專利名稱：：一種混合內生菌,以及用該內生菌制備石杉堿甲的方法
技術領域：
：本發明涉及一種混合內生菌，特別是從植物中分離的內生菌。本發明還涉及內生菌的用途，即用該內生菌制備石杉堿甲的方法。
背景技術：
：石杉堿甲(HuperzineA，簡稱HupA)，哌啶衍生物，又名福定堿，是從千層塔中分離得到的一種天然生物堿，屬強效的可逆性乙酰膽堿酯酶(AC服)抑制劑，對提高學習記憶力和改善老年人記憶功能有很好的效果，對治療重癥肌無力和老年性癡呆有顯著療效。臨床上石杉堿甲(藥品名哈伯因)已用于治療各種原因和不同年齡組的老年人記憶衰退和早期老年癡呆癥，是目前國內外上述病癥最有效的藥物。由于它的治療指數高，且作用時間長，在國際上己被列為第二代膽堿酯酶的抑制劑之一。但是由于石杉堿甲結構復雜人工合成十分困難且全草中含量甚微，在千層塔中含量僅為萬分之一左右，并且千層塔植物來源困難且生長周期長達810年，尚未能人工栽培，目前藥品生產完全依賴野生資源，價格昂貴。長期采挖勢必破壞千層塔天然資源的保存與可持續開發。因此對石杉堿甲的其他提取來源的研究尤其重要。現有技術中提供了從千層塔植物提取石杉堿甲的方法。例如1.陳建華，黃少烈，李忠高速逆流色譜技術制備石杉堿甲單體，中國現代應用藥學雜志2006年8月第23巻第4期。2.査圣華，李秀男，孫海虹等從千層塔中微波協助提取石杉堿甲和石杉堿乙，中國生物工程雜志第24巻第11期。
發明內容本發明的目的是提供一種混合內生菌，以及它的用途，即用該混合內生菌制備石杉堿甲。本發明的技術方案是，該種混合內生菌是從植物千層塔中分離得到的。根據本發明的實施例具體的分離方法如下取千層塔植株的一部位做外植體，經消毒后，用MS培養基培養，培養誘導內生菌。具體地，可選取的千層塔植株的部位有莖、葉或/和芽。特別優選的是莖為去皮莖。由此，本發明提供了一種由上述獲得的內生菌制備石杉堿甲的方法。現有技術中公開了大量的培養微生物菌種的方法。本發明具體地公開了用上述獲得內生菌來制備培養制備石杉堿甲的方法。該制備方法包括如下步驟1)發酵培養溫度25—3(TC，PH4—6,接種量體積比5-10;2)發酵培養基為PDA培養基或類似培養基；3)液體發酵培養的真菌溶液，用濾紙過濾得到發酵液和菌絲體；和4)將干燥后的菌絲體乙醇溶劑，90-95。C條件下回流20-24h，得到回流液，濃縮干燥后得到；或5)將發酵液離心后取上清液，上清液干燥后得到。上述制備方法中優選其中第5步中離心速率為4500——5000rpm，離心后的上清液用0.40——0.5um的濾膜過濾，濾液再千燥獲得石杉堿甲。本發明首次公開了從千層塔植物中分離培養出內生菌，在沒有分離的情況下，是可以得到混合的內生菌。并且發現該混合內生菌經過培養發酵后，在發酵液和菌絲體中都可以提取得到石杉堿甲化合物。為該化合物的制備找到了一條簡捷，成本低廉，不需要破壞珍稀植物的途徑。具體實施方式實施例1內生菌分離取千層塔帶皮莖，用75X酒精消毒5min，再用0.1X升汞消毒10rain，然后用無菌水沖洗數次，接種。將消毒好的材料接種到MS培養基上。(1000ml:瓊脂7g、蔗糖30g、無機大量100ml、無機微量10ml、有機物10ml、鐵鹽10ml、lmg/lKT、0.lmg/LNAA、PH5.8)26。C恒溫培養10天左右，挑取形態不同的菌落的孢子轉到在PDA培養基上PDA培養基(1000ml:去皮馬鈴薯200g、葡糖糖20g、瓊脂1520g)26。C恒溫培養。培養誘導內生菌，挑取形態不同的菌落的孢子在PDA培養基上培養，獲得內生菌。菌種發酵培養挑取少量菌絲體分別進行發酵培養。配置PD液體培養基1000ml，然后在每個300ml的搖瓶中裝入200ml的液體培養基，在超凈工作臺上用接種環接入少量的菌絲和孢子，然后進行發酵。(1)發酵培養基首先根據菌株的基本生物學特性，該菌株生長代謝所需的碳源，氮源，無機鹽及生長因子的種類和配比，確定發酵培養基為PD培養基(1000ml:去皮馬鈴薯200g、葡糖糖20g)。