專利名稱：一種生物涂層劑及其制備方法和在烤煙腋芽控制上的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體地說，涉及利用微生物發酵 原理，從次生代謝產物中篩選出活性成分并加以應用的技術。
技術背景烤煙是世界上ioo多個國家廣泛種植的經濟作物之一，田間栽培管理中的封頂打杈作業極其勞累費力。為提高煙葉產量及減輕勞累，從20世紀50年代開始，許多國家都先后應用化學藥劑抑制腋芽生長。 我國從80年代開始，從國外引進Flumetralin (抑芽敏)， Maleichydrazide (抑芽丹、芽敵)、Pendimethalin (除芽通)、 Butradlin (止芽素)等試驗使用。這些藥劑的抑芽效果各有千秋， 但都是有機合成制劑，有殘留毒性，污染環境，對烤煙品質有影響， 成本也較高，內吸性MH類品種目前己經禁用。近年來，為減少或消 除化學農藥大量推廣應用帶來的種種弊端，各國人民要求控制公害保 護環境的呼聲日益高漲，為此，國際《環境與發展大會》要求21世 紀初，世界生物農藥應用比例將提高到占總體農藥的60%，世界平均 水平目前不到10%，我國僅為2%，因此，積極研創生物制劑已是當務之急o發明內容本發明要解決的問題是提供一種更安全，無毒副作用，不污染環 境，無殘毒顧慮，高效價廉的生物涂層劑，同時本發明提供了該生物 涂層劑的制備方法和在烤煙腋芽控制上的應用。本發明提供的生物涂層劑，其活性成分為e-苯乙醇，分子量為 122，分子式是C6H5CH2-CH2OH，結構式為^V0112""01^""011 。上述生物涂層劑的制備方法，由下列步驟組成:(1) 、從植物中采集Botrytis Cinerea Persr真菌CGMCCN0 NO 0357-1的病害標本，選擇新鮮、癥狀典型的標本進行表面消毒，用滅 菌水沖洗，再用組織分離或直接孢子振落法進行單孢分離、純化培養， 然后按照室內菌株篩選及生產工藝流程方法，選拔出生物活性強、固 體發酵物產率為25% 30%、小麥抑芽快速檢測試驗抽提物稀釋至1500 倍仍然有效的菌株，再誘變育種，反復比較篩選出高產菌株，依序編 號，將菌種接入煮至半熟滅菌大麥粒i:，放入-4(TC -6(TC冰箱保存 備用；
(2) 、培養基每升使用去皮馬鈴薯200克水煮過濾，加葡萄糖 10 15克，磷酸二氫鉀2.5 3克，動物蛋白胨l克，維生素B,5毫 克，檸檬酸O. l克，搖勻，室溫振搖培養8 10天，乙酸乙脂萃取抽 提2次，濃縮，無水硫酸鈉脫水得粗抽品e-苯乙醇、對羥基苯乙醇 等，放入-80'C低溫冰箱內保存備用；
(3) 、將所得產物采用抑制小麥胚芽鞘生長法，進行室內快速生 物測定篩選，將預先提取的待測粗抽品稀釋為100倍、200倍……1200 倍系列濃度各5毫升，移入放有處理過的小麥種子的燒杯中，以剛好 浸沒種子為宜，對照用清水，每一濃度重復3次，置26'C溫箱中培養 7天，篩選出活性強，產率高的菌株培養所得粗品e-苯乙醇，并提供 生測試驗；
(4) 、經生測篩選到活性較高的組分，再用柱層析和TLC法純化， HPLC分析，應用IRV、 UV、 MS，結合H固R儀器解析，確定活性成分 P-苯乙醇的分子量、分子式和結構式。
將生物涂層劑用于烤煙栽培過程的腋芽控制上，采用滴涂或淋滴 方式施用，達到了控制腋芽瘋長，收到了良好的抑芽效果。該涂層劑 也可用于其它植物的封頂打杈，還可用于花卉、蔬菜保鮮，調控作物 生育，改善品質、提高產量等。由于本發明的生物涂層劑是從植物中 采集、分離、培養、萃取、過濾、干燥而得，整個加工過程安全無毒， 不含有毒成分，因而不污染環境、無殘毒，生產成本低，價格便宜， 每畝成本僅需8 9元，又能增進烤煙品質，控芽效果平均可達92% 98%。
具體實施例方式
