家蠶基因及其在真核細胞中的表達和應用的制作方法

專利名稱：家蠶基因及其在真核細胞中的表達和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，特別是一種家蠶乙酰膽堿酯酶基因核苷酸序列，以該核苷酸序列編碼的多肽及其制備方法和應用。
背景技術：
乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE；Ace；EC3.1.1.7)是神經傳導中的一種關鍵酶，在膽堿能突觸間，該酶降解乙酰膽堿，終止神經遞質對突觸后膜的興奮作用，保證神經信號在生物體內的正常傳遞。它是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標。殺蟲劑與酶分子結合后，使酶磷酰化或氨基甲酰化，鈍化酶的活性而阻斷正常的神經傳導，使昆蟲致死。
1986年Hall和Spierer從黑腹果蠅中克隆到第一個昆蟲的乙酰膽堿酯酶基因，迄今為止已經報道了23種昆蟲和螨類的乙酰膽堿酯酶的基因序列。家蠶是重要的經濟昆蟲，是人類最早馴化的動物之一。也是繼果蠅和岡比亞按蚊之后第三個完成基因組測序的昆蟲。在長期的馴化過程中與農藥的接觸相對較少，關于家蠶乙酰膽堿酯酶基因的克隆和序列分析在國內外還未見報道。
桿狀病毒表達系統(Baculovirus expression vector system，BEVS)是20世紀80年代發展起來的真核表達系統，Smith等人在“Production ofhuman belta interferon in insect cells infected with baculovirus expressionvector”(《Mol Cell Biol》.19833，183-192.)公開的技術，利用AcMNPV，在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf-9細胞中成功地表達了β-干擾素。又有人利用BmNPV在家蠶幼蟲體內高水平表達了人的α-干擾素，目前日臻完善，已有數百種外源基因在該系統中進行了表達。Bac to Bac桿狀病毒表達系統是利用桿狀病毒穿梭載體Bacmid，它含有完整的AcMNPV基因組，既能在大腸桿菌中低拷貝復制和穩定分離，又可以直接轉染昆蟲細胞，得到病毒粒子。外源基因通過位點特異性轉座作用整合到Bacmid中，經過篩選重組Bacmid。直接轉染昆蟲細胞，得到純的重組病毒，同時高效表達外源基因，該系統具有快速穩定高效等特點。

發明內容
本發明提供了家蠶兩種類型乙酰膽堿酯酶的核苷酸序列及編碼的多肽序列及其表達和應用。
一種編碼家蠶乙酰膽堿酯酶基因的序列，具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
一種編碼家蠶乙酰膽堿酯酶基因的序列，具有序列表中SEQ ID No.2所述的核苷酸序列。
本發明首次克隆到編碼家蠶乙酰膽堿酯酶的兩個基因，分別為Bmace1和Bmace2。(具有序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所述的核苷酸序列)。Bmace1基因編碼區全長為2052bp，預計編碼683個氨基酸殘基，Signal P預測到一個17氨基酸殘基的信號肽。Bmace2編碼區長度為1917bp，編碼一個638個殘基的蛋白，預測有一個23個氨基酸殘基的信號肽。同時將兩個基因與電鰩，果蠅等其它昆蟲序列聯配的結果表明，克隆的兩個基因具有保守的催化三聯體，6個半胱氨酸殘基形成三對二硫鍵，保守的氧陰離子洞，保守的FGESAG基序。
本發明還提供了所述基因(Bmace1)編碼的多肽，該多肽具有序列表中SEQ ID No.3所述的氨基酸序列。
本發明還提供了所述基因(Bmace2)編碼的多肽，該多肽具有序列表中SEQ ID No.4所述的氨基酸序列。
本發明還提供了基因(Bmace1)編碼的多肽的制備方法，包括如下步驟(a)構建帶有目的基因的桿狀病毒轉移載體；(b)將桿狀病毒轉移載體轉化含有穿梭載體Bacmid的大腸桿菌DH10Bac，提取重組基因；(c)將重組基因轉染粉紋夜蛾細胞，培養后收獲細胞，分離出多肽。
本發明還提供了基因(Bmace2)編碼的多肽的制備方法，包括如下步驟
(a)構建帶有目的基因的桿狀病毒轉移載體；(b)將桿狀病毒轉移載體轉化含有穿梭載體Bacmid的大腸桿菌DH10Bac，提取重組基因；(c)將重組基因轉染粉紋夜蛾細胞，培養后收獲細胞，分離出多肽。
本發明還提供了基因(Bmace1)和基因(Bmace2)編碼的多肽在農藥篩選中的應用。
