三分三托品酮還原酶Ⅰ基因及其編碼的蛋白質和應用的制作方法

專利名稱：：三分三托品酮還原酶Ⅰ基因及其編碼的蛋白質和應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，具體說，是涉及在三分三中表達的托品酮還原酶I基因及其編碼的蛋白質和應用。
背景技術：
：莨菪烷生物堿如莨菪堿(hy。scyaraine)和東莨菪堿(scopolamine)等，主要是從茄科植物如顛茄、曼陀羅、莨菪及三分三f^/^^/sSC""/2^//M)等中提取到的，在醫用方面是作用于副交感神經系統的抗膽堿藥，具有麻醉、解痙、止痛的功能。此外，還具有改善微循環的作用，臨床上可用于治療微循環障礙性疾病。由于我國學者的努力，莨菪烷生物堿的臨床應用遍及內科、外科、婦產科、神經科、皮膚科、耳鼻喉科等，能治療100多種疾病，巿場需求十分巨大。藥用植物三分三，為茄科多年生草本植物，主要分布于我國云南西北部，在云南民間它作為解痙鎮痛的中藥使用已有悠久歷史。三分三根部富含莨菪烷生物堿，據報道，野生三分三干燥品總生物堿含量高達l.2%，所含生物堿含量比世界上一些常用的茄科植物如顛茄、莨菪曼陀羅等均高的多。根據記載，七年生三分三總生物堿含量可高達5%。實驗表明，三分三所含生物堿絕大部分是莨菪烷類生物堿。隨著巿場對莨菪烷生物堿的需求不斷擴大，尋找可以大量生產莨菪烷生物堿的替代方法已成為當前研究的熱點。近年來基因工程技術的飛速發展和廣泛應用，為利用現代生物技術提高托品烷生物堿含量開辟了一條嶄新的途徑。利用現代生物技術將莨菪堿生物合成途徑中的關鍵酶基因導入資源植物中，獲得轉基因植株，并進行大規模的培養，是實現從根本上提高莨菪烷生物堿含量的最佳途徑之一。托品酮還原酶I(TropinonereductaseI,TRI)是整個莨菪堿生物合成途徑中的一個關鍵的催化酶，它和托品酮還原酶II(TropinonereductaseII)分別催化莨菪堿合成過程中的一個重要分支點的兩個分支。其中托品酮還原酶I(TRI)專一的將托品酮的3-酮基還原成3cc-羥基從而生成莨菪醇(3a-hydroxytropane),而TRII則將托品酮的3-酮基還原成3(3-羥基從而生成假莨菪醇(3p-hydroxytr叩ane)。莨菪醇沿TRI主路途徑最終生成莨菪堿和東莨菪堿，而假莨菪醇則沿另一條旁支途徑最終生成Calystegines。這兩個酶的活力比值將決定代謝流在這一重要分支點的流向，因為目前在植物體內莨菪醇和假莨菪醇的互變還沒有被發現。因此，克隆托品酮還原酶I的編碼基因并利用基因工程技術來提高藥用植物如三分三等中托品酮還原酶I(力"'"^^acw"刀^7mTropinonereductaseI,AaTRI)的活性或含量，從而提高轉基因植物如三分三中莨菪堿和東莨菪堿的含量，有著十分重要的醫學價值。在對現有文獻的分析中，雖然"TheProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerican(美國國家科學院進展)1993,90,9591-9595"報道了從曼陀羅中克隆了托品酮還原酶I基因，但至今尚未有任何從我國云南特有的藥用植物三分三中分離克隆出托品酮還原酶I的文獻報道。由于這個基因編碼的酶對于代謝流流向莨菪堿具有直接的決定作用，因此，這一步是利用基因工程技術來調控莨菪堿和東莨菪堿生物合成的重要切入點。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種三分三托品酮還原酶I基因及其編碼的蛋白質與用途，以填補從我國云南特有的藥用植物三分三中分離克隆出托品酮還原酶I基因的空白。本發明所提供的三分三托品酮還原酶I基因，是具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。本發明所提供的三分三托品酮還原酶I基因編碼的蛋白質，是具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。含有本發明的三分三托品酮還原酶I基因全序列或部分片段的質粒和植物表達載體均屬于本發明的保護范圍。一種宿主細胞，該細胞含有本發明的三分三托品酮還原酶I基因或質粒或植物表達載體的基因序列。所述宿主細胞為大腸桿菌細胞、農桿菌細胞、酵母細胞、煙草細胞或其它植物細胞。所述宿主細胞優選大腸桿菌細胞或農桿菌細胞或三分三發根細胞。本發明的三分三托品酮還原酶I基因的應用，包括用所述的植物表達載體轉化三分三細胞或者用所述的農桿菌與三分三細胞共培養或者用所述的三分三發根細胞培育雄性不育植株或者用所述的托品酮還原酶I基因序列提供一種轉基因三分三。本發明技術方案中涉及的概念具體內容如下本發明所說的三分三托品酮還原酶I基因的DNA分子包括編碼具有三分三托品酮還原酶I活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQIDNO.1中從核苷酸第70-891位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55'C條件下與SEQIDNO.1中從核苷酸第70-891的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQIDNO.1中從核苷酸第70-891位的核苷酸序列。本發明分離出的三分三托品酮還原酶I多肽包括具有SEQIDNO.2氨基酸序列的多肽或其保守性變異多肽或其活性片段或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQIDNO.2序列的多肽。