFactor)VIII的CHO細胞的情況下，因子VIII的生產率(mU/mL)的比4交。Mix1由不含大豆水解產物但含有表4所列氨基酸混合物的無血清無蛋白培養基組成；Mix2由含有大豆水解產物的無血清無蛋白培養基組成；Mix3由含有大豆水解產物以及表4所列氨基酸混合物的無血清無蛋白培養基組成；Mix4由含有2.5g/l純化超濾大豆水解產物以;^4所列氨基酸混合物的無血清無蛋白培養基組成。對于所述超濾大豆水解產物的純化，使用Sephadex⑧柱。圖3顯示在開始加入純化超濾大豆蛋白胨(即在培養的第6天)后表達重組因子VIII的CHO細胞在無血清無蛋白培養基中連續生長的情況下，因子VIII的生產率(U/L);和圖4顯示已經在含有大豆水解產物的無蛋白無血清培養基中培育的表達重組因子II的BHK細胞。實施例實施例1:rvWF-CHO細胞在從含血清的培養液轉移到無血清無蛋白培養液后的穩定性用質粒phAct-rvWF和pSV-dhfr共轉染CHO-dhfr細胞，如Fischer等所述方法(1994,FEBSLetters351:345-348)亞克隆表達vWF的克隆。工作細胞庫(WCB)始于所述亞克隆，該亞克隆以穩定的方式、在含血清、但不存在MTX的條件下表達rvWF，將所述細胞在含血清的條件下在多孔微載體(0>^叩0化*)上固定化。在細胞密度已經達到2x10細胞/mL基質后，將所述細胞4告移到無血清無蛋白培養液中。在無血清無蛋白條件下將所述細胞再培養幾個世代。利用免疫萸光，用標記的抗vWF抗體，在無血清無蛋白培養液中，在不同時間點測試所述細胞。采用轉換培養液之前的工作細胞庫，在所述無血清無蛋白培養液中10個世代后和60個世代后，評價所述細胞的穩定性。雖然所述工作細胞庫仍表現為100。/。rvWF生產者，但rvWF生產者的比例在無血清無蛋白培養液中10個世代后減至約50%。60個世代后，超過95%的所述細胞被鑒定為非生產者。實施例2:克隆穩定的重組CHO克隆從按照實施例1的含有rvWF-CHO細胞的細胞培養物(根據布達佩斯條約，于1998年1月22日將名為r-vWF-CHOF7的這種穩定細胞克隆提交給ECACC(歐洲動物細胞保藏中心(EuropeanCollectionofCellCultures,Salisbury,WiltshireSP4OJG,英國)保藏，其分類命名為CLONF7(WCB40SF/808.68/F7/20.O8.97);所獲得的保藏號為98012206)制備連續稀釋液，所述細胞培養物已經在無血清無蛋白培養液中培養了60個世代，然后將O.l細胞接種到微量滴定板的各孔中。將所述細胞在不加血清或不加蛋白的DMEM/HAM，sF12中在無選擇壓力下培養約3周，通過免疫熒光，用標記的抗vWF抗體測試所述細胞。將已經鑒定為陽性的一個細胞克隆用作制備種子細胞庫的起始克隆。主細胞庫(MCB)始于無J^青無蛋白培養液中的所述種子細胞庫，于單個安瓿中冷凍保存，用于進一步帝洛工作細胞庫。在/u^青無蛋白培養液中從^^^l瓦帝]^工作細月酵。將所必田月^多孑Lf^^體上固定^^，在/u^青無蛋白的^^牛下再培養;VHfr代。借助免赴光，用標記的抗vWF抗體，觀'H^斤必田月&^無jk^青無蛋白培養液中在不同時間點的生產率。在工作細月酵階段以^^^青無蛋白培養液中10個世代和60個世代后，評價所必田胞6輛急定性。約100%的所述細胞被鑒定為穩定的陽性克隆，所述克隆在工作細胞庫階段、10個世代和60個世^f戈后均表達rvWF。實施例3:重組細胞克隆的細胞比產出率在重組細胞的培養期間在特定階段取出特定量的細胞，然后用新鮮培養液將這些細胞培養24小時。測定所述細胞培養物上清液中的rvWF:Risto-CoF-活性。表1顯示，就按照本發明的穩定重組細胞克隆而論，細胞的比產出率甚至在無血清無蛋白培養液中60個世代后也是穩定的，并且與已經在含血清的培養液中培養的原始克隆相比，甚至提高了細胞的比產出率。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*)于1998年1月22日提交保藏(ECACC(歐洲細胞培養物保藏中心,Salisbury,WiltshireSP4OJG,莢國)；保藏號98012206)實施例4:合成的無血清無蛋白培養基的組成表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例5:在無蛋白無血清基本培養基中培養rFVIII-CHO細胞在具有灌流的IO-L攪拌釜中培養含有rFVin-CHO細胞的細胞培養物。