鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類熒光蛋白質的制備方法

專利名稱：鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類熒光蛋白質的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術中色素蛋白質材料領域，具體涉及鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素 (PEB)的藻藍蛋白類熒光蛋白質的制備方法。
背景技術：
藻膽蛋白(phycobiliproteirO是藍藻和紅藻光合作用捕光復合物的功能組分。根據其 吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、藻紅 藍蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻藍蛋 白(allophycocyanin，簡稱APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亞基，每個亞基 中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半 胱氨酸殘基的巰基共價結合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質。 藻膽色素與脫輔基蛋白共價結合形成特定的構象，使得CPE主要吸收約560nm的可見光，發 射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發射約630nm的熒光；CPC吸收約620nm的 可見光，發射約640nm的熒光；APC吸收約650 660咖的可見光，發射約660 670nm的熒 光。CPE結合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB); PEC的alpha亞基結 合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB); PEC的beta亞基結合的輔基色素 為藻藍膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB); CPC和APC結合的輔基色素都為藻藍膽素PCB。
鏈霉親和素可以跟生物素特異結合，通過鏈霉親和素-生物素系統，可以實現信號放大作 用，提高檢測靈敏度。目前鏈霉親和素-生物素系統已經廣泛應用于生物學檢測和醫療檢測等 領域。目前主要是通過化學交聯實現鏈霉親和素對目標的標記。
CPC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(Tooley A J， Cai Y A, Glazer A N. Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001， 98(19) : 10560 10565)。與 前人的方法不同，我們發現Anabaena sp. PCC7120中aZrt^77基因編碼beta裂合酶，在其 它藍藻中也存在同源的beta裂合酶。這類beta裂合酶不僅能催化藻藍膽素PCB與CPC的beta 亞基及其同源蛋白質的84位半胱氨酸巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價結合生成藻藍蛋白 類熒光蛋白質，還能催化藻紅膽素PEB與CPC的beta亞基及其同源蛋白質的84位半胱氨酸 巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價結合生成一種新型的結合了PEB的藻藍蛋白類熒光蛋白 質。
4藻紅膽素PEB可由HOl、 PebA、 PebB協同催化生成(Alvey, R. M., Karty， J. A. etc. Lesions in Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis in Fremyella diplosiphon Reveal Coordinated Light Regulation of Apoprotein and Pigment Biosynthetic Enzyme Gene Expression. Plant Cell 15 (10), 2448-2463 (2003))。通過基因工程技術，把鏈霉親和素 基因和藻藍蛋白亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于表達載體，可以在大腸桿菌內表達得到鏈 霉親和素和藻藍蛋白亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，直接實現鏈鏈霉親和素和藻藍蛋白亞基脫 輔基蛋白的連接，而不需要通過化學交聯等方法實現鏈霉親和素標記。
藻膽蛋白類熒光蛋白質可以應用于食品、化妝品、醫藥和生物工程領域。藻藍蛋白類熒 光蛋白質具有優良的熒光性質，通過直接實現鏈鏈霉親和素和藻藍蛋白亞基脫輔基蛋白的連 接，可用于生物學檢測以及醫療檢測領域。這種結合PEB的新型藻藍蛋白，為開發新型熒光 探針提供了更多的選擇。本方法為藻藍蛋白類色素蛋白質功能材料應用于食品、化妝品、醫 藥和生物工程領域奠定了基礎。

發明內容
本發明的目的在于提供一種鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類熒光蛋白質的 制備方法。它是應用beta裂合酶催化PEB與鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類脫輔基蛋白共價結 合，從而制備新型藻藍蛋白類熒光蛋白質(天然狀態下藻藍蛋白類脫輔基蛋白是與PCB結合)。 將含有beta裂合酶基因、鏈霉親和素基因和藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接的基因、PEB生 物合成酶基因的表達質粒依次轉入宿主菌，得到相應的工程菌，通過如此設計的基因工程菌 生產新型鏈霉親和素標記的結合PEB的藻藍蛋白類熒光蛋白質。
本發明的技術方案是這樣的 一種鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類熒光蛋 白質的制備方法，包括下述步驟
(1) 用基因工程方法，將beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表達載體中，得到beta 裂合酶表達質粒；
(2) 用基因工程方法，將藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因與鏈霉親和素基因拼 接后克隆于第二個表達載體中，得到鏈霉親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒；
(3) 用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因力o7和peZ^或其同源基因克隆于第三 個表達載體中，得到力o7和peM表達質粒；
(4) 用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因/^似或其同源基因克隆于第四個表達 載體中，得到； eW表達質粒；
(5) 將beta裂合酶表達質粒、鏈霉親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒、力W和peZ^表 達質粒及/ e^表達質粒依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌后，得到相應的工程菌，應用此工程菌通過發酵工程生產鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類熒 光蛋白質；發酵后，按常規蛋白質提純技術，提純得到相應的鏈霉親和素標記的結合藻紅膽 素的藻藍蛋白類熒光蛋白質。
本發明的技術方案也可以是這樣的 一種鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類 熒光蛋白質的制備方法，包括下述步驟
