專利名稱：一種用于分析酸性環境中微生物群落結構的基因組芯片的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因芯片，尤其涉及用于分析酸性環境中微生物群落結構的基因組芯片。
背景技術：
傳統的微生物群落研究方法是以分離培養為依據，包括對微生物細胞形態、生長適溫、pH值、GC含量、微生物總量、生物量、呼吸效率、酶活性等性質的測定和分析。盡管這些傳統的方法仍然是微生物群落研究的基礎，但是由于不同種類微生物對培養要求的差異，以分離培養為基礎的微生物群落分析不能提供足夠準確而豐富的信息。特別是在在酸性環境中存在的微生物大多數是屬于化能自養的嗜酸性細菌，這些細菌在人工條件下很難進行分離培養，特別是在固體培養基上。雖然熒光顯微鏡法、掃描電鏡法和透射電鏡法等方法能觀察微生物個體豐度和形態，但仍不能提供微生物群落結構多樣性的足夠信息。20世紀80年代末90年代初發展了以核酸(基因)為基礎的分子生物學技術，該方法大大地減輕對微生物培養的依賴性，并迅速地廣泛應用于微生物群落結構分析。但是，目前在微生物群落分析中所用的核酸限制性片段長度多態性分析(RFLP/Restriction Fragment Length Polymorphism)和變性梯度凝膠電泳(DGGE/denatured gradient gel electrophoresis)等方法靈敏度低、特異性不高，而基因克隆與序列分析則工作量大。FISH檢測技術盡管靈敏度高、特異性強，但存在熒光染料種類的限制，每次檢測的微生物種類有限。因此，這些方法都難以同時、快速、準確、靈敏地進行微生物群落結構的分析。
發明內容
本發明的目的在于提供了一種分析酸性環境中微生物群落結構的群落基因組芯片。利用該芯片，可以實現快速、準確、靈敏地對酸性環境中微生物群落結構進行分析和研究。
本發明的基因組芯片由基片及固定于基片之上的細菌DNA探針組成，這些探針包括至少10株氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、至少2株嗜酸氧化硫硫桿菌(Acidithiobacillus thiooxidans菌)、至少1株喜溫嗜酸硫桿菌(Acidithiobacillus caldus菌)、至少1株Acidithiobacillus albertensis菌、至少6株氧化亞鐵微螺菌(Leptospirillum sp.菌)、至少8株異養嗜酸菌(Acidiphiliums sp.)、至少1株金屬硫葉菌(Sulfolobus Metallicus)、至少1株嗜酸兩面菌(Acidianus sp)、至少1株勤奮金屬球菌(Metallosphaera sedula)和至少2株嗜熱硫化桿菌(Sulfobacillus)的全基因組DNA。
這些探針最好包括16株氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、3株嗜酸氧化硫硫桿菌(Acidithiobacillus thiooxidans菌)、3株喜溫嗜酸硫桿菌(Acidithiobacillus caldus菌)、2株Acidithiobacillus albertensis菌、10株氧化亞鐵微螺菌(Leptospirillum sp.菌)、14株異養嗜酸菌(Acidiphiliums sp.)、1株金屬硫葉菌(Sulfolobus Metallicus)、1株嗜酸兩面菌(Acidianus sp)、1株勤奮金屬球菌(Metallosphaera sedula)和3株嗜熱硫化桿菌(Sulfobacillus)的全基因組DNA。
與現有的微生物群落分析方法相比，利用本發明的基因組芯片對微生物進行群落分析，克服了過程復雜、耗時長、勞動強度大、嗜酸性細菌很難進行分離培養的缺點。利用這種芯片，能夠檢測環境中豐度較低的微生物，適用于分析酸性環境中微生物群落。具有高通量、同時、快速、準確、靈敏地分析酸性環境中微生物群落組成的優點。
圖1使用Acidithiobacillus ferrooxidans菌的全基因組DNA與本發明的基因組芯片雜交后進行特異性評估的雜交結果圖；圖2使用Acidithiobacillus ferrooxidans菌的全基因組DNA與本發明的基因組芯片雜交后進行靈敏度評估雜交圖；圖3使用Acidithiobacillus ferrooxidans菌的全基因組DNA與本發明的基因組芯片雜交后進行定量性能評估線性圖。
具體實施例方式
