專利名稱：Cik細胞的凍存及復蘇的制作方法
技術領域：
本發明涉及凍存技術的一種新的應用。
背景技術：
CIK細胞是一種非MHC限制性的高效溶腫瘤細胞毒性T淋巴細胞，其在外周血淋巴細胞中的比例為1％～5％。1991年Schmidt-Wolf等首先報道了一類由多種細胞因子誘導的殺傷細胞，即CIK(cytokine-induced killer CIK)細胞。正常人或患者外周血、骨髓單個核細胞中加入細胞因子IFN-γ、IL-1、CD3mAb、IL-2經2～4周的誘導即可獲得大量的腫瘤殺傷細胞CIK(《世界華人消化雜志》.2007.15(6)548～553)，CIK細胞是非MHC限制性的一群異質性細胞，具有強大的殺瘤活性。具有TIL、LAK細胞無法比擬的優勢，但誘導CIK細胞需要花費很長的時間，在臨床應用上需要多次誘導和采血，給患者造成了極大的痛苦和不必要的麻煩。
發明內容
本發明的目的是為了解決CIK細胞誘導時間長，需要多次誘導和患者多次采血的問題，而首次提出了CIK細胞的凍存及復蘇。CIK細胞的凍存及復蘇通過以下步驟實現一、CIK細胞的凍存a、取CIK細胞放入離心管中，然后以1000轉/分鐘的速度離心5分鐘，取出上清液放于玻璃瓶中并于零下20度凍存，視上清液完全凍結后，將裝有上清液的玻璃瓶放于零下80度的低溫冰箱中凍存備用，b、向離心管內的細胞中加入細胞凍存液，細胞凍存液是由AIMW和DMSO按照9∶1的體積比配制，然后將離心管內物質放于凍存管中，c、按照溫度下降速度為10攝氏度/小時的速率將凍存管在4℃的溫度下放置1小時后，再于零下20℃放置2小時，然后放入零下80℃冰箱過夜，最后放于液氮中凍存，即達到凍存CIK細胞的目的。二、CIK細胞的復蘇d、取出步驟一a中凍存的上清液于4度冰箱中解凍，然后將上清液在2000轉/分鐘的條件下離心5分鐘，取上清液備用，得到經過離心處理的上清液，e、將凍存的CIK細胞放入37～40℃的溫水中速融，然后將CIK細胞加入到裝有生理鹽水的離心管中并以1000轉/分鐘的速度離心5分鐘，然后去上清液，f、將CIK細胞放入到步驟二d中經過離心處理的上清液中，然后將細胞濃度稀釋到1.0×106/ml后均分于六孔板中培養，根據每孔中細胞的體積按600U/ml和100ng/ml的濃度加IL-2和CD3mAb，于孵箱中培養，即達到CIK細胞復蘇的目的。本發明中復蘇的細胞存活率為95～99％，利用凍存技術保存了CIK細胞并使它的殺傷活性和增殖率得到保持，CIK細胞凍存后可以根據需要隨時復蘇，復蘇時間僅需要1～2天，避免了臨床使用CIK細胞需要多次誘導的麻煩和多次采血給患者造成的痛苦，節省了每次誘導所需要的大量的誘導因子和培養液，降低了成本，利用本發明可長期保存CIK細胞并且在長期保存后CIK細胞殺傷活性不發生變化。
圖1是用熒光倒置顯微鏡觀察的復蘇后的CIK細胞400倍放大圖，圖2是未凍存的CIK細胞的400倍放大圖；圖3和圖4是CIK細胞凍存后復蘇測定細胞表型圖，圖3中橫軸為CD4+，縱軸為CD8+，圖4中橫軸為CD3+，縱軸為CD56+；圖5是復蘇后的CIK細胞未凍存的CIK細胞的增殖率的比較圖，圖5中深色線為未凍存的CIK細胞的增殖率，淺色線為復蘇的CIK細胞的增殖率。