專利名稱：：一種乙酸萘酯酶的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種乙酸萘酯酶的提取方法，尤其是一種可用于有機(jī)磷農(nóng)藥快速測(cè)定的乙酸萘酯酶的提取方法。(二)
背景技術(shù)：
測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法主要有色譜法和酶抑制法，色鐠法雖然可靠，但耗時(shí)、成本高，需要受過專門訓(xùn)練的技術(shù)人員操作，只適合在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，不適合在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。在用酶抑制法快速測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥中常用的酶為乙酰膽堿酯酶，乙酰膽堿酯酶從動(dòng)物血液或組織中提取。動(dòng)物乙酰膽堿酯酶不太適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)使用，這是因?yàn)閯?dòng)物乙酰膽堿酯酶源不僅取材不便，而且必須冰凍保存，乙酰膽堿酯酶價(jià)格也比較昂貴，如對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥較敏感的電鰩乙酰膽堿酶，800元/500U,使對(duì)果蔬中農(nóng)藥殘留的快速測(cè)定產(chǎn)品難以普及應(yīng)用?，F(xiàn)有公開的測(cè)定果蔬中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的植物源性酯酶的提取方法，由于酶源的處理、提取液的選擇、酶源浸泡時(shí)間以及酶源質(zhì)量與提取液比例的選擇等條件優(yōu)化不足的原因，所提取出的酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的最低檢出限較高。本方法提供的提取方法能夠制得對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥敏感、對(duì)農(nóng)藥的最低檢出限較低的酯酶。在目前公開的資料中將這類酶稱為植物酯酶，根據(jù)酶學(xué)分類和命名，這種命名方法不夠確切。本方法中根據(jù)該酯酶催化的底物(乙酸萘酯)和酶學(xué)分類、命名原則，將該酯酶命名為乙酸萘酯酶。所述乙酸萘酯酶可催化下列反應(yīng)乙酸萘酯+水』4"-萘酚+乙酸"-萘酚+固藍(lán)鹽B4顯色產(chǎn)物+氯化鋅+氯化氫
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能用于快速測(cè)定果蔬中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的乙酸萘酯酶的提取方法，以代替動(dòng)物乙酰膽堿酯酶，降低生產(chǎn)成本，提高檢測(cè)靈敏度，使有機(jī)磷農(nóng)藥殘留可在現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定。為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種乙酸萘酯酶的提取方法，所述方法包括如下順序步驟(1)將含有乙酸萘酯酶的植物種子去皮磨粉，04。C下、用815倍質(zhì)量的蒸餾水浸泡12~18h,取上清液2000~6000r.p.m、0~4°C離心，取上清液，得酯酶粗提液；所述含有乙酸萘酯酶的植物種子來自下列之一的作物①小麥、②蕎麥、③黃豆、④玉米、⑤水稻、大麥。(2)水浴條件下，往酯酶粗提液中加入硫酸銨，使酶液中硫酸銨飽和度為5075%,再于3000~5000r.p.m、04。