(1) 用基因工程方法，將beta裂合酶基因或其同源基因、藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因 或其同源基因與鏈霉親和素基因拼接后同時克隆于表達載體中，得到beta裂合酶和鏈霉親和 素標記的藻藍蛋白類脫輔基蛋白表達質粒；
(2) 用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因力o/和/ e/^或其同源基因克隆于第二 個表達載體中，得到力o7和peM表達質粒；
(3) 用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因pe似或其同源基因克隆于第三個表達 載體中，得到； eW表達質粒；
(4) 將beta裂合酶和鏈霉親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒、Ao7和/ e65表達質粒及 pe^表達質粒依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌后，得到相應的工程菌， 應用此工程菌通過發酵工程生產鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類熒光蛋白質； 發酵后，按常規蛋白質提純技術，提純得到相應的鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋 白類熒光蛋白質。
上述鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類熒光蛋白質的制備方法中，所述的宿 主菌為大腸桿菌；所述的beta裂合酶基因是指與^ a/we朋sp. PCC7120中alrW77基因同 源的基因；所述的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因是指與^ a^e/7S sp. PCC7120或尨^啦';7M^ sp. PCC7603中cpcS基因同源的基因。
本發明與現有技術相比，具有以下優點
1、 不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質， 大腸桿菌繁殖快，可以大大縮短周期；
2、 與藻類相比，大腸桿菌細胞壁容易破碎，純化過程中可節省能源；
3、 通過大腸桿菌生產，目標蛋白含量高，有His-tag標記，且體系中幾乎沒有性質類似 的蛋白，提取方便；
4、 生成結合PEB的新型藻藍蛋白，具有與天然藻藍蛋白不同的光譜特性，為發展熒光藻 膽蛋白類色素蛋白質功能材料提供更多選擇。


圖1為本發明中Alr0617催化下生成的鏈霉親和素標記的結合PEB的藻藍蛋白類熒光蛋白質的吸收與熒光光譜；其中實線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步地詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。 實施例1
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋Z 譜a sp. PCC7120的全序列已經測定完成， ^ Z3肌7 aws sp. PCC7603和CWot/^i義sp. PCC7601部分序列已經測定。^朋力ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(c/ c^、 WrW77、力o7); 必^j啦'/7os^sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(c/x^); Ca"t力rix sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因。eW和peM)。通過基因工程方法，將」朋6朋朋 sp.PCC7120中的aZrt^77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫 pETDuet-a^^W7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將^朋Z^e朋sp.PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^和鏈霉親和素基因 (簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫pET30-sa-cpcA
鏈霉親和素基因和藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達得到鏈霉親和素 和藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫輔基蛋白藻藍蛋白B。 鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o 和pe/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-p^^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達PebA。
即鏈霉親和素基因幼在pET30中在j/wi和^wn兩個酶切位點之間，脫輔基蛋白基因
印Ci9在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個酶切位點之間；裂合酶基因a7r^W7在pETDuet-1 中，處于第二個多克隆位點和Z力o I之間；PEB合成酶基因是3個(力o厶peZ^和peM)， 力o7和peM在同一個載體pCDFDuet-l中，Zw7在第一個多克隆位點tVco I禾卩Af I之間，peM 在第二個多克隆位點We I和i7 o I之間，peZ^在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點A^II和 i7wl之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5)將pETDuet-aZrt^77、 pET30_sa~cpc& pCDFDuet-力o卜/ eZ^和pACYCDuet-轉 入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養基中，37'C振蕩培養至OD,為0.5至0.8，加入異丙基硫代i3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l鵬ol/L， 20。C至37。C振蕩表 達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收 集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。其吸收與熒光光譜見 附圖1中所示，其中實線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。 將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式如下
從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養基，37°C 振蕩培養過夜;取100pL飽和培養物，無菌轉接至5mL LB培養基，37。C振蕩培養至OD6。。=0. 3 0.4時，將菌液轉移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min;離心lmin (10000g， 4'C)棄去 上清，收集沉淀菌體;用lmL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體，離心30s(10000g， 4°C) 去上清，菌體沉淀用100pL預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰上，加入一定量的構建好 的質粒，混勻后冰浴放置30min， 42。C熱休克90s，冰浴5min后加入300pL LB培養基，37'C 低速振蕩培養45min，無菌涂布在含有相應抗生素的LB培養基平板上，倒置于37"C培養箱至
形成可見的單克隆菌斑。
