專利名稱：固定化脂肪酶催化合成α－亞麻酸單甘油酯的方法
技術領域：
本發明屬于抗癌藥物原料的合成方法技術領域，特別涉及一種通過固定化脂肪酶法催化合成抗癌藥物原料α-亞麻酸單甘油酯的方法。
背景技術：
α-亞麻酸單甘油酯主要存在于中藥薏苡仁中。α-亞麻酸單甘油酯作為一種非細胞毒性抗癌物質，具有抑制腫瘤生長，調節機體免疫功能的作用。其作用環節主要是誘導細胞凋亡，并能逆轉耐藥的腫瘤細胞，與化療有協同作用。在臨床上，薏苡仁主要用于治療鼻咽癌。
α-亞麻酸單甘油酯傳統的制備方法是從原料藥薏苡仁中通過有機溶劑進行提取，與本發明相近的現有技術是一篇論文，名稱為“油相干燥法制備薏苡仁酯微膠囊最佳工藝研究”，源自《時珍國醫國藥》2006年第17卷第1期。其方法主要采用丙酮分3次對薏苡仁粉末進行提取，得到粗提掖后，加入石油醚，濾除白色絮狀物，濾液減壓蒸餾，得到薏苡仁提取液。然而，傳統的方法有很多的缺點(1)原料藥薏苡仁價格較高，并且薏苡仁本身含有α-亞麻酸單甘油酯的量很少(約為1.31％)；(2)提取工藝非常復雜，提取物純化困難，費用高；(3)制備過程中大量使用有機溶劑，導致藥物中有機溶劑殘留量超標。因此采用傳統制備方法，嚴重地阻礙了α-亞麻酸單甘油酯作為抗癌藥物的原料的廣泛應用。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，1.通過對介孔材料進行擴孔以及表面修飾，通過交聯法使脂肪酶分子組裝進載體孔道中，從而保證介孔材料固定化酶在有機相中的高穩定性，以及維持脂肪酶的原活性；2.在有機介質正己烷或乙酸乙酯中合成治療癌癥的藥物原料α-亞麻酸單甘油酯。
介孔分子篩孔道中功能材料的組裝，特別是生物大分子酶蛋白的組裝固定，是目前國際上介孔材料研究的熱點之一。由于介孔材料孔徑的限制，組裝固定的基本都是小分子量的酶，而實際應用的一些酶類分子量往往很大，如脂肪酶的分子量約30000左右，酶分子的平均動力學直徑約為5nm。常規方法合成的介孔材料SBA-15的孔徑雖然能夠能達到6nm，但通過實驗證明，脂肪酶只能吸附到材料表面，而不能進入孔道內。
本發明的技術方案包括將脂肪酶在擴孔后的SBA-15中進行組裝制成固定化酶，再將固定化酶在有機介質中進行α-亞麻酸單甘油酯的合成。
本發明的固定化脂肪酶催化合成α-亞麻酸單甘油酯的方法具體過程如下步驟A.制備固定化酶載體以三嵌段共聚化合物P123(EO20PO70EO20)為模板劑，用鹽酸(HCl)調節pH值，水為溶劑，正硅酸乙脂(TEOS)為硅源、乙醇為擴孔劑；摩爾配比為如下范圍0.8～1.0模板劑/40～60硅源/300～350HCl/7500～10000H2O/300～350擴孔劑；將P123溶于水中，加入鹽酸攪拌溶解；加入正硅酸乙酯(TEOS)在50℃～60℃恒溫攪拌30～45min后加入乙醇，攪拌后裝入反應釜中，在100℃烘箱中放置48小時；將產物過濾，洗滌，干燥，再經過500℃～550℃灼燒6～8小時可完全除去表面活性劑，得到介孔材料，產品名稱為SBA-15/80。將介孔材料SBA-15/80分散于水中，二者質量∶體積比為1g∶20～50ml，加熱回流3～4h，混合物冷卻后離心分離，除去水分，白色固體在空氣中干燥5～6天。取水合后的介孔材料先后加入100～150ml甲苯和10～20ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，加熱回流4～6h。反應結束后，產物過濾，經氯仿洗滌，室溫干燥，即得白色產物固定化酶載體，記為NH2-SBA-15/80。
步驟A對介孔材料SBA-15進行了擴孔和修飾。擴孔和修飾后的固定化脂肪酶載體可通過X射線衍射，透射電鏡，紅外光譜，熱重-差熱分析進行表征。