實施例1本發明基因組芯片的制備將至少10株氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、至少2株嗜酸氧化硫硫桿菌(Acidithiobacillus thiooxidans菌)、至少1株喜溫嗜酸硫桿菌(Acidithiobacillus caldus菌)、至少1株Acidithiobacillus albertensis菌、至少6株氧化亞鐵微螺菌(Leptospirillum sp.菌)、至少8株異養嗜酸菌(Acidiphiliums sp.)、至少1株金屬硫葉菌(Sulfolobus Metallicus)、至少1株嗜酸兩面菌(Acidianus sp.)、至少1株勤奮金屬球菌(Metallosphaera sedula)和至少2株嗜熱硫化桿菌(Sulfobacillus)的全基因組用DNA抽提試劑盒進行抽提。以抽提的全基因組DNA作探針，將其用50％的DMSO溶解，到終濃度為50pmol/μl，然后在相對濕度為55～58％的環境條件下使用OmniGridAccent Arraying System(Genomic Solutions，美國)將探針點樣在經氨基化表面處理的硅化玻片上。每一玻片上有8個探針陣列重復。點好的芯片處于室溫下干燥過夜，最后在600mJ的輻射劑量下對芯片進行紫外線交聯。
實施例2芯片雜交特異性評估選取氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)，簡稱A.f菌，來檢測芯片探針的雜交特異性。將A.f菌全基因組DAN用cy3熒光染料標記后與寡核苷酸芯片在50℃雜交，結果顯示芯片上與A.f菌對應的探針位置點上都產生了很強的熒光信號(如附圖1所示)，并且在芯片上沒有發現與非靶標基因間的非特異性交互雜交現象。說明特異性的寡核苷酸探針與其對應的目標基因之間具有很強的特異性。
實施例3芯片雜交靈敏度檢測使用Acidithiobacillus ferrooxidans 23270的純基因組DNA來檢測本發明芯片的靈敏度。將純基因組DNA按照一定的濃度梯度稀釋(濃度分別為0.11，1.15，11.5，115ng/ul)，并使用cy3進行標記后與芯片雜交。從芯片雜交分析結果(見附圖2)發現，該芯片對純培養微生物基因組DNA的檢測極限為0.11ng/ul。
實施例4芯片的定量性能測定通過測定目標DNA濃度與芯片雜交信號之間的關系評估了芯片的用于核酸定量的能力。將純的Acidithiobacillus ferrooxidans 23270基因組DNA按照梯度稀釋后使用cy3進行標記并與芯片進行雜交，每一濃度的DNA制備三個平行雜交，每一探針對應的信號取其均值，以DNA濃度的對數值和對應的熒光信號強度對數值為座標點作圖(見附圖3)，并對DNA濃度與熒光信號強度作線性回歸分析。結果顯示DNA濃度在1到500ng之間時，DNA濃度與信號強度之間存在很強的線性相關性，r2＝0.982，同樣的線性相關性也存于16s rRNA基因探針的數量與信號強度之間。此外，當DNA濃度范圍在0.11到115ng/ul之間時，DNA濃度與芯片的總信號強度之間也存在很強的線性關系，r2＝0.91，p＜0.05。這一結果表明芯片雜交對于特定濃度范圍內的DNA具有定量作用，因此也說明了本發明構建的芯片可以作為一種定量工具使用。
權利要求
1.一種用于分析酸性環境中微生物群落結構的基因組芯片，包括基片及固定于基片之上的細菌DNA探針，其特征在于所述探針包括至少10株氧化亞鐵硫桿菌、至少2株嗜酸氧化硫硫桿菌、至少1株喜溫嗜酸硫桿菌、至少1株Acidithiobacillus albertensis菌、至少6株氧化亞鐵微螺菌、至少8株異養嗜酸菌、至少1株金屬硫葉菌、至少1株嗜酸兩面菌、至少1株勤奮金屬球菌和至少2株嗜熱硫化桿菌的全基因組DNA。
2.如權利要求1所述的基因組芯片，其特征在于所述探針包括16株氧化亞鐵硫桿菌、3株嗜酸氧化硫硫桿菌、3株喜溫嗜酸硫桿菌、2株Acidithiobacillus albertensis菌、10株氧化亞鐵微螺菌、14株異養嗜酸菌、1株金屬硫葉菌、1株嗜酸兩面菌、1株勤奮金屬球菌和3株嗜熱硫化桿菌的全基因組DNA。
3.如權利要求1或2所述的基因組芯片，其特征在于每個探針設8個重復。
全文摘要
本發明公開了一種用于分析酸性環境中微生物群落結構的基因組芯片。該芯片的探針包括至少10株氧化亞鐵硫桿菌、至少2株嗜酸氧化硫硫桿菌、至少1株喜溫嗜酸硫桿菌、至少1株Acidithiobacillus albertensis菌、至少6株氧化亞鐵微螺菌、至少8株異養嗜酸菌、至少1株金屬硫葉菌、至少1株嗜酸兩面菌、至少1株勤奮金屬球菌和至少2株嗜熱硫化桿菌的全基因組DNA。這種芯片，能夠檢測酸性環境中豐度較低的微生物，具有高通量、同時、快速、準確、靈敏地分析酸性環境中微生物群落組成的優點。
文檔編號C12Q1/68GK101033490SQ20071003475
公開日2007年9月12日 申請日期2007年4月17日 優先權日2007年4月17日
發明者邱冠周, 劉學端, 覃文慶, 劉新星, 申麗, 王軍 申請人:中南大學