專利名稱：復合酶解帶魚脊骨制備降血壓肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及生物制藥技術(shù)及功能性食品 生產(chǎn)加工技術(shù)。
背景技術(shù)：
血管緊張素轉(zhuǎn)換酶UCE)在血壓調(diào)節(jié)過程中扮演重要的角色。其可 使無活性的血管緊張素十肽前體轉(zhuǎn)化為血管緊張素，從而使血壓升高。血 管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制活性肽是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI) 中的一種，通過抑制ACE的活性而達到降低血壓的作用。目前已經(jīng)有多種 化學合成肽類藥物作為ACE的抑制劑。這類合成降血壓藥物的缺點是作用 時間不長，血壓容易反彈，并且藥物經(jīng)腎臟排出容易造成腎功能的損傷。從天然蛋白質(zhì)中提取具有營養(yǎng)性和生理活性的功能肽，并將這些功能 肽應(yīng)用到保健食品和強化營養(yǎng)食品當中不但能夠全面利用食品及食品加 工中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，而且能夠有效的提高來源廣泛的蛋白質(zhì)原料的附加值， 同時大大提升傳統(tǒng)食品的科技含量。食品蛋白質(zhì)經(jīng)酶解產(chǎn)生的降血壓肽具有食用安全性高、無副作用，特 別是其對高血壓患者具有降壓作用，但對血壓正常人無降壓作用的優(yōu)點， 近年來受到廣泛關(guān)注。目前人們已經(jīng)成功地從磷蝦、金槍魚、沙丁魚、鰹 魚、玉米、大豆、酒糟、蠶蛹、酪蛋白中獲得了 ACE抑制肽。但上述研究 分離方法成本高，M^莫化生產(chǎn)的成本也較高，并且原料多為人們的生活食 物。九十年代后期，國內(nèi)外關(guān)于蛋白酶解肽的研究主要圍繞在蛋白質(zhì)的水 解度、分子量大小、游離氨基酸含量、生物酶重復利用以及對苦味的控制 和去除等。帶魚(7Wc/7/wms力/ o"/cw)屬多盧形目、帶魚科、帶魚屬，俗名刀魚、 裙帶魚、牙帶、白帶魚等，為集群于底層的暖水性魚類，廣泛分布于中國、 朝鮮、日本、印度尼西亞、菲律賓、印度、非洲東岸及紅海等海域。據(jù)統(tǒng) 計，該魚種在中國的漁獲量中最高，占世界同種魚漁獲量的70%-80% ,
位居中國海洋漁業(yè)單魚種漁獲量第l位；而東海區(qū)帶魚漁獲量又最高，占 中國同種漁獲量的80%-90% ，是東海區(qū)漁業(yè)生產(chǎn)最重要的捕撈對象。傳統(tǒng)醫(yī)學認為，帶魚性溫、味甘、能暖胃、澤膚、補氣、養(yǎng)血、健美， 適宜久病體虛、血虛頭暈、氣短乏力、食少贏瘦、營養(yǎng)不良之人和皮膚千 燥之人食用?！妒澄镏兴幣c便方》云帶魚.滋陰.養(yǎng)肝。急慢性腸炎蒸 食，能改善癥狀。經(jīng)常食用帶魚.具有補益五臟的功效。帶魚脊骨是帶魚加工后的主要下腳料，俗稱帶魚魚排。目前其主要用 于祠料工業(yè)，對于利用帶魚脊骨的利用及深度加工尚屬空白。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種復合酶解帶魚脊骨制備具有對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 (ACE)具有抑制作用的降血壓肽的方法。一種復合酶解帶魚脊骨制備降血壓肽的方法，包括如下步驟將帶魚脊骨 粉碎后加水攪勻，調(diào)節(jié)PH值為7-9 (—般用鹽酸)，將溫度升高到30-45 。C,保持10-20分鐘后，加入原料(帶魚脊骨)中蛋白重量的0. 