步驟B.制備固定化脂肪酶取介孔材料NH2-SBA-15/80(固定化酶載體)與交聯劑戊二醛，在攪拌情況下反應2～4h，之后用磷酸緩沖液(PBS)洗滌以除去未反應的戊二醛。再向介孔材料NH2-SBA-15中加入20～40ml脂肪酶溶液反應4～6小時；按質量體積比為1g固定化酶載體/20ml～40ml交聯劑/20～40ml脂肪酶溶液；最后用PBS洗滌并離心，直到在溶液中檢測不到蛋白為止。脂肪酶溶液的濃度可以是16～20mg/ml。
一般情況下可以在離心轉速5000rpm下離心10～15min即可。
前述的脂肪酶最好是假絲酵母脂肪酶或銅綠假單胞菌脂肪酶。交聯劑也可以使用鞣酸。
步驟C.α-亞麻酸單甘油酯的合成取0.5～1g上述合成的固定化酶，加入有機溶劑正己烷或乙酸乙酯，攪拌均勻。再加入等摩爾量的濃度分別為20～30mmol/ml和25.0～30.0mmol/ml的亞麻酸和甘油各18～22ml。混合液在20～50℃水浴震蕩器中，孵育5～15min。最后，過濾反應混合液，去除固定化酶，然后減壓蒸發正己烷。殘留物為產品α-亞麻酸單甘油酯，一種薏苡仁酯。通過高效液相色譜定性，定量測定，其產率為75～80％。
由本發明得到的α-亞麻酸單甘油酯顏色淺黃，品質高，酶組裝進分子篩后熱穩定性增強，可以保證介孔材料固定化酶在有機相中的高穩定性，以及維持脂肪酶的原活性；得到的α-亞麻酸單甘油酯療效確切，低成本，易于連續化生產，從而為工業化奠定了基礎。
表1給出固定化脂肪酶與吸附法的操作穩定性比較數據。
由于測定脂肪酶的活性過程中，加入有機溶劑終止反應，從而造成酶無法回收利用，所以采用通過測定酶從載體上脫落的實驗來間接反映固定化酶的操作穩定性。酶泄漏結果見表1，用本發明的交聯法制備的固定化酶洗滌5次后酶從載體SAB-15/80上脫落累計僅1％，而用吸附法制備的固定化酶，洗滌5次后已有累計34％的酶從載體脫落。結果表明，交聯法制備的固定化酶穩定性高，有望在應用于工業生產中。
表1固定化脂肪酶的操作穩定性
本發明的方法中，采用對脂肪酶載體進行了擴孔和修飾，使介孔材料的孔徑達到8～12nm，修飾后SBA-15仍呈規則的六方結構，由于孔道均勻，孔徑大，保證了α-亞麻酸單甘油酯合成的需要；本發明的方法操作穩定性好；反應條件溫和，酶與產物易分離且酶可回收重復使用，低成本，易于連續化生產，有利于大規模工業生產；脂肪酶最適溫度提高，這有助于產品產率提高，轉化率可達70～80％。
圖1為本發明的固定化脂肪酶載體NH2-SBA-15/80的X射線衍射圖；圖2為本發明的固定化脂肪酶載體NH2-SBA-15/80的透射電鏡圖；圖3為SBA-15(a)與本發明的NH2-SBA-15/80(b)的紅外圖譜；圖4為本發明的固定化脂肪酶載體NH2-SBA-15/80的熱重-差熱分析圖；圖5為已有的脂肪酶(▲)和本發明的固定化脂肪酶(■)的最適反應溫度曲線圖；圖6為已有的脂肪酶(▲)和本發明的固定化脂肪酶(■)的最適反應pH曲線圖；圖7為本發明的固定化脂肪酶的米氏常數(Km)曲線圖；圖8為已有的脂肪酶(▲)和本發明的固定化脂肪酶(■)的熱穩定性曲線。
具體實施例方式
實施例1介孔材料SBA-15的擴孔修飾及表征將0.8g三嵌段共聚化合物P123(Pluronic P123)溶于去離子水中，待P123完全溶解后加入鹽酸中，攪拌溶解。該混合物在50℃～60℃恒溫攪拌30～45min后加入3ml乙醇，攪拌后裝入反應釜中，在100℃烘箱中放置48小時。將產物過濾，洗滌，干燥。再經過500℃～550℃灼燒6～8小時至完全除去表面活性劑。產品名稱為SBA-15/80。
將介孔材料SBA-15/80溶于去離子水中，質量∶體積比為1g∶30ml，加熱回流3.5h，混合物冷卻后離心分離，除去水分，白色固體在空氣中干燥6天。取水合后的介孔材料先后加入130ml甲苯和15mlAPTES，加熱回流5h。反應結束后，產物過濾，經氯仿反復洗滌，室溫干燥，即得白色的固定化酶載體產物，經修飾后的固定化酶載體記為NH2-SBA-15/80。
