專利名稱：：一種微生物催化制備(r)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的方法
技術領域：
：本發明涉及微生物催化制備(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的方法，屬于生物催化不對稱還原制備醫藥化工中間體鹵代芳基手性醇的
技術領域：
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背景技術：
：手性藥物及其手性中間體越來越受到重視，例如抗抑郁首選藥氟西汀(Fluoxetine)，原是一種外消旋體的抗抑郁藥，1997年銷售額曾達到27億美元，后來發現其S-氟西汀是R-氟西汀藥效的3倍(歐志敏等無錫輕工大學學報2003，22(1):43-48)，該產品很快為S-氟西汀所替代，其重要的手性中間體即為手性芳基醇3-氯-l-苯丙醇。又如抗哮喘藥福莫特羅，是一種長效(32受體激動藥，它有兩個手性中心，四種異構體。研究表明第一個碳原子的R構型是主要有效成分，其(R^R)異構體的藥效是其(S,S)對映體的1000倍(王永梅等CN1228448C，2005)，其重要中間體也是(R)-卣代芳基醇。本發明所涉及的化合物鹵代芳基手性醇主要用于合成P3腎上腺素素受體激動劑。從80年代初就有關于P3腎上腺素素受體激動劑的研究報道，許多國際大型制藥公司都在研發此類藥物，例如SR58611,化學名稱為[(7S)7-[(2R)2-(3-氯苯基)-2-羥乙基胺基]-5,6,7，8-四氫萘-2-基氧基]乙酸乙酯(結構式I)，是一種由Sariofi-Aventis公司研制的卩3腎上腺素能受體激動劑，目前已處于m期臨床研究。在II期臨床的研究過程中發現，SR58611療效優于氟西汀，且耐受性良好。在IIb期臨床研究時與另一抗抑郁首選藥帕羅西汀(paroxetine,Paxil)的比較發現，SR58611的療效和耐受性更好，足以保證繼續進行III期臨床研究(中國藥理學通報.2005,10:1153-1157)。研究表明SR58611在抗抑郁、抗肥胖、抗糖尿病、心血管舒張、胃腸道的解痙和抗炎以及尿道解痙等方面有顯著的療效。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>結構式i又如Solabegron，化學名稱為3'-[(2-U(2R)-2-(3-氯苯基)-2-羥乙籠]氨基！乙基)氨基]聯苯-3-甲酸(結構式11)，是一種由Glaxosmithkline研究開發的p3腎上腺素能受體激動劑，主要用于治療抑郁癥，目前已處于臨床II期<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>結構式II該藥物有兩個手性中心，所以一共有(2R,2'S)、(2R，2'R)、(2S，2'S)、(2S，2'R)四種異構體。研究表明第一個碳原子的R構型要好于其S構型，并且(2R，2'S)要好于其對映體(2R^2'R)、(2S,2'S)與(2S，2'R)。(EuropeanJournalofMedicinalChemistry.1994,29(4):259267)。在SR58611與Solabegron的合成過程中的關鍵手性中間體為(1R)-2-氯-(氯代苯基)乙醇(結構式m)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>結構式in已有報道采用不對稱催化還原(1R)-2-氯-(鹵代苯基)乙酮的方法合成(1R)-2-氯-(卣代苯基)乙醇(MarcDevocelle,et.al.:TetrahedronLetters40,4551-4554,1999;Ohkuma.T，et.al.:OrganicLetters,9(2)，255-257,2007)，描述了使用錄(Rh)催化劑，這種方法的催化劑昂貴、價格高、反應條件比較苛刻、催化劑回收復雜，大規模工業化生產易造成污染。中國專利CN1063422C(兒玉浩宣,等19%)公開了以外消旋的2-鹵代-1-(取代苯基)乙醇和鄰苯二甲酸酐反應所得產物，再采用光學活性有機堿作為拆分劑，得旋光性中間體，最后水解或醇解得到光學活性的化合物2-鹵代-1-(取代苯基)乙醇，該方法需從外消旋的原料入手經三步反應才得產物，收率低，同時在拆分過程中還需要價格較高的生物堿、多種溶劑和試劑，增加了生產成本，同時還有50%的無用對映體及部分副產物難以處理，從而造成環境污染。中國專利CN1228448C(王永梅等，2005)描述了使用生物催化還原的方法制備(R)-2-鹵代-1-(取代苯基)乙醇，但從該專利的實施例中可以看出，該專利采用普通市售酵母作生物催化劑，由于其酶系復雜，造成其轉化產物光學純度不高，且產率低。并且以上專利均未T渉及化合物rR)-2-m:代-i-(3-氯苯基)乙醇。還沒有關于酵母以外的其它種屬微生物羰基還原酶催化不對稱還原反應生產芳基手性醇(R)-2-氯代-l-(3-氯苯萄乙醇的研究報道。