在這種情況下使用按照實施例4的培養基。由此將細胞在多孔微載體(Cytopore氣Pharmada)上固定化，然后培養至少6周。灌流速度為4倍體積換^天；pH為6.9-7.2;02濃度為約20-50%;溫度為37。C。圖1顯示rFVIII-CHO細胞克隆在10L灌注式生物反應器中的培養結果。a)42天內因子VIII的活性(毫單位/mL)及灌流速度(l-5/天)。b)灌注式生物反應器中的容積生產率(因子VIII的單位/L/天)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表3顯示表達rFVIII的細胞的穩定性和比產出率。為了獲得這些結果，于15天、21天、28天、35天和42天后取樣，然后以300g將其離心，重懸于新鮮無血清無蛋白培養液中。再培養24小時后，測定細胞培養物上清液中因子VIII的濃度和細胞計數。根據這些數據計算出FVIII的比產出率。荻得888毫單位/106細胞/天的穩定的平均生產率。在無血清無蛋白培養液中15天、21天、28天、35天和42天后，用抗FVIII抗體標記，通過免疫熒光也證實這種穩定的生產率。實施例6:比較重組FVIII-CHO細胞在含有其它培養基成分的無蛋白無血清培養液中的生產率分批培養含有rFVin-CHO細胞的細胞培養物。在這種情況下，使用已經添加以下氨基酸的按照實施例4的培養基表4<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>于37。C和pH6.9-7.2培育細胞。采用分批法在24-72小時內培育細胞。測定重組FVIII-CHO細胞在下列培養基組合物中的生產率Mix1:包含不含大豆蛋白胨但另外含有按照上述表的氨基酸混合物的無血清無蛋白培養基。Mix2:包含含有大豆蛋白胨的無血清無蛋白培養基。Mix3:包含含有大豆蛋白胨并且另外還含有按照上述表的氨基酸混合物的無血清無蛋白培養基。Mix4:包含無血清無蛋白培養基，并且另外還含有按照上述表的氨基酸混合物以及2.5g/L純化超濾大豆蛋白胨。所述超濾大豆蛋白胨的純化在Sephadex⑧柱上用層析法進行。實施例7:采用恒化培養法在無蛋白無血清培養液中培養重組FVIII-CHO細胞在IO-L攪拌式生物反應器中培養含有rFVIII-CHO細胞的細胞培養物。在這種情況下，使用按照實施例4的不含大豆蛋白胨但含有按照實施例6的氨基酸混合物的培養基。于37。C和pH6.9-7.2時培養細胞；氧濃度為20-50%空氣飽和度。為了測定培養物上清液中因子VIII的效價和細胞濃度，每24小時進行取樣。從笫2天至第M天總細胞濃度是恒定的。從笫6天開始在培養液中添加超濾大豆蛋白胨。因子VIII的生產率示于3中；借助CHROMOGENIXCoAFVIII:C/4系統進行所述測定。用標記的抗Fvm抗體進行免疫焚光。從所述數據可以觀察到由于添加大豆蛋白胨，因子vm的生產率明顯增加，并且因此生物反應器系統的容積生產率增加，因而這并不會導致細胞生長的明顯增加。幾天后，連續培養物中不存在大豆蛋白胨導致因子vm的生產率的明顯下降，而添加大豆蛋白胨的結果是生產率幾乎增加io倍。然而，由于所述添加并不增加細胞計數，由此清楚地表明，超濾大豆蛋白胨的結果是導致不依賴于細胞生長的生產率的明顯增加。實施例8:比較重組FVIII-CHO細胞在含有不同水解產物的無蛋白無血清培養液中的生長速率和生產率分批培養rFVin-CHO細胞培養物。在這種情況下，使用已經添加不同水解產物(來自大豆、酵母、水稻和小麥)的如實施例4所述的無血清無蛋白培養基。將沒有加入水解產物的無血清無蛋白培養基用作對照、。初始細胞密度分別為0.6x105和0.4x106。采用分批法于37。C在pH6.9-7.2下培養所述細胞。表5:顯示在已經添加大豆水解產物(超濾的)和酵母水解產物的無血清無蛋白培養基中培養rFVIII-CHO細胞的實驗結果。初始細胞密度為0.6xl0"田胞。將沒有加入水解產物的無血清無蛋白培養基用作對照。