將合成的固定化酶載體通過X射線衍射，透射電鏡，紅外光譜，熱重-差熱分析進行表征。見說明書附圖1～4。
由圖1，本發明的固定化脂肪酶載體NH2-SBA-15/80的X-射線衍射圖可以辨別出三個衍射峰，經計算可分別歸屬為二維六方晶系100、110和200晶面的衍射峰。所以，修飾過程沒有造成SBA-15結構的破壞，其仍保持原有結構。
由圖2透射電鏡照片可以看出NH2-SBA-15/80仍呈規則的六方結構，孔道均勻，保證了之后的α-亞麻酸單甘油酯合成的需要。
圖3是溴化鉀(KBr)壓片，在Impact410 FT-IR光譜儀上測定NH2-SBA-15/80的紅外光譜(IR)，測量范圍400～4000cm-1。從圖3中可以看出，SBA-15/80分子篩在用3-氨丙基三乙氧基硅烷修飾之后，出現了兩個新峰，位置為2934cm-1和1564cm-1，這兩個譜帶可分別歸屬為C-H鍵的伸縮振動和伯胺中的N-H鍵的彎曲振動。此結果說明產物中存在-CH2NH2基團。另外，SBA-15中位于960cm-1處的峰代表Si-OH的彎曲振動，它在經硅烷修飾之后基本消失，這說明分子篩表面的硅羥基與有機硅烷發生了反應。由此可以證明3-氨丙基三乙氧基硅烷已經與分子篩表面的硅羥基充分發生了反應從而將-NH2引入分子篩的表面。
圖4為氨基修飾后的SBA-15/80的熱重-差熱分析圖。差熱分析(b)結果顯示307.2℃為SBA-15/80表面修飾的NH2基團降解的放熱峰，這同時表明已有NH2基團修飾在SBA-15/80表面，熱重圖譜(a)顯示，100℃時質量下降為水分損失，之后平臺期無物質分解，然后氨基開始降解，到第二個平臺出現降解完全。根據熱重圖譜可計算出氨基的修飾量為1.57mmol/g載體。
在實施例1中，各原料的用量及工藝條件有微小的增減(在本發明內容的范圍內)，對制備固定化酶載體NH2-SBA-15/80基本沒有影響。
實施例2固定化脂肪酶的組裝及其最適條件確定取實施例1制得的介孔材料NH2-SBA-15/80與戊二醛，按質量∶體積比為1g∶30ml，在攪拌情況下反應3h，之后用磷酸緩沖液洗滌以除去未反應的戊二醛。再向介孔材料中加入30ml假絲酵母脂肪酶溶液反應5小時，最后用PBS洗滌并離心(5000rpm，13min)，直到在溶液中檢測不到蛋白為止。
本實施例中的假絲酵母脂肪酶用銅綠假單胞菌脂肪酶替代，用法相同，二者的效果亦相同。
固定化脂肪酶的最適溫度，最適pH，米氏常數(Km)的確定以及熱穩定性，見說明書附圖5～8。
圖5顯示了脂肪酶固定前后最適溫度的變化，即酶被固定后最適溫度由50℃提高到70℃，在80℃時仍能保持85％以上的活力。由于高溫可以提高反應速度，降低細菌的污染機率，提高底物溶解度，從而提高產率，所以脂肪酶最適溫度的提高有助于生產。
圖6顯示了脂肪酶固定前后最適pH的變化，脂肪酶被固定后最適pH是9.0，和溶液酶相比，最適pH沒有改變。
見圖7，由于脂肪酶的底物為橄欖油，系混合物，分子量不確定，故Km值以百分濃度表示，而不是摩爾濃度。溶液酶的Km值為4.27％，而固定化酶為5.6％，與溶液酶相比，表明通過交聯固定脂肪酶，Km值略有升高，其原因推測為孔道經修飾后使酶與底物接觸存在障礙所至。
圖8是將固定化脂肪酶(■)和溶液酶(▲)的熱穩定性進行比較。將固定化脂肪酶樣品在50℃下分別保溫一定時間，迅速冷至室溫后，測定酶活力。測定結果顯示將脂肪酶通過交聯法被介孔材料固定后其熱穩定性明顯增強，即使在保溫6h.仍保留活力75％，而溶液酶保溫6h后已無活力，說明酶組裝進分子篩后熱穩定性增強。
在實施例2中，各原料的用量及工藝條件有微小的增減(如本發明內容的范圍內)，對固定化脂肪酶的組裝影響不大。