本發明中的DNA分子包含所述的DNA分子中8-100個連續核苷酸。在本發明中，"分離的"、"純化的"DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組分分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。本發明中術語"三分三托品酮還原酶I(或多肽)基因"指編碼具有三分三托品酮還原酶I活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.1中第70-891位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指位于SEQIDNO.l序列的編碼框第70-891位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQIDNO.1中第70-891位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQIDNO.2所述的序列。還包括能在中度嚴謹條件下，更佳的在高度嚴謹條件下與SEQIDNO.1中從核苷酸第70-891位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還包括與SEQIDNO.1中從核苷酸第70-891位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95。/。的核苷酸序列。還包括能編碼具有與天然的三分三托品酮還原酶I相同功能的蛋白的SEQIDNO.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為l-90個，較佳地l-60個，更佳地l-20個，最佳地l-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5，和/或3'端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為IO個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。本發明中術語"三分三托品酮還原酶I蛋白或多肽"指具有三分三托品酮還原酶I活性的SEQIDNO.2序列的多肽。該術語還包括具有與天然三分三托品酮還原酶I相同功能的SEQIDNO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為l-50個，較佳地1-30個，更佳地l-20個，最佳地l-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為IO個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括三分三托品酮還原酶I的活性片段和活性衍生物，還包括能夠可操作地連于信號肽、啟動子或者核糖體結合位點序列所組成的衍生物。本發明的三分三托品酮還原酶I多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與三分三托品酮還原酶IDNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用三分三托品酮還原酶I多肽的血清獲得的多肽或蛋白。本發明中三分三托品酮還原酶I保守性變異多肽指與SEQIDNO.2的氨基酸序列相比，有至多IO個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行替換而產生。表1.保守性變異多肽中的取代殘基<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發明還包括三分三托品酮還原酶I或多肽的類似物，這些類似物與天然托品酮還原酶I多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。所述修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，轔酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優化了溶解性在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如巿售的載體，包括質粒，粘粒等。在生產本發明的三分三托品酮還原酶I多肽時，可以將三分三托品酮還原酶I基因的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，從而形成三分三托品酮還原酶I表達載體。所述"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。本發明中宿主細胞為原核細胞或者真核細胞。常用的原核宿主細胞包括大腸桿菌；常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、煙草細胞和其它植物細胞。本發明還可用Northern印跡法技術分析三分三托品酮還原酶I基因產物的表達，即分析三分三托品酮還原酶I的MA轉錄物在細胞中的存在和數量。此外，本發明中可用作探針的核酸分子通常具有三分三托品酮還原酶I核苷酸編碼序列的8-100個連續核苷酸，較佳地具有15-50個連續核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼三分三托品酮還原酶I的核酸分子。