專利名稱：：利用重組大腸桿菌高效生產丙酮酸氧化酶的培養基的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物工程領域，更具體地，本發明涉及重組大腸桿菌高效表達丙酮酸氧化酶的發酵培養基，以及利用所述的培養基生產丙酮酸氧化酶的方法。
背景技術：
：丙酮酸氧化酶(Pyruvateoxidase,EC1.2.3.3)是一種非常重要的臨床診斷用酶，其最重要的應用是用于血液中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(AST)的活力測定；此外還可以用于丙酮酸測定、丙酮酸激酶活性測定等。目前商業化生產的丙酮酸氧化酶主要來源于野生型植物乳桿菌，酶產量較低，僅有約120U/L。盡管現有技術中已經出現了利用重組法表達丙酮酸氧化酶的方法，采用的重組菌株例如大腸桿菌五.co/ZDH5o/pSMLPyOD;然而，目前的重組法生產丙酮酸氧化酶的產量還不夠高，一些方面的生產條件還需要進行優化。因此，本領域迫切需要開發高產丙酮酸氧化酶的方法，并且進一步改進發酵培養基，提高產酶水平也顯得十分緊迫。
發明內容本發明的目的在于提供一種生產丙酮酸氧化酶的方法。本發明的另一目的在于提供一種特別適合于生產丙酮酸氧化酶的培養基。在本發明的第一方面，提供一種用于培養大腸桿菌的培養基，所述的培養基含有碳源、氮源、磷源、無機鹽，所述的大腸桿菌中含有表達載體，所述的表達載體中含有丙酮酸氧化酶的表達盒；其中，所述的培養基中碳源90%以上是甘油。在另一優選例中，所述的表達盒含有與啟動子操作性相連的丙酮酸氧化酶基因。在另一優選例中，所述的培養基中碳源95%以上是甘油；更優選的，所述的培養基中碳源98%以上是甘油。在另一優選例中，所述的大腸桿菌是五.co"'DH5o/pSMLPyOD。在另一優選例中，所述的培養基用于發酵生產丙酮酸氧化酶。在另一優選例中，所述的氮源選自蛋白胨，酵母提取物，硫酸銨或它們的組合。在另一優選例中，所述的磷源是磷酸鹽。在另一優選例中，所述的無機鹽選自氯化鈉，硫酸鎂或它們的組合。在另一優選例中，所述的培養基的碳源是甘油。在另一優選例中，所述的培養基含有甘油蛋白胨酵母提取物硫酸銨硫酸鎂磷酸鹽氯化鈉6-18ml/L;12-20g/L;10-16g/L;3-7g/LMg/L4-8g/L6-15g/L在另一優選例中，所述的培養基含有:甘油蛋白胨酵母提取物硫酸銨硫酸鎂磷酸鹽氯化鈉8-16ml/L12-16g/L10-12g/L4-6g/L2-3g/L5-7g/L8-12g/L。在另一優選例中，所述的磷酸鹽是復合磷酸鹽，其中，K2HP04:Na2HP04:KH2P04=1:2:1。在另一優選例中，所述的培養基中還含有微量元素1-2.2ml/L(優選的是1.25-2ml/L);其中所述的微量元素含有:FeS04.7H2012.8±3g/L;ZnS04'7H202.84±1g/L;CuS045H201.6±0.5g/L;MnS04-H203.2±1g/L;CaCl20.28±0.08g/L;CoCl26H201.6±0.5g/L;H3B040.24±0.08g/L;Na2Mo0412.8±3g/L;和KI0.16±0.05g/L。在另一優選例中，所述的培養基由甘油、蛋白胨、酵母提取物、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸鹽、微量元素、氯化鈉組成。在另一優選例中，所述的大腸桿菌是五.co/ZDH5WpSMLPyOD。在本發明的第二方面，提供所述的培養基的用途，用于培養大腸桿菌，發酵生產丙酮酸氧化酶；其中，所述的大腸桿菌中含有表達載體，所述的表達載體中含有丙酮酸氧化酶的表達盒。在本發明的第三方面，提供一種生產丙酮酸氧化酶的方法，所述方法包括步驟(1)利用所述的培養基培養大腸桿菌，獲得培養產物；其中，所述的大腸桿菌中含有表達載體，所述的表達載體中含有丙酮酸氧化酶的表達盒；(2)從步驟(1)獲得的培養產物中分離獲得丙酮酸氧化酶。在另一優選例中，在步驟(1)中，培養時間是12-20小時；或者培養的溫度是28-37°C。在另一優選例中，所述的大腸桿菌是五.co/ZDH5o/pSMLPyOD。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，發現在丙酮酸氧化酶的發酵生產過程中，發酵培養基的成份是影響發酵產量的關鍵因素，而在培養基中利用甘油作為碳源，可極大地提高丙酮酸氧化酶的產量，并且在整個發酵過程中pH值穩定，發酵時間短。