一種評估孕前營養代謝遺傳能力的試劑盒的制作方法

文檔序號：591294閱讀：424來源：國知局

專利名稱：一種評估孕前營養代謝遺傳能力的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域，更具體的，本發明涉及一種評估孕前營養代謝遺傳能力的試劑盒，通過同時檢測與孕前營養代謝遺傳能力密切相關的5,10-亞甲基四氣葉酸還原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因(MTRR)、維生素D受體基因(VDR)、 G蛋白P 3亞單位基因(GNB3)的單核苷酸多態性位點基因型來評估孕前營養代謝遺傳能力。
背景技術：
營養是人體健康的物質基礎。孕前/圍產期的營養尤其重要，因為它不僅影響孕婦的健康，而且還影響到胎兒的正常發育以及出生后嬰幼兒的體力和智力狀況。有調査表明，孕前及妊娠期蛋白質的缺乏，不利于胎兒中樞神經系統的發育和功能的健全，會使30%的幼兒出現精神或智力不正常，如反應遲鈍，記憶力差等。有人曾對唇裂嬰兒的母親進行了妊娠期營養調査，發現其中40%的母親在妊娠期患有營養缺乏癥， 60%的母親患有不同程度的貧血。不僅如此，營養對妊娠期婦女自身的健康也是極為重要的。她們既要維持自身正常新陳代謝的需要，又要保證充足的營養供給胎兒正常發育所需，因此需要充足且優質的飲食。充足優質的營養不僅可以減輕妊娠初期的不適反應，還可以減少妊振后期發生某些疾病的可能，同吋對產后泌乳也是有益的。但是妊娠期和產后的營養補充也應適量，否則易增加產后肥胖的風險。產后肥胖正是目前大多數產婦所面臨的困擾問題之一。臨床研究發現，妊娠過程中胎盤激素的變化，是造成產后肥胖的主要原因，這與遺傳因素密切相關，此外圍產期營養過剩以及運動缺乏也是十分重要的原因。遺傳體質不同的人存在營養素代謝能力的差異，因此不同身體狀況與素質的育齡婦女必須根據自身情況，有的放矢地準備與補充所需要的蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質。因此，選取與育齡婦女孕前/圍產期以及胎兒發育營養代謝密切相關且研究明確的一些重要基因位點，綜合利用現代科學研究成果，開發一項基于分子遺傳基礎的營養素代謝能力評估及個性化干預提示產品，將能夠對由f營養素代謝能力缺陷而影響母體及胎兒健康的情況以及由:p營養過剩而導致的產后肥胖風險增加起到預瞀和個性化防治作用，具有很強的社會意義和廣闊的市場前景。目前，經證實并且機理研究清楚的與甲基類維生素代謝密切相關的基因有5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因(MTRR)。MTHFR為5， 10—methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH)(亞甲基四氣葉酸還原酶)蛋白編碼基因，主要作用是在葉酸代謝通路中將5, 10-亞甲基四氫葉酸轉化為具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸鹽。5-甲基四氫葉酸鹽可以進一步進入甲基傳遞通路,通過同型半胱氨酸的重新甲基化過程間接的為DNA 甲基化和蛋白質甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸量保持在一個較低的水平。研究發現，MTHFK 基因存在多種多態型，影響MTHFR活性和熱穩定性。常見的變異包括(1) 677C-T: MTHFR基因第677位密碼子胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)替代，編碼后酶分子中丙氨酸被纈氨酸替代，引起MTHFR熱穩定性和活性降低，相對于iE常的C/C基因型，純合子T/T基因型MTHFR活性在37攝氏度降低50免 609&，在46攝氏度降低65%; (2M298A-C:編碼后酵分子中谷氨酸被丙氨酸替代，引起MTHFR活性降低。1298 A-C與677 C-T 不同的是，純合子和雜合子血漿同型半胱氨酸升髙和葉酸降低均不明顯。然而，如果同時存在1298 A-C 和677 C-T復合變異的雜合子，則MTHFR活性低于野生型40先。甲硫氨酸是蛋白質合成和一碳代謝的必需氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合酶(MTR編碼)催化的，而甲硫氨酸合酶因為輔助因子維生素B12被氧化而最終失活。MTRR編碼的甲硫氨酸合成酶還原酶能夠通過還原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。MT服能夠保持甲基鈷銨m在一定水平，而甲基鈷銨m是激活蛋氨酸合成酶的輔助因子，它可催化同型半胱氨酸再甲基化生成蛋氨酸。MTRR變異是造成葉酸/甲基維生素缺乏癥E型的主要原因。MTRR66A—G多態性，導致蛋氨酸被異亮氨酸替代，使該酶活性降低。該棊因型對同型半胱氨酸水平有顯著影響。