5-2%的彈 性蛋白酶(酶活力為15000U/g，彈性蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶伴有廣泛 的底物特異性，它能水解氨基化合物和酯。彈性酶的特殊之處在于它能作 用于彈性蛋白。用于蛋白測序研究以及制備組織分離細胞。)，繼續(xù)保溫并 不斷攪拌進行酶解反應(yīng)2-5小時，然后將酶解液迅速升溫至90-100'C，保 持10-15分鐘后，再迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)。調(diào)酶解液pH為1. 5-3. 0(優(yōu) 選2.0),加入原料(帶魚脊骨)中蛋白重量的0.05-0. 3%的胃蛋白酶(酶 活力5000U/g，胃蛋白酶能消化蛋白質(zhì)，使凝固的蛋白質(zhì)分解。在pH值 1. 5-2. 5時其活力最強，遇堿性藥物或抗酸藥，效果減弱甚至失效。遇 鞣酸、沒食子酸或多數(shù)重金屬鹽溶液產(chǎn)生沉淀而失效。)，在35-4(TC繼續(xù) 保溫并不斷攪拌進行酶解反應(yīng)1-3小時，而后反應(yīng)體系迅速升溫至90-100 。C，保持10-15分鐘后，再迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)，在2500-3000r/min 的條件下離心30分鐘，留上清液，過濾，利用真空濃縮才幾將酶解液濃縮， 進行冷凍干燥，得到具有降血壓功能的肽粉。所述的帶魚脊骨加水攪勻時，帶魚脊骨的質(zhì)量與水的體積比為1: 2-6 (g/ml)，優(yōu)選l: 4(g/ml);調(diào)節(jié)PH值優(yōu)選為8.0。作為優(yōu)選，調(diào)節(jié)PH值后將溫度升高到37。C。
作為優(yōu)選，彈性蛋白酶加入量為原料(帶魚脊骨)中蛋白重量的0. 8%。 作為優(yōu)選，加入彈性蛋白酶后進行酶解反應(yīng)3小時。 作為優(yōu)選，胃蛋白酶加入量為原料(帶魚脊骨)中蛋白重量的O. 1%。 作為優(yōu)選，加入胃蛋白酶后在37'C進行酶解反應(yīng)2小時。 本發(fā)明方法采用兩段酶解，縮短了酶解時間，減低能源消耗。帶魚脊骨中主要是彈性蛋白，用相應(yīng)的酶進行有針對性酶解效果好。對于產(chǎn)品得率，和產(chǎn)品性能有4艮大提高。本發(fā)明方法的優(yōu)點是1. 本發(fā)明所制備的P爭血壓肽是帶魚脊骨經(jīng)生物酶水解而得，具有抑制 ACE活性的作用，對高血壓患者具有降壓作用，安全、無毒副作用，對血壓 正常者可起到保健作用，對正常血壓無影響。2. 本發(fā)明所采用的原料來源豐富，價格低廉，經(jīng)過本發(fā)明的技術(shù)轉(zhuǎn)化 可以有效的提高帶魚脊骨這種水產(chǎn)加工下腳料的經(jīng)濟附加值，對繼續(xù)促進 水產(chǎn)加工業(yè)的發(fā)展有重要的意義。3. 本發(fā)明的產(chǎn)品可以作為藥品、保健食品、食品、食品添加劑、藥物 增效劑等，工藝科學合理，操作簡單，具有較強的工業(yè)化實施性。具體實施方法1 實施例1稱取勻漿后的帶魚脊骨(水分76. 22%,蛋白質(zhì)含量12. 17%,浙江省寧 波超星海洋生物制品有限公司提供)20kg，加水80kg攪勻后用調(diào)節(jié)PH值 為8.0，將溫度升高到37。C,保持20分鐘后，加入原料中帶魚脊骨重量 的O. 196的彈性蛋白酶0.02kg(酶活力為15000U/g)，繼續(xù)保溫并不斷攪拌 進行酶解反應(yīng)3小時。然后采用酶解液迅速升溫至90-IOO'C，保持10-15 分鐘后，迅速冷卻至室溫來終止反應(yīng)。調(diào)節(jié)酶解液的pH為2.0，將溫度保 持在37。C約20分鐘，加入原蛋白含量的0. lyo的胃蛋白酶0.002kg,繼續(xù) 保溫并不斷攪拌進行酶解反應(yīng)2小時。然后采用酶解液迅速升溫至90-100 。