本發明涉及檢測樣品中是否存在三分三托品酮還原酶I核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產物，其中PCR擴增引物對應于三分三托品酮還原酶I核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。此外，根據本發明的三分三托品酮還原酶I核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質的同源性基礎上，篩選三分三托品酮還原酶I源基因或同源蛋白。為了得到與三分三托品酮還原酶I基因相關的三分三cDNAs的點陣，可以用DNA探針篩選三分三cDNA文庫，這些探針是在低嚴謹條件下，用32P對三分三托品酮還原酶I基因的全部或部分做放射活性標記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自三分三的文庫。構建來自感興趣的細胞或者組織的c卵A文庫的方法是分子生物學領域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Stratagene，PaloAlto，Cal.。這種篩選方法可以識別與三分三托品酮還原酶I的基因家族的核苷酸序列。本發明的三分三托品酮還原酶I核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用巿售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。除了用重組法產生之外，本發明蛋白的片段還可用固相技術，通過直接合成肽而加以生產(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo"SanFrancisco;MerrifieldL(1963)J.AmChem.Soc85:2149-2154)。在體外合成蛋白質可以用手工或自動進行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity,CA)來自動合成肽。可以分別化學合成本發明蛋白的各片段，然后用化學方法加以連接以產生全長的分子。利用本發明的三分三托品酮還原酶I,通過各種常規篩選方法，可篩選出與三分三托品酮還原酶I發生相互作用的物質，或者受體、抑制劑或拮劑等。本發明提供的托品酮還原酶I基因是首次從三分三中克隆制備的，可以通過基因工程技術用來提高三分三等植物中莨菪烷生物堿的含量，轉基因結果顯示，托品酮還原酶I基因對于通過基因工程技術促進三分三等植物中莨菪烷生物堿的含量提高具有顯著作用，可廣泛應用于產托品烷生物堿的資源植物的品質改良。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例l(三分三托品酮還原酶I基因的克隆)1.組織分離(isolation)三分三植株來源于云南麗江，釆取幼嫩根后立即置于液氮中冷凍保存。2.RNA的分離(RNAisolation)取部分組織用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內。勻漿后移至1.5mLEP管中，抽提總RNA(TRIzolReagents,GIBC0BRL，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。3.基因的全長克隆(CloningofFull-lengthcDNA)根據莨菪及其它癡科植物的TRI氨基酸保守序列，設計簡并引物，利用同源性基因克隆原理，釆用Smart-RACE方法(Clonetech試劑盒)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行(1)3'-RACEPCR(UPM+F2)得到AaTRIF2'(540bp),回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，釆用終止物熒光標記(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer,USA)上進行測序。測序結果用GCG軟件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數據庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知托品酮還原酶I基因(如莨菪托品酮還原酶I基因等)的同源性很高，故初步認為它是一個托品酮還原酶I基因。(2)5'-RACE根據3'RACE結果，設計反向特異引物R2，經PCR(UPM+R2)得到AaTRIR2'(722bp)(過程同(1))。回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，釆用終止物熒光標記(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法,在ABI377測序儀(Perkin-Elmer,USA)上進行測序。將測序結果與3'RACE結果比序并進行拼接，得到全長片段序列。(3)將5'RACE測序結果與3'RACE測序結果比序并進行拼接，得到全長片段序列信息，并設計一對特異引物進行PCR擴增AaTRI編碼區(AaTRIKFl+AaTRIKRl)得到AaTRI編碼區(822bp)(過程同步驟(l))。BLAST的結果證明從三分三中新得到的基因確為一個托品酮還原酶I基因。由于已知的同源的來源于曼陀羅的托品酮還原酶I基因具有提高蓖菪烷生物堿的功能(UteRichter等，2005),故推測此基因具有相同的功能。