發明內容本發明的目的是提供了產高立體選擇性羰基還原酶的微生物，提供了一種新的能有效催化不對稱還原反應制備手性鹵代芳基醇的方法，并利用該類微生物菌株催化2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮不對稱還原，以獲得高光學純度、高反應產率、高產物濃度的(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇。為實現上述目的，本發明提供了微生物催化制備(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的方法，其特征是以選擇性羰基還原酶產生菌為微生物催化不對稱還原反應用菌株，在單一水相體系或水/有機溶劑兩相體系中，以2-氯代-(氯代苯基)乙酮為底物，在酶反應過程中補充添加底物，并添加葡萄糖和大孔樹脂，制備(R)-2-氯小(3-氯苯基)乙醇。本發明(R)-2-鹵代-1(鹵代苯基)乙醇的制備方法反應式如下OOH以下是本發明方法的詳細步驟描述如下。(1)菌株由本發明篩選得到的能有效催化不對稱還原反應制備手性鹵代芳基醇的微生物菌株是河流弧菌(W6ho^m^fc)ATCC33810，ATCC33812，需土金桿菌C4weo&cferZw附/e"egera)ATCC13345，糞產堿桿菌(j/cfl/fgew^/aecafe)ATCC15554,蘇云金芽孢桿菌(5ac/WM;/Awr/一—AS1.785，AS1.786，AS1,787，AS1.788，AS1.792，皮狀絲孢酵母(7Wc/o^orawcwto附wm)AS2.571，或博伊丁假絲酵母(Owwfe/a6o!VAm!')AS2.1644等；其中糞產堿桿菌(^/0//^股《/"^0/的ATCC15554轉化效果較優，作為實例中進一步研究出發菌株。(2)微生物菌體的培養培養基組成為酵母膏550g/L,玉米漿干粉550g/L，蛋白胨550g/L，CoCl20.010.1mmol/L,pH59，溫度2040。C，培養14天，發酵液過濾獲得濕菌體；(3)配制反應體系以2-氯-1-(3-氯苯基)乙鵬為底物，甩0:2TV1，pH6.5"的磷酸緩沖液配制成單一水相反應體系，底物濃度為50mmol140mmol/L(艮卩9.5g/L~26.5g/L);或者用有機溶劑與pH6.5的磷酸緩沖液配制成水/有機溶劑兩相體系，再加入底物濃度0讓ol140薩ol/L(艮卩9.5g/L26.5g/L);(4)微生物催化反應在上面(3)的單一水相反應體系中，或者水/有機溶劑兩相體系中，加入濕菌體，加濕菌體量以底物計為140g/g，反應溫度為205CTC,反應時間為272小時在微生物催反應過程中補充添加底物，并添加葡萄糖或添加大孔樹脂；在反應過程中添加葡萄糖，其濃度為1%-10%重量。在反應過程中添加大孔樹脂，采用添加樹脂是用來吸附底物、產物，以抑制底物、產物對菌體的毒性。樹脂與底物的質量比為0.6-6:1，大孔樹脂為DA201、Hz816、Hz803、AB-8、D4006、HPD300、HPD100A、NAK-II、X-5、CAD-40、SD30(KDM—1、XAD—7、DlOl、AB-8、H—103、DM-130大孔吸附樹脂，D201GF、D392、D315、D290、D280、D293大孔陰離子樹脂，HD-2、D61、DOOl、HD隱1、D001-CC、D113大孔陽離子樹脂，所述大孔樹脂的孔徑為100180A。上述樹脂均為市售，為上海華東理工大學華震科技開發公司、南開大學化工廠等產品。在水/有機溶劑兩相體系中，用有機溶劑與pH6.5的磷酸緩沖液，按體積比O丄l1:0.1配制成水/有機溶劑兩相體系，再加入底物濃度1050g/L，所用的有機溶劑為鄰苯二甲酸二辛酯，或鄰苯二甲酸二丁酯、乙酸正丁酯、環己烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、異辛垸、癸垸、壬垸等，均為市售化學純產品。在上述反應過程中，在進行上述步驟(2)時可以不進行過濾而是采用在濕菌體培養發酵液中直接添加2-氯-卜(3-氯苯基)乙酮為底物，其濃度為50mmo卜140mmol/L，即9.5g/L~26.5g/L替代步驟(3)配制反應體系，然后進行步驟(4)的微生物催化反應。(5)轉化液后處理微生物催化反應后的轉化液過濾或離心分離菌體，清液以乙酸乙酯萃取，吸附樹脂用乙酸乙酯洗脫，合并萃取液和洗脫液，再向其中加入1%-5%(w/v)的無水硫酸鈉，攪勻后靜置過夜，除去殘余的水份。將有機相用濾紙過濾，收集有機相。5(TC水浴旋轉蒸發回收溶劑，得到無色油狀液體(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇。取(R)-2-氯-l-(3-氯苯基)乙醇0.05g，溶于乙酸乙酯中，定容至5mL，用GC-MASS進行定性分析，樣品與標準品(SigmaCo.)