專利名稱：Mrpink在抑制羅氏沼蝦精子活性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及羅氏沼蟲下雄性生殖系統(tǒng)特異性Kazal型蛋白酶抑制劑 MRPINK在抑制羅氏沼蚱精子活性中的應(yīng)用。
(二) 背景^支術(shù)
生物的性別、生殖現(xiàn)象是生物學(xué)研究的主要內(nèi)容之一，它涉及到許多 重大的生物學(xué)問題，比如性別決定、遺傳、發(fā)育和進(jìn)化等，因此歷來倍受 關(guān)注。目前對于性別、生殖的分子機(jī)制研究主要集中在人類和模式生物中， 而對于一般水生生物這方面的研究很少，尤其在甲殼類中，已知的相關(guān)分 子信息更加缺乏。
蝦類作為具有重要經(jīng)濟(jì)價值的水生生物，在分子水平的研究開展得相 對較少，因此，大量獲取水生動物性別和生殖相關(guān)基因資源來研究它們的 生殖生物學(xué)、遺傳育種等顯得尤為必要。壞類同齡雌雄性別個體的大小、 生長速度相差懸殊，性別與生殖制約著它們的產(chǎn)值。若能培育出單性蝦， 并進(jìn)行單性化養(yǎng)殖可以大幅度提高上市商品規(guī)格和養(yǎng)殖產(chǎn)量，因此壞類性 別控制一直是遺傳育種研究的熱點之一。目前有關(guān)這方面的認(rèn)識僅僅局限 在形態(tài)結(jié)構(gòu)和一般的組織化學(xué)、生化成份和基本的生理指標(biāo)，在基因水平 的認(rèn)識和可操作性則幾乎為零。
(三)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明則是通過對羅氏沼蝦雄性生殖相關(guān)基因進(jìn)行克隆、表達(dá)特征分 析以及定位功能等研究，提供了羅氏沼蝦雄性生殖系統(tǒng)特異性Kazal型蛋
白酶抑制劑MRPINK在抑制羅氏沼壞精子活性中的應(yīng)用。 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
羅氏沼壞雄性生殖系統(tǒng)特異性Kazal型蛋白酶抑制劑MRPINK在抑 制羅氏沼奸精子活性中的應(yīng)用。(有關(guān)MRPINK的相關(guān)介紹參見文獻(xiàn) Cao JX， Dai JQ， Dai ZM， Yin GL and Yang WJ. A male-reproduction-related kazal-type peptidase inhibitor gene in the prawn, Macra6rac/z/wm rase"6ergz7: molecular characterization and expression patterns. Marine Biotechnology. 2007， 9: 45~55.)
所述 MRPINK 的 cDNA 序列 如下
TAGTTCACGAAGGCGAATGTAAGCAAGACTACTGCGCCCCGGTAG
AGACTGAAGTATGGTAGCGAGGTGGTGACTGTTGGAAATAGACCA
TTACGTGAGTGAAAACGGCGATATATGAATATGTTCCATCAATCAA具體的，所述應(yīng)用為以MRPINK制備精子活性抑制劑，用于羅氏 沼奸精子凍存。
優(yōu)選的，所述精子活性抑制劑為MRPINK。所述MRPINK的氨基酸 序 列 如 下
MKLYIFTFCLAASILVGFSSGEYRFLVSPLCPVRCTLRYIPVCGSDGRTY
DGQTYLNECFAKVAACGFPNLKIVHSGLCGPRPKTEVW 。
選取羅氏沼蝦幾乎全組織，包括肌肉、肝胰腺、心臟、鰓、胃、血
細(xì)胞、雄性生殖系統(tǒng)、卵巢、腦、中樞神經(jīng)、脂肪體、眼柄、腸和腹
部神經(jīng)進(jìn)行Northern blotting分析，結(jié)果表明MRPINK基因僅表達(dá)在雄性
生殖系統(tǒng)，而且在輸精管中的表達(dá)占主導(dǎo)地位，其次是末端壺腹，在精巢
中的表達(dá)并不是4艮高。
到，此后其表達(dá)出現(xiàn)，但表達(dá)量隨著羅氏沼蝦逐漸生長發(fā)育并無明顯變化。 MRPINK基因的表達(dá)在羅氏沼蝦的不同生長發(fā)育時期呈現(xiàn)恒定趨勢，表 明這一基因更多的與維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和整個組織的完整性相關(guān)，而不是調(diào) 控精子形成或形態(tài)分化的特異階段。