通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的三分三AaTRI蛋白的全長編碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎上，進一步設計引物AaTRIFl:5'-AAAGGAAAACCAATTGTCACATTTG-3'(SEQIDNO.3)為正向引物,寡核苷酸AaTRIRl:5'—ATGCTAACTATTTGCGACATTTTA-3'(SEQIDNO.4)為反向引物，以總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，Fl/R2的PCR條件為94°C5分鐘，隨之以94°C1分鐘、60°C1分鐘和72°C2分鐘進行35個循環，最后以72°C延伸10分鐘。電泳檢測PCR擴增產物，獲得擴增片段長度為1168bP。然后按常規方法以PCR擴增產物進行克隆、測序，獲得SEQIDNO.l所示的序列。實施例2(三分三托品酮還原酶I基因的序列信息與同源性分析)本發明新的三分三托品酮還原酶I全長cDNA的長度為1168bp，詳細序列見SEQIDNO.l，其中開放讀框位于70-891位核苷酸。根據全長cDNA推導出三分三托品酮還原酶I的氨基酸序列，共273個氨基酸殘基，分子量29.463KD,pi為6.45，詳細序列見SEQIDNO.2。將三分三托品酮還原酶I的全長cDNA序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non_redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數據庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現它與莨菪TRI基因(GenBankAccessionNo.D88156)具有94%的同源性(見表2);在氨基酸水平上，它與莨菪TRI(GenBankAccessionNo.BAA13547)的第1-273位氨基酸殘基有90%的相同性和96%的相似性(見表3)。由上可見，三分三托品酮還原酶I基因與莨菪托品酮還原酶I基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，故可以認為三分三托品酮還原酶I在提高資源植物中東莨菪堿的含量上也具有相似的作用。表2.本發明的三分三AaTRI與莨菪(Hyoscy讓sniger)HnTRI的核苷酸序列的同源比較(GAP)表Query61TAACCAGAAATG—-GGAGAATCAAAAGTTTACATGAATGGCAACCATGGAGGAACTAGA117MilINNIImilimIIIMMMIMIIIIIMIMININIIIISbjct44Query118Sbjct104Query178Sbjct164237Query238GAACTCCAACAATGCCTTGAGATTTGGAGTAAA-GAAGGACTTAAAGTTGAAGGTTCTGT296MmiiiMiiimimmmiimimmiimiiiimiimiSbjct224GAACTCCAACAATGCCTTGATATTTGGAG—AAATGAAGGACTTCAAGTTGAAGGTTCTGT282Query297iiiMmiiiNiiMNiiiimiMiiiiiiMimmillimmiiSbjct283Query357Sbjct343416476Query417Sbjct403Query477iiiiiiiiiiiiiiiiimmmmiiimmmiimmiiimiiSbjct463—Query537mmiiimiiimimiiiiiimMiiiimiiiiiiiimiimiiiiiiSbjct523Query597Sbjct583656642Query657Sbjct643702776Query717Sbjct703Query777mimilMMiimimiMimmiimimimmimmSbjct763Query837mmm11mmimmmiimimmmimmmiSbjct823其中Query表示三分三AaTRI的核酸序列；Sbjct表示莨菪HnTRI的核酸序列(GenBankAccessionNo.D88156)。結果在832個核苷酸的比對中兩者有94%的相似性。表3.本發明的三分三的托品酮還原酶I與莨菪的托品酮還原酶I氨基酸序列的同源比較(FASTA)表Query2GES+VY+NGN+GGRWSLKGTTALVTGGSKGIGYAVVEELAGGAVYTCSRNEKELQQCSbjct3Query62LEIWSKEGLKVEGSVCDLLLRSEREKLMQAVGDLFNGKLNILV麗AGVVIHKEAKDFTEE121L+IWEGL+VEGSVCDLLLRSER+KLMQVDLFNGKLNILVNNAGVVI服EAKDFT+ESbjct63LDIWRNEGLQVEGSVCDLLLRSERDKLMQTVADLFNGKLNILVNNAGVVIHKEAKDFTKE122Query122DY+IV+GTNFEAAYHLQLAYPLKAS+NGNVIFLSSIAGFSALPSVSLYSASKAAINQ+Sbjct123182Query182TKNLACEWAK+NIRVNSVAPG+ILTPL+ETAIKKNPHQKEEIDNFIVKTPMGRAGKPEVSbjct183241242Query242SALISFLCFPAASYITGQIIWM)GGFTANGGF273SALI+FLCFPAASYITGQIIWADGGFTANGGFSbjct243SALIAFLCFPAASYITGQIIWADGGFTANGGF274其中Query表示三分三AaTRI的氨基酸序列;Subject表示莨菪HnTRI的氨基酸序列(GenBankAccessionNo.BAA13547);相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出。