提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，振蕩培養至飽和；分 別從中取10(VL轉接至5ml含相應抗生素的LB培養基中；37。C振蕩培養至0D6。。=0. 5-0. 7時， 冰浴約30min，加入IPTG誘導表達；避光、2(TC、 150轉/分，表達約12小時。離心收集細 胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產物熒光量，選取熒光產量高的菌株進行大量表 達。
實施例2
(1)從GeneBank中可以査到，藻種^ Wae朋sp.PCC7120的全序列已經測定完成， 7az7i"os"s sp. PCC7603和Ca7"力Wzsp. PCC7601部分序列已經測定。^ a/we朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(cpM、 alrt W7、力o/);尨7a啦'/7os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(cpc5); CaJo^rk sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(/^W和；^力歷。通過基因工程方法，將力朋力ae朋 sp.PCC7120中的WrW77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫 pETDuet-s^^W;7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將z/朋力se朋sp.PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^(C1551)和鏈霉親和 素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫 pET30-ss-c/xW(C1551)，鏈霉親和素基因和藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌 中能表達得到鏈霉親和素和藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫輔 基蛋白藻藍蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-/w7-/ eM，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即鏈霉親和素基因ss在pET30中在J/w I和5^11兩個酶切位點之間，脫輔基蛋白基因 c/ Ci (C155I)在pET30中是在fcoRV和i7 o I兩個酶切位點之間；裂合酶基因WrW"在 pETDuet-1中，處于第二個多克隆位點5g7II和J/wI之間；PEB合成酶基因是3個(力o厶 peZ^和peM)，力o7和peM在同一個載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個多克隆位點辰o I和 尸st I之間，； eZ^在第二個多克隆位點AWe I和J力o I之間，peM在pACYCDuet-l中第二個多 克隆位點和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: 1混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5 ) 將 pETDuet-aZrM77 、 pET30-sa^/ cMC1551) 、 pCDFDuet-力o卜/)eZ^和pACYCDuet-/^M轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工 程菌接種于pH 7. 0的LB培養基中，37。C振蕩培養至OD,為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thiof D-galactoside,簡稱IPTG)至終濃度為1畫1/L, 20。C至37 'C振蕩表達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B; 離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過N;T親和層析，可提 純得到相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例3
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種J朋6ae朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， 7syz y/7oms sp. PCC7603和Cs7"力ri;r sp. PCC7601部分序列己經測定。^ s力ae朋sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(cpc5、 a〗r0577、 Zw7);
Ja肌'"os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(cpc^); Ca"t力riz sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和peZ^)。通過基因工程方法，將力/7a力a朋a sp.PCC7120中的aZn9W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫 pETDuet-^ZiY^7T;在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將^7atee朋sp.PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^和鏈霉親和素基因 (簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pC0LADuet中，所得質粒叫
pC0LADuet-幼-cpcA鏈霉親和素基因和藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能 表達得到鏈霉親和素和藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫輔基蛋 白藻藍蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-/w7-; e/^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即鏈霉親和素基因幼和脫輔基蛋白基因c/ c^拼接后連接到pC0LADuet的fcoR I和戶W I之間；裂合酶基因Wr(^77在pETDuet-l中，處于第二個多克隆位點^^1I和J力oI之間；
10PEB合成酶基因是3個(力o入pe^和/jeZ^)，力o/和/ e/^在同一個載體pCDFDuet-l中，力W 在第一個多克隆位點I和At I之間，peM在第二個多克隆位點yWe I和J/w I之間，pe似 在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點5^711和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5)將pETDuet-aZrW77、 pC0LADuet_sa~c; c5、 pCDFDuet-力o7-; e/^和pACYCDuet-/pe似 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH 7. 0 的LB培養基中，37。C振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (is叩rophyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振蕩表 達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收 集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Nr親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例4
