專利名稱：規模化昆蟲病原線蟲活體高倍培殖方法
技術領域：
本發明屬于林業生產技術領域。是一種規模化昆蟲病原線蟲活體 高倍培殖方法。
技術背景如今，地下害蟲和隱蔽性害蟲防治主要采用化學藥劑，但是該方 法易造成人畜中毒，還會污染環境。并且多次防治成本高，害蟲還容 易產生抗藥性。隨著人們對食品安全性要求的提高，以及對化學藥劑 可能給生態環境帶來潛在危機的考慮，篩選可替代化學藥劑的生物防治制劑成為迫切需要。當今已篩選出蘇云金桿菌(fe"77^ t力〃n'"^7'e/ 5^'51)、 白僵菌 (SeawKeria 力r。"卵ia )、 綠僵菌 (,e^rh'w'咖朋iso/ h'ae)等作為生物防治制劑，但防治一些地下害 蟲和隱蔽性害蟲效果不是很理想。而昆蟲病原線蟲 (&to節/ az^^e/7j'c Afefflat^/e)是昆蟲的專化寄生性天敵。以侵染 期蟲態(即三齡線蟲IJ)隨寄主食物或從昆蟲的肛門、氣孔、節間 膜進入昆蟲體內，隨后釋放其攜帶的共生細菌，這些共生細菌迅速繁 殖，使寄主昆蟲患敗血癥于48小時之內死亡。昆蟲病原線蟲是一種 很有潛能的生物防治因子。當今世界上有許多國家，如美國、澳大利 亞、新西蘭、德國、埃及等國家都投入大量的人力、物力研究利用這 種線蟲，致力于將線蟲產品銷售到世界各地。1994年據Lisansky & Coombs統計，在發達國家的生物農藥市場中，昆蟲病原線蟲這種新 型殺蟲劑的市場銷售額僅次于工業蘇云金芽胞桿菌，已經成功地應用 于防治林木、果樹、觀賞園林等隱蔽性害蟲和盆栽作物、經濟作物、 蔬菜和牧草、草坪等地下害蟲。所以昆蟲病原線蟲這種新型生物殺蟲 劑具有廣闊的應用前景，但所用線蟲數量極少，不能滿足市場需求。 因為昆蟲病原線蟲能夠大量培養繁殖，所以可以將其推廣應用。
雖然傳統的ffhite trap法繁殖得到的線蟲侵染力較高，但其規模遠 遠滿足不了當今市場的需求，廣東昆蟲研究所韓日疇采用人工離體繁 殖的方法，美國生產線蟲的發酵罐已從5升、20升到Biosys公司生 產斯氏線蟲15000升，生產異小桿線蟲7500升的規模，雖然線蟲產 量較高，但其致病力有所下降。 發明內容本發明的目的是提供一種規模化昆蟲病原線蟲活體高倍培殖方 法，是規模化大量高倍活體繁殖昆蟲病原線蟲，達到林業生產實踐中 生物防治蟲害的良好效果。本發明的關鍵技術是對已有的離體繁殖， 改為活體繁殖，使線蟲對林業害蟲的致病力明顯增強，并且產量與效 率較高，成本低，質量好，防治效果明顯提升。本發明采用培養介質接種侵染期線蟲后與寄主昆蟲混合裝入繁 殖袋中，將繁殖袋置于恒溫培養箱中培養，對培養參數進行優化，將 得到大量的昆蟲病原線蟲。a.介質與繁殖袋質地篩選寄主昆蟲采用黃粉蟲，培養介質選用價格便宜的蛭石。蛭石用自來水浸泡，洗干凈，然后在6(TC烘箱 中烘干至恒重。侵染前期準備.把1Kg蛭石裝在布袋中浸泡在蒸餾水桶中，完全 浸泡之后，取出布袋，掛起來，曬干直至布袋上不滴水，再稱布袋的 重量，計算蛭石含水量，即蛭石完全浸透所需水量。侵染將線蟲懸液，配成一定濃度的線蟲懸浮液。將一定濃度的線蟲懸浮液噴在蛭石上，使蛭石完全濕透，沒有水溢出為宜。布袋是17X26cm大小，布料質地有尼龍、純棉，設侵染每頭末 齡黃粉蟲的異小桿線蟲劑量為50條IJ、斯氏線蟲100條IJ。結果繁 殖袋采用純棉布制作的線蟲產量是尼龍袋的5倍。b.培養介質不滅菌寄主昆蟲、培養介質處理和侵染劑量同a 步，結果培養介質不滅菌的線蟲產量高于滅菌的1.25倍，所以考慮 到繁殖效率培養介質不必滅菌。c. 繁殖袋不用翻動寄主昆蟲、培養介質處理和侵染劑量同a 步，結果繁殖袋翻動與不翻動的線蟲產量相當，所以繁殖袋也不必翻動。d. 侵染劑量篩選寄主昆蟲與培養介質混合比例、收獲時間、繁殖袋大小進行正交組合試驗，寄主昆蟲和培養介質處理同a步，結 果寄主昆蟲(黃粉蟲)與培養介質(蛭石)混合比例是三比二；異小桿線蟲侵染劑量是800條侵染期線蟲/克黃粉蟲(斯氏線蟲侵染劑量 是1600條侵染期線蟲/克黃粉蟲)；繁殖袋大小選用17X26cm;異小 桿線蟲的收獲時間是培養12天時開始收獲，將布袋浸泡并收獲5次， 培養15天時再次收獲，將布袋浸泡并收獲3次(斯氏線蟲的收獲時 間是培養10天時開始收獲，將布袋浸泡并收獲5次，培養13天時再 次收獲，將布袋浸泡并收獲3次)；e. 