結果在273個氨基酸的比對中，兩者分別有90%的相同性和96%的相似性。實施例3(三分三托品酮還原酶I或多肽在大腸桿菌中進行原核表達及提純)在該實施例中，將全長的三分三AaTRI編碼序列或片段構建入商品化的蛋白質融合表達載體之中，以表達和提純重組蛋白。1、原核表達載體的構建以及轉化大腸桿菌根據三分三AaTRI的核苷酸序列，設計擴增出蛋白編碼區的引物，并在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這根據選用的pET32a(+)載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增后，將三分三AaTRI基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pET32a(+)載體(Novagen)。鑒定好的表達載體利用CaCl2方法轉入大腸桿菌BL21,篩選鑒定得到含有pET32a(+)-AaTRI表達載體的工程菌BL21-pET32a(+)-AaTRI。2、表達Trx-AaTRI重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的BL21-pET32a(+)-AaTRI工程菌于3mL含100叫/mL氨芐青霉素的LB培養基中振搖培養過夜，按1:100的濃度吸取培養液于新的LB培養基(含100叫/mL氨節青霉素)中培養約3小時，至0D^。達0.5后，加入IPTG至終濃度lmmol/L繼續于37。C分別培養0、1、2、3小時。取培養時間不同的lfflL菌液離心，在細菌沉淀物中加入裂解液(2xSDS上樣緩沖液50^L,蒸餾水45jiL，二巰基乙醇5jU),混懸細菌沉淀，沸水洛中煮5分鐘，10000rpm離心l分鐘，上清加入12%SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達Trx-AaTRI融合蛋白的工程菌。3、Trx-AaTRI融合蛋白的提取純化按上述方法誘導表達Trx-AaTRI融合表達蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-AaTRI，經離心沉淀收集菌體，并根據廠家(Novagen)的說明書以BugBuster試劑和Benzonase核酸酶來純化包涵體。包涵體可用溶解緩沖液(50mMCAPS,pH11.0,0.3%N-lauroylsarcosine)來溶解,再用透析緩沖液(200mMTris-HCl,pH8.5)來透析。然后用組氨酸結合(His*Bind)樹脂進行親和層析，并經洗脫緩沖液(1Mimidazole,500mMNaCl,20mMTris-HClpH7.9)洗脫來收集Trx-AaTRI融合蛋白。融合蛋白經腸激酶2CTC酶切16小時后即可分離獲的AaTRI的表達蛋白。實施例4(三分三托品酮還原酶I或多肽在三分三中進行真核細胞表達及轉基因發根中莨菪堿和東莨菪堿含量測定)含目的基因(三分三托品酮還原酶I基因)的表達載體的構建，根據三分三托品酮還原酶I的全長序列(SEQIDNO.1),設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增后，將三分三托品酮還原酶I基因cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進一步克隆到雙元表達載體(如PBI121和改進的pCAMBIA13(M),在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達載體，再將其轉入農桿菌中，遺傳轉化資源植物三分三。利用發根農桿菌Ri質粒介導的三分三的遺傳轉化1)發根農桿菌A4。使用前自冰箱取出，傳代2次，傳代用固體培養基為YEB培養基。菌種在使用前接種于YEB液體培養基中，28X:培養過夜。2)經種子萌發生長8周左右的三分三的無菌嫩葉片。3)經過夜培養的菌液，用轉化液稀釋為100個細菌/mL。取無菌三分三葉片，用無菌的解剖刀劃以"+"字形傷口，放入上述轉化中，60rpm/min振蕩培養8h取出，用無菌水沖洗3次，放入含250-500mg/L卡那霉素和不同濃度6-BA(0.5mg/L-3mg/L)的B5培養基中，每2周轉移到新鮮培養基中1次，待長出毛狀根后分離毛狀根，轉移至含250-500mg/L卡那霉素無激素的B5培養基中培養，轉移4-5次直至無細菌為止，然后再轉移至不含卡那霉素的無激素B5培養基中培養。4)把在固體培養基中的毛狀根的繼代培養物，接種于裝有100mL無激素B5，培養基的500mL三角瓶中，培養溫度、光照、轉速等培養條件與愈傷組織液體懸浮培養條件相同，培養20天，將毛狀根從培養基上取出放入冷凍干燥機中進行干燥，然后稱重，貯存于-7(TC備用。5)含三分三托品酮還原酶I基因的轉基因發根的莨菪堿和東莨菪堿含量測定按Zhang等(PNAS,2004)的方法對表達三分三托品酮還原酶I基因的轉基因發根進行莨菪堿和東莨菪堿含量測定。結果表明在表達三分三托品酮還原酶I基因的轉基因發根中托品烷生物堿含量同非轉基因對照上的相比顯著提高(P〈0.05)。