質譜圖對照，確定為同一物質。分析方法產物(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇對映異構體過量值(e.e.)測定采用手性氣相色譜法。手性氣相色譜柱CP-ChirasilDexCB25mx(T.55mmx0.2Snm;色譜條件為l(TC保留2min，以2'C/min升溫至140。C保留2tnin;進樣量0.2^L;柱流速2.0mL/min;載氣H2流速30mL/min，燃燒氣&流速30mL/min,空氣流速300mL/min，尾吹N2流速25mL/min;進樣口250°C，檢測器250°C，分流比50:1。本發明的有益效果本發明篩選獲得了高對映體選擇性的河流弧菌(W6Wo/wv/ato)ATCC33810，ATCC33812，需土金桿菌04w/"eo6a"en'wnf^regejw)ATCC13345，糞產堿桿菌04/ca/ige""/aecato)ATCC15554，蘇云金芽孢桿菌(5a"7/usf/mn"g/e附&)AS1.785，AS1.786，AS1.787,AS1.788，AS1.792，皮狀絲孢酵母(7Hc/KMporawcwMweww)AS2.571，博伊丁假絲酵母(C朋^fo知/必w7)AS2.1644等，在單一水相體系中催化不對稱還原2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮生成的(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇對映體過量值達到80%-99%e.e.，在反應體系中添加樹脂或者有機溶劑，供給能量物質，可以添加高濃度底物，獲得高光學純度、高反應產率、高產物濃度，更主要的是在整個反應過程中不需要添加輔酶。由此提取制備得到的(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇達到含量99.2%，光學純度99，/。e.e.。本發明微生物轉化法相對于傳統的化學不對稱合成法、面包酵母氧化還原方法或用添加輔酶NADH/NAD+的酶催化不對稱還原方法具有以下優點①生成的(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇對映體過量值高，最高可達到99%e.e以上；②生物催化劑為微生物菌體，可以自行發酵生產，質量穩定，成本低廉；③在反應體系中添加樹脂或者采用水/W機相兩相體系，供給能量物質，可以獲得高光學純度、高反應產率、高產物濃度；④在整個反應過程中不需要添加輔酶；⑤反應條件溫和，環境友好。生物材料樣品說明本發明所用的河流弧菌(J^r'oy/mv'a//j)ATCC33810，ATCC33812，需土金桿菌(4weo6a"e"wwferegera)ATCC13345，糞產堿桿菌04/ca/ige朋s/flecafc)ATCC15554，蘇云金芽孢桿菌(^c"/wsf/w/"g!'era的AS1.785,AS1.786，AS1.787，AS1.788，AS1.792，皮狀絲孢酵母(7WctospwwzCMto朋wm)AS2.571，博伊丁假絲酵母(Cam/WaAoWi"ii)AS2.1644等。其中ATCC編號菌種保存于美國模式菌種收集中心，AS編號菌種保存中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。具體實施方式以下是以選擇性羰基還原酶產生菌為出發菌株，在單一水相體系或水/有機溶劑兩相體系中，以2-鹵代-(鹵代苯基)乙酮為底物，微生物催化制備(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的實施例。但本發明并不限于所列出的幾個實例。微生物菌株的培養和篩選斜面培養培養基為100mL麥芽汁(含麥芽粉10g)，瓊脂2g，pH6.0，121。C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種，菌種為表1所示的各種微生物菌株，28'C培養2天，作為斜面活化種子。種子培養和發酵酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L,pH6.5，裝液量為250mL三角瓶裝液50mL，120'C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種斜面種子，180r/min的搖床，28'C培養24-48小時，作為種子或發酵菌液。發酵菌液中濕菌體量為1.6g/100mL，離心10分鐘(8,000轉/分鐘)收集菌體，用磷酸鉀緩沖液(0.2M，pH6.5)清洗兩次，將菌體轉入5mL含葡萄糖(0.5M)的相同的緩沖液中，使菌體濃度為發酵液中的兩倍，同時加入10Ommol/L底物，于30'C，180r/min下反應。