本發明提供的生物涂層劑，其活性成分為e-苯乙醇，分子量為
122，分子式是C6H5CH「CH20H，結構式為Q-CH2"0112""011 。
制備上述生物涂層劑時，按下列工藝步驟進行 (1)、從植物中采集BotrytisCinereaPersr真菌的病害標本(己
于1998年送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保 藏編號CGMCCNO NO 0357-1),選擇新鮮、癥狀典型的標本進行表面消 毒，用滅菌水沖洗，再用組織分離或直接孢子振落法進行單孢分離、 純化培養，然后按照室內菌株篩選及生產工藝流程方法，選拔出生物 活性強、固體發酵物產率為25%~30%、小麥抑芽快速檢測試驗抽提物 稀釋至1500倍仍然有效的菌株，再誘變育種，反復比較篩選出高產 菌株，依序編號，將菌種接入煮至半熟滅菌大麥粒上，放入-4(TC -60'C冰箱保存備用；
(2) 、培養基每升使用去皮馬鈴薯200克水煮過濾，加葡萄糖10 15克，磷酸二氫鉀2.5 3克，動物蛋白胨l克，維生素B,5毫克， 檸檬酸0.1克，搖勻，室溫振搖培養8 10天，乙酸乙脂萃取抽提2 次，濃縮，無水硫酸鈉脫水得粗抽品0-苯乙醇、對羥基苯乙醇等， 放入-80'C低溫冰箱內保存備用；
(3) 、將所得產物采用抑制小麥胚芽鞘生長法，進行室內快速生物 測定篩選，將預先提取的待測粗抽品稀釋為IOO倍、200倍……1200 倍系列濃度各5毫升，移入放有處理過的小麥種子的燒杯中，以剛好 浸沒種子為宜，對照用清水，每一濃度重復3次，置26'C溫箱中培養 7天，篩選出活性強，產率高的菌株培養所得粗品活性物，例如，我 們從萵苣、蔥、草莓、酸木瓜等植物的灰霉病中分離篩選到7個高產 菌株，按照前述方法分離培養，萃取、濃縮，即可得到粗制品提供生 測試驗；
(4)、經生測篩選到活性較髙的組分，再用柱層析和TLC法純化， HPLC分析，應用IRV (紅外)、UV (紫外)、MS (質普)，結合HNMR儀器解析，確定活性成分P-苯乙醇的分子量、分子式和結構式。
e-苯乙醇向來認為是較好的食品添加劑，用途廣泛， 一直以來 都是作為天然香料應用。本發明通過試驗研究，發現其控制植物發芽
如烤煙腋芽具有很好的效果，平均控芽率達95%，超過目前進口使用 的化學型抑芽劑。
目前國內外通常采用有機化學合成或用微生物發酵制取生產3-苯乙醇，在微生物發酵制取e-苯乙醇時一般采用啤酒酵母菌或克魯 維酵母菌，將苯丙氨酸、氟苯丙氨酸經發酵轉化制取苯乙醇，所用原 料苯丙氨酸、氟苯丙氨酸價格昂貴，生產成本高，不宜規模化工業生 產；也有采用煙草廢棄物(煙梗、煙末)，適當添加培養基，將煙草 中的木質素、果膠、多酚類化合物經微生物發酵降解并轉化成苯乙醇 的，但所用微生物依然是酵母菌類，且產率不夠高。本發明利用微生 物發酵生產P-苯乙醇，所用葡萄孢真菌Botrytis cinerea Persr于 1998年保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏 編號為CGMCCN0 N0 0357-1。
釆用微生物(Botrytis Cinerea Persr)發酵制備出的P-苯乙醇 用于烤煙腋芽的控制研究，仍然遵循室內外結合的辦法，首先在溫室 內盆栽烤煙幼苗若干株，然后將6-苯乙醇配制成0.5%、 1%、 2%…… 8%系列濃度，分別用施藥瓶將1% 2%濃度制劑噴或淋滴到幼苗上，24 小時后即可觀察到幼苗心葉枯死，而大葉不受傷害，重復試驗3批， 結果一致，證明該制劑對烤煙幼芽生長有強烈觸殺功能。