因此轉基因結果證明三分三托品酮還原酶I基因對促進托品烷生物堿含量的提高有明顯作用，可廣泛應用于產托品烷生物堿的資源植物的品質改良。核苷酸序列表<110>上海師范大學<120>三分三托品酮還原酶I基因及其編碼的蛋白質和應用〈160〉4<170>Patentlnversion3.3<210>1<211〉1188<212〉腿<213>三分三(An/sot/iiS3<由，//[/5)<221〉CDS<222>(70)..(891)<400〉1aaaggaaaaccaattgtcacatttgggctaattccatatctcaaaatagttgcaagaaax60taaccagaaatgggagaateaaaagtttacatgaatggcaaccatggagga111MetGlyGluSerLysValTyrMetAsnGlyAsnHisGlyGly1510actagatggagtetcaaaggcaccactgcccttgttactggtggctct159ThrArgTrpSerLeuLysGlyThrThrAlaLeuValThrGlyGlySer15202530雄ggcattgggtatgcagtagtggaagaactggcaggttttggagca207LysGlylieGlyTyrAlaValValGluGluLeuAlaGlyPheGlyAla354045acagtatatacatgtteacgtaatgaaaaggaaetccaacaatgcctt255ThrValTyrThrCysSerArgAsnGinLysGluLeuGinGinCysLeu505560gaga"tggagtaaagaaggacttaaagttgaaggttctgUtgtgat303GlulieTrpSerLysGluGlyLeuLysValGluGlySerValCysAsp657075ttattactgcgctctgaacgtgagaagcttatgcaggetgUggagat351LeuLeuLeuArgSerGluArgGluLysLeuMetGinAlaValGlyAsp808590ttatttaatggaaagetcaatattttggtaaataatgcaggggtggtg399LeuPheAsnGlyLysLeuAsnlieLeuValAsnAsnAlaGlyValVal95100105110atacataaagaagetaaagacttcacagaagaagattataacategta447lieHisLysGluAlaLysAspPheThrGluGluAspTyrAsnlieVal115120125atgggcactaattttgaagcagettatcacttatctcaacttgettat495MetGlyThrAsnPheGluAlaAlaTyrHisLeuSerGinLeuAlaTyr130135140cccUattgaaggcatctgaaaatggcaatgttatttttctttcttct543ProLeuLeuLysAlaSerGluAsnGlyAsnValliePheLeuSerSer145150155attgetggatttteagcactgccttctgtttctctttattctgettec591lieAlaGlyPheSerAlaLeuProSerValSerLeuTyrSerAlaSer160165170aaagetgcaataaatcaaatgacgaagaacttggcatgtgaatgggcc639LysAlaAlalieAsnGinMetThrLysAsnLeuAla.CysGluTrpAla175180185190aaggagaacattegggtcaatteagttgetccgggaateattUaact687LysGluAsnlieArgValAsnSerValAlaProGlylielieLeuThr195200205ccaetcgttgaaactgcaattaagaaaaatcctcatcaaaaagaagaa735ProLeuValGluThrAlalieLysLysAsnProHisGinLysGluGlu210215220atagacaattttattgtcaagactccaatgggcegggccggaaaaccc783lieAspAsnPhelieValLysThrProMetGlyArgAlaGlyLysPro225230235aaagaagtttctgcaetaatetcttttctttgcttccctgetgettct831LysGluValSerAlaLeulieSerPheLeuCysPheProAlaAlaSer240245250tatattactggccagateatatgggetgatggtggattcacagetaat879TyrlieThrGlyGinlielieTrpAlaAspGlyGlyPheThrAlaAsn255260265270ggtggattttgaatcttacatattcaaaagaagtttcagcttUgaagcaat931GlyGlyPhetctgttttctgtttgggcUtgtaatcttttttaactttttgtggtttgtaccttgggcc991tataaaaeggcccattatattttgaacaatttctgtccacgggcttgtgttcttcggtct1051acatgcttccatattcatgggcttattattttgggcctagatgattcttgtgtcagctag1111gcttctatctgctUUgttgtcatcatcacaataaaatgtegcaaatagttagcataaa1171aaaaaaaaaaaaaaaaa1188<210>2<211〉273<212>PRT<213>三分三(J//6^0toaCi//^/7^Y//^S")<400〉2MetGlyGluSerLysValTyrMetAsnGlyAsnHisGlyGlyThrArg151015TrpSerLeuLysGlyThrThrAlaLeuValThrGlyGlySerLysGly202530lieGlyTyrAlaValValGluGluLeuAlaGlyPheGlyAlaThrVal354045TyrThrCysSerArgAsnGluLysGluLeuGinGinCyslxuGlulie505560TrpSerLysGluGlyLeuLysValGluGlySerValCysAspLeuLeu65707580LysArg85AsnLeuArgSerGluArgGluLysLeuMetGinAlaValGlyAspAsnGlyLysGlulieLeuValLeu100LysAspPheThrGin90AsnAlaGlyValAla115PheGluAlaAlaAsn105GluAspTyrAsnThrAsn130LeuLysAlaSerGlu145GlyPheSerAlaGlu120HisLeuSerGinTyr135GlyAsnVallieAsn150ProSerValSerAlalieAsnAsnlieValGlu210AsnPhe225ValSerAlaLeu165MetThrLysAsnGin180ValAsnSerValLeu170AlaPhe155TyrLeu140Leulie125AlaSerVal110ValTyrSerLeuPhe95lieHisMetGlyProLeuArg195ThrlieValLysLeu185ProGlylielielieAla160SerAlaSerLysAla175LysGluAlalieLysValLeuAla200AsnProHisGinCysGluTrpAla190ThrProIxuLys215ProMetGlyArgLeu205GluThr230SerPheLeuThrGlyGinPhelie260lie245lieTrpAlaAspGlyCysGly265Ala235ProLys220GlyLysProGlulieAspPhe250GlyPheThrAlaLysGlu240AlaAlaSerTyrlie255GlyGlyAsn270<210>3<211〉25<212〉DNA<213>三分三(爿/22'S(t/"sacwfa/gw/i/51)<400〉3aaaggaaaaccaattgtcac"ttg<210>4<211〉24<212>歸<213>三分三(！o/i"(9^/iAS"<3CW^/7^//i/S)<400>4atgctaactaUtgcgacatttta權利要求1.一種三分三托品酮還原酶I基因，其特征在于，所述基因具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。2.—種權利要求1所述的三分三托品酮還原酶I基因編碼的蛋白質，其特征在于，所述蛋白質具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。3.—種質粒，其特征在于，所述質粒含有權利要求l所述的三分三托品酮還原酶I基因全序列或部分片段。4.一種植物表達載體，其特征在于，所述植物表達載體含有權利要求1所述的三分三托品酮還原酶I基因全序列或部分片段。5.—種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有權利要求l或3或4所述的基因序列。6.根據權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為大腸桿菌細胞、農桿菌細胞、酵母細胞、煙草細胞或其它植物細胞。7.根據權利要求6所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為大腸桿菌細胞或農桿菌細胞或三分三發根細胞。8.—種權利要求1所述的三分三托品酮還原酶I基因的應用，其特征在于，用權利要求4所述的植物表達載體轉化三分三細胞。9.一種權利要求1所述的三分三托品酮還原酶I基因的應用，其特征在于，用權利要求7所述的農桿菌細胞與三分三細胞共培養或者用所述的三分三發根細胞培育雄性不育植株。10.—種權利要求1所述的三分三托品酮還原酶I基因的應用，其特征在于，用權利要求l所述的托品酮還原酶I基因序列提供一種轉基因三分三。全文摘要本發明公開了一種三分三托品酮還原酶I基因及其編碼的蛋白質與用途，填補了從我國云南特有的藥用植物三分三中分離克隆出托品酮還原酶I基因的空白。本發明所提供的三分三托品酮還原酶I基因具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，所述基因編碼的蛋白質具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。本發明提供的托品酮還原酶I基因對于通過基因工程技術提高三分三等植物中莨菪烷生物堿的含量具有顯著作用，可廣泛應用于產托品烷生物堿的資源植物的品質改良。文檔編號C12N15/53GK101168740SQ200710047000公開日2008年4月30日申請日期2007年10月12日優先權日2007年10月12日發明者周根余,開國銀,林張,禮李,偉王,敬王,楊陸申請人:上海師范大學