有研究指出，MTRR基因A66G多態，血漿同型半胱氨酸增高，基因型為MTRR 66GG， MTRR 66AG的孕婦或胎兒發生神經管畸形的危險性較正常對照組增加。目前，經證實并且機理研究清楚的與鈣磷代謝密切相關的基因主要是維生素D受體(VDR)。VDR(vitaminD (1,25-dihydroxyvitaminD3) rec印tor)編碼維生素D3的核激素受體，該蛋白也是膽石酸的第二受體。 VDR屬于轉錄調控因子，為類固醇激素/甲狀腺類激素受體超家族的成員。該蛋白對基因表達的調節主要通過一系列代謝反應通路.包括免疫反應和腫瘤激活通路。該基因的多態性會導致維生素D缺乏引起的佝僂病。目前報導的VDR基因多態性主要與rsl544410和rs731236單核苷酸多態性位點有關。妊娠過程中體內激素的變化，是造成產后肥胖的主要原因。G蛋白P3亞單位基因(GNB3)與產后肥胖密切相關。GNB3為G蛋白P3亞單位編碼基因，G蛋白是一種鑲嵌于細胞膜上的異源三聚體，在細胞膜和效應蛋白之間的信息傳遞過程中起"分子開關"作用，介導許多刺激血管活性和血管增生的細胞內效應。 G蛋白由a、 3和V亞單位組成，GNB3主要編譯e亞單位。國內外多項研究表明，該基因上的多態現象與高血壓及其用藥、肥胖、胰島素抗性等都有相關性。發明內容基于5,10-亞甲基四氫葉酸還原嗨基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因(MTRR)、維生素D受體基因(VDR)、 G蛋白P3亞單位基因(GNB3)上的6個SNPs位點多態性可用來評估孕前營養代謝遺傳能力的基礎上，本發明提供一種評估孕前營養代謝遺傳能力的試劑盒。該試劑盒包括檢測5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性炎光探針對；檢測5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801131號SNP多態性基閑型的特異性引物對及特異性熒光探針對；檢測甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rs1801394號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對；檢測維生素D受體基因上rs731236號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對；檢測維生素D受體基因上rsl544410號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對；檢測G蛋白P 3亞單位基因上rs5443號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對；熒光定量PCR反應組件(包括T叫酶、dNTP混合液、MgCh溶液、反應緩沖液、去離子水等)。本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133號和 rsl801131號SNP位點、甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rsl801394號SNP位點、維生素D受體基因上rs731236 號和rsl544410號、G蛋白e 3亞單位基因上rs5443號SNP位點而設計，能特異性擴增出包含這6個SNPs 位點的DNA片段的引物對。設計這類引物對是本領域技術人員能夠輕易完成的。優選地，試劑盒中包含具有SEQIDNO: l和2、 3和4、 5和6、 7和8、 9和10所示序列的引物對。特異性引物對可用常規的合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的引物不限于這六對引物。本試劑盒中所述的特異性熒光探針對是指針對5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133號和 rsl801131號SNP位點、甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rsl801394號SNP位點、維生素D受體基因上rs731236 號和rsl544410號、G蛋白P 3亞單位基因上rs5443號SNP位點而設計，能通過熒光定量PCR技術特異性檢測出這六個SNPs位點基因型的T叫nrnn探針對。設計這類探針是本領域技術人員能夠輕易完成的。優選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 11和12、 13和14、 15和16、 17和18、 19和20所示序列的Taqman 探針對。特異性熒光探針對可用常規的探針合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的特異性熒光Taqman探針對不限于這六對探針，所有可用于熒光定量PCR法檢測本發明中所述的六個SNPs位點的探針均在本發明范圍內。