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式中CIK細胞的凍存及復蘇通過以下步驟實現一、CIK細胞的凍存a、取CIK細胞放入離心管中，然后以1000轉/分鐘的速度離心5分鐘，取出上清液放于玻璃瓶中并于零下20度凍存，視上清液完全凍結后，將裝有上清液的玻璃瓶放于零下80度的低溫冰箱中凍存備用，b、向離心管內的細胞中加入細胞凍存液，細胞凍存液是由AIMW和DMSO按照9∶1的體積比配制，然后將離心管內物質放于凍存管中，c、按照溫度下降速度為10攝氏度/小時的速率將凍存管在4℃的溫度下放置1小時后，再于零下20℃放置2小時，然后放入零下80℃冰箱過夜，最后放于液氮中凍存，即達到凍存CIK細胞的目的。二、CIK細胞的復蘇d、取出步驟一a中凍存的上清液于4度冰箱中解凍，然后將上清液在2000轉/分鐘的條件下離心5分鐘，取上清液備用，得到經過離心處理的上清液，e、將凍存的CIK細胞放入37～40℃的溫水中速融，然后將CIK細胞加入到裝有生理鹽水的離心管中并以1000轉/分鐘的速度離心5分鐘，然后去上清液，f、將CIK細胞放入到步驟二d中經過離心處理的上清液中，然后將細胞濃度稀釋到1.0×106/ml后均分于六孔板中培養，根據每孔中細胞的體積按600U/ml和100ng/ml的濃度加IL-2和CD3mAb，于孵箱中培養，即達到CIK細胞復蘇的目的。
本實施方式中利用凍存技術保存了CIK細胞并保持了它的殺傷活性，CIK細胞凍存后可以根據需要隨時復蘇，復蘇時間僅需要1～2天，避免了臨床使用CIK細胞需要多次誘導的麻煩和多次采血給患者造成的痛苦，節省了每次誘導所需要的大量的誘導因子和培養液，降低了成本。凍存復蘇后細胞集落形態圖如圖1所示，未凍存的細胞菌落形態圖如圖2所示，兩者對比發現復蘇后的細胞飽滿，細胞呈異型性，有很多散在的大集落和小集落，細胞狀態良好。
CIK細胞殺傷活性的比較用0.01ml PBS溶解MTT，使其濃度為5mg/ml，調整pH為7.3，過濾除菌，置棕色瓶4℃避光貯存，即為貯存液。CIK細胞復蘇的第二天把對數生長期的腫瘤細胞HepG2調整濃度分別為1×105/ml、5×104/ml、2.5×104/ml，每孔100ul鋪于96孔板中，每組設四個復孔，置37℃，CO2體積濃度為5％孵箱內培養24h，復蘇的第三天將效應細胞CIK濃度調整為1×106/ml與靶細胞濃度分別為10∶1、20∶1、40∶1加入96孔板中，另設未凍存相同比例濃度的單獨靶細胞組(靶細胞+培養液)和單獨效應細胞組(效應細胞+培養液)為陰性對照，作用48h后每孔加入MTT20ul/孔，繼續培養4h，然后翻板棄去上清液，每孔加入100ul DMSO，震蕩幾分鐘，等沉淀全部溶解后用酶標儀(波長570nm)測定吸光度A值，計算殺傷率(％)＝{1-[A(效+靶)-A(效)]/A(靶)}×100％。復蘇后細胞和未凍存細胞殺傷活性的比較如表1所示說明凍存復蘇后的細胞的殺傷活性未下降。
表1 復蘇后細胞和未凍存細胞殺傷活性比較(x±s)
CIK細胞表型測定取2×106/ml細胞于流式專用管中，相應抗體混勻避光放置20min，用PBS洗兩遍，1500rpm離心5min，1％甲醛固定后上機測定。CIK細胞凍存后復蘇測定細胞表型如圖3、圖4所示，CD3+為(88.1±4)％，CD4+為(3.2±0.3)％，CD8+為(82.6±2.8)％，CD3+CD56+為(19.1±0.4)％，復蘇后細胞和未凍存細胞培養14、20天的細胞表型比較如表2所示凍存后復蘇的CIK細胞的CD3+CD56+高于誘導14天的CIK細胞，相比誘導20天的CIK細胞無明顯差異，說明凍存復蘇后的細胞的細胞表型保持正常。
表2 復蘇后細胞和未凍存細胞表型比較(x±s)