運(yùn)用原位雜交的實驗手段在細(xì)胞水平上斥企測了 MRPINK在羅氏沼蝦 雄性生殖系統(tǒng)中的定位，發(fā)現(xiàn)這MRPINK基因的mRNA僅表達(dá)在輸精管 和末端壺腹的內(nèi)壁上皮分泌細(xì)胞中。這一特異性的定位暗示著它可能在精
子自身保護(hù)、生殖系統(tǒng)中蛋白酶降解及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等過程中發(fā)揮功能。
MRPINK基因的表達(dá)在羅氏沼蝦生長發(fā)育時期呈現(xiàn)恒定趨勢且僅在 輸精管和末端壺腹的內(nèi)壁上皮分泌細(xì)胞中有表達(dá),表明這一基因在精子自 身保護(hù)、生殖系統(tǒng)中蛋白酶降解及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等過程中發(fā)揮了重要功 能。MRPINK是蛋白酶抑制劑，參與維持雄性生殖系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定， 對精子的生理成熟和活力維持可能有十分重要的意義。在我們的研究中發(fā) 現(xiàn)，在羅氏沼蝦的精子中添加MRPINK能有效的抑制精子活性。
人類精子庫已應(yīng)用于臨床治療，但是作為生育能力的儲備形式仍然有 很大的局限性。目前人類精子儲存的辦法是將精子凍存在裝有液態(tài)氮的大 罐子中，在超低溫情況下保持精子自身能量不被消耗。但在精子冷凍和復(fù) 蘇過程中，溫度的變化會對精子產(chǎn)生生物物理損傷和化學(xué)損害，使精子細(xì) 胞膜水、電介質(zhì)濃縮、紊亂、使不穩(wěn)固的類脂蛋白變性、以及機(jī)械性破壞 從而影響精子的生命活力。此外，精子冷凍的價格非常昂貴，需要一套嚴(yán) 格的控制系統(tǒng)，以避免出現(xiàn)差錯。
在精子的凍存中添加類似的蛋白酶抑制劑，抑制精子內(nèi)酶活性，使精 子不活化，對精子的低溫儲存具有重要的借鑒意義。 具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍 并不僅限于此
實施例l: MRPINK基因及其編碼的蛋白質(zhì)的獲得
具體可參見文獻(xiàn)Cao JX， Dai JQ， Dai ZM, Yin GL and Yang WJ. A male-reproduction-related kazal-type peptidase inhibitor gene in the prawn， Afocra6rac/z/簡 ra5^w6ergz7: molecular characterization and expression
patterns. Marine Biotechnology. 2007, 9: 45~55.
① 取羅氏沼蝦雄性和雌性生殖系統(tǒng)組織，按Trizol試劑盒說明抽提總 腦A;
② 建立羅氏沼蝦雄性生殖系統(tǒng)SSHcDNA文庫，篩選差異性表達(dá)的基因 片段
A. 第一條鏈的合成按Oligotex mRNA Kits法，提取PolyA+RNA,以 PolyA+RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA。
B. 雙鏈(dscDNA)的合成，Rsal酶消化產(chǎn)生平末端。
C. 接頭連接把RsaI酶切后雄性組織ds cDNA分成兩份，分別加上接 頭1 ( Adaptor 1)和接頭2 (Adaptor 2) , 16。C連接過夜，形成兩組檢測 子(Tester )。
D. 消減雜交
第一，分別將Tester 1和Tester 2的連接產(chǎn)物與Rsal酶消化的過量驅(qū)動子 (Driver) ds cDNA混合，在98。C下熱變性，然后在65 68。C下放置10 小時使Tester和Driver的cDNA進(jìn)行充分地雜交。檢測子單鏈cDNA片 段被均化，即平均高、低豐度的cDNA濃度，使其基本相等。 第二，將第一次雜交的產(chǎn)物混勻到一起，然后在68。C繼續(xù)放置過夜(約 16小時)，使Tester 1和Tester 2之間的目的差異cDNA形成異源雜交子。
E. 巢氏PCR擴(kuò)增差異表達(dá)的cDNA 。
F. 篩選差異性文庫PCR產(chǎn)物經(jīng)連接轉(zhuǎn)化到TOPO10載體上，構(gòu)建差異 表達(dá)基因富集的cDNA文庫，篩選差異性表達(dá)的基因。
③ 全長cDNA的獲得
利用FirstChoice RLM-RACE kit合成5，和3'RACE,分別得到487bp 的5'端和270bp的3，端，拼接完成后獲得全長cDNA，命名為MRPINK基