本發明中的“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來；還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語“家蠶乙酰膽堿酯酶蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有家蠶乙酰膽堿酯酶蛋白(或多肽)的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與家蠶乙酰膽堿酯酶相同功能的蛋白的序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5’和/或3’端添加數個核苷酸。
在本發明中，術語“家蠶乙酰膽堿酯酶蛋白多肽”指具有家蠶乙酰膽堿酯酶蛋白活性的多肽。該術語還包括具有與家蠶乙酰蛋白膽堿酯酶蛋白相同功能的序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括家蠶乙酰膽堿酯酶蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體，誘導突變體，在高或低的嚴謹度條件下能與家蠶乙酰膽堿酯酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白，以及利用抗家蠶乙酰膽堿酯酶多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發明中，術語“宿主細胞”為真核細胞，包括酵母細胞，昆蟲細胞和哺乳動物細胞，優選宿主細胞是真核細胞，如Tn細胞、Sf細胞等。
本發明首次克隆得到家蠶的乙酰膽堿酯酶基因，為家蠶乙酰膽堿酯酶的雙基因編碼提供了直接的證據，且公開家蠶乙酰膽堿酯酶的基因組序列，是鱗翅目昆蟲中第一個明確基因結構的昆蟲。家蠶是一種馴養了5000多年的模式昆蟲，因此家蠶乙酰膽堿酯酶基因具有特別的用途。
本發明在昆蟲細胞中表達了鱗翅目的兩種類型的乙酰膽堿酯酶，制備了具有生物活性的基因工程鱗翅目乙酰膽堿酯酶，可以直接用于農藥的篩選，為針對農業最重要類群的害蟲即鱗翅目害蟲的殺蟲劑設計和新農藥離體篩選提供了便捷途徑，在新農藥篩選前期可省去了培養鱗翅目昆蟲的大量費用和時間。


圖1為Bmace1基因在Tn細胞里的表達(A)和Western blot分析(B)(A)Marker標準蛋白樣品；泳道TnTn細胞對照；泳道Bacmid感染對照病毒Bacmid的Tn細胞；泳道Bmace1感染含Bmace1基因的重組病毒的Tn細胞抽提物，箭頭表示表達的Bmace1蛋白條帶(B)泳道Bmace1感染含Bmace1基因的重組病毒的Tn細胞抽提物，箭頭表示用Bmace1抗體檢測出的Bmace1蛋白印跡。
圖2為Bmace2基因在Tn細胞中的表達(A)和Western標blot分析(B)(A)Marker標準蛋白樣品；泳道TnTn細胞對照；泳道Bacmid感染對照病毒Bacmid的Tn細胞；泳道Bmace2感染含Bmace2基因的重組病毒的Tn細胞抽提物，箭頭表示表達的Bmace2蛋白條帶。
(B)泳道TnTn細胞對照；泳道Bacmid感染對照病毒Bacmid的Tn細胞；泳道Bmace2感染含Bmace2基因的重組病毒的Tn細胞抽提物，箭頭表示用Bmace1抗體檢測出的Bmace1蛋白印跡。
具體實施例方式
家蠶乙酰膽堿酯酶的cDNA的克隆和測定以家蠶總RNA反轉錄得cDNA為模版，用兩對寡核苷酸為引物，其中正向引物含有Bgl II酶切位點，反向引物含有Xho I酶切位點。
其中
利用引物BmAce1 Forward5-AGATCTATGCGCGTGGTGTTGGCABmAce1 Reverse5-CTCGAGTTATATGGTGTATTTGAACAGTGC擴增得到1型家蠶乙酰膽堿酯酶基因，編碼區全長為2052bp，稱為Bmace1基因(SEQ ID No.1)，預計編碼683個氨基酸殘基，Signal P預測到一個17氨基酸殘基的信號肽。
利用引物BmAce2 Forward5’-AGATCTATGATCAACTACGGCAAGBmAce2 Reverse5’-CTCGAGTTACAAAGCAATAGTGATTGCCA擴增得到2型家蠶乙酰膽堿酯酶基因，編碼區長度為1917bp，稱為Bmace2基因(SEQ ID No.2)，編碼一個638個殘基的蛋白，預測有一個23個氨基酸殘基的信號肽。
通過RT-PCR，分別用兩對引物擴增出兩條片段。將PCR擴增產物與pGEM-T Easy載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌TG1用堿法提取質粒，進行測序。