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力朋6譜a sp.PCC7120的全序列已經測定完成， ^肌'/7oms sp. PCC7603和CW"/ n'xsp. PCC7601部分序列已經測定。力朋力ae朋sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(cpc仏a^^/A 必h/z i/30s"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(c/ cS); 6kZot/^j';f sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和pe6i9)。通過基因工程方法，將^/7aZ ae朋 sp. PCC7120中的sZrt W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫 pETDuet-WrM7 7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將^Ws朋a sp.PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5 (C155I)和鏈霉親
和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pC0LADuet中，所得質粒叫pC0LADuet-ss-c/x^(C1551)，鏈霉親和素基因和藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸 桿菌中能表達得到鏈霉親和素和藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的 脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和/7eM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-pe65，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-pe力A在大腸桿菌中能表達PebA。
即鏈霉親和素基因ss和脫輔基蛋白基因cpcA(C1551)拼接后連接到pCOLADuet的fcoR I和尸"I之間；裂合酶基因WrWW在pETDuet-l中，處于第二個多克隆位點份7II和J力o I之間；PEB合成酶基因是3個(力o7、 ； eM和pe/^)，力o7和peZ^在同一個載體pCDFDuet-1 中，力o7在第一個多克隆位點I和尸"I之間，peM在第二個多克隆位點yVofe I和i7 o I 之間，/ eW在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點和J/ o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5 )將pETDuet-aZrt ^/7、 pCOLADuet-stc;x^(Cl551) 、 pCDFDuet-力o7-peZ^禾口 pACYCDuet-peW轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工 程菌接種于pH 7. 0的LB培養基中，37。C振蕩培養至0D柳為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腸1/L， 20。C至37 。C振蕩表達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B; 離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提 純得到相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例5
(1)從GeneBank中可以査到，藻種力朋6ae朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， 7柳i/jasiAS sp. PCC7603和CaJ"/ n>sp. PCC7601部分序列已經測定。^ a6ae/ a sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(c/ c仏a7/^W7、 Z o7);屈J柳j'y70MS sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(c/5c^); CaJ"/ ri;r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe^和pe/^)。通過基因工程方法，將力/7a力ae朋 sp. PCC7120中的a^W77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第二位點，藻藍蛋白類脫 輔基蛋白基因cpc^和鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的pETDuet-1 中第一位點，所得質粒叫pETDuet-sa-cpc5 -^/^^7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶以 及鏈霉親和素和藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和/ e/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達PebA。
即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因cpcZ 拼接后連接到pETDuet的I和尸W I 之間，a^^W7處于第二個多克隆位點^^1I禾[]i7 oI之間；PEB合成酶基因是3個(力o入
和pe/ 5)， / o7和peM在同一個載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個多克隆位點Afco I和 尸"I之間，peZ^在第二個多克隆位點yWe I和I之間，在pACYCDuet-1中第二個多 克隆位點5WI1和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: 1混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pETDuet-sa"C/)c5"a7^rt W7、 pCDFDuet-力o7-/ e/^和pACYCDuet-peiM轉入大腸桿 菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH 7.0的LB培 養基中，37。C振蕩培養至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小時， 生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應的鏈霉親和 素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例6
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋力朋朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， M Ja則7 as"s sp. PCC7603和CaJo^ W義sp. PCC7601部分序列已經測定。加a力3e朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(c/ M、 W/^W7、力o7); 必Ja肌'/7ows sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(cpc"); CaJoMrix sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679,可從所査到序列中找到所需基因(peM和peM)。通過基因工程方法，將力/7aZ^e/ a sp. PCC7120中的alrt W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第二位點，藻藍蛋白類脫 輔基蛋白基因c/ "(C155I)和鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的 pETDuet-1中第一位點，所得質粒叫pETDuet-sa-cpcMC155I) -a^W77，在大腸桿菌中能表 達beta裂合酶以及鏈霉親和素和藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和pe/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達PebA。
