專利名稱：一種大片段dna克隆載體的構建方法
技術領域：
本發明涉及生物克隆技術，尤其涉及一種簡單快捷構建大片段 DNA克隆載體的方法。
背景技術：
在分子生物學中，克隆DNA片段是一項常規工作。自從Cohen 等(1973)引入質粒pSC101作克隆載體以來，目前已有大量性能優 良的載體質粒被成功構建并實現商業化生產。現在使用的載體除 了 pBR322, pUC系列，pGEM系列，噬菌體，粘粒外，還有酵母人工 染色體，細菌人工染色體等，這些載體雖已被廣泛應用，但由于其 中的外源基因克隆窗口區域的限制性內切酶識別位點不容易替 換，給克隆一些特異DNA片段，尤其是較大的片段，帶來很多困 難。
發明內容
本發明的目的是提供一種新的簡單快捷構建大片段DNA克隆 載體的方法，即LJY法。
本發明的技術方案是提供一種大片段DNA克隆載體的構建方 法，包括以下步驟
(1) 在基準引物VF和VR的5'端添加所需限制性內切酶識 別位點并合成擴增引物V1F和V1R;
(2) 以pBR322為模板，用所合成的擴增引物V1F、 V1R擴增
載體骨架；(3)回收載體骨架片段，溶于3.5ul滅菌的超純水中， 加入反應液1. 1至終濃度為lmM，孵育；
(4) 力Q入5uLDNA Ligation Kit (Mighty Mix),進行連接；
(5) 取(4)連接產物轉化入DH5a感受態細胞中，涂布Amp+ 的LB平板培養基后，于37'C培養14 16h，挑取單菌落于含有 Ampicilline的LB液體培養基中37。C振蕩培養5 6h;
(6) 以擴增引物V1F和V1R為檢測引物，對可疑菌落進行菌 落PCR檢測，取可疑質粒，人為引入特異性限制性內切酶進行酶 切鑒定或測序鑒定，最終得到的陽性重組質粒即為目的載體質粒。
步驟(1)所述的基準引物VF和VR序列分別為 VF: 5， -cggaacatgtgagcaaaa-3，； VR: 5， -cttcaataatattgaa-3，。
步驟(2)所述載體骨架是以pBR322的AmpK基因和ori復制 起始點為骨架。
步驟(2)所述擴增條件為94。C 2min; 98°C 15s， 50°C 15s， 72°C 2min， 30個f盾環；72°C 10min。
步驟(3)所述反應液為10XT4 Polynucleotide Kinase buffer 0.5"、 T4 Polynucleotide Kinase 5U和ATP 0. 5til。
步驟(3)所述孵育是于37'C孵育30min。
步驟(4)所述連接是5'端于25。C反應連接30min或平滑末端 于16。C反應連接30min。
本發明具有以下有益效果
(1) 本發明通過獨特的引物設計方法和平端連接，可簡單快 速地在新構建的克隆載體質粒中引入所需的限制性內切酶識別位 點，并有效地提高載體的外源基因容量和穩定性，避免大片段基 因克隆時常出現的目的基因意外突變等問題。用本發明構建的克 隆載體分子量小，拷貝數較高，以大腸桿菌為寄主，轉化率高；
(2) 多克隆位點的限制性內切酶識別位點可根據需要隨意添 加，比一般的克隆載體質粒靈活性大；
(3) 能插入較大的外源DNA (>8. 2Kb);
(4) 具有容易操作的檢測表型(AmpR);
(5) 以pBR322的AmpR基因和ori復制起始點為骨架，使用 該方法所構建的DNA克隆載體能夠使所插入的外源基因片段較穩 定的復制，包括一些對菌體有毒性的基因；
(6) 本發明自環-平端連接也可以針對重組DNA質粒上的特 定位置設計引物，進行定點突變、短序列的插入或基因的敲除。
圖l本發明自環-平端連接示意圖
具體實施例方式
實施例1
一、材料
1.質粒和菌株pBR322克隆載體(accession No. : J01749)， 用于骨架擴增的模板，購自Takara公司。DH5ct感受態細胞由華 南農業大學禽病教研室保存。
2. 酶和其他試劑T4 Polynucleotide Kinase、 PrimeSTAR HS腿Polymerase禾卩DNA Ligation Kit< Mighty Mix >購自Takara 公司。Gel Extraction Kit和Plasmid mini Kit (200)購自OMEGA 公司。
3. 引物依照pBR322克隆載體序列，設計基準引物(VF， VR) 用于擴增含有Amp和ori的2471-4180區域，由Takara公司合成， 序列為
VF: 5， —cggaacatgtgagcaaaa—3， VR: 5， -cttcaataatattgaa-3，