C離心，取沉淀，用pH6~7的磷酸緩沖液稀釋210倍，得稀釋后的酶液；(3)將稀釋后的酶液用1030倍體積的蒸餾水透析，直至不產(chǎn)生沉淀為止，酶液再經(jīng)濃縮、干燥，得所述乙酸萘酯酶。所述步驟(1)中蒸餾水浸泡時(shí)間優(yōu)選為15h。所述步驟(2)中所用磷酸緩沖液pH值為6.38。具體的，所述步驟(3)中濃縮步驟為采用真空冷凍千燥機(jī)，04°C下濃縮酶液至固體。所述步驟(3)中濃縮步驟為將酶液裝入透析袋中，用聚乙二醇6000做干燥劑，4"C下濃縮。具體的，所述方法按如下順序步驟進(jìn)行(1)將含有乙酸萘酯酶的植物種子去皮磨粉，04。C下、用IO倍質(zhì)量的蒸餾水浸泡15h,取上清液4500r.p.m、04。C離心，耳又上清液，得酯酶粗提液；(2)水浴條件下，往酯酶粗提液中加入石克酸銨，使酶液中硫酸銨飽和度為50%,再于4500r.p.m、04。C離心，取沉淀，用pH6.38的磷酸緩沖液稀釋4倍，得稀釋后的酶液；(3)將稀釋后的酶液用20倍體積的蒸餾水透析24h后，酶液采用真空冷凍干燥機(jī)，4"C下濃縮酶液至固體，并冷凍干燥，得所述乙酸萘酯酶?；蛘?，所述方法按如下順序步驟進(jìn)行a)將含有乙酸萘酯酶的植物種子去皮磨粉，04。C下、用10倍質(zhì)量的蒸餾水浸泡15h,取上清液4500r.p.m、04。C離心，取上清液，得酯酶粗提液；b)水浴條件下，往酯酶粗提液中加入石克酸銨，使酶液中碌u酸銨飽和度為50%，再于4500r.p.m、04。C離心，取沉淀，用pH6.38的磷酸緩沖液稀釋4倍，得稀釋后的酶液；c)將稀釋后的酶液用20倍體積的蒸餾水透析24h后，酶液裝入透析袋中，用聚乙二醇6000作干燥劑，用量為4mL/g酶液，4。C下濃縮酶液，得所述乙酸萘酯酶。乙酸萘酯酶可以使乙酸-a-萘酯水解為萘酚和乙酸，萘酚與顯色劑固藍(lán)B鹽作用形成紫紅色的偶氮化合物。當(dāng)樣品溶液中依次加入酶片和底物后，若樣品中不含有機(jī)磷農(nóng)藥，則酶催化底物乙酸-a-萘酯迅速分解，樣品溶液很快變?yōu)樽霞t色；若樣品中含有機(jī)磷農(nóng)藥時(shí)，酶被有機(jī)磷農(nóng)藥抑制，催化能力下降或喪失，底物分解變慢或不分解，樣品顏色變化緩慢或不發(fā)生變化，根據(jù)樣品顏色的變化情況可判斷樣品中是否含有有機(jī)磷農(nóng)藥或其含量的情況。本發(fā)明所提供的乙酸萘酯酶提取方法，其原料來源廣泛，制備工藝簡(jiǎn)單穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，提取酶后的副產(chǎn)物無毒無害，可作其它原料用。經(jīng)測(cè)定，產(chǎn)品用于對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，具有很高的靈敏度。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1:從小麥粉中提取乙酸萘酯酶的步驟如下(1)將小麥粉在4。C用蒸餾水浸泡15h,小麥粉與水的質(zhì)量比為1:10,耳又其上清液；所得的上清液以4500r.p.m,0-4。C離心，耳又其上清液，即得酯酶粗提液；(2)在冰浴中，緩慢攪拌酯酶粗提液中，并加入石克酸銨，使酶液中硫酸銨的飽和度約為50%;上述所得溶液于4500r.p,m,04。C冷凍離心，保留沉淀；加入pH6.38的磷酸緩沖溶液溶解沉淀，并用pH6.38的磷酸緩沖溶液稀釋4倍；(3)將上步經(jīng)過碌u酸銨沉淀的酶液裝入透析袋中，用其體積20倍的蒸餾水透析24h,其間換水5次，直至用1。/。BaCl2無法測(cè)出硫酸根為止；植物植酶的濃縮用真空冷凍干燥機(jī)，在4t:條件下濃縮酶液至固體，并冷凍干燥，所得的酯酶制品密封后在冰箱冷藏中保存。測(cè)定樣品從小麥粉中提取的酯酶。