專利名稱：一種利用種蛋自身蛋殼開窗操作和孵化雞胚的方法
技術領域：
本發明涉及一種種蛋開窗操作和孵化雞胚的技術，特別是一種利用種蛋自身蛋殼開窗操作和孵化雞胚的技術。
背景技術：
目前種蛋開窗操作雞胚的技術主要應用于以下4個方面1)以囊胚細胞為載體的禽類轉基因技術；2)以原生殖細胞為載體的禽類轉基因技術；3)利用多能細胞保存禽類種質資源技術；4)以雞胚為動物胚胎發育研究模型，研究基因(或藥物)功能。
怎樣在一個雞蛋中操作黃豆般大小的胚胎，方法要簡單方便，同時要保證高的孵化率，一直是一個難題。目前按實驗種蛋胚胎在蛋殼中孵化的方式，存在3類主要方法(1)利用自身蛋殼；(2)利用代用蛋殼；(3)自身蛋殼與代用蛋殼相結合。第1類方法相對簡單，但孵化率低；第2類方法孵化率較高，但制作過程復雜；第3類方法介于二者之間。
1)利用自身蛋殼方面Thoraval等(1994)報道了相關方法未孵化種蛋用70％酒精擦拭消毒，在囊胚正上方，雞蛋赤道面部位的蛋殼上開邊長約為5cm的三角形窗口。用精細的微針將5μL細胞液注射入囊胚腔。窗口用切塊封閉，同時再覆蓋一層醫用外科3M Steri Strip TM膜。在37.7℃，50％的濕度條件，每小時以90度角轉蛋一次，孵化至出殼。該方法較簡單，但當時的孵化率只有5％。
Kwon等2004和Koo等2004報道，新產蛋用70％酒精擦拭消毒，用一個精密的鉆孔器在雞蛋赤道面上開一個4.5×4.5mm2的口，用精致的鑷子和外科手術刀去掉窗口內的小殼膜。用微注射針，將5μL含有濃縮病毒顆粒的DMEM培養基注射進入了囊胚腔中央部分。微注射針由耐熱玻璃管拉成，尖端內徑為80μm。注射完后，窗口用薄膜封口，孵化率為8.3％。
2)利用代用蛋殼方面周振明等2004報道(孵化率為35％～44％，樣本少于20)(1)代用蛋殼的準備將比相應的種蛋重約20～30g的白殼雙黃雞蛋，消毒水浸洗，在其鈍端用牙鉆切一個直徑約4cm的切口，棄去頂端和內容物。(2)用PBS(青霉素80萬IU/L，鏈霉素100萬IU/L)消毒沖洗2-3次備用。(3)通過背主動脈注射2μL DMEM的方法與上一操作方法相同，將微注射完畢的雞胚輕輕打開轉入代用蛋殼內，小心除去氣泡。(4)清蛋白涂抹在代用蛋殼的邊緣，用保鮮膜封口，鈍端向上放入孵化器。(5)孵化至第18d，停止翻蛋轉入37.5℃培養箱，相對濕度為60％～70％，孵化至出雛。(6)觀察雞胚，當雛雞將喙伸入氣室時用針在保鮮膜上刺幾個小孔以利呼吸，當雛雞的血管已干縮時，將保鮮膜揭去。用培養皿蓋住，等待出雛，對弱雛進行適時助產。
3)自身蛋殼與代用蛋殼相結合方面Kamihira等2005報道新產蛋在0-60h內，在37.8℃，65％的濕度條件，每15min以90度角轉蛋一次。注射前，在種蛋銳端水平切去了一個直徑35mm部分。病毒液以1.5-3.5μL的量注射到胚體或心臟。該實驗蛋在2-3天內，在37.8℃，65％的濕度條件，每30min以90度角轉蛋一次。以后胚再轉移到代用蛋殼(代用蛋殼的準備將另一蛋殼從鈍端切去直徑為45mm部分，胚轉移到該殼中后，以25mg胚的濃度添加稀蛋清和乳酸鈣懸液)。在37.8℃，65％的濕度條件，每小時以30度角轉蛋一次，同時在孵化機中加入純氧氣。孵化率63％，每組樣本數小于20。