收獲方法優化收獲后將線蟲懸浮液沉淀，移去上清液后再 用放在瓷盤上的面巾紙過濾除去雜質，可保持線蟲原有的致病力，并 且壽命比不過濾儲存的線蟲延長6倍。f. 規模化生產選擇以上篩選出的最佳培養參數，將繁殖袋懸掛在25"C裝有空調的房間里，每天觀察懸在繁殖袋上的彈簧秤的讀 數，以監控繁殖袋的失水量，當失水達到50%時，應用蒸餾水噴濕布 袋。最終獲取繁殖倍數高、質量好的線蟲。g.所用儀器設備DHP-9162A恒溫培養相(天津泰斯特)、 30405359相差顯微鏡(麥克奧迪)、S633069冷光源解剖鏡(麥克奧 迪)、Z18400微量移液器(上海)。
具體實施方式
本發明是黑龍江省科技廳科技攻關項目"丘陵黑土區水土保持林構建與流域綜合治理技術研究"(編號GA06B302-3 )中的部分內容。 我們于2006年3月至2007年6月在黑龍江省水土保持科學研究所 二龍山生態試驗站按以上步驟進行了規模化試驗性生產，供試樹種3 個，分別是小黑楊、:樟子松、落葉松。所有苗木均為1年生實生苗。 生產中獲取了昆蟲病原線蟲活體最佳高倍繁殖方法的成功，可解決 線蟲數量少不能應用于生產實踐的難題，經過試驗防治地下害蟲效 果達到80%以上，既獲得了經濟效益，又獲得了生態效益。本發明的使用材料分布廣，價格便宜，可降低成本。廣泛應用于 盆栽作物、經濟作物、蔬菜、牧草、草坪等地下害蟲防治和果樹、觀 賞園林等林木上隱蔽性害蟲防治，本發明將進一步提高昆蟲病原線蟲 的產量和質量，促進我國生物防治的發展。
權利要求
1.一種規模化生產昆蟲病原線蟲活體高倍培殖方法，其特征在于改目前的離體繁殖為活體繁殖，其步驟如下a.介質與繁殖袋質地篩選寄主昆蟲采用黃粉蟲，培養介質選用價格便宜的蛭石，蛭石用自來水浸泡，洗干凈，然后在60℃烘箱中烘干至恒重；侵染前期準備把1Kg蛭石裝在布袋中浸泡在蒸餾水桶中，完全浸泡之后，取出布袋，掛起來，曬干直至布袋上不滴水，再稱布袋的重量，計算蛭石含水量，即蛭石完全浸透所需水量；侵染將線蟲懸液，配成一定濃度的線蟲懸浮液，將一定濃度的線蟲懸浮液噴在蛭石上，使蛭石完全濕透，沒有水溢出為宜；布袋是17×26cm大小，布料質地選用純棉，設侵染每頭末齡黃粉蟲的異小桿線蟲劑量為50條IJ、斯氏線蟲100條IJ；b.培養介質不滅菌；c.繁殖袋不用翻動；d.侵染劑量篩選寄主昆蟲與培養介質混合比例、收獲時間、繁殖袋大小進行正交組合試驗，寄主昆蟲和培養介質處理同a步，寄主昆蟲(黃粉蟲)與培養介質(蛭石)混合比例為三比二；異小桿線蟲侵染劑量是800條侵染期線蟲/克黃粉蟲或斯氏線蟲侵染劑量是1600條侵染期線蟲/克黃粉蟲；繁殖袋大小選用17×26cm；異小桿線蟲的收獲時間是培養12天時開始收獲，將布袋浸泡并收獲5次，培養15天時再次收獲，將布袋浸泡并收獲3次，斯氏線蟲的收獲時間是培養10天時開始收獲，將布袋浸泡并收獲5次，培養13天時再次收獲，將布袋浸泡并收獲3次；e.收獲方法優化收獲后將線蟲懸浮液沉淀，移去上清液后再用放在瓷盤上的面巾紙過濾除去雜質；f.規模化生產選擇以上篩選出的最佳培養參數，將繁殖袋懸掛在25℃裝有空調的房間里，每天觀察懸在繁殖袋上的彈簧秤的讀數，以監控繁殖袋的失水量，當失水達到50％時，應用蒸餾水噴濕布袋。
全文摘要
本發明屬于林業生產技術領域。是一種規模化昆蟲病原線蟲活體高倍培殖方法。改目前的離體繁殖為活體繁殖，明顯提高了對農業害蟲的致病能力，并且產量與效率較高，成本低，質量好，防治效果明顯提升。本發明的使用材料分布廣，價格便宜，可降低成本。廣泛應用于林木、果樹、觀賞園林等隱蔽性害蟲防治和盆栽作物、經濟作物等地下害蟲防治上，本發明將進一步提高昆蟲病原線蟲產量和質量，促進我國生物防治的發展。
文檔編號C12N1/10GK101157893SQ200710056058
公開日2008年4月9日 申請日期2007年9月11日 優先權日2007年9月11日
發明者于澤波, 劉洪家, 王玉璽, 解運杰, 陳祥偉, 馬光波 申請人:中國科學院東北地理與農業生態研究所