專利名稱：鑒別尖頭蟲草的特征性核苷酸序列和方法
技術領域：
本發明屬于利用分子生物學方法檢測中藥材真偽的技術領域。具體的說，是用于鑒別尖頭蟲草 Cora^e戸o砂c印/w/a Penz. et Sacc.的特征性核苷酸序列以及核酸分子探針和鑒別尖頭蟲草的方法。
背景技術：
尖頭蟲草Cor辦ce;w oxyc印/w/a Penz. et Sacc.是屬于蟲草屬(C0W7ceps)的一種蟲生真菌，該屬真菌還包 括冬蟲夏草[Cor辦ce/w w'"m^(Berk)Sacc]以及蛹蟲草[Cor辦ce/w /m7/ton\s (L.) Link]。野生冬蟲夏草用于中藥 已有兩千年的歷史，普通民眾俗稱的蟲草即為冬蟲夏草，具有保肺腎、補精髓、化痰止勞咳的作用，常食 可促進消化、調節免疫功能，增強人體抵抗力。冬蟲夏草產于青藏高原，產量相對較大，但隨著逐年的瘋 狂采挖，導致生態環境遭到破壞，引起國家重視，現已禁止采挖，引起價格的大幅上漲。但由于人工發酵 菌絲生產冬蟲夏草菌粉周期長達40天以上，且條件苛刻，成本很高，同時子實體至今仍然無法人工栽種， 故尋找和開發冬蟲夏草的替代品成為蟲草資源開發與應用的重要方向。蛹蟲草又稱北蟲草或北冬蟲夏草， 具有益肺腎，補精髓，止血化痰的功能，與冬蟲夏草具有相似的溫補特性，同時含有冬蟲夏草中含量極低 的蟲草素。由于蛹蟲草菌絲的發酵生產以及子實體的栽培均比冬蟲夏草容易，故蛹蟲草的生產與栽培已形 成相當的規模，市場銷售有了突破性的增長。尖頭蟲草與前面兩者具有相似的功能，而且菌絲發酵與子實 體栽培都很容易，完全具有開發為蟲草新產品的價值。因此可以快速而準確的鑒別尖頭蟲草菌絲、子實體 以及相關制品真偽的方法和技術將對于尖頭蟲草生產相關企業以及相關檢驗機構具有重要的意義。DNA是生物儲存遺傳信息的物質，每個生物物種乃至個體均具有獨特的特征性核苷酸序列，可以作 為該生物物種或個體區別與其他物種或個體的標志。DNA是細胞生物的基本組成部分，作為遺傳信息的 載體，具有一定的穩定性，不會受表形的影響而改變，是用來鑒別物種、個體的可靠依據。通過生物信息 學的分析可以找到不同物種或個體的特征性核苷酸序列，利用分子生物學的手段對該序列進行探測即可快 速、準確的對物種或個體進行鑒別。目前，己有用于鑒別冬蟲夏草的核苷酸特征性序列獲得專利，但并未 見與尖頭蟲草鑒別相關的核苷酸特征性序列的專利。發明內容本發明提供利用分子生物學手段鑒別尖頭蟲草的所需的特征性核苷酸序列以及方法，它可以直接從遺 傳本質上鑒別尖頭蟲草菌絲、子實體以及相關制品的真偽。具體包括1、用于分子鑒別尖頭蟲草的特征 性核苷酸序列；2、來源于上述特征性序列的尖頭蟲草專一性核苷酸分子探針；3、包含上述分子探針的用 于鑒別尖頭蟲草的試劑盒；4、利用上述特征性核苷酸序列、核苷酸分子探針以及試劑盒鑒別尖頭蟲草的 方法。本發明提供的用于分子鑒別尖頭蟲草的特征性核苷酸序列來源于尖頭蟲草核糖體rRNA內轉錄間隔區 (以下簡稱ITS)以及5.8S rRNA基因(核糖體rRNA內轉錄間隔區以及5.8S rRNA基因合并簡稱ITS區)， 其序列(SEQIDNO.l)所在位置以及特征見圖1及序列表，該序列包含尖頭蟲草的ITS1、 5.8SrDNA以及ITS2的序列。該序列可通過實施例1所述方法獲得，亦可通過人工合成的方法在商業化的DNA合成儀 器上按照發明人提供的核苷酸順序合成。本發明的尖頭蟲草專一性核苷酸分子探針是以上述尖頭蟲草的特征性核苷酸序列(SEQIDNO.l)為 模板而設計得到的全長序列或不少于16個核苷酸組成的寡核苷酸序列，以及在上述全長序列或寡核苷酸 序列的基礎上經修飾、加工、變化而獲得核苷酸序列，也包括在上述全長序列或寡核苷酸序列的基礎上在 5'端添加或改變10個核苷酸以下或改變原有核苷酸序列數量小于10%以及3'端6個核苷酸改變不足1個 核苷酸的核苷酸序列。上述序列可通過DNA自動合成儀等DNA合成裝置按照設計好的順序合成而獲得， 并可以通過酶、同位素、生物素、化學熒光素、熒光劑等方式進行標記。