本發明試劑盒的組分和含量包括6ul 10 X熒光定量PCR反應緩沖液，0. 6u1 25mM dNTP混合液，3.6ul 25mM MgCl2溶液，0. 15ul (5units/ul) Taq DNA聚合酶，20uM特異性引物對每條引物各0.225ul，IO一特異性熒光探針對每條探針各0.25nl，去離子水31.95nl。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照廠兩所建議的條件。實施例l.檢測試劑盒的使用步驟l: DNA模板的抽取用硅膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。步驟2:熒光定量PCR反應使用評估孕前營養代謝遺傳能力的熒光定量PCR檢測試劑盒，其中，含有下列引物對和熒光探針對:有義引物l: 5 反義引物l: 5 5 5 5 5 5 5有義引物2 反義引物2 有義引物3 反義引物3 有義引物4 反義引物4 有義引物5: 5 反義引物5: 5 有義引物6: 5 反義引物6: 5 帶VIC熒光基團探針l 帶FAM熒光基團探針1 帶VIC熒光基團探針2 帶FAM熒光基團探針2 帶VIC熒光基團探針3 帶FAM熒光基團探針3 帶VIC熒光基團探針4 帶FAM熒光基團探針4 帶VIC熒光基團探針5 帶FAM熒光基團探針5MAGCTGCGTGA -3' (SEQ ID NO: 1) TGAAGGAGAAGGTG -3' (SEQ ID NO: 2) MGAACGMGACTTCA -3' (SEQ ID NO: 3) GGGAGGAGCTGAC -3' (SEQ ID NO: 4) GCCATCGCAGAA -3' (SEQ ID NO: 5) ATCCATGTACCACAG -3' (SEQ ID NO: 6) TGGACAGGCGGTCC -3' (SEQ ID NO: 7) CTGGGGTGCAGGAC -3' (SEQ ID NO: 8) GAGCAGAGCCTGAGTATT -3' (SEQ ID NO: 9) TTCCT謀CCACAGA -3' (SEQ ID NO: 10) AGAGCATCATCTGCGGCAT -3' (SEQ ID NO: 11) GGCGGCCACTGAGGG -3' (SEQ ID NO: 12)5' - ATCGgCTCCC -3'5， - TCGaCTCCCGC -3'5' - ACACTTgCTTC -3'5' - CACTTtCTTCA -3'5' - MTaTGTGAGCAAG5, - AATgTGTGAGCAA -3'5' - TGGCCTCgATCAG -3'5' - TGGCCTCaATCAG -3'5， - GGGMTGtGCAGGC -3'5' - GGMTGcGCAGGC -3'5， - ACGTCcGTGGCC -3' 5，(SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO: 14) (SEQ ID NO: 15) (SEQ ID NO: 16) 3' (SEQ ID NO: 17) (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 19) (SEQ ID NO: 20) (SEQ ID NO: 21) (SEQ ID NO: 22) (SEQ ID NO: 23)帶VIC熒光基團探針6:帶FAM熒光基團探針6: 5' - ACGTCtGTGGCCT _3' (SEQ ID NO: 24) 有義引物l,反義引物l、帶VIC熒光基團探針1、帶FAM熒光基團探針1特異地針對檢測5,10-亞甲基四氨葉酸還原酶基因上rsl80U33號SNP位點多態性；有義引物2，反義引物2、帶VIC熒光基團探針2、帶FAM熒光基團探針2特異地針對檢測5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801131SNP位點多態性；有義引物3，反義引物3、帶VIC熒光基團探針3、帶FAM熒光基團探針3特異地針對檢測甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rsl801394號SNP位點多態性；有義引物4，反義引物4、帶VIC熒光基團探針4、帶FAM熒光基團探針4特異地針對檢測維生素D受體基因上rs731236號SNP位點多態性；有義引物5，反義引物5、帶VIC熒光基團探針5、帶FAM熒光基團探針5特異地針對檢測維生素D受體基因上rsl544410號SNP位點多態性；有義引物6，反義引物6、帶VIC熒光基團探針6、帶FAM熒光基團探針6特異地針對檢測G蛋白e3 亞單位基因上rs5443號SNP位點多態性；6個SNPs位點分別進行6次獨立的熒光定量PCR反應，每個反應的體系為總體積10pl，包含濃度為 20ng/nl的DNA模板2pl、 lpl 10 X熒光定量PCR反應緩沖液、0. lpl 25mM dNTP混.合液、0. 