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表6:顯示在已經添加大豆水解產物(超濾的)、水稻水解產物和小麥水解產物的無血清無蛋白培養基中培養rFVIII-CHO細胞的實驗結果。初始細胞密度為0.6xl()S細胞。將沒有加入水解產物的無血清無蛋白培養基用作對照。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表7:顯示在已經添加大豆水解產物(超濾的)和d、麥水解產物的無血清無蛋白培養基中培養rFVin-CHO細胞的實驗結果。初始細胞密度相當于0.4x106細胞。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例9:在含大豆水解產物的無蛋白無血清培養液中培養BHK細胞通過CaP04方法將BHK-21(ATCCCCLIO)細胞用以下質粒共轉染三次25嗎質粒pSV-FII(Fischer,B.等，J.Biol.Chem.,1996,笫271巻，第23737-23742頁)，該質粒含有在SV40啟動子(SV40早期基因啟動子)控制下的人因子II(凝血酶原)-cDNA;4jxg氨甲蝶呤抗性的質粒pSV-DHFR和1iug介導G418/新霉素抗性的質粒pUCSV-neo(Schlokat，U.等，Biotech.Appl.Biochem.,1996,第24巻，笫257-267頁)。通過逐步增加氨曱蝶呤濃度直到3MM的濃度，借助在含有500pg/mLG418的培養液中進行培養來選擇穩定的細胞克隆。對以這種方法獲得的克隆進行亞克隆，并使其適應無蛋白無血清培養基。采用懸浮培養技術進行培養。結果可以參閱表6;在含大豆水解產物的無蛋白無血清培養基中培育的BHK細胞，表現出重組因子II的高的穩定的產率。權利要求1.一種用于培養哺乳動物細胞的無蛋白無血清培養基，所述培養基包含基于所述培養基總干重的超過10％重量的大豆水解產物，其中所述大豆水解產物的分子量≤1000道爾頓。2.權利要求1的培養基，其中所述大豆水解產物是超濾大豆水解產物。3.權利要求1或2的培養基，其中所述大豆水解產物是純化大豆水解產物。4.權利要求3的培養基，其中所述大豆水解產物的分子量《500道爾頓。5.權利要求4的培養基，其中所述大豆水解產物的分子量《350道爾頓。6.權利要求1-5任一項的培養基，其中所述大豆水解產物的內毒素含量<500U/g。7.權利要求1-5任一項的培養基，其中所迷培養基還含有氨基酸。8.權利要求7的培養基，其中所述氨基酸選自L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酰胺或其混合物。9.權利要求1-5任一項的培養基，其中所述培養基還含有輔助物質，所述輔助物質選自緩沖物質、氧化穩定劑、對抗機械應力的穩定劑和蛋白酶抑制劑。10.權利要求1的培養基用于培養哺乳動物細胞的用途。11.權利要求10的用途，其中所述哺乳動物細^!包選自CHO細胞和BHK細胞。12.—種培養哺乳動物細胞的方法，所述方法包括將所述哺乳動物細胞接種到權利要求1的培養基中和讓所述哺乳動物細胞在所述培養基中生長。13.—種從細胞培養物制備重組產物的方法，所述方法包括將哺乳動物細胞接種到權利要求1的培養基中，其中所述哺乳動物細胞表達重組產物；讓所述哺乳動物細胞在所述培養基中生長并且^^達所述重組產物，由此在所述培養基中產生所述哺乳動物細胞和所述重組產物的混合物；從所述混合物中純化所述重組產物。14.一種細胞培養組合物，所述組合物包含哺乳動物細胞和^又利要求1的培養基。15.—種制備權利要求l的細胞培養基的方法，所述方法包括獲得大豆水解產物，采用超濾法超濾所述大豆水解產物采用大小排阻層析純化所述大豆水解產物，選擇由分子量<1000道爾頓的大豆水解產物組成的大豆水解產物級分。全文摘要本發明描述了一種培養基，所述培養基用于無蛋白無血清培養細胞、尤其是哺乳動物細胞，因而所述培養基含有一定比例的大豆水解產物。文檔編號C12N5/00GK101173246SQ20071009684公開日2008年5月7日申請日期2000年9月27日優先權日1999年9月28日發明者A·米特雷爾,F·多納,L·格里爾伯格,M·雷特,W·蒙德特申請人:巴克斯特股份公司