即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因(C155I)拼接后連接到pETDuet的^boR I和之間，a^rt^ 7處于第二個多克隆位點^ /II和Z/ o1之間；PEB合成酶基因是3 個(力o厶pe/W和peM)，力o7和peM在同一個載體pCDFDuet-1中，Z o7在第一個多克隆位 點yVco I和尸"I之間，pe/^在第二個多克隆位點We I和J力o I之間，在pACYCDuet-1 中第二個多克隆位點^711和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同
樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: 1混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4)將pETDuet-ss"c; c5(C155I)-aZrt W7、 pCDFDuet—Z o7-; eZ^和pACYCDuet—轉 入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養基中，37。C振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腦1/L， 20。C至37。C振蕩表 達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收 集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例7
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋6ae朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， 7ayw'/70s"s sp. PCC7603和CWotAriz sp. PCC7601部分序列已經測定。力/7a6ae"a sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(cpc5、 aJr^577、 Zw7); #. ^啦7 os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(c/ c"); sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為
AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe^和peM)。通過基因工程方法，將勱a&朋a sp.PCC7120中的alrt^77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫 pETDuet-WrOW 7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將#. h肌'/JO幼s sp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因c/9cS和鏈霉親和素 基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫pET30-幼-cpc5， 鏈霉親和素基因和藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達得到鏈霉親和素 和藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/w/和pe6幼克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-pe65，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得
質粒叫pACYCDuet-pe似，在大腸桿菌中能表達PebA。即鏈霉親和素基因M在pET30中在I和5g7II兩個酶切位點之間，脫輔基蛋白基因 cpM在pET30中是在fcoRV和兩個酶切位點之間；裂合酶基因a7/^W7在pETDuet-l 中，處于第二個多克隆位點^§^11禾卩i7wl之間；PEB合成酶基因是3個(/ o7、； eZ^和peZ^)， 力o7和peZ^在同一個載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個多克隆位點Afco I和尸st I之間，/ eM 在第二個多克隆位點yVA I和Z/w I之間，； eZ^在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點S《Jn和 之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5)將pETDuet-a&W77、 pET30-sa~c;x^、 pCDFDuet-Z o卜/ e/ i9和pACYCDuet-/ eW轉 入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養基中，37。C振蕩培養至0仏。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1國1/L， 20'C至37'C振蕩表 達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收 集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例8
(1)從GeneBank中可以查到，藻種J/7^aey a sp.PCC7120的全序列已經測定完成，
yK Ja/w'/7as"s sp. PCC7603和CaJ"力rj';f sp. PCC7601部分序列已經測定。^7aZ7朋"a sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(c/ c仏alrt 《77、 Z o7);
尨7az i/70幼s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序
列中找到所需基因(cpc扔；6k ot/jri;r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為
AY363679，可從所查到序列中找到所需基因。aW和/ eZ^)。通過基因工程方法，將」朋6朋朋
sp.PCC7120中的a7r^77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得質粒叫
pETDuet-W/^W7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通