C，保持10-15分鐘后，迅速冷卻至室溫來終止反應(yīng)。在J-6M型大容量冷 凍離心機(BECKMAN公司)3000r/min的4。C條件下離心30分鐘，得上清液 76.5kg。以普通濾紙過濾，而后利用中空纖維聚砜超濾膜(截留分子量 10KDa)對粗濾酶解液進行超濾，工作壓力0. 2MPa,工作溫度約30。C，得到 膜透過液62.7kg。利用真空濃縮機將超濾透過酶解液濃縮至5kg，進^f亍冷 凍干燥，得到具有降血壓功能的肽粉1.32kg，肽含量為93.89%,產(chǎn)品得率 為6. 7%，色澤乳黃色細膩，利用體外檢測ACE抑制活性的CUSIMAN法，測得 其IC5。為0. 598mg/ml。實施例2稱取勻漿后的帶魚脊骨(水分76.22%,蛋白質(zhì)含量12. 17%，浙江省寧 波超星海洋生物制品有限公司提供)10kg,加水30kg攪勻后用調(diào)節(jié)PH值 為7.0，將溫度升高到37。C，加入原料中帶魚脊骨重量的0. 12%的彈性蛋 白酶0.012kg(酶活力為15000U/g)，繼續(xù)保溫并不斷攪拌進行酶解反應(yīng)2 小時。然后采用酶解液迅速升溫至90-IOO'C，保持10-15分鐘后，迅速冷卻 至室溫來終止反應(yīng)。調(diào)節(jié)酶解液的pH為2. 0，將溫度保持在37。C約20分 鐘，加入原蛋白含量的O. l呢的胃蛋白酶0.002kg，繼續(xù)保溫并不斷攪拌進 行酶解反應(yīng)1小時。然后采用酶解液迅速升溫至90-100。C，保持10-15分 鐘后，迅速冷卻至室溫來終止反應(yīng)。在J-6M型大容量冷凍離心機(BECKMAN 公司)3000r/min的4。C條件下離心30分鐘，得上清液27. 2kg。以普通濾紙 過濾，而后利用中空纖維聚砜超濾膜(截留分子量10KDa)對粗濾酶解液 進行超濾，工作壓力0. 2MPa，工作溫度約25-30°C，得到膜透過液22. lkg。 利用真空濃縮機將超濾透過酶解液濃縮至3kg，進行冷凍千燥，得到具有 降血壓功能的肽粉0.42kg,肽含量為87.24%,產(chǎn)品得率為4.2%，色澤乳黃 色細膩，利用體外檢測ACE抑制活性的CUSHMAN法，測得其IC5。為 1.996mg/ml。實施例3稱取勻漿后的帶魚脊骨(水分76.22%,蛋白質(zhì)含量12.17%，浙江省寧 波超星海洋生物制品有限公司提供)25kg,加水125kg攪勻后用調(diào)節(jié)PH 值為8.0，將溫度升高到37。C，保持20分鐘后，加入原料中帶魚脊骨重 量的0. 129&的彈性蛋白酶0.03kg (酶活力為15000U/g)，繼續(xù)保溫并不斷 攪拌進行酶解反應(yīng)3小時。然后采用酶解液迅速升溫至90-IO(TC，保持10-15分鐘后，迅速冷卻至室溫來終止反應(yīng)。調(diào)節(jié)酶解液的pH為1. 5,將 溫度保持在37C約20分鐘，加入原蛋白含量的0. 1%的胃蛋白酶0. 0025kg, 繼續(xù)保溫并不斷攪拌進行酶解反應(yīng)1小時。然后采用酶解液迅速升溫至 90-100°C，保持10-15分鐘后，迅速冷卻至室溫來終止反應(yīng)。在J-6M型大 容量冷凍離心機(BECKMAN公司)3000r/min的4'C條件下離心30分鐘，得上 清液98.9kg。以普通濾紙過濾，而后利用中空纖維聚^1濾膜(截留分子 量10KDa)對粗濾酶解液進行超濾，工作壓力0. 2MPa，工作溫度約30°C， 得到膜透過液81.4kg。利用真空濃縮機將超濾透過酶解液濃縮至7kg，進 行冷凍干燥，得到具有降血壓功能的肽粉1. 3kg，肽含量為89. 93%,產(chǎn)品得 率為5. 2%,色澤乳黃色細膩，利用體外檢測ACE抑制活性的CUSHMAN法，測 得其IG。為1.207mg/ml。
權(quán)利要求