家蠶兩種類型乙酰膽堿酯酶基因在真核細胞(Tn細胞株，即粉紋夜蛾細胞株)中的表達將帶有家蠶1型(Bmace1)和2型(Bmace2)乙酰膽堿酯酶基因的質粒pGEM-T-easy載體分別用Bgl II+Xho I進行雙酶切，分別回收大小為2052bp和1917bp的片段，并分別與用BamH I+Xho I雙酶切的載體pFASTBac1進行連接反應，連接產物轉化TG1，經堿法抽取質粒DNA，并通過PCR驗證，PCR片段與理論大小相符，說明桿狀病毒轉移載體構建成功。轉移載體分別命名為pFastBac1-Bmace1和pFastBac1-Bmace2。
用重組轉移載體pFastBac1-Bmace1和pFastBac1-Bmace2分別轉化含有穿梭載體Bacmid的大腸桿菌DH10Bac，挑取發生轉座作用生成的白色菌落，提取重組Bacmid DNA，并作PCR分析鑒定，得到了整合位點正確的分別含有Bmace1和Bmace2基因的重組桿狀病毒Bacmid載體。
在無血清條件下用Lipofectin介導重組Bacmid DNA轉染生長狀態良好的粉紋夜蛾細胞，8h后換新鮮培養基(含10％胎牛血清)，72h后取10μL含病毒粒子的培養液繼續傳代感染。連續4～5次傳代感染后，收獲細胞，3000r/min離心3min，棄上清，PBS緩沖液洗滌1～2次。1×PBS懸浮細胞，加等體積2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5min。同時與被感染Bamid的細胞同時收獲進行電泳SDS-PAGE分析。結果表明，感染含有Bmace1的重組病毒的Tn細胞抽提物在71kD左右出現特異性表達條帶。進一步對凝膠進行自動掃描分析表明，Bmace1表達量占總蛋白的15.2％(圖1)；感染含有Bmace2重組病毒的Tn細胞抽提物在66kD處有特異性的表達帶。凝膠進行自動掃描分析表明，Bmace2表達量占總蛋白的13％(圖2)。
表達產物的生物活性分析和在農藥測定中的利用以0.5mM的碘化硫代乙酰膽堿乙酰膽堿(acetylthiocholine iodide，ATCh)為底物測定了上述表達的Bmace1和Bmace2蛋白的酶的活性。Bmace1酶的活性為28.63nmol/min/mg.pro，Bmace2酶的活性為30.65nmol/min/mg.pro。
同時測定了兩種有機磷農藥抑制劑即對氧磷和毒扁豆堿對上述表達的Bmace1和Bmace2兩種類型的家蠶乙酰膽堿酯酶的抑制作用。與從活體幼蟲頭部抽提的粗酶液相比，表達產物對兩種抑制劑更為敏感。對氧磷農藥對粗酶液、Bmace1和Bmace2的抑制中濃度I50分別為9.8×10-7M、2.5×10-7M和0.6×10-7M，Bmace2比Bmace1更為敏感。毒扁豆堿的抑制也表現出同樣的趨勢，粗酶液、Bmace1和Bmace2的I50分別為4.8×10-7M、0.7×10-7M和0.2×10-7M。同時抑制結果也發現，毒扁豆堿對三種酶的抑制作用高于對氧磷。
結果說明本發明用真核細胞表達的Bmace1和Bmace2基因工程酶對有機磷農藥敏感，可以用于篩選有機磷農藥。本發明首先表達出具有生物活性的基因工程鱗翅目乙酰膽堿酯酶，為針對農業最重要類群的害蟲即鱗翅目害蟲的殺蟲劑設計和新農藥離體篩選提供了便捷途徑，在新農藥篩選前期可省去了培養鱗翅目昆蟲的大量費用和時間。
SEQUENCE LISTING<110>浙江大學<120>家蠶基因及其在真核細胞中的表達和應用<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2240<212>DNA<213>家蠶1型(Bmace1)乙酰膽堿酯酶基因<400>1caggcggtgt ttgtgggtgt aggtgccagc gacggtatgc gcgtggtgtt ggcagcgctg 60acggcgctgg cggcgcgcac ccttgccggt ccgcacgagc accgggcgag gcaccacgcg120cctgcgcctc cgcagcccta ccacggccac ggcgaggccg tccgatacaa ccccgaactc180gataccatcc taccaagact cgaagaccac gaaacttcgt ctaagcgcgc cagtgatgcg240gaaacttcgt ccaagagaac caagtatgag gagagatttt actctaatca cgaacgagcc300gcggagctca tggccgatga gccggtctca gaaaaaggag