過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將必7s啦'/ o^As sp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^(C1551)和鏈霉 親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫 pET30-sa-c;x^(C1551)，鏈霉親和素基因和藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌 中能表達得到鏈霉親和素和藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫輔 基蛋白藻藍蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和/ e力萬)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-peM，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/ e/W)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即鏈霉親和素基因sa在pET30中在A>71和^^1I兩個酶切位點之間，脫輔基蛋白基因 c/ Ci (C155I)在pET30中是在fcoRV和7力o I兩個酶切位點之間；裂合酶基因a7r^W7在 pETDuet-l中，處于第二個多克隆位點5WII和J/wI之間；PEB合成酶基因是3個(力o厶 peM和peZ^)，力o7和peM在同一個載體pCDFDuet-l中，力o7在第一個多克隆位點I和 尸"I之間，/ e^9在第二個多克隆位點Afate I和J/ o I之間，在pACYCDuet-1中第二個多 克隆位點和Wo I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別
帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把
所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同
樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在
T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5 ) 將 pETDuet-alr( W;7 、 pET30-sa~c/ cMC155I) 、 pCDFDuet-力o7-/ eZ^和
pACYCDuet-v^W轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工
程菌接種于pH 7. 0的LB培養基中，37。C振蕩培養至OD腳為0. 5至0. 8,加入異丙基硫代-(3-D-
半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37
'C振蕩表達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;
離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提
純得到相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。(1) 從GeneBank中可以査到，藻種J/7a6ae/ a sp. PCC7120的全序列已經測定完成， #. Ja/w'"osus sp. PCC7603和C^"力ri義sp. PCC7601部分序列已經測定。A atee/ a sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(cpc5、 WrM77、力o7); M h/w'/70s^ sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(c; c^); C37"力ri;r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679,可從所査到序列中找到所需基因。e^和pe/^)。通過基因工程方法，將力朋6ae/ja sp. PCC7120中的W/^5/7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫 pETDuet-aJ/Y^77，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將屈^M7i/7os^ sp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5和鏈霉親和素 基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pCOLADuet中，所得質粒叫 pCOLADuet-sa-c;^A鏈霉親和素基因和藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能 表達得到鏈霉親和素和藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫輔基蛋 白藻藍蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe/ S)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-pe力5，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(pe/W)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-pe^，在大腸桿菌中能表達PebA。
即鏈霉親和素基因幼和脫輔基蛋白基因cpc5拼接后連接到pCOLADuet的I和戶" I之間；裂合酶基因W/^W7在pETDuet-l中，處于第二個多克隆位點i5^7ll和i7wl之間； PEB合成酶基因是3個(力o7、 pe/W和pe65)，力o7和； e/^在同一個載體pCDFDuet-1中，力o7 在第一個多克隆位點/Vco I和尸W I之間，peM在第二個多克隆位點AWe I和i7 o I之間，peM 在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點j5^II和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別
帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把
所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同
樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: 1混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5)將pETDuet-aZrt W7、 pC0LADuet-sa"C/ c5、 pCDFDuet-/ o/—/ eZ^禾口 pACYCDuet-pe似 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養基中，37。C振蕩培養至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1畫1/L， 20。C至37。C振蕩表 達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收 集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例10
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種」/7a力ae朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， 必73/wV osiAs sp. PCC7603和CaJ"/ r&sp. PCC7601部分序列已經測定。^ 3tee/7asp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(cpM、 Wr。677、力o7);