1、一種復合酶解帶魚脊骨制備降血壓肽的方法，包括如下步驟將帶魚脊骨粉碎后加水攪勻，調(diào)節(jié)PH值為7-9，將溫度升高到30-45℃，保持10-20分鐘后，加入原料帶魚脊骨中蛋白重量的0.5-2％的彈性蛋白酶，繼續(xù)保溫并不斷攪拌進行酶解反應(yīng)2-5小時，然后將酶解液迅速升溫至90-100℃，保持10-15分鐘后，再迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)，調(diào)酶解液pH為1.5-3.0，加入原料帶魚脊骨中蛋白重量的0.05-0.3％的胃蛋白酶，在35-40℃攪拌進行酶解反應(yīng)1-3小時，而后反應(yīng)體系迅速升溫至90-100℃，保持10-15分鐘后，再迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)，離心后取上清液過濾、真空濃縮、冷凍干燥，得到粉狀降血壓肽。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的帶魚脊骨加水攪 勻時，帶魚脊骨的質(zhì)量與水的體積比為1: 2-6g/ml。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的帶魚脊骨加7jc攪 勻時，帶魚脊骨的質(zhì)量與水的體積比為1: 4g/ml。
4、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于彈性蛋白酶加入量為原 料帶魚脊骨中蛋白重量的0. 8%。
5、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于加入彈性蛋白酶后進行 酶解反應(yīng)3小時。
6、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于胃蛋白酶加入量為原料 帶魚脊骨中蛋白重量的0.1%。
7、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于加入胃蛋白酶后在37。C 進行酶解反應(yīng)2小時。
8、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的離心條件是 2500-3000r/min，離心20-30分4中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種復合酶解帶魚脊骨制備降血壓肽的方法，包括如下步驟將帶魚脊骨粉碎后加水攪勻，調(diào)節(jié)PH值，將溫度升高到30-45℃，加入彈性蛋白酶，進行酶解反應(yīng)，然后將酶解液迅速升溫至90-100℃，保持10-15分鐘后，再迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)，調(diào)酶解液pH為1.5-3.0，加入胃蛋白酶，進行酶解反應(yīng)，而后反應(yīng)體系迅速升溫至90-100℃，保持10-15分鐘后，再迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)，離心后取上清液過濾、真空濃縮、冷凍干燥，得到粉狀降血壓肽。本發(fā)明方法原料來源豐富，價格低廉，經(jīng)過本發(fā)明的技術(shù)轉(zhuǎn)化可以有效的提高帶魚脊骨這種水產(chǎn)加工下腳料的經(jīng)濟附加值，對繼續(xù)促進水產(chǎn)加工業(yè)的發(fā)展有重要的意義。
文檔編號C12P21/00GK101153310SQ20071007125
公開日2008年4月2日 申請日期2007年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月7日
發(fā)明者何國慶, 王鳳平, 王金玲, 章海峰, 暉 阮, 陳啟和 申請人:浙江大學