本發明提供了優選的兩個尖頭蟲草專一性核苷酸分子探針Probe I及Probe II，其序列分別為SEQ ID NO，2和SEQ IDNO.3,其具體位置見圖2。該序列同樣適用于上述修飾、加工與變化、添加酶切位點、 改變部分核苷酸序列以及標記等操作。本發明提供的上述探針具有極高的專一性，可以與尖頭蟲草發生專一性的反應而不與其他種類的蟲草 或其他真菌發生反應。利用上述探針通過PCR的方法或核酸雜交的方法可以快速的對尖頭蟲草的菌絲、子 實體以及相關的制品進行檢測，從而快速鑒別尖頭蟲草。本發明還提供一種有尖頭蟲草專一性核酸分子探針和相關PCR引物及試劑組成的尖頭蟲草專一性鑒 定試劑盒，包括1、兩個優選的尖頭蟲草專一性核苷酸分子探針(Probe I及Probe II); 2、兩個蟲草菌ITS 通用引物；3、尖頭蟲草DNA提取試劑。其中，兩個蟲草菌的通用引物是CorF(SEQIDNO,4)和CorR(SEQ ID NO. 5)。所述的尖頭蟲草DNA提取試劑為尿素提取液，其成分為SDS 1.5%,尿素7mol/L，Tris-HCl pHS.O 0.05mol/L, NaCl 0.5mol/L。利用本試劑盒通過常規的PCR方法即可準確、快速的鑒定尖頭蟲草。本發明提供的尖頭蟲草鑒定方法包括核酸雜交以及PCR的方法。核酸分子雜交發采用前面所述的尖頭蟲草專一性的核酸分子探針，通過核酸分子雜交的方式(例如 Southern雜交或點雜交)對尖頭蟲草及相關制品進行鑒定。具體步驟和過程(包括探針的制備、標記以及 待測樣品的處理)按照常規的分子生物學方法進行。其中，尖頭蟲草的菌絲、子實體以及相關制品可以直 接進行檢測也可以先進行DNA的提取與擴增后再進行檢測。PCR方法采用前面所述的尖頭蟲草專一性的核酸分子探針Probe I及Probe II作為一組PCR引物， 以如前所述蟲草菌ITS區通用引物CorF及CorR作為陽性對照組的PCR引物，分別利用上述兩組引物按 照常規的PCR方法擴增待測樣品，兩者均能擴增到特異性DNA片段的樣品即為尖頭蟲草，其中利用Probe I及Probe II獲得的DNA片斷長為346bp，利用CorF及CorR獲得的DNA片斷長為540bp左右。僅蟲草 菌ITS通用引物CorF及CorR能夠得到特異性片段而本發明提供的尖頭蟲草專一性的核酸分子探針組成的 PCR引物Probe I及Probe II不能擴增到特異性DNA片段的樣品則不是尖頭蟲草樣品。其中，PCR反應可 以利用本發明所述的試劑盒中的試劑或按照常規的分子生物學方法提取的尖頭蟲草樣品總DNA作為模 板，也可以直接挑取少量的尖頭蟲草樣品加入PCR反應體系作為模板。本發明由于有采用DNA序列作為檢測標記，因此可以準確快速檢測未知樣品是否為或含有尖頭蟲草， 其中樣品可以為菌絲體、子實體及其粉碎加工產品以及包含有尖頭蟲草的中成藥制劑、保健品。采用PCR 方法檢測時，所需樣品量極少，方法簡單，半天內可完成檢測。
圖l是核糖體rRNA基因結構示意圖，其中標示為ITS區的范圍為本發明涉及的DNA序列，即核糖 體rRNA內轉錄間隔區以及5.8S rRNA基因；圖2是本發明所述的尖頭蟲草特征性核苷酸序列全序列以及優選的兩個尖頭蟲草專一性核苷酸分子 探針Probe I及Probe II的位置圖，該圖顯示ITS區正鏈序列，左側為5'端，右側為3'端，其中加粗及下劃 線部分分別為ProbeI (13bp-32bp，位于正鏈上)及Probe II (359bp-340bp,位于負鏈上)；圖3是實施例3中的PCR反應結果示意圖，其中l為蟻蟲草，2為古尼蟲草，3為蛹蟲草，4為尖頭 蟲草，5為蜂頭蟲草，M為1Kb+100bpDNA分子量標準， 一為空白對照；圖4是實施例4中的PCR反應結果示意圖，其中l為蟻蟲草，2為古尼蟲草，3為蛹蟲草，4為尖頭 蟲草，5為蜂頭蟲草，M為1Kb+100bpDNA分子量標準，一為空白對照。
具體實施方式