反應48小時結束，離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，分離水相和有機相。向有機相加入適量無水NaS04干燥過夜，蒸干乙酸乙酯，加入流動相(85X正己烷+15X異丙醇)80(HiL，液相色譜分析產物含量與對映體過量值，結果如表l。表1產羰基還原酶微生物菌株的篩選<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>皮狀絲孢酵母(7Wc/os/wro"cM/a"e廳)AS2.57198.0288.44/博伊丁假絲酵母(OwKfefo6o/A'm7)AS2.164486.8159.54及結果表明，轉化產物(R)-2-氯-l-(3-氯苯基)乙醇光學純度e.e值可達到81.70%~99.16%e.e、摩爾轉化率46.29~93.68%，在整個反應過程中不需要添加輔酶。其中糞產堿桿菌G4/ca"geM/fleca/的ATCC15554轉化效果更好，作為進一步實施例出發菌株。實施例2:不同碳源對轉化的影響采用糞產堿桿菌04/^/扭""/"""/")^0:15554為轉化菌株，將該菌種按實施例1的方法培養，在實施例1中加入不同的碳源替代葡萄糖。從斜面上將菌種接至5ml液體培養基中，空氣搖床28'C，180r/min預培養24h，然后轉入50ml培養基中擴大培養24h，4。C下，12000r/min離心8min。反應條件和收集方法同實施例1。結果如表2。表2不同碳源對轉化的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由表2結果可以看出樣品e.e.值可以達到99%以上，各平行樣的重復性良好。由轉化率考慮確定以玉米漿作為實驗中的培養基碳源。實施例3:不同氮源對轉化的影響將糞產堿桿菌04/^//^""/"6￡^/&)八10:15554菌種按實施例1的方法培養，在實施例1中葡萄糖培養基加入不同的氮源(表3所示)。從斜面上將菌種接至5ml液體培養基中，搖床180r/min，28°C，預培養24h，然后轉入50ml培養基中擴大培養24h，4'C下，12000r/min離心8min。反應條件和收集方法同實施例1。結果如表3。表3不同氮源對轉化的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表3結果可以看出以(NH4)2S04作為氮源的樣品轉化率雖高(80.22%)，e.e.值99.79%，但各水平之間的差異很大。綜合考慮，在不影響ee值的條件下仍然以酵母膏加普通蛋白胨為氮源。同時，在對各種產酶條件進行優化后，確定培養基配方如下酵母膏10g/L，精制玉米漿干粉10g/L，蛋白胨20g/L，CoCl20.1mmol/L，pH6.5。在上述條件下，10Ommol/L的底物在48h后的轉化率可達到99.8%，e.e.值99.9%。實施例4:不同底物濃度對轉化的影響將糞產堿桿菌(j/ca/fge"^/aeca/的ATCC15554菌種按實施例1的方法培養，發酵培養基按優化碳氮源后的培養基，即酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，玉米漿20g/L，pH6.5。從斜面上將菌種接至5ml液體培養基中，空氣搖床28。C，180r/min預培養24h，然后轉入50ml培養基中擴大培養24h，4'C下，12000r/min離心8min。反應條件和收集方法同實施例1。結果如表4。表4不同底物濃度對轉化的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例5:不同的菌體量對轉化的影響將糞產堿桿菌(^/0//^"/^ca/的ATCC15554菌種按實施例4的方法培養。從斜面上將菌種接至5ml液體培養基中，空氣搖床28'C，180r/min預培養24h，然后轉入50ml培養基中擴大培養24h，4'C下，12000r/min離心8min。反應條件和收集方法同實施例1，底物濃度10g/L。結果如表5。表5不同菌體量對轉化的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例6:添加樹脂對轉化的影響將糞產堿桿菌04/ca"ge"^/aec"/的ATCC15554菌種按實施例1的方法培養。從斜面上將菌種接至5ml液體培養基中，空氣搖床28°C,180r/min預培養24h，然后轉入50ml培養基中擴大培養24h，4r下，12000r/min離心8min。反應條件和收集方法同實施例1，底物濃度20g/L。反應體系中分別添加大孔樹脂DA201、Hz816、Hz803、AB-8、D4006、HPD300、HPD100A、NAK-II、X-5、CAD-40、SD300、DM—11、XAD—7、DlOl、AB-8、H—103、DM-130大孔吸附樹脂，D201GF、D392、D315、D290、D280、D293大孔陰離子樹脂，HD-2、D61、DOOl、HD-1、D001-CC、D113大孔陽離子樹脂，所述大孔樹脂的孔徑為100~180A。