Ja/w'/7osiAS sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(cpc幼；Ca7o^n'x sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679,可從所查到序列中找到所需基因(peM和pe力A)。通過基因工程方法，將v^a力a朋a sp.PCC7120中的WrOW7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫 pETDuet-aJi^W7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將J/.h犯'如幼ssp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpM(C1551)和鏈 霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pCOLADuet中，所得質粒叫 pC0LADuet-sa-c;x^(C1551)，鏈霉親和素基因和藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸 桿菌中能表達得到鏈霉親和素和藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的 脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe6幼克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質粒 叫pCDFDuet-力o卜pe/^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pe似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達PebA。
即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因cpc^(C1551)拼接后連接到pCOLADuet的^boR I和尸WI之間；裂合酶基因WrW77在pETDuet-1中，處于第二個多克隆位點5^711和J力o I之間；PEB合成酶基因是3個(力o入pe似和； eM)，力o7和； eM在同一個載體pCDFDuet-l 中，力o7在第一個多克隆位點I和Af I之間，/^Z^在第二個多克隆位點AWe I和i7 o I 之間，pe似在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點勘/ II和i7w I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5 )將pETDuet-alr0^/7、 pCOLADuet-sa^c; t^(C1551) 、 pCDFDuet-力W-pe/^和 pACYCDuet-z^W轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工 程菌接種于pH 7. 0的LB培養基中，37'C振蕩培養至0D6。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37 'C振蕩表達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B; 離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提 純得到相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例11
(1)從GeneBank中可以査到，藻種七Wae朋sp.PCC7120的全序列已經測定完成，
vK 7a/w'加s〃s sp. PCC7603和CaJ"/ rj>sp. PCC7601部分序列已經測定。^朋力ae/ a sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(c; c5、 a&W77、力o7);
必Ja/w'/7M^ sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序
列中找到所需基因(cpc5); CW"力rj'義sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為
AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe^和pe/^)。通過基因工程方法，將^7a^e朋
sp. PCC7120中的aZrt W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中第二位點，將# 7柳i"os"s
sp. PCC7603中藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5和鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于
Novagen公司的pETDuet-1中第一位點，所得質粒叫pETDuet-sa-cpc萬-aZrM77，在大腸桿
菌中能表達beta裂合酶以及鏈霉親和素和藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白。根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和/ eM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-/w7-pe/^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/ e/W)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-z eM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即鏈霉親和素基因ss和脫輔基蛋白基因c/x^拼接后連接到pETDuet的I和At I 之間，s&W77處于第二個多克隆位點《WII和i7wl之間；PEB合成酶基因是3個(力o厶
和/7eM)，力o7和peM在同一個載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個多克隆位點Abo I和 I之間，； e/^在第二個多克隆位點M/e I和J力o I之間，pe^在pACYCDuet-1中第二個多 克隆位點i 《Jn和/力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pETDuet-sa"cpc^"sZrt W7、 pCDFDuet-Z o7-peZ^和pACYCDuet-/ e/W轉入大腸桿 菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的LB培 養基中，37'C振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37。C振蕩表達約12小時， 生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加 入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的鏈霉親和 素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例12
(1)從GeneBank中可以查到，藻種細te簡sp.PCC7120的全序列已經測定完成，
髮/柳i/ M"ssp. PCC7603和CaJ"Arj> sp. PCC7601部分序列已經測定。^ atee朋sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(cpc仏aJr( W7、力oO;尨J柳/y7osiA9 sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(c/ Ci9); C^W/7/7> sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因。eW和peZ^)。通過基因工程方法，將力/73力ae朋 sp. PCC7120中的WrW77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中第二位點，將尨/a歷i/70 ^ sp. PCC7603中藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因c;^^(C155I)和鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接 后克隆于N。vagen公司的pETDuet-l中第一位點，所得質粒叫pETDuet-sa-cpc取C1551) -W^^77，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶以及鏈霉親和素和藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合 蛋白。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和pe65)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-pe65，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因。e似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-; eW，在大腸桿菌中能表達PebA。