實施例1尖頭蟲草rRNA內轉錄間隔區以及5.8S rRNA基因的制備取尖頭蟲草樣品0.1-0.5g,液氮中研磨成粉，加入300^1尿素提取液(SDS 1.5%，尿素7mol/L， Tris-HCl pH8.0 0.05mol/L， NaCl 0.5mol/L)，移入1.5ml微型離心管中，在液氮中冷卻，迅速移到65'C融化。反復 凍融3 5次后，加入等體積的酚氯仿異戊醇(25: 24: 1)，震蕩，13000r/min離心10min，上清移入新 管中加入等體積氯仿異戊醇(24: 1),震蕩，13000r/min離心10min,上清移入新管中加入微量Rnase A， 37。C保溫30min，加入3倍體積無水乙醇，3MNaAc (pH5.2)， .2(TC放置至少30min后，13000rpm離心15min, 回收DNA沉淀，用70%乙醇和無水乙醇洗滌，抽干或風干，每管加入50ulTE(100mmol/LTris-Cl， 10mmol/L EDTA， pH8.0)回溶，獲得總DNA。取0.2ml PCR管一支，加入20ul PCR反應液(包括10xPCR緩沖液2ul， 引物CorF、 CorR各40ng， 2mmol/L dNTP lul， Taq酶l個單位，加超純水至20ul)，加入0.5ul尖頭蟲草 總DNA提取液，閉緊管蓋，置于PCR儀上按以下程序進行PCR反應94°C預變性3min，然后93°C 變性lmin， 55。C復性lmin， 72°C延伸2min,共30個循環，最后72°C延伸10min。反應完成后利用商 業化的純化試劑盒進行產物的純化并直接在DNA測序儀上測序。獲得核苷酸序列除去18S rRNA基因以 及28S rRNA基因序列后所得到的序列即為尖頭蟲草rRNA內轉錄間隔區以及5.8S rRNA基因的序列如序 列表1所示。實施例2尖頭蟲草專一性探針(引物)Probe I及Probe II的制備將尖頭蟲草的ITS區序列與其他蟲草菌的同源序列進行比較，獲得最適于鑒別尖頭蟲草寡核苷酸片段 組成與排列順序，即Probe I及Probe II (如圖2所示Probe I位置是13bp-32bp，位于正鏈上，Probe II位 置是359bp-340bp，位于負鏈上)。根據Probe I及Probe II的核苷酸排列和組成可以在商業化的DNA合成 儀上通過化學合成的方法合成如序列表2、序列表3所載序列，即可用作專一性PCR引物。再此基礎上， 可以利用常規的分子生物學方法利用酶、同位素、生物素、化學熒光素、熒光劑等對Probe I及Probe II進 行標記，即可用做雜交用探針。實施例3鑒定尖頭蟲草的正對照試驗本試驗用以確定DNA樣品符合PCR要求可獲得特異性PCR產物。方法l:總DNA提取以及PCR反應皆參照實施例l進行，對不同的樣品分別提取DNA，并在同一條件下進行PCR擴增，其中包括不添加模板的空白實驗，擴增的產物在2%的含有DNA染料的瓊脂糖凝膠 上進行電泳，在適當的光源下査看以及拍照。方法2:用牙簽直接挑取適量樣品(菌絲、粉碎子實體、粉碎的相關制品)在裝20ul超純水的0.2 ml PCR 管種攪動，并分別稀至0.1倍以及0.01倍，取2ul上述三個濃度的樣品懸濁液加入含有20ulPCR反應液(包 括10xPCR緩沖液2ul，引物CorF、 CorR各40ng， 2mmol/L dNTP lul, Taq酶l個單位，加超純水至20ul) 的0.2mlPCR管中，充分混勻閉緊管蓋，其中包括不添加樣品的空白實驗，全部PCR管置于PCR儀上進 行如下PCR反應94°C預變性3min,然后93°C變性lmin, 55°C復性lmin， 72°C延伸2min，共30 個循環，最后72°C延伸10min。擴增的產物在2%的含有DNA著色劑的瓊脂糖凝膠上迸行電泳，在適當 的光源下查看以及拍照。圖3為按方法1進行的實驗結果，顯示五種蟲草(l為蟻蟲草，2為古尼蟲草，3為蛹蟲草，4為尖頭 蟲草，5為蜂頭蟲草)均可正常的擴增得到ITS區DNA特異性片段，該結果表明五種待測蟲草提取的總 DNA符合PCR擴增的要求，可以用作專一性檢測的待測樣品，空白實驗結果排除了假陽性的可能。