復蘇后的CIK細胞的增殖活性與未凍存的CIK細胞的增殖活性的比較如表3所示表3 復蘇后細胞和未凍存細胞增值活性比較(×107)(x±s)
復蘇后的CIK細胞的增殖率與未凍存的CIK細胞的增殖率的比較如圖4所示，在生長曲線上看未凍存細胞較凍存復蘇后的細胞增殖快，兩組之間有差別(P＜0.05)，但未凍存細胞在誘導20天后、凍存細胞在復蘇后8、9天時增殖均進入平臺期，說明兩者快速增殖期都是短期內的，凍存細胞在復蘇后增殖率未變化。
本發明中HepG2肝癌腫瘤細胞株由本所提供，CD3mAb為北京天廣實生物技術有限公司產品，IL-2購自江蘇金絲利藥業有限公司，Percp結合的鼠抗人CD3、FITC結合的鼠抗人CD4、PE結合的鼠抗人CD8、PE結合的鼠抗人CD56均為美國BD公司產品，RPMI 1640干粉為美國Gibco BRL產品，MTT為北京索萊寶科技有限公司產品，流式細胞儀為美國BD公司產品，酶標分光光度計為BioRAU，450型，美國制造，熒光倒置顯微鏡為日本OLYMPUS公司產品。
權利要求
1.CIK細胞的凍存及復蘇，其特征在于CIK細胞的凍存及復蘇通過以下步驟實現一、CIK細胞的凍存a、取CIK細胞放入離心管中，然后以1000轉/分鐘的速度離心5分鐘，取出上清液放于玻璃瓶中并于零下20度凍存，視上清液完全凍結后，將裝有上清液的玻璃瓶放于零下80度的低溫冰箱中凍存備用，b、向離心管內的細胞中加入細胞凍存液，細胞凍存液是由AIMW和DMSO按照9∶1的體積比配制，然后將離心管內物質放于凍存管中，c、按照溫度下降速度為10攝氏度/小時的速率將凍存管在4℃的溫度下放置1小時后，再于零下20℃放置2小時，然后放入零下80℃冰箱過夜，最后放于液氮中凍存，即達到凍存CIK細胞的目的。二、CIK細胞的復蘇d、取出步驟一a中凍存的上清液于4度冰箱中解凍，然后將上清液在2000轉/分鐘的條件下離心5分鐘，取上清液備用，得到經過離心處理的上清液，e、將凍存的CIK細胞放入37～40℃的溫水中速融，然后將CIK細胞加入到裝有生理鹽水的離心管中并以1000轉/分鐘的速度離心5分鐘，然后去上清液，f、將CIK細胞放入到步驟二d中經過離心處理的上清液中，然后將細胞濃度稀釋到1.0×106/ml后均分于六孔板中培養，根據每孔中細胞的量按600U/ml和100ng/ml的濃度加IL-2和CD3mAb，于孵箱中培養，即達到CIK細胞復蘇的目的。
全文摘要
CIK細胞的凍存及復蘇，本發明涉及凍存技術的一種新的應用。它是為了解決現有CIK細胞誘導時間長，需要多次誘導和患者多次采血的問題，而首次提出了CIK細胞的凍存及復蘇。CIK細胞的凍存及復蘇通過以下步驟實現一、CIK細胞的凍存；二、CIK細胞的復蘇。本發明中復蘇的細胞存活率為95～99％，利用凍存技術保存了CIK細胞并使它的殺傷活性和增殖率得到保持，CIK細胞凍存后可以根據需要隨時復蘇，復蘇時間僅需要1～2天，避免了臨床使用CIK細胞需要多次誘導的麻煩和多次采血給患者造成的痛苦，節省了每次誘導所需要的大量的誘導因子和培養液，降低了成本，利用本發明可長期保存CIK細胞并且在長期保存后CIK細胞殺傷活性不發生變化。
文檔編號C12N5/08GK101063107SQ20071007209
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月25日 優先權日2007年4月25日
發明者王志華, 袁玉濤 申請人:哈爾濱醫科大學