即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因c/ M (C155I)拼接后連接到pETDuet的fcoR I和尸WI之間，a^^《77處于第二個多克隆位點SWn和之間；PEB合成酶基因是3 個(力o厶/ eZ^和/ e65)， / W和； e/^在同一個載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個多克隆位 點yVco I禾n尸"I之間，pe6S在第二個多克隆位點AWe I和J/ o I之間，pe^在pACYCDuet-1 中第二個多克隆位點AWII和i7 o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pETDuet-stcpc》(C155I)-a7/^W7、 pCDFDuet-力o7-/ e65和pACYCDuet-/ eM轉 入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養基中，37。C振蕩培養至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷
(isoprophyl thio-卩-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收 集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。 將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
上述制備方法適用于采用各種藍藻中的beta裂合酶、藻藍蛋白類脫輔基蛋白、藻紅膽素 生物合成酶基因或其同源基因來制備鏈霉親和素標記的結合PEB的藻藍蛋白類熒光蛋白質， 但涉及到微生物菌種公開的問題，本發明只選用了 GenBank中已公開全序列的藍藻A7a&e朋 sp. PCC7120和已經部分測序的尨J柳i/ ows sp. PCC7603和(^Jo^ n> sp. PCC7601為例對 本發明方法加以說明，本領域的技術人員可以根據上述公開的內容采用其它原料實施本發明。
權利要求
1. 一種鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類熒光蛋白質的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1)用基因工程方法，將beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表達載體中，得到beta裂合酶表達質粒；(2)用基因工程方法，將藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因與鏈霉親和素基因拼接后克隆于第二個表達載體中，得到鏈霉親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒；(3)用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因hol和pebB或其同源基因克隆于第三個表達載體中，得到hol和pebB表達質粒；(4)用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆于第四個表達載體中，得到pebA表達質粒；(5)將beta裂合酶表達質粒、鏈霉親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒、hol和pebB表達質粒及pebA表達質粒依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌后，得到相應的工程菌，應用此工程菌通過發酵工程生產鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類熒光蛋白質；發酵后，按常規蛋白質提純技術，提純得到相應的鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類熒光蛋白質。
2. —種鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類熒光蛋白質的制備方法，其特征在 于包括下述步驟(1) 用基因工程方法，將beta裂合酶基因或其同源基因、藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因 或其同源基因與鏈霉親和素基因拼接后同時克隆于表達載體中，得到beta裂合酶和鏈霉親和 素標記的藻藍蛋白類脫輔基蛋白表達質粒；(2) 用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因力o7和；^/^或其同源基因克隆于第二 個表達載體中，得到力W和peM表達質粒；(3) 用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因或其同源基因克隆于第三個表達 載體中，得到peW表達質粒；(4) 將beta裂合酶和鏈霉親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒、力W和/^Z^表達質粒及 peM表達質粒依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌后，得到相應的工程菌， 應用此工程菌通過發酵工程生產鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類熒光蛋白質； 發酵后，按常規蛋白質提純技術，提純得到相應的鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋 白類熒光蛋白質。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌為大腸桿菌。
4. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的beta裂合酶基因是指與力朋&e朋sp. PCC7120中aZrt W7基因同源的基因。
5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因是 指與力y a6ae朋sp. PCC7120或M ^/w';70幼s sp. PCC7603中c; c5基因同源的基因。
全文摘要
本發明公開了一種鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類熒光蛋白質的制備方法，通過應用藻膽蛋白beta裂合酶催化藻紅膽素與鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類脫輔基蛋白共價結合，制備鏈霉親和素標記的結合PEB的藻藍蛋白類熒光蛋白質。本發明的方法應用生物過程生產藻藍蛋白類熒光蛋白質，是一種環境友好的生產方法。藻藍蛋白類熒光蛋白質能應用于食品、保健與醫藥功能材料領域，特別是應用為生物和醫學分子監測領域的熒光探針。
文檔編號C12N15/60GK101469332SQ20071003293
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月27日 優先權日2007年12月27日
發明者佟順剛, 明 周, 坤 夏, 趙開弘 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發有限公司;華中科技大學