具體操作步驟
見附圖l連接示意圖，其中A:載體骨架，包括pBR322的AmpR 基因和ori復制起始點；B，C:待引入的限制性內切酶識別位點； VF， VR:基準引物。
(1) 在基準引物(VF, VR)的5'端添加所需限制性內切酶識 別位點并合成擴增引物(VIF， V1R);
(2) 以pBR322為模板，用所合成的擴增引物(V1F， V1R)按 照如下程序擴增出載體骨架94°C 2min; 98°C 15s， 50°C 15s， 72°C 2min， 30個循環；72。C lOmin;
(3) 回收載體骨架片段，溶于3.5P1滅菌的超純水中，向 其中力口入下列反應液10XT4 Polynucleotide Kinase buffer 0. 5 y L， T4 Polynucleotide Kinase 5U ， ATP0. 5 y 1至終濃度為 lmM， 37。C孵育30min;
(4) 加入等量的(5uL) DNA Ligation Kit (Mighty Mix), 25°C 30min(若為平滑末端則推薦使用16°C 30min的連接條件)；
(5) 取連接產物轉化入DH5a感受態細胞中，涂布Amp+的LB 平板培養基后，于37t:培養14—16h，挑取單菌落于含有 Ampicilline的LB液體培養基中37。C振蕩培養5-6h;
(6) 以擴增引物(V1F， V1R)為檢測引物，對可疑菌落進行菌 落PCR檢測，取可疑質粒，用特異性(人為引入)限制性內切酶 進行酶切鑒定或測序鑒定。最終得到的陽性重組質粒即為目的載 體質粒。
權利要求
1、一種大片段DNA克隆載體的構建方法，其特征在于包括以下步驟(1)在基準引物VF和VR的5’端添加所需限制性內切酶識別位點并合成擴增引物V1F和V1R；(2)以pBR322為模板，用所合成的擴增引物V1F、V1R擴增載體骨架；(3)回收載體骨架片段，溶于3.5μl滅菌的超純水中，加入反應液1.5μl至終濃度為1mM，孵育；(4)加入5μ LDNA Ligation Kit(Mighty Mix)，進行連接；(5)取(4)連接產物轉化入DH5α感受態細胞中，涂布Amp+的LB平板培養基后，于37℃培養14～16h，挑取單菌落于含有Ampicilline的LB液體培養基中37℃振蕩培養5～6h；(6)以擴增引物V1F和V1R為檢測引物，對可疑菌落進行菌落PCR檢測，取可疑質粒，人為引入特異性限制性內切酶進行酶切鑒定或測序鑒定，最終得到的陽性重組質粒即為目的載體質粒。
2、根據權利要求1所述的大片段DNA克隆載體的構建方法，其 特征在于步驟(1)所述的基準引物VF和VR序列分別為 VF: 5， —cggaacatgtgagcaaaa-3，； VR: 5， -cttcaataatattgaa-3，。
3、根據權利要求1所述的大片段DNA克隆載體的構建方法，其 特征在于步驟(2)所述載體骨架是以pBR322的AmpK基因和ori 復制起始點為骨架。
4、 根據權利要求1所述的大片段DNA克隆載體的構建方法，其 特征在于步驟(2)所述擴增條件為94°C 2min;98°C 15s，50。C 15s， 72°C 2min， 30個循環；72°C 10min。
5、 根據權利要求1所述的大片段DNA克隆載體的構建方法，其 特征在于步驟(3)所述反應液為10XT4 Polynucleotide Kinase buffer 0. 5uL、 T4 Polynucleotide Kinase 5U禾口 ATP 0. 5ul。
6、 根據權利要求1所述的大片段DNA克隆載體的構建方法，其 特征在于步驟(3)所述孵育是于37。C孵育30min。
7、 根據權利要求1所述的大片段DNA克隆載體的構建方法，其 特征在于步驟(4)所述連接是5'端于25'C反應連接30min或平 滑末端于16。C反應連接30min。
全文摘要
本發明公開了一種簡單快捷構建克隆載體的方法，簡稱LJY法和用此方法已構建好的4個克隆載體。本發明以pBR322的AmpR基因和ori復制起始點為骨架，通過獨特的引物設計方法和平端連接，可簡單快速地在新構建的克隆載體質粒中引入所需的限制性內切酶識別位點，并有效地提高載體的外源基因容量和穩定性，避免大片段基因克隆時常出現的目的基因意外突變等問題。
文檔編號C12N15/66GK101195830SQ20071003296
公開日2008年6月11日 申請日期2007年12月28日 優先權日2007年12月28日
發明者周燕芬, 明 廖, 江經緯, 郁宏偉 申請人:華南農業大學