(2)發酵工藝參數發酵培養溫度28度，PH5，接種量0.25cm2，轉速160r/m，時間8天。石杉堿甲提取真菌液體發酵培養的溶液，用濾紙過濾分別得到發酵液和菌絲體。(1)菌絲體用濾紙包好放在烘箱中6crc干燥，將完全干燥的菌絲體放在研缽里，加液氮磨成粉末，并稱其重量，然后用濾紙包好放在索氏提取管中。95。C水浴，50ml95。/。乙醇回流24h，得到提取液。取15ml提取液用0.45um的微孔濾膜過濾到15ml的閃爍瓶中，真空冷凍離心濃縮至完全干后，用40。/。乙腈定容至lml。然后13000r/min高速離心5分鐘，取上清夜進行液相色譜分析。(2)取15ml發酵液用0.45um的微孔濾膜過濾到15ml的閃爍瓶中，真空冷凍離心濃縮至完全干后，用40%乙腈定容至lml。然后13000r/min高速離心5分鐘，取上清夜進行液相色譜分析。(3)稱取lg千層塔植物莖和0.78g千層塔的葉片，加液氮磨成粉末，用濾紙包好放在索氏提取管中，95。C水浴，50ml95%乙醇回流2處得到提取液。取15ml提取液用0.45um的微孔濾膜過濾到15ml的閃爍瓶中，真空冷凍離心濃縮至完全干后，用40。/。乙腈定容至lml。然后13000r/min高速離心5分鐘，取上清夜進行液相色譜分析。石杉堿甲的檢測高效液相色譜儀測定測定方法(1)色譜條件高效液相色譜儀(Agilent1100);紫外檢測器(G1314A);分析柱(4.6咖X250nm，5.0iimwatersC18);測定波長308nm;流速1.Oml/min;進樣量10ul;柱溫35。C。(2)測定波長的選擇稱取石杉堿甲標準樣品適量，配成50ug/ml的溶液，繪制紫外吸收光譜，結果在230mn、308nm有兩個較強的吸收峰，根據選擇308nm為石杉堿甲檢測波長。(3)流動相的選擇流動相成分10%乙腈。檢測結果真菌發酵液、菌絲、千層塔莖、葉在同等條件下高壓液相色譜檢測石杉堿甲的濃度對照<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權利要求1.一種混合內生菌，它是從植物千層塔上分離得到的。2、根據權利要求1所述的混合內生菌，其特征在于分離方法如下:取千層塔植株的部位做外植體，經消毒后，用MS培養基培養，培養誘導內生菌。3、根據權利要求2所述的混合內生菌，其特征在于取千層塔的部位為莖、葉或/和芽。4、根據權利要求3所述的混合內生菌，其特征在于莖為去皮莖。5、制備石杉堿甲的方法，其特征在于用權利要求1至4之一的內生菌發酵培養制備。6、根據權利要求5所述的制備石杉堿甲的方法，其特征在于將權利要求1至4之一的內生菌進行發酵培養，包括如下步驟1)，發酵培養溫度25—30度，Wi4—6，接種量體積比5-102)發酵培養基為PDA培養基或類似培養基；3)液體發酵培養的真菌溶液，過濾得到發酵液和菌絲體；和4)將干燥后的菌絲體乙醇溶劑，90-95。C條件下回流20-24h，得到回流液，濃縮干燥后得到；或5)將發酵液離心后取上清液，上清液干燥后得到。7、根據權利要求6所述的制備石杉堿甲的方法，其特征在于其中第5步中離心速率為4500——5000rpm，離心后的上清液用0.40——0.5um的濾膜過濾，濾液再干燥獲得石山堿甲。全文摘要本發明涉及一種混合內生菌，特別是從植物中分離的內生菌。本發明還涉及內生菌的用途。本發明提供的該種混合內生菌是從植物千層塔中分離得到的。本發明還提供了一種由上述獲得的內生菌制備石杉堿甲的方法。本發明首次公開了從千層塔植物中分離培養出內生菌，并且發現該混合內生菌經過培養發酵后，在發酵液和菌絲體中都可以提取得到石杉堿甲化合物。為該化合物的制備找到了一條簡捷，成本低廉，不需要破壞珍稀植物的途徑。文檔編號C12N1/00GK101275116SQ200710034638公開日2008年10月1日申請日期2007年3月28日優先權日2007年3月28日發明者劉仲華,洪亞輝,肖浪濤申請人:洪亞輝