因。
MRPINK cDNA序列如下:
TAGTTCACGAAGGCGAATGTAAGCAAGACTACTGCGCCCCGGTAG
ATCAAGTTCTGATCGGCTGTGTACTAATAACTTCGTACATATGGCC
ATATTGGAGGTTTCTGAGATACGCCCAGTTGTCTATTACATCTGAA
MRPINKcDNA全長736bp,編碼區(qū)405bp, 5'和3，非翻譯區(qū)長度分 別是72bp和247bp,其中3，非翻譯區(qū)具有多聚腺普酸信號。該基因已遞 交到GenBank,其序列號為AY885242。
MRPINK氨基酸序列如下 MKLYIFTFCLAASILVGFSSGEYRFLVSPLCPVRCTLRYIPVCGSDGRTY GNKCJLDNARLCDNSNVQVVHEGECKQDYCAPVVRCPPVIKAVCAN
DGQTYLNECFAKVAACGFPNLKIVHSGLCGPRPKTEVW。
它編碼135個氨基酸，分子量約14.7kDa，推演的氨基酸序列中具有
兩個Kazal型domain,且含有21個氨基酸的信號肽。
MRPINK和已知的Kazal型蛋白酶抑制劑在氨基酸序列上的同源性
為16~32%，其Kazal型domain序列上有19~52%的同源性，表明這個蛋
白屬于Kazal家族中的成員。MRPINK作為蛋白酶抑制劑，與已知哺乳動
物蛋白酶抑制劑可能具有相似的功能。
實施例2: MRPINK對羅氏沼奸的精子活性的抑制作用 明膠底物實驗
羅氏沼蝦精子(挑選成熟雄性羅氏沼奸，摘取壺腹磨碎，離心，計數(shù)， 使精子濃度為lx106 cells/ml)用MRPINK(2 mg/ml) 28°C預(yù)處理lh;未 經(jīng)MRPINK處理的羅氏沼蝦精子作為對照組；將處理后樣品涂于已含明 膠(終濃度為5%)的玻片上，37-C孵育過夜，相差顯微鏡(400x)下觀察。
實驗結(jié)果表明95%羅氏沼蝦精子會降解明膠形成暈輪(圖l-A),經(jīng) MRPINK處理的精子不能降解明膠形成暈輪(圖l-B), MRPINK能有效 抑制羅氏沼蝦精子降解明膠的活性。由此說明，MRPINK對羅氏沼蝦的 精子活性有抑制作用。
序列表—ST25
SEQUENCE LISTING
〈110〉浙江大學(xué)
〈120〉 MRPINK在抑制羅氏沼蝦精子活性中的應(yīng)用
〈130〉
〈160〉 2
〈170> Patentln version 3. 4
<210〉 1
<211〉 736
〈212> 腿
〈213> Macrobrachium rosenbergii
<400> 1
eigttg3C3gactgccagcttcctgtgcagaattctgaacgataggcttaggtaagacctc60
acaactagcaaaatgaaactgtacatcttcaccttctgcctagccgcgtcaattctcgtc120
gggttt"tcatctggggaataccgcttcct1:gtctctccactgtgccccgtacgttgtact180
ctgaggtacatccctgtctgtggcagcgacggccgaacgtacggga^c犯atgtcacctg240
gacaatgcacgtctctgtgacaacagcaatgttcaggtagttcacgaaggcgaatgt犯g300
caagactactgcgccccggtagtccgctgcccaccggtcataaaagccgtatgtgccaac360
gacggccaaacatacttgaacgagtgtttcgccaaagtcgcagcctgcggattccctaac420
ctgaagatagtccacagcggattatgtggtcctagaccaaagactgaagtatggtagcga480
ggtggtgactgttggaaatagaccattacgtgagtgaaaacggcgata化tgaatatgtt540
ccatcaatcaaatcaagttctgatcggctgtgtactaataacttcgtacatatggccttc600
tttcaagttctcctgatttccaccagatttattatatttttatggatsttggaggtttct660
cagttgtctattacatctgagatcaataaagcctttgtaa720
cagg犯aaa3736
<210〉 2 <211〉 134 <212> PRT
〈213> Macrobrachium rosenbergii
<400〉 2
Met Lys Leu Tyr lie Phe Thr Phe Cys Leu Ala Ala Ser lie Leu Val 15 10 15