測(cè)定方法取lmL稀釋后的酶液到試管中(酶液濃度為50mg/L),加入lmlpH=6.38的樣品溶液，放在35。C的水浴中10min,加入lml顯色基質(zhì)溶液(l:9的1250mg/L乙酸-a-萘酯乙醇溶液與1562mg/L固藍(lán)B鹽水溶液)。反應(yīng)10min后，觀察顏色變化，呈紫紅色為樣品不含有機(jī)磷農(nóng)藥，顏色由淺至深，樣品所含有才幾^疇農(nóng)藥量由多至少。所提取出的酶能夠促使下列反應(yīng)發(fā)生，因此提取出的酶為乙酸萘酯酶。"-乙酸萘酯+水~^~>"-萘酚+乙酸"-萘酚+固藍(lán)鹽B—顯色產(chǎn)物+氯化鋅+氯化氫測(cè)定結(jié)果用分光光度法，由此酶液直接測(cè)定水中有機(jī)磷農(nóng)藥的檢出限為曱胺磷0.03mg/L;敵敵畏0.0008mg/L;樂果0.16mg/L;馬拉碌u磷4.5mg/L;辛硫磷8mg/L。按照上述提取方法及測(cè)定方法，改變步驟(l)中蒸餾水浸泡時(shí)間、或測(cè)定時(shí)磷酸緩沖溶液的pH值、或測(cè)定時(shí)的水浴溫度，以反應(yīng)時(shí)間(單位為分鐘)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖得到的斜率可反映出酶活性的大??；一、用小麥粉在4'C用蒸餾水浸泡0.5h后提取出的酶，測(cè)得的斜率為0.028;而浸泡15h后提取出的酶，測(cè)得的斜率為0.046,可知浸泡15h所得的產(chǎn)物酶活要高于浸泡0.5h所得的產(chǎn)物。二、pH值與酶活間的關(guān)系(見表l):表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表1可知，在反應(yīng)液pH值為6.38時(shí)乙酸萘酯酶的酶活為最高，因此在提取過程中優(yōu)選采用pH6.38的磷酸緩沖液進(jìn)行沉淀和稀釋，以使獲得乙酸萘酯酶的酶活最大化，同時(shí)制得的乙酸萘酯酶可直接用于測(cè)定，無需再調(diào)pH,簡(jiǎn)化了操作。三、溫度與酶活間的關(guān)系(見表2):表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表2可知，在35。C下進(jìn)行測(cè)定，酶活最高。實(shí)施例2:從蕎麥粉中提取乙酸萘酯酶的步驟如下(1)將蕎麥粉在4。C用蒸餾水浸泡15h，粉末與水的質(zhì)量比為1:10,棄去沉淀，取其上清液；所得的上清液以4500r.p.m,04。C離心，取其上清液，即得酯酶粗提液。(2)在水浴中，緩慢攪拌酯酶粗提液中，并加入硫S吏銨，使酶液中硫酸銨的飽和度在50%的范圍內(nèi)；上述所得溶液于4500r.p.m,0-4。C冷凍離心，保留沉淀；加入pH6.38的磷酸緩沖溶液溶解沉淀，并用pH6.38的磷酸緩沖溶液稀釋4倍；(3)將上一步經(jīng)過碌u酸銨沉淀的酶液裝入透析袋中，用其體積20倍的蒸餾水透析24h，其間換水5次，直至用1。/。BaCl2無法測(cè)出硫酸根為止；采用透析法濃縮酶液，將酶液裝入透析袋中，用聚乙二醇6000作干燥劑，用量為4mL/g，在4。C條件下濃縮酶液，所得的植物酯酶制品密封后在冰箱冷藏中保存。所提取出的酶能夠促使下列反應(yīng)發(fā)生，因此提取出的酶為乙酸萘酯酶。"-乙酸萘酯+水"-萘酚+乙酸"-萘酚+固藍(lán)鹽B—顯色產(chǎn)物+氯化鋅+氯化氫n權(quán)利要求1.一種乙酸萘酯酶的提取方法，所述方法包括如下順序步驟(1)將含有乙酸萘酯酶的植物種子去皮磨粉，0～4℃下、用8～15倍質(zhì)量的蒸餾水浸泡12～18h，取上清液2000～6000r.p.m、0～4℃離心，取上清液，得酯酶粗提液；所述含有乙酸萘酯酶的植物種子來自下列之一的作物①小麥、②蕎麥、③黃豆、④玉米、⑤水稻、⑥大麥；(2)冰浴條件下，往酯酶粗提液中加入硫酸銨，使酶液中硫酸銨飽和度為50～75％，再于3000～5000r.p.m、0～4℃離心，取沉淀，用pH6～7的磷酸緩沖液稀釋2～10倍，得稀釋后的酶液；(3)將稀釋后的酶液用10～30倍體積的蒸餾水透析，直至不產(chǎn)生沉淀為止，酶液再經(jīng)濃縮、干燥，得所述乙酸萘酯酶。