郝志明等2006報道了對發育3d的胚胎操作實驗，方法為先用鉛筆在大頭頂端畫一直徑為1.0cm的圓圈，然后用手術刀片沿畫線刻出劃痕，去除蛋殼和殼膜，切口盡量平滑。取預先剝好的直徑約為1.2cm的蛋殼皿(浸泡于加有青霉素和慶大霉素的生理鹽水)，濾紙吸干后蓋在胚蛋/種蛋的開口處，用特配的封口膠進行封口。孵化條件為溫度37.8℃，出雛溫度37.0℃；相對濕度60％；人工翻蛋(6次/d)，轉蛋角±45。每組樣本數低于40，孵化率為33.3％～76.5％，但實驗沒有對照組數據。此外，作者在2005年報道用同樣的方法對未孵化種蛋進行實驗，孵化率竟然是0，這顯然與國內外研究報道不符。
總的來說，目前以上研究方法還存在以下缺陷制作方法復雜煩瑣，無法批量制作，且經實驗操作后種蛋成活率低(一般低于30％)，個別達到60％以上，但樣本含量極少，可操作性不強。
發明內容
針對已有技術存在的上述缺陷，以及孵化率大幅度降低的原因不是微注射，而是種蛋開窗技術(Petitte et.al 1990)，本發明旨在提供一種種蛋自身蛋殼開窗操作和孵化雞胚的技術，雞胚的操作和孵化全部過程在其自身蛋殼中完成，在實驗過程中不必轉移胚胎，無需制作代用蛋殼，制作方法較之前技術簡單方便，可操作性強，而且孵化率大幅度提高。
為實現上述發明目的，本發明提供一種利用種蛋自身蛋殼開窗操作和孵化雞胚的方法，包括種蛋開口、胚胎操作、封口和孵化，所述種蛋開口包括將種蛋消毒后，用開蛋工具在種蛋(1)的外殼(6)上開多邊形或圓形槽(5)，分割開一個多邊形或圓形切塊(3)，不切開內殼膜(8)；將種蛋(1)于無菌條件下用切割工具劃開大部分槽(2)的內殼膜，保留多邊形的一邊或圓的一小段弧(4)的內殼膜，使切塊(3)連同其內側的內殼膜(8)沿多邊形的一邊或圓的一小段弧(4)一側的內殼膜呈鉸鏈狀翻起固定到外殼(6)上，以備通過多邊形或圓形窗口(7)操作胚胎。
所述多邊形或圓形槽(5)中多邊形的一邊或圓的一小段弧(4)的縫寬以翻起切塊時不至于壓壞外殼或扯斷內殼膜為宜。
所述多邊形的一邊或圓的一小段弧(4)依賴臨近一側蛋殼上粘的雙面膠固定在外殼(6)上。所述多邊形或圓形切塊(3)位置處于雞蛋赤道面上。
所述切割工具采用10#解剖刀。
本發明所述方法的詳細步驟包括1)種蛋開口所述種蛋開口包括用開蛋工具在雞蛋赤道面部位開多邊形或圓形切槽，首先切開外殼，不切開內殼膜，多邊形或圓形切口保留內殼膜的一段槽的寬度以切塊能翻起不扯斷內殼膜和破壞切塊為宜，可比槽的其它部分稍寬，同時在該寬槽一側的外殼邊緣粘上膠；將雞蛋于無菌條件下用切割工具劃開大部分槽下的內殼膜，將包含有外殼和內殼膜的切塊沿寬槽，即多邊形的一邊或圓的一小段弧呈鉸鏈狀自由翻起，粘到外殼上，以備胚胎操作；2)胚胎操作通過窗口進行胚胎操作，將細胞液或其它物質注射入囊胚或發育一定時期的胚胎；3)封口剪比切塊大的醫用膜，以切塊為中心直接貼上，稍用力抹平，再在醫用膠帶上涂上一層502膠水；4)孵化創口水平向上平放在蛋架上，轉入孵化器內運行正常孵化程序。
本發明提供的種蛋開窗操作雞胚的技術，制作方法較之前技術簡單方便，可操作性強，而且孵化率高達50％以上。