6^1 25mM MgCl2 溶液、0.025pl (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20^M的有義引物和反義引物各0. 225pl、 10一的帶VIC 熒光探針和帶FAM熒光探針各0. 25^1,去離子水5. 325jd。在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為50'C、 2分鐘，95'C、 IO分鐘，進行60個循環的 95'C、 30秒，60C、 l分鐘。反應結束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。歩驟3: SNP基因型分析熟悉熒光定量PCR技術的本領域技術人員能夠通過辨識熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根據不同序列探針VIC和FAM熒光信號的強弱即可確定所檢測的SNP位點的基因型。實施例2.評估孕前營養代謝遺傳能力的服務步驟l: DNA提取由醫院檢驗科醫師指導被檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用硅膠吸附法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。步驟2:基因分型檢測使用本發明提供的試劑盒，對被檢測者基因組DNA的5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133 號和rsl801131號SNP位點、甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rsl801394號SNP位點、維生素D受體基因上 rs731236號和rsl544410號、G蛋白P 3亞單位基因上rs5443號SNP位點分別進行熒光定量PCR檢測，確定這6個SNPs位點的基因型。步驟3:孕前營養代謝遺傳能力的分析通過對被檢測者SNPs基因型的分析，出具孕前營養代謝遺傳能力的分析報告單。報告中詳細說明了被檢測者孕前各種營養代謝遺傳能力的高低，并由醫師向被檢者詳細說明和解讀孕前營養代謝遺傳能力評估分析報告單。序列表<110>上海主健生物工程有限公司<120〉一種評估孕前營養代謝遺傳能力的試劑盒<勝24<210〉 1 <211〉 12 <212> DM <213>人工序列<220〉<223〉引物 <400> 1AAAGCTGCGT GA 12<210> 2 <211> 14 <212〉 DNA <213>人工序列<220〉<223>引物 <400> 2TGAAGGAGAA GGTG 14<210> 3<211〉 16 <212〉腿 <213〉人工序列<220〉<223>引物 <400> 3AAGAACGAAG ACTTCA 16<210> 4<211> 13 <212>瞧 <213>人工序列<220〉<223>引物 <400> 4GGGAGGAGCT GAC 13<210> <211> <212> <213>512DNA人工序列<220><223>引物 <400> 5GCCATCGCAG AA 12<210> <211> <212> <213>615DNA人工序列<220><223>引物働〉6ATCCATGTAC CACAG 15<210> <211> <212> <213>14 ■人工序列<220〉<223>引物 <400> 7TGGACAGGCG GTCC "<210> 8 〈211> 14 <212> DNA <213>人工序列<220>〈223〉引物<400〉 8CTGGGGTGCA GGAC 14<210> 〈211〉 <212〉 <213〉918DNA人工序列<220〉<223>引物 <柳> 9GAGCAGAGCC TGAGTATT 18<210〉 <211〉 <212〉 <213〉10 16 賺人工序列<220><223〉引物 < 10TTCCTGGGGC CACAGA 16<210> <211〉 <212〉 <213〉11 19 ■人工序列<220〉<223〉引物 <400〉 11AGAGCATCAT CTGCGGCAT 19<210〉 <211〉 <212〉 <213〉12 15 DNA人工序列<220><223〉引物 <■〉 12GGCGGCCACT GAGGG 15<210> 13 <211> 10 <212> DNA <213>人工序列<220><223〉探針<400> 13 ATCGgCTCCC<210〉 14 <211〉 11 <212> DNA <213〉人工序列<220><223>探針催> 14 TCGaCTCCCG C<210〉 15 <211> 11 <212〉 DNA <213>人工序列<220><223>探針< 15 ACACTTgCTT C<210> 16 <211> 11 <212> DNA <213>人工序列<220>〈223〉探針 <400〉 16CACTTtCTTC A <210> 1710111111<211> 14 <212> ■ <213>人工序列<220〉〈223 >探針 <400> 17AATaTGTGAG CAAG 14<210> 18 <211> 13 <212〉 DNA <213〉人工序列<220><223〉探針 <揚18AATgTGTGAG CAA 13<210> 19 <211> 13 <212> DNA <213>人工序列<220><223〉探針 <400> 19TGGCCTCgAT CAG 13<210> 20 <211> 13 <212> DNA <213>人工序列<220><223>探針〈400> 20TGGCCTCaAT CAG 13<210> 21 <211> 14 <212> DNA<formula>formula see original document page 12</formula>
權利要求
1. 一種評估孕前營養代謝遺傳能力試劑盒，其特征在于包括同時檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rs1801133號和rs1801131號SNP位點、甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rs1801394號SNP位點、維生素D受體基因上rs731236號和rs1544410號、G蛋白β3亞單位基因上rs5443號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、去離子水。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對5, 10-亞甲基四氧葉酸還原酶基因上rsl801133號和rsl801131號SNP位點、甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rsl801394號SNP位點、維生素D受體基因上rs731236號和rsl544410號、G蛋白P 3亞單位基因上rs5443號SNP位點而設計，肖巨特異性擴增出包含這6個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針對是指針對5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133號和rsl801131號SNP位點、甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rsl801394號SNP 位點、維生素D受體基因上rs731236號和rsl544410號、G蛋白P 3亞單位基因上rs5443號SNP位點而設計，能通過熒光定量PCR技術特異性檢測出這6個SNPs位點基因型的Tacpan探針對。
4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對選自具有SEQIDNO: l和2、 3 和4、 5和6、 7和8、 9和10、 11和12所示序列的引物對。
5. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQ IDNO: 13和 14、 15和16、 17和18、 19和20、 21和22、 23和24所示序列的Taqman探針對。
6. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括6pl IOX熒光定量PCR反應緩沖液、0.6nl 25raM dNTP混合液、3^1 25mM MgClz溶液、0. 15fU (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20-特異性引物對每條引物各0.225^1、 10nM特異性熒光探針對每條探針各0.25nl、去離子水31.95jil。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
全文摘要
本發明公開了一種評估孕前營養代謝遺傳能力的試劑盒。該試劑盒包括同時檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rs1801133號和rs1801131號SNP位點、甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rs1801394號SNP位點、維生素D受體基因上rs731236號和rs1544410號、G蛋白β3亞單位基因上rs5443號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、用于熒光定量PCR檢測的常規組件等。本發明的試劑盒通過同時檢測與孕前營養代謝遺傳能力密切相關的單核苷酸多態性位點基因型來評估孕前營養代謝遺傳能力。
文檔編號C12N15/11GK101240324SQ20071003717
公開日2008年8月13日申請日期2007年2月6日優先權日2007年2月6日
發明者馮哲民, 鄒祖燁申請人:上海主健生物工程有限公司

完整全部詳細技術資料下載