添加量按說明書所述范圍選擇質量比為1:1。反應結束后濾出吸附樹脂用乙酸乙酯洗脫，洗脫液用手性氣相色譜檢測，其中結果較好的為CAD40、SD300、DM—11、XAD—7、DlOl、AB-8、H—103、DM-130,結果如表6所示。表6添加樹脂對轉化的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例7:不同比例的水/有機溶劑兩相反應體系對轉化的影響將糞產堿桿菌04/cflZ/gewM/aecafc)ATCC15554菌種按實施例1的方法培養。從斜面上將菌種接至5ml液體培養基中，搖床180r/min，28°C，預培養24h，然后轉入50ml培養基中擴大培養24h，4'C下，12000r/min離心8min。反應條件和收集方法同實施例1，底物濃度為20g/L。底物預先溶于一定體積的有機溶劑中。試驗的有機溶劑為鄰苯二甲酸二辛酯，或鄰苯二甲酸二丁酯、乙酸正丁酯、環己烷、正己烷、正庚垸、正辛烷、異辛垸、正癸垸、壬烷、十一烷、十二烷等，反應結束后分出有機相，用？"性氣相色譜檢測，結果如表7和8。表7水/不同種類有機溶劑的兩相反應體系對轉化的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表8不同比例7]C/鄰苯二甲酸二辛酯兩相反應體系對轉化的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例8:微生物催化反應產物的提取按實施例6的方法，微生物催化反應后的轉化液過濾，并離心分離菌體，清液以乙酸乙酯萃取，濾出的吸附樹脂用乙酸乙酯洗脫，合并萃取液和洗脫液，再向其中加入1%-5%(w/v)的無水硫酸鈉，攪勻后靜置過夜，除去殘余的水份。將有機相用濾紙過濾，收集有機相。5(TC水浴旋轉蒸發回收溶劑，得到無色油狀液體(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇，GC測定含量99.2。/。，光學純度99.8y。e.e.。取(R)-2-氯-l-(3-氯苯基)乙醇0.05g，溶于乙酸乙酯中，定容至5mL,用GC-MASS進行定性分析，樣品與標準品(SigmaCo.)質譜圖封照，確定為同一物質。權利要求1.一種微生物催化制備(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的方法，其特征是以選擇性羰基還原酶產生菌為出發菌株，在單一水相體系或水/有機溶劑兩相體系中，以2-氯代-(氯代苯基)乙酮為底物，在酶反應過程中補充添加底物，并添加葡萄糖和大孔樹脂，制備(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇，其步驟如下(1)選擇以下菌株河流弧菌(Vibriofluvialis)ATCC33810，ATCC33812，需土金桿菌(Aureobacteriumterregens)ATCC13345，糞產堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)ATCC15554，蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)AS1.785，AS1.786，AS1.787，AS1.788，AS1.792，皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)AS2.571，或博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)AS2.1644；(2)微生物菌體的培養培養基組成為酵母膏5～50g/L，玉米漿干粉5～50g/L，蛋白胨5～50g/L，CoCl20.01～0.1mmol/L，pH5～9，溫度20～40℃，培養1～4天，發酵液過濾獲得濕菌體；(3)配制反應體系以2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮為底物，用0.2M，pH6.5的磷酸緩沖液配制成單一水相反應體系，底物濃度為50mmol～140mmol/L，即9.5g/L～26.5g/L；或者用有機溶劑與pH6.5的磷酸緩沖液配制成水/有機溶劑兩相體系，再加入底物濃度50mmol～140mmol/L，即9.5g/L～26.5g/L；(4)微生物催化反應在步驟(3)的單一水相反應體系中，或者水/有機溶劑兩相體系中，加入濕菌體，加濕菌體量以底物計為1～40g/g，反應溫度為20～50℃，反應時間為2～72小時；在微生物催反應過程中補充添加底物，并添加葡萄糖；(5)轉化液后處理微生物催化反應后的轉化液過濾或離心分離菌體，清液以乙酸乙酯萃取，吸附樹脂用乙酸乙酯洗脫，合并萃取液和洗脫液，再脫水，脫色，蒸發回收溶劑，得到無色油狀液體(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇。2.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述菌株采用河流弧菌(W^7'0yim'afc)ATCC33810，ATCC33812，需土金桿菌04wreo6flc/eA7'wmfc/regms)ATCC13345，糞產堿桿菌04/^//^""/aecafo)ATCC15554，蘇云金芽孢桿菌(Ba"7/^Aw/"gie"s/s)AS1.785，AS1.786，AS1.787，AS1.788，AS1.792，皮狀絲孢酵母(7Wc/wwporawc^""ew附)AS2.571，或博伊丁假絲酵母(Om力tfok)Wm'OAS2.1644。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于采用糞產堿桿菌04/o^g^"/aecflfo)ATCC15554。4.根據權利要求1所述的方法，其特征是在進行上述步驟(2)時不進行過濾而是采用在濕菌體培養發酵液中直接添加2-氯-l-(3-氯苯基)乙酮為底物，其濃度為50mmo1140mmol/L，即9.5g/L26.5g/L替代步驟(3)配制反應體系，然后進行步驟(4)的微生物催化反應。5.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述微生物催化反應，在反應過程中添加葡萄糖，其濃度為1%-10%重量。6.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述微生物催化反應，在反應過程中添加大孔樹脂，所述的大孔樹脂為DA201、Hz816、Hz803、AB-8、D4006、HPD300、HPD100A、NAK-II、X-5、CAD-40、SD300、DM—11、XAD—7、D101、AB-8、H—103、DM-130大孔吸附樹脂，D201GF、D392、D315、D2卯、D280、D293大孔陰離子樹脂，HD隱2、D61、D001、HD-1、D001-CC、D113大孔陽離子樹脂，所述大孔樹脂的孔徑為100180A，樹脂與底物的質量比為0.66:1。7.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述微生物催化反應，用有機溶劑與pH6.5的磷酸緩沖液，按體積比0丄11:0.1配制成水/有機溶劑兩相體系，再加入底物濃度1050g/L，所用的有機溶劑為鄰苯二甲酸二辛酯、鄰苯二甲酸二丁酯、乙酸正丁酯、環己垸、正己垸、正庚烷、正辛烷、異辛烷、癸垸或壬烷。全文摘要本發明提供一種微生物催化制備(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的方法，該方法利用已知的高對映體選擇性羰基還原酶的產生菌株河流弧菌(Vibriofluvialis)，需土金桿菌(Aureobacteriumterregens)，糞產堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)，蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)，皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)，博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)等，在優化條件下發酵產酶，并在單一水相體系或水/有機溶劑兩相體系中，以2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮為底物，并添加葡萄糖和大孔樹脂，當底物2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮濃度為50mmol～140mmol/L(即9.5g/L～26.5g/L)，轉化48h，轉化條件優化后得到產物(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇達到光學純度e.e值99.6％e.e、摩爾轉化率99％以上，在整個反應過程中不需要添加輔酶。由此提取制備得到的(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇含量達到99.2％，光學純度99.8％e.e.。文檔編號C12R1/63GK101302552SQ20071007846公開日2008年11月12日申請日期2007年5月10日優先權日2007年5月10日發明者居年豐,坡朱,力秦,洋虞申請人:重慶博騰科技有限公司