實施例4尖頭蟲草專一性鑒別用以從符合PCR要求的樣品中專一性的擴增尖頭蟲草，從而鑒別尖頭蟲草。方法1:使用實施例3中符合PCR反應要求的樣品如實施例1中方法進行PCR擴增(包括不添加模 板的空白實驗)，其中引物替換為Probe I及Probe II，反應條件為94°C預變性3min，然后93°C變性lmin, 60°C復性lmin， 72°C延伸2min，共30個循環，最后72°C延伸10min。擴增的產物在2%的含有DNA 染料的瓊脂糖凝膠上進行電泳，在適當的光源下査看以及拍照。方法2:使用實施例3中符合PCR反應要求的樣品懸濁液如實施例3中方法2所述進行PCR反應， 其中引物替換為Probe I及Probe II，反應條件為94°C預變性3min，然后93°C變性lmin, 60°C復性lmin， 72°C延伸2min，共30個循環，最后72°C延伸10min。擴增的產物在2%的含有DNA染料的瓊脂糖凝膠 上進行電泳，在適當的光源下查看以及拍照。圖4為按方法1進行的實驗結果，顯示五種蟲草(l為蟻蟲草，2為古尼蟲草，3為蛹蟲草，4為尖頭 蟲草，5為蜂頭蟲草)中尖頭蟲草被專一性的擴增獲得346bp左右的特異性DNA片段，而其他蟲草均無 特異性DNA片段被擴增，該結果表明，尖頭蟲草專一性探針(引物)Probe I及Probe II可以從多種蟲草中準 確的鑒別出尖頭蟲草，同時根據實施例3排除了假陰性(不符合PCR擴增條件而造成的陰性結果)的可能。序列表SEQ ID NO. 1<110>廣東省微生物研究所〈120〉鑒別尖頭蟲草的特征性核苷酸序列和方法<160>5<210〉1<211>463<212>DNA<213>尖頭蟲草 (Cor辦ce/w OAycepWa) 〈400〉1CAGAGAGTGAAAACTCCCTAACCCACTGTGACCTATACCTATATATGCCT CGGCAGGCTC60TGTAAAGAGACTGCCAAAGGMCCTAAACTCTTgttttttATATAACTAG TCTTCTGAGT120GATTTTTATAAATATATAAAAACTTTTAGCAACGGATCTCTTGGCTCTAG CATCGATGAA180GAACGCAGCAAAATGCGATAAGTMTGCGAATTGCAGATTTTAGTGAGTC ATCGAGTTTT240TGAACGCATATTGCGCCTGCTGGCTATTCTAGCAGGCATGCCTGTCCGAA CGTCATTTAC300AGTACTAAAGACCCTATATGGTCTTTCTGTTGGAGGCTGGCTCTTAGCGG CCACCTCTTA360AATTTAGTAGCGGCGGTTGCTTTTMTTTCCCCTGCMAGTAGATTTTTT ACTTGCCATG420TTGGAAGACTAGCAACCCCCTATAAACAACCTCTTTCTCTCTASEQ ID NO. 2〈160〉5<210>2<211>19<212>DNA<213>尖頭蟲草(Cora 戸/ s rayc—a/a) <400>2CTCCCTAACC CACTGTGAC 19 SEQ ID NO. 3〈160>5 〈210>3 〈211〉19 <212>腿<213>尖頭蟲草(CoW戸/w ox戸p/za/a) 〈400>3AAGAGGTGGC CGCTAAGAG 19SEQ ID NO. 4<勝5〈210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據蟲草屬(Cor力'c'e;M) rRNA保守序列設計合成 〈400>4CGTTGGTGAA CCAGCGGAGG GAT 23SEQ ID NO. 5<160>5<210>5<211〉23<212>DNA<213〉人工序列 <220><223〉根據蟲草屬(Cor辦c印s)rRNA保守序列設計合成 <400>5TTGCCGCTTC ACTCGCCGTT ACT 2權利要求