實施例3固定化酶在有機相中合成α-亞麻酸單甘油酯取1g實施例2合成的固定化酶，加入有機溶劑正己烷，攪拌均勻。加入亞麻酸，甘油(加入量各20ml)，最初濃度分別為25mmol/ml和30.0mmol/ml。混合液在恒溫水浴震蕩器中，20～50℃孵育一定時間。最后，過濾反應混合液，去除固定化酶，然后減壓蒸發正己烷。殘留物為產品α-亞麻酸單甘油酯，一種薏苡仁酯。通過高效液相色譜定性，定量測定，其產率為75～80％。
本實施例中，有機溶劑正己烷可以用乙酸乙酯替代。
本實施例中，各原料的用量有微小的增減(如本發明內容的范圍內)，也是能夠合成適合應用的藥物原料α-亞麻酸單甘油酯的。
權利要求
1.一種固定化脂肪酶催化合成α-亞麻酸單甘油酯的方法，有制備固定化酶載體、制備固定化脂肪酶和α-亞麻酸單甘油酯的合成的工藝過程所說的制備固定化酶載體是，以三嵌段共聚化合物P123為模板劑，用鹽酸調節pH值，水為溶劑，正硅酸乙脂為硅源、乙醇為擴孔劑；按摩爾配比為0.8～1.0模板劑/40～60硅源/300～350HCl/7500～10000H2O/300～350擴孔劑；將模板劑溶于水中，加入鹽酸攪拌溶解，加入正硅酸乙酯在50℃～60℃攪拌30～45分鐘后加入乙醇，攪拌后裝入反應釜中，在100℃烘箱中放置48小時；將產物過濾，洗滌，干燥，再經過500℃～550℃灼燒6～8小時，得到介孔材料；按質量體積比為1g介孔材料/20～50ml水將介孔材料分散于水中，加熱回流3～4小時，混合物冷卻后離心分離，除去水分，白色固體在空氣中干燥5～6天；取水合后的介孔材料先后加入甲苯和3-氨丙基三乙氧基硅烷，加熱回流4～6小時，其中按質量體積比為1g水合后的介孔材料/100～150ml甲苯/10～20ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷；反應結束后，產物過濾，經氯仿洗滌，室溫干燥，即得白色產物固定化酶載體；所說的制備固定化脂肪酶是，取固定化酶載體與交聯劑戊二醛或鞣酸在攪拌情況下反應2～4小時，之后用磷酸緩沖液洗滌除去未反應的交聯劑；再加入20～40ml脂肪酶溶液反應4～6小時；按質量體積比為1g固定化酶載體/20ml～40ml交聯劑/20～40ml脂肪酶溶液；最后用磷酸緩沖液洗滌并離心，直到在溶液中檢測不到蛋白為止；所說的α-亞麻酸單甘油酯的合成是，將固定化脂肪酶加入到有機溶劑正己烷或乙酸乙酯中，攪拌均勻，再加入等摩爾量的濃度分別為20～30mmol/ml和25.0～30.0mmol/ml的亞麻酸和甘油，按質量體積比為1g固定化脂肪酶/18～22ml亞麻酸；混合液在20～50℃水浴震蕩器中孵育5～15分鐘；最后，過濾反應混合液，去除固定化酶，然后減壓蒸發有機溶劑，殘留物為產品α-亞麻酸單甘油酯。
2.按照權利要求1所述的固定化脂肪酶催化合成α-亞麻酸單甘油酯的方法，其特征在于，所說的脂肪酶是假絲酵母脂肪酶或銅綠假單胞菌脂肪酶。
全文摘要
本發明的固定化脂肪酶催化合成α－亞麻酸單甘油酯的方法屬用于一種抗癌藥物原料的制備方法領域。步驟有制備固定化酶載體、制備固定化脂肪酶、α－亞麻酸單甘油酯的合成的過程。其中制備固定化酶載體過程包括對介孔材料SBA－15的擴孔和氨基修飾；最后將固定化酶在有機介質中進行α－亞麻酸單甘油酯的合成。本發明方法操作穩定性好、修飾后SBA－15仍呈規則的六方結構，孔道均勻，孔徑大，保證了α－亞麻酸單甘油酯合成的需要；脂肪酶最適溫度的提高有助于產品產率提高；反應條件溫和，酶與產物易分離且酶可回收重復使用，低成本，有利于大規模連續化工業生產得到的產物顏色淺黃，品質高，療效確切，熱穩定性增強。
文檔編號C12N11/00GK101058820SQ20071005563
公開日2007年10月24日 申請日期2007年5月15日 優先權日2007年5月15日
發明者高波, 滕利榮, 孟慶繁, 王博 申請人:吉林大學