圖1是本發明實施例中切開多邊形或圓形切塊(以三角形為例)的示意2是本發明實施例中翻開多邊形或圓形切塊(以三角形為例)的示意圖在附圖中1-種蛋2-大部分槽3-切塊 4-多邊形的一邊或圓的一小段弧5-槽 6-外殼7-窗口 8-內殼膜具體實施方式
以切塊為三角形為例在無菌室外，用開蛋器在雞蛋赤道面切邊長約為5mm的三角形，僅切開外殼，不切開內殼膜，靠種蛋銳端切口縫寬大于其它兩邊的縫寬，同時在該寬縫下邊緣粘約1mm2的雙面膠，用于割開切塊內殼膜后翻轉切塊并粘住。
將雞蛋轉入無菌室，用10#解剖刀，劃開縫較窄的兩邊的內殼膜，用刀片將切塊挑起，翻轉約180度通過雙面膠固定到種蛋殼上，用玻璃注射針通過窗口注射目的物質，對胚胎進行操作。
剪比三角形切塊大的1.5cm規格寬的醫用紙膠帶，以切塊為中心直接貼上，稍用力抹平，再在醫用膠帶上涂上一層502膠水后，采取正常孵化程序進行孵化。
參照如下表格，表1為對種蛋實施操作后的實驗結果，表2為國內外同類水平表1
表2
*雞蛋鈍端開窗，破壞了種蛋天然氣室，而且不能最近距離操作雞胚**難度極大根本無法批量制作(見背景技術詳細說明)
權利要求
1.一種利用種蛋自身蛋殼開窗操作和孵化雞胚的方法，包括種蛋開口、胚胎操作、封口和孵化，其特征在于，所述種蛋開口包括將種蛋消毒后，用開蛋工具在種蛋(1)的外殼(6)上開多邊形或圓形槽(5)，分割開一個多邊形或圓形切塊(3)，不切開內殼膜(8)；將種蛋(1)于無菌條件下用切割工具劃開大部分槽(2)的內殼膜，保留多邊形的一邊或圓的一小段弧(4)的內殼膜，使切塊(3)連同其內側的內殼膜(8)沿多邊形的一邊或圓的一小段弧(4)一側的內殼膜呈鉸鏈狀翻起固定到外殼(6)上，以備通過多邊形或圓形窗口(7)操作胚胎。
2.根據權利要求1所述利用種蛋自身蛋殼開窗操作和孵化雞胚的方法，其特征在于，所述多邊形或圓形槽(5)中多邊形的一邊或圓的一小段弧(4)的縫寬以翻起切塊時不至于壓壞外殼或扯斷內殼膜為宜。
3.根據權利要求1或2所述利用種蛋自身蛋殼開窗操作和孵化雞胚的方法，其特征在于，所述多邊形的一邊或圓的一小段弧(4)依賴臨近一側的蛋殼上粘的雙面膠固定在外殼(6)上。
4.根據權利要求1或2所述利用種蛋自身蛋殼開窗操作和孵化雞胚的方法，其特征在于，所述多邊形或圓形切塊(3)位置處于雞蛋赤道面上。
5.根據權利要求1所述利用種蛋自身蛋殼開窗操作和孵化雞胚的方法，其特征在于，所述切割工具采用10#解剖刀。
全文摘要
本發明公開了一種利用種蛋自身蛋殼開窗操作和孵化雞胚的方法，包括種蛋開口、胚胎操作、封口和孵化，其特征在于，所述種蛋開口包括將種蛋消毒后，用開蛋工具在種蛋的外殼上開多邊形或圓形槽，分割開一個多邊形或圓形切塊，不切開內殼膜；將種蛋于無菌條件下用切割工具劃開大部分槽的內殼膜，保留多邊形的一邊或圓的一小段弧的內殼膜，使切塊連同其內側的內殼膜沿多邊形的一邊或圓的一小段弧一側的內殼膜呈鉸鏈狀翻起固定到外殼上，以備通過多邊形或圓形窗口操作胚胎。本發明方法提供的種蛋開窗操作雞胚的技術，制作方法較之前技術簡單方便，可操作性強，而且孵化率高達50％以上。
文檔編號C12N5/06GK101020898SQ20071003425
公開日2007年8月22日 申請日期2007年1月12日 優先權日2007年1月12日
發明者燕海峰, 朱立軍, 肖兵南 申請人:湖南省畜牧獸醫研究所