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中蒸餾水浸泡時(shí)間為15h。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中所用磷酸緩沖液pH值為6.38。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中濃縮步驟為采用真空冷凍干燥機(jī)，04。C下濃縮酶液至固體。5.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中濃縮步驟為將酶液裝入透析袋中，用聚乙二醇6000做干燥劑，4。C下濃縮至體積為濃縮前酶液體積的1/5-1/3。6.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述方法按如下順序步驟進(jìn)行:(1)將含有乙酸萘酯酶的植物種子去皮磨粉，04。C下、用IO倍質(zhì)量的蒸餾水浸泡15h,取上清液4500r.p.m、04。C離心，取上清液，得酯酶粗提液；(2)冰浴條件下，往酯酶粗提液中加入硫酸銨，使酶液中石克酸銨飽和度為50%,再于4500r.p.m、04。C離心，取沉淀，用pH6.38的磷酸緩沖液稀釋4倍，得稀釋后的酶液；(3)將稀釋后的酶液用20倍體積的蒸餾水透析24h后，酶液采用真空冷凍干燥機(jī)，4。C下濃縮酶液至固體，并冷凍干燥，得所述乙酸萘酯酶。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法按如下順序步驟進(jìn)行(1)將含有乙酸萘酯酶的植物種子去皮磨粉，04。C下、用IO倍質(zhì)量的蒸餾水浸泡15h，取上清液4500r.p.m、04。C離心，取上清液，得酯酶粗提液；(2)冰浴條件下，往酯酶粗提液中加入硫酸銨，使酶液中硫酸銨飽和度為50%,再于4500r.p.m、04。C離心，取沉淀，用pH6.38的磷酸緩沖液稀釋4倍，得稀釋后的酶液；(3)將稀釋后的酶液用20倍體積的蒸餾水透析24h后，酶液裝入透析袋中，用聚乙二醇6000作干燥劑，用量為4mL/g酶液，4。C下濃縮酶液至體積為濃縮前酶液體積的1/5~1/3,得所述乙酸萘酯酶。全文摘要本發(fā)明提供了一種乙酸萘酯酶的提取方法，所述方法包括如下順序步驟(1)將植物種子去皮磨粉，0～4℃下、用蒸餾水浸泡12～18h，取上清液離心，取上清液，得酯酶粗提液；(2)冰浴條件下，往酯酶粗提液中加入硫酸銨，使酶液中硫酸銨飽和度為50～75％，再于離心，取沉淀，用pH6～7的磷酸緩沖液稀釋2～10倍，得稀釋后的酶液；(3)將稀釋后的酶液用蒸餾水透析，直至不產(chǎn)生沉淀為止，酶液再經(jīng)濃縮、干燥，得所述乙酸萘酯酶。本發(fā)明所提供的乙酸萘酯酶提取方法，其原料來源廣泛，制備工藝簡(jiǎn)單穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，提取酶后的副產(chǎn)物無毒無害，可作其它原料用。經(jīng)測(cè)定，產(chǎn)品用于對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，具有很高的靈敏度。文檔編號(hào)C12N9/16GK101148660SQ20071007120公開日2008年3月26日申請(qǐng)日期2007年9月6日優(yōu)先權(quán)日2007年9月6日發(fā)明者嚴(yán)航貞,劉維屏,璟葉,張安平,張宏華,苗優(yōu)娜,趙美蓉申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)