在此基礎上完成了本發明。培養基本發明人在研究中發現，葡萄糖代謝產物乙酸對大腸桿菌的生長有明顯的抑制作用，另外，以葡萄糖作為碳源時，重組菌在生長過程前期不表達目的產物丙酮酸氧化酶，只有在生長后期，碳源消耗殆盡時才開始表達，而該階段細胞生理活性己經下降，產酶水平很難提高。經過反復的試驗，本發明人發現，以甘油為碳源的培養基，可克服葡萄糖對丙酮酸氧化酶生產菌株的抑制作用，同時使得重組細胞的質粒穩定性大大提高。此外，采用該培養基能夠使發酵液pH在發酵全過程穩定在6.8-7.2之間，這使得整個發酵過程省去了pH控制環節，發酵工藝大大簡化。并且，采用本發明提供的發酵培養基，能夠使得丙酮酸氧化酶生產菌株在發酵全過程持續表達丙酮酸氧化酶，使得批發酵時間縮短至約16-20小時之間，丙酮酸氧化酶的發酵單位也大大提高，進一步體現了基因重組技術在丙酮酸氧化酶生產中的優勢。碳源是指能提供微生物營養所需碳元素的營養源。本發明的培養基中主要以甘油(占碳源的90%以上)作為碳源。作為本發明的優選方式，所述的培養基的以甘油作為唯一的碳源。作為本發明的優選方式，甘油在培養基中的含量是6-18ml/L;進一步優選的是8-16ml/L。上述用量中，所述的甘油含量以純甘油計。此外，所述培養基中還含有氮源、磷源、無機鹽或微量元素等成分。氮源是指能提供微生物營養所需氮元素的營養源。無機鹽是行使構成菌體成分、酶活性基組成或維持酶活性、調節滲透壓、pH等的成份。作為本發明的優選方式，所述的培養基中含有的氮源、磷源、無機鹽或微量元素如表1所列。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>作為本發明的優選方式，所述的磷酸鹽可選自K2HP04、Na2HP04、KH2P04、或它們的組合。更優選的，所述的磷酸鹽是復合磷酸鹽，其中含有K2HP04、Na2HPOjnKH2P04。進一步優選的，所述復合磷酸鹽中，K2HP04:Na2HP04:KH2P04=1:2:1。作為本發明的優選方式，所述的微量元素的成分如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>作為本發明的優選方式，所述的培養基由甘油、蛋白胨、酵母提取物、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸鹽、微量元素、氯化鈉組成。經本發明人優化后的培養基配方，它含有足夠的營養成份，既能滿足搖瓶實驗的需要，又能成功地將搖瓶發酵結果放大到發酵罐。在本發明的實施例中，所述培養基與不以甘油作為主要碳源的培養基相比，丙酮酸氧化酶的產量大大提高，并且發酵時間很短。本發明的培養基適用于不同規模的丙酮酸氧化酶生產菌的培養或發酵，包括(但不限于)用于進行發酵生產丙酮酸氧化酶的搖瓶培養；或大規模發酵生產丙酮酸氧化酶。培養方法
技術領域：
：本發明還提供了利用所述的培養基生產丙酮酸氧化酶的方法，所述方法包括步驟(1)利用所述的培養基培養可表達丙酮酸氧化酶的重組大腸桿菌，獲得培養產物；(2)從步驟(1)獲得的培養產物中分離獲得丙酮酸氧化酶。作為本發明的優選方式，在步驟(1)中，培養時間是12-20小時；或者培養的溫度是28-37"C。可用于生產丙酮酸氧化酶的重組大腸桿菌中含有至少一個表達載體(質粒)，并且，所述的表達載體中含有丙酮酸氧化酶的表達盒。所述的表達盒含有與啟動子操作性相連的丙酮酸氧化酶基因，本領域人員了解如何在適當的表達載體中構建可表達丙酮酸氧化酶的基因表達盒D在本發明中，對用于表達丙酮酸氧化酶的表達載體沒有限制，可以是任何適于轉化進入大腸桿菌并且表達丙酮酸氧化酶的組成型表達載體。優選的表達載體是pSML。可采用常規的技術，將丙酮酸氧化酶基因克隆入表達載體的多克隆位點中，構建含有丙酮酸氧化酶表達盒的重組表達載體；再通過常規方法，將重組表達載體轉化宿主菌。在本發明的一種優選方式中，使用的重組大腸桿菌是五.co/z'DH5a/pSMLPyOD。本發明的主要優點在于(1)首次發現在生產丙酮酸氧化酶時利用甘油作為碳源，能夠使得重組大腸桿菌在發酵全過程持續表達丙酮酸氧化酶，發酵單位大大提高，因而極大地提高了丙酮酸氧化酶的產量。并且，采用本發明的培養基進行發酵，重組細胞的質粒穩定性大大提高。(2)采用本發明的培養基進行發酵，在整個發酵過程中pH值穩定在6.8-7.2之間，無需額外控制pH值，發酵工藝大大簡化。