1.一種用于鑒別尖頭蟲草Cordyceps sphecocephala的特征性核苷酸序列，其特征是該序列是來源于尖頭蟲草核糖體rRNA內轉錄間隔區以及5.8S rRNA基因的核苷酸序列，具體序列為CAGAGAGTGA AAACTCCCTA ACCCACTGTG ACCTATACCT ATATATGCCT CGGCAGGCTCTGTAAAGAGA CTGCCAAAGG AACCTAAACT CTTGTTTTTT ATATAACTAG TCTTCTGAGTGATTTTTATA AATATATAAA AACTTTTAGC AACGGATCTC TTGGCTCTAG CATCGATGAAGAACGCAGCA AAATGCGATA AGTAATGCGA ATTGCAGATT TTAGTGAGTC ATCGAGTTTTTGAACGCATA TTGCGCCTGC TGGCTATTCT AGCAGGCATG CCTGTCCGAA CGTCATTTACAGTACTAAAG ACCCTATATG GTCTTTCTGT TGGAGGCTGG CTCTTAGCGG CCACCTCTTAAATTTAGTAG CGGCGGTTGC TTTTAATTTC CCCTGCAAAG TAGATTTTTT ACTTGCCATGTTGGAAGACT AGCAACCCCC TATAAACAAC CTCTTTCTCT CTA。
2. —種以權利要求1的核苷酸序列為模板而設計的用于鑒別尖頭蟲草的專一性核酸分子探針，其特征是其核苷酸序列為Probe I: 5，- CTCCCTAACCCACTGTGAC -3'及Probe II: 5，- AAGAGGTGGCCGCTAAGAG -3，。
3. —種鑒別尖頭蟲草的試劑盒，其特征是包括兩個權利要求2所述核苷酸分子探針， 一對蟲草屬核 糖體rRNA內轉錄間隔區通用引物，以及DNA提取試劑；所述的蟲草屬核糖體rRNA內轉錄間隔區通用引 物是CorF: 5'-CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3，及CorR: 5'-TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3，； 所述的DNA提取試劑為尿素提取液，其成分為SDS1.5。/。，尿素7mol/L， Tris-HCl pH8.0 0.05mol/L， NaCl 0.5mol/L。
4. 一種鑒別尖頭蟲草的方法，其特征是采用權利要求2所述的核苷酸分子探針，通過核酸雜交的方 式鑒定尖頭蟲草，具體步驟按照常規的分子生物學方法進行。
5. —種鑒別尖頭蟲草的方法，其特征是采用權利要求2所述的核苷酸分子作為PCR引物，利用PCR 方法鑒定尖頭蟲草，具體步驟按照常規PCR方法進行。
6. 根據權利要求5所述的方法,其特征在于還包括利用權利要求3所述的引物CorF和CorR作為PCR 引物進行陽性對照實驗的方法。
全文摘要
本發明提供一種鑒別尖頭蟲草的特征性核苷酸序列和方法，屬于利用分子生物學方法檢測中藥材真偽的技術領域。本發明提供了用于鑒定尖頭蟲草的來自尖頭蟲草核糖體rRNA內轉錄間隔區的特征性核苷酸序列及在其基礎上設計的核酸分子探針和包含該探針的尖頭蟲草鑒定試劑盒，以及利用該序列、探針或試劑盒通過PCR或核酸雜交的方式鑒別尖頭蟲草的方法。利用本發明，可以方便、快速、準確的進行尖頭蟲草(包括菌絲體、子實體以及相關的制品)的鑒定，本發明使用分子生物學手段排除了鑒定中的人為影響、鑒定結果客觀準確，鑒定時間短，半天即可完成。
文檔編號C12R1/645GK101230380SQ20071003287
公開日2008年7月30日 申請日期2007年12月26日 優先權日2007年12月26日
發明者李浩華, 潘清靈, 磊 王, 章衛民, 陶美華 申請人:廣東省微生物研究所