烤煙幼苗試驗證實P -苯乙醇雖是食品添加劑，但對控制烤煙腋芽 生長也有很好的功能，于是可進一步加工配制成含有效成分10 25% 的乳油(苯乙醇10 25%、溶劑10 25%、乳化劑8 10%、展散劑 5%)，供烤煙大田期正規田間試驗，具體方法是在大田烤煙生長到封 頂打杈時，選擇生長整齊，高矮基本一致，施肥管理基本相同的地塊 作試驗，四周劃保護行，小區隨機區組排列，每小區面積30 50株 煙，分別掛牌標志，釆用國內普遍推廣應用的化學型抑芽劑(如除芽 通、滅芽靈、抑芽敏、芽凈、止芽素等)作標準對照，將生物涂層劑和化學抑芽劑同田相間排列，重復四次，按各自使用書對水施用，間隔40天，組織有關試驗人員聯合調査其效果，隨機5點取樣，分別 計算控芽百分率，必要時采摘芽位的鮮芽稱重。經多年、多點田間試 驗表明，新型生物涂層劑控制烤煙腋芽的效果達到92% 98%，超過化 學型抑芽劑。加之，安全無毒副作用，對環境友好，無殘毒顧慮，又 能促進烤煙產量質量的提高，市場前景好。
權利要求
1、一種生物涂層劑，其特征在于它的活性成分為β-苯乙醇，分子量為122，分子式是C6H5CH2-CH2OH，結構式為 id="icf0001" file="A2007100930280002C1.tif" wi="45" he="14" top= "33" left = "135" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>
2、 一種權利要求1所述生物涂層劑的制備方法，其特征在于包 括下列步驟-.(1) 、從植物中采集Botrytis Cinerea Persr真菌CGMCCNO NO 0357-l的病害標本，選擇新鮮、癥狀典型的標本進行表面消毒，用滅 菌水沖洗，再用組織分離或直接孢子振落法進行單孢分離、純化培養， 然后按照室內菌株篩選及生產工藝流程方法，選拔出生物活性強、固 體發酵物產率為25% 30%、小麥抑芽快速檢測試驗抽提物稀釋至1500 倍仍然有效的菌株，再誘變育種，反復比較篩選出高產菌株，依序編 號，將菌種接入煮至半熟滅菌大麥粒上，放入-4(TC -6(TC冰箱保存 備用；(2) 、培養基每升使用去皮馬鈴薯200克水煮過濾，加葡萄糖 10 15克，磷酸二氫鉀2. 5 3克，動物蛋白胨l克，維生素B,5毫 克，檸檬酸O. l克，搖勻，室溫振搖培養8 10天，乙酸乙脂萃取抽提2次，濃縮，無水硫酸鈉脫水得粗抽品e-苯乙醇、對羥基苯乙醇等，放入-8(TC低溫冰箱內保存備用；(3) 、將所得產物采用抑制小麥胚芽鞘生長法，進行室內快速生 物測定篩選，將預先提取的待測粗抽品稀釋為100倍、200倍……1200 倍系列濃度各5毫升，移入放有處理過的小麥種子的燒杯中，以剛好 浸沒種子為宜，對照用清水，每一濃度重復3次，置26。C溫箱中培養 7天，篩選出活性強，產率高的菌株培養所得粗品苯乙醇，并提供 生測試驗；(4) 、經生測篩選到活性較高的組分，再用柱層析和TLC法純化， HPLC分析，應用IRV、 UV、 MS，結合H麗R儀器解析，確定活性成分 P-苯乙醇的分子量、分子式和結構式。
3、 權利要求1所述生物涂層劑在烤煙腋芽控制上的應用，采用滴 涂或淋滴方式，用來控制腋芽的生長。
全文摘要
本發明提供了一種活性成份為β-苯乙醇的生物涂層劑，是從植物中采集、分離、純化培養，選拔生物活性強，產率高的株系，進行小麥抑芽快速檢測，再反復比較篩選出高產菌株，再經培養、溶劑萃取、濃縮、干燥而得，將其用于烤煙腋芽的控制上，有效率達92～98％，整個加工過程安全無毒，不含有毒成份，因而不污染環境、無殘毒，生產成本低，價格便宜，該生物涂層劑也可用于花卉、蔬菜保鮮，調控作物生育，改善品質提高產量等。
文檔編號C12P7/22GK101313676SQ200710093028
公開日2008年12月3日 申請日期2007年11月23日 優先權日2007年11月23日
發明者劉云輝, 劉令輝, 沈嘉祥, 陳正邦 申請人:劉令輝