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1五.o//DH5a/pSMLPyOD的構建從綠色氣球菌(』eracoccMATCC10400基因組中擴增得到丙酮酸氧化酶基因。上游引物(SEQIDNO:1):AATTAACATC-3'(劃線部分為Ncol酶切位點，同時添加對應9個氨基酸殘基MGMHHHHHH(SEQIDNO:3)的核苷酸序列，可用于Ni親和層析)；下游引物(SEQIDNO:2)(劃線部分為BamHI酶切位點》以爿erococctwWnWfl/wATCC10400基因組為模板，采用以上引物對，PCR擴增得到Jv尸少OZ)基因，鑒定PCR擴增產物，經鑒定獲得序列正確的JW^(9Z)擴增產物。常規方法純化該PCR擴增產物。用限制性內切酶Ncol和BamHI酶切上述PCR擴增產物，將酶切后的產物連接入經過NcoI和BglII酶切的質粒pSML104(購自中國科學院生化細胞所)中，獲得重組表達質粒pSMLPyOD。采用常規的方法，將重組質粒pSMLPyOD轉化E.coliDH5a感受態細胞。由于轉化有重組表達質粒pSMLPyOD的目的轉化子表達丙酮酸氧化酶，丙酮酸氧化酶催化丙酮酸產生過氧化氫，過氧化氫從菌體細胞滲透到胞外，在辣根過氧化物酶的酶催化下，過氧化氫與聯大茴香胺作用產生棕褐色色素物質，從而使陽性轉化子形成棕褐色的菌落。因此，將上述轉化后的細胞在含四環素的選擇性指示平板上生長的菌落置4'C顯色，具有四環素抗性又呈現棕褐色的菌落即為含有表達質粒pSMLPyOD的細胞，經驗證該重組細胞能夠組成型表達丙酮酸氧化酶。實施例2培養基的配制所述的培養基的幾種配方見表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>其中，微量元素母液的組成為FeS04'7H2012.8g/L;ZnS04'7H202.84g/L;CuS04'5H201.6g/L;MnS04'H203.2g/L;CaCl20.28g/L;CoCl2.6H201.6g/L;H3B040.24g/L;Na2Mo0412.8g/L;KI0.16g/L。復合磷酸鹽為K2HP04、Na2HPOjPKH2P04，且它們的比例是K2HP04:Na2HP04:KH2P04=l:2:1。實施例3采用發酵培養基2搖瓶培養丙酮酸氧化酶發酵培養基l:配方如實施例2中培養基1，pH7。將硫酸鎂以外的其它組分按照所述濃度混合，以30ml/瓶裝入250ml搖瓶中，經121。C,.20分鐘滅菌，冷卻。將硫酸鎂分開滅菌(過濾除菌法滅菌)，接種前按照所述濃度加入。甘油管保存的五.co//DH5a/pSMLPyOD按1%接種量接入盛有100mlLB培養基(含50mg/L四環素)的500ml搖瓶，37°C，220RPM培養過夜后，按10%接種量接入上述發酵培養基搖瓶，37°C，220RPM培養12小時后，將發酵溫度降至30。C，繼續培養至16小時左右發酵終了，經檢測，此時發酵液中丙酮酸氧化酶活性達到1100U/L。實施例4采用發酵培養基1發酵生產丙酮酸氧化酶發酵培養基2:配方如實施例2中培養基1，pH7.2。將硫酸鎂以外的其它組分按照所述濃度混合，3升上述培養基加入5升發酵罐后，經12rC、15分鐘滅菌，冷卻。將硫酸鎂分開滅菌(過濾除菌法滅菌)，接種前按照所述濃度加入。種子同實施例l，按10%接種量接入上述5升發酵罐，32'C發酵培養，初始攪拌轉速200RPM，通氣量5L/Min，進入對數生長期后，通過調整攪拌轉速和通氣量將DO控制在30。/。以上。14小時左右發酵終了，經檢測，此時發酵液中丙酮酸氧化酶活性達到1300U/L。實施例5采用以葡萄糖為碳源的培養基發酵生產丙酮酸氧化酶發酵培養基3(/L):配方見表4，pH7。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>其中，微量元素母液的組成為FeS04'7H2012.8g/L;ZnS04'7H202.84g/L;CuS04.5H201.6g/L;MnS04'H203.2g/L;CaCl20.28g/L;CoCl2'6H201.6g/L;H3B040.24g/L;Na2Mo0412.8g/L;KI0.16g/L。復合磷酸鹽為.-K2HP04、Na2HPCX^PKH2P04，且它們的比例是K2HP04:Na2HP04:KH2P04=1:2:1。將硫酸鎂和葡萄糖以外的其它組分按照所述濃度混合，以100ml/瓶裝入500ml搖瓶，經121'C，20分鐘滅菌。硫酸鎂和葡萄糖單另滅菌，接種前按照所述濃度加入。