acgaagagga ccctctagtt360attcgcacta ggaaggggaa ggtgagagga attacgctga cttcagcaac tggaaagaag420gtcgatgcgt ggttcggaat cccttatgca caaaaaccta tgggcgattt gaggttcagg480cacccaagac cagtcgaaga ttggggcgat gaaattctta acacaacaac actgccacat540tcctgcgtcc aaatagttga cacggtattc ggtgactttc ccggagctat gatgtggaat600cccaatacag atatgcagga agattgtctt tatattaaca tagtgacacc tcgaccacgt660ccaaagaatg ctgcggttat gctatgggta tttgggggag gcttttattc cggtacagcc720
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85 90 95Pro Val Pro Ile Glu Pro Trp His Gly Val Leu Glu Ala Asn Leu Met100 105 110Pro Asn Ser Cys Tyr Gln Glu Arg Tyr Glu Tyr Phe Pro Gly Phe Glu115 120 125Gly Glu Glu Met Trp Asn Pro Asn Thr Asn Ile Ser Glu Asp Cys Leu130 135 140Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln His Leu Arg Val Arg His His Gln145 150 155 160Asp Lys Pro Leu Ala Glu Arg Pro Lys Val Pro Ile Leu Val Trp Ile165 170 175Tyr Gly Gly Gly Tyr Met Ser Gly Thr Ala Thr Leu Asp Leu Tyr Lys180 185 190Ala Asp Ile Met Ala Ser Thr Ser Asp Val Ile Val Ala Ser Met Gln195 200 205Tyr Arg Val Gly Ala Phe Gly Phe Leu Tyr Leu Asn Lys Tyr Phe Ser210 215 220Pro Gly Ser Glu Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Trp Asp Gln Gln225 230 235 240Leu Ala Ile Arg Trp Ile Lys Glu Asn Ala Arg Ala Phe Gly Gly Asp245 250 255Pro Glu Leu Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Gly Ser Val260 265 270Ser Leu His Met Leu Ser Pro Glu Met Lys Gly Leu Phe Lys Arg Gly275 280 285Ile Leu Gln Ser Gly Thr Leu Asn Ala Pro Trp Ser Trp Met Thr Gly290 295 300Glu Arg Ala Gln Asp Ile Gly Lys Val Leu Ile Asp Asp Cys Asn Cys305 310 315 320Asn Ser Ser Leu Leu Ala Lys Asp Pro Ser Leu Val Met Asp Cys Met
325 330 335Arg Gly Val Asp Ala Lys Thr Ile Ser Val Gln Gln Trp Asn Ser Tyr340 345 350Thr Gly Ile Leu Gly Phe Pro Ser Ala Pro Thr Val Asp Gly Ile Phe355 360 365Leu Pro Lys Asp Pro Asp Thr Met Met Lys Glu Gly Asn Phe His Asn370 375 380Ser Glu Val Leu Leu Gly Ser Asn Gln Asp Glu Gly Thr Tyr Phe Leu385 390 395 400Leu Tyr Asp Phe