Gly Phe Ser Ser Gly Glu Tyr Arg Phe Leu Val Ser Pro Leu Cys Pro 20 25 30
Val Arg Cys Thr Leu Arg Tyr lie Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Arg 35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Lys Cys His Leu Asp Asn Ala Arg Leu Cys Asp Asn 50 55 60
Ser Asn Val Gin Val Val His Glu Gly Glu Cys Lys Gin Asp Tyr Cys 65 70 75 80
Ala Pro Val Val Arg Cys Pro Pro Val lie Lys Ala Val Cys Ala Asn 85 90 95Asp Gly Gin Thr Tyr Leu Asn Glu Cys Phe Ala Lys Val Ala Ala Cys 100 105 110
Gly Phe Pro Asn Leu Lys lie Val His Ser Gly Leu Cvs Gly Pro Arg 115 120
Pro Lys Thr Glu Val Trp 130
權(quán)利要求
1.羅氏沼蝦雄性生殖系統(tǒng)特異性Kazal型蛋白酶抑制劑MRPINK在抑制羅氏沼蝦精子活性中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述MRPINK的cDNA序列如 下AGTTGACAGACTGCCAGCTTCCTGTGCAGAATTCTGAACGATAGGCTTAGGTAAGACCTCACAACTAGCAAAATGAAACTGTACATCTTCACCTTCTGCCTAGCCGCGTCAATTCTCGTCGGGTTTTCATCTGGGGAATACCGCTTCCTTGTCTCTCCACTGTGCCCCGTACGTTGTACTCTGAGGTACATCCCTGTCTGTGGCAGCGACGGCCGAACGTACGGGAACAAATGTCACCTGGACAATGCACGTCTCTGTGACAACAGCAATGTTCAGGTAGTTCACGAAGGCGAATGTAAGCAAGACTACTGCGCCCCGGTAGTCCGCTGCCCACCGGTCATAAAAGCCGTATGTGCCAACGACGGCCAAACATACTTGAACGAGTGTTTCGCCAAAGTCGCAGCCTGCGGATTCCCTAACCTGAAGATAGTCCACAGCGGATTATGTGGTCCTAGACCAAAGACTGAAGTATGGTAGCGAGGTGGTGACTGTTGGAAATAGACCATTACGTGAGTGAAAACGGCGATATAACCAGATTTATTATATTTTTATGGATATTGGAGGTTTCTGAGATA CGCCCAGTTGTCTATTACATCTGAAGAAAAACTTGATCAATAAA GCCTTTGTAACAGGAAAAAAAAAA AA 。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為以MRPINK制備 精子活性抑制劑，用于羅氏沼蝦精子凍存。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述精子活性抑制劑為 MRPI服。
5. 如權(quán)利要求1~4之一所述的應(yīng)用，其特征在于所述MRPINK的氨基酸 序 列 如 下 MKLYIFTFCLAASILVGFSSGEYRFLVSPLCPVRCTLRYIPVCGSDGRTANDGQTYLNECFAKVAACGFPNLKIVHSGLCGPRPKTEVWc
全文摘要
本發(fā)明提供了羅氏沼蝦雄性生殖系統(tǒng)特異性Kazal型蛋白酶抑制MRPINK在抑制羅氏沼蝦精子活性中的應(yīng)用。在研究中發(fā)現(xiàn)，在羅氏沼蝦的精子中添加MRPINK能有效的抑制精子活性，使精卵不能受精。在精子的凍存中添加類似的蛋白酶抑制劑，抑制精子內(nèi)酶活性，使精子不活化，對精子的低溫儲存具有重要的借鑒意義。
文檔編號C12N5/08GK101366944SQ200710070808
公開日2009年2月18日 申請日期2007年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月16日
發(fā)明者曹俊霞, 楊衛(wèi)軍, 馬文明 申請人:浙江大學(xué)