甘油管保存的co/iDH5a/pSMLPyOD按1%接種量接入盛有100mlLB培養基(含50mg/L四環素)的500ml搖瓶，37°C，220RPM培養過夜后，按10%接種量接入上述發酵培養基搖瓶，37°C，220RPM培養12小時后，將發酵溫度降至3(TC，繼續培養至16小時左右發酵終了，此時發酵液中基本未檢測到丙酮酸氧化酶活性。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110〉華東理工大學<120〉利用重組大腸桿菌高效生產丙酮酸氧化酶的培養基<130>076428<160>3<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉54〈212>DNA<213>人工序列<220><221〉misc—feature<223>引物<400>1catgccatgggaatgcatcaccatcaccatcactcagataacaaaattaacatc54<210>2<211〉45<212〉DNA<213>人工序列<220><221>raise—feature<223〉引物<400〉2cgcggatccttatcatttgatgtatttagattctaagccttcagc45<210〉3<211〉9<212〉PRT<213>人工序列<220〉<221〉MISC—FEATURE<223>肽<400〉3MetGlyMetHisHisHisHisHisHis1權利要求1.一種用于培養大腸桿菌的培養基，所述的培養基含有碳源、氮源、磷源、無機鹽；所述的大腸桿菌中含有表達載體，所述的表達載體中含有丙酮酸氧化酶的表達盒；其特征在于，所述的培養基中碳源90％以上是甘油。2.如權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述的培養基的碳源是甘油。3.如權利要求2所述的培養基，其特征在于，所述的培養基含有甘油6-18ml/L;蛋白胨12-20g/L;酵母提取物10-16g/L;硫酸銨3-7g/L;硫酸鎂1-4g/L;磷酸鹽4-8g/L;氯化鈉6-15g/L。4.如權利要求3所述的培養基，其特征在于，所述的磷酸鹽是復合磷酸鹽，其中，K2HP04:Na2HP04:KH2P04=1:2:1。5.如權利要求3所述的培養基，其特征在于，所述的培養基中還含有微量元素1-2.2ml/L;其中所述的微量元素含有FeS04.7H2012.8士3g/L;ZnS04-7H202.84±1g/L;CuS045H201.6±0.5g/L;MnS04H203.2±1g/L;CaCl20.28±0.08g/L;CoCl26H201.6±0.5g/L;H3B040.24±0.08g/L;Na2Mo0412.8±3g/L;和KI0.16±0.05g/L。6.如權利要求l所述的培養基，其特征在于，所述的大腸桿菌是EDH5a/pSMLPyOD。7.權利要求1所述的培養基的用途，其特征在于，用于培養大腸桿菌，發酵生產丙酮酸氧化酶；其中，所述的大腸桿菌中含有表達載體，所述的表達載體中含有丙酮酸氧化酶的表達盒。8.—種生產丙酮酸氧化酶的方法，其特征在于，所述方法包括步驟(1)利用權利要求1所述的培養基培養大腸桿菌，獲得培養產物；其中，所述的大腸桿菌中含有表達載體，所述的表達載體中含有丙酮酸氧化酶的表達合.XOL，(2)從步驟(1)獲得的培養產物中分離獲得丙酮酸氧化酶。9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中，培養時間是12-20小時；或者培養的溫度是28-37'C。10.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的大腸桿菌是五.co/ZDH5a/pSMLPyOD。全文摘要本發明屬于生物工程領域，提供一種培養基，所述的培養基主要以甘油為碳源。本發明還提供了一種利用所述培養基生產丙酮酸氧化酶的方法。本發明首次揭示在生產丙酮酸氧化酶時利用甘油作為碳源，能夠使得重組大腸桿菌在發酵全過程持續表達丙酮酸氧化酶，極大地提高了丙酮酸氧化酶的產量；并且，采用本發明的培養基進行發酵，在整個發酵過程中pH值穩定，發酵工藝大大簡化。文檔編號C12N1/21GK101182486SQ200710047750公開日2008年5月21日申請日期2007年11月2日優先權日2007年11月2日發明者炬儲,莊英萍,張嗣良,王永紅,袁中一,劼趙申請人:華東理工大學