Leu Asp Tyr Phe Glu Lys Asp Gly Pro Ser Phe Leu405 410 415Gln Arg Glu Lys Phe Leu Glu Ile Val Asp Thr Ile Phe Lys Asp Phe420 425 430Ser Lys Ile Lys Arg Glu Ala Ile Val Phe Gln Tyr Thr Asp Trp Glu435 440 445Glu Ile Thr Asp Gly Tyr Leu Asn Gln Lys Met Ile Ala Asp Val Val450 455 460Gly Asp Tyr Phe Phe Val Cys Pro Thr Asn Tyr Phe Ala Glu Ile Leu465 470 475 480Ala Asp Ala Gly Val Asp Val Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Thr His Arg Thr485 490 495Ser Thr Ser Leu Trp Gly Glu Trp Met Gly Val Met His Gly Asp Glu500 505 510Met Glu Tyr Val Phe Gly His Pro Leu Asn Met Ser Leu Gln Tyr His515 520 525Ser Arg Glu Arg Asp Leu Ala Ala His Ile Met Gln Ser Phe Thr Gln530 535 540Phe Ala Leu Thr Gly Lys Pro His Lys Pro Asp Glu Lys Trp Pro Leu545 550 555 560Tyr Ser Arg Ser Ser Pro His Tyr Tyr Thr Tyr Thr Ala Val Gly Pro
565 570 575Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Arg Ala Ser Ala Cys Ala Phe580 585 590Trp Asn Asp Phe Leu Asn Lys Leu Asn Glu Leu Glu Arg Val Pro Cys595 600 605Asp Gly Ala Val Thr Gly Pro Tyr Ser Ser Val Ala Gly Thr Ala Leu610 615 620Pro Val Thr Leu Leu Thr Thr Leu Ala Ile Thr Ile Ala Leu625 630 63權利要求
1.一種編碼家蠶乙酰膽堿酯酶基因的序列，具有序列表中SEQ IDNo.1所述的核苷酸序列。
2.一種編碼家蠶乙酰膽堿酯酶基因的序列，具有序列表中SEQ IDNo.2所述的核苷酸序列。
3.如權利要求1所述基因編碼的多肽，該多肽具有序列表中SEQ IDNo.3所述的氨基酸序列。
4.如權利要求2所述基因編碼的多肽，該多肽具有序列表中SEQ IDNo.4所述的氨基酸序列。
5.如權利要求3所述的多肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟(a)構建帶有目的基因的桿狀病毒轉移載體；(b)將桿狀病毒轉移載體轉化含有穿梭載體Bacmid的大腸桿菌DH10Bac，提取重組基因；(c)將重組基因轉染粉紋夜蛾細胞，培養后收獲細胞，分離出多肽。
6.如權利要求4所述的多肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟(a)構建帶有目的基因的桿狀病毒轉移載體；(b)將桿狀病毒轉移載體轉化含有穿梭載體Bacmid的大腸桿菌DH10Bac，提取重組基因；(c)將重組基因轉染粉紋夜蛾細胞，培養后收獲細胞，分離出多肽。
7.如權利要求2或3所述的多肽在農藥篩選中的應用。
全文摘要
本發明公開了家蠶乙酰膽堿酯酶基因核苷酸序列，以及該核苷酸序列編碼的多肽及其制備方法和應用。本發明在昆蟲細胞中表達了鱗翅目的兩種類型的乙酰膽堿酯酶，制備了具有生物活性的基因工程鱗翅目乙酰膽堿酯酶，可以直接用于農藥的篩選，為針對農業最重要類群的害蟲即鱗翅目害蟲的殺蟲劑設計和新農藥離體提供了便捷途徑，在新農藥篩選前期省去了培養鱗翅目昆蟲的大量費用和時間。
文檔編號C12N1/21GK101041828SQ20071006741
公開日2007年9月26日 申請日期2007年3月2日 優先權日2007年3月2日
發明者尚金燕, 張傳溪, 陳艷霞, 袁剛, 王強, 唐振華 申請人:浙江大學