專利名稱：：沙門氏菌顯色培養基、檢測試劑盒及檢測方法沙門氏菌顯色培養基、檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
：本發明涉及一種微生物顯色培養基、檢測試劑盒及檢測方法，屬于食品微生物安全監測領域。
背景技術：
："民以食為天"，食品是人類賴以生存的物質基礎，食品安全是關系人類健康和社會發展的重大問題。近年來，國內外食品安全的惡性事件不斷發生。食源性致病菌是指以食物為載體，導致人類發生疾病的一大類細菌。據統計，發達國家每年約有1/3的人患食源性疾病，美國每年約有7600萬例食源性疾病患者，全世界每年約有220萬人因患食源性疾病而喪生，而且，食源性疾病常常是發展中國家導致人非正常死亡的主要原因。由此可見，食源性疾病已成為國內外普遍關心的問題。沙門氏菌(Salmonella)是人類常見的重要食源性致病菌之一，是人和動物腸道中最主要且數量最多的正常棲居菌，嬰兒出生后即隨哺乳進入腸道，與人終身相伴，正常棲居條件下不致病。但若進入膽囊、膀胱等處可引起感染，如腹膜炎、膽囊炎、膀胱炎及腹瀉等。為有效控制病原的發生和擴散，準確及時的檢測手段是預防和控制沙門氏菌傳播的關鍵。目前，沙門氏菌傳統的檢測方法需要分離培養、鏡檢觀察、生化鑒定等多個步驟，檢測周期長，整個過程大約4-7天，且操作復雜，已不能滿足食品中病源菌快速檢測的現實需要，而且當有其它的腸道菌群存在時會影響沙門氏菌在傳統SS培養基和DHL培養基中的檢出。近年來，快速檢驗法中的PCR法、金標試紙法、免疫法和特異性的顯色生化鑒定技術等快速檢驗方法，已在不斷得到擴大應用，使沙門氏菌的快速檢測有了很大發展。但是這些技術也存在一定缺陷，如技術要求高，設備操作復雜，需要專業的技術人員進行操作，以及檢測費用昂貴等。針對以上不足，以顯色培養基為基礎的特異性顯色生化鑒定技術在當前能更好地與傳統方法相接軌，檢測成本較低。顯色生化鑒定技術的原理是使用適當的顯色底物，在細菌特異性酶作用下，顯示一定顏色，直接觀察菌落顏色的快速分析法，可以把檢測、計數和鑒定一次完成。應用顯色酶底物來檢測微生物專一性和特異性的方法，推動了食源性致病菌的鑒定以及早期篩選培養基一系列技術的發展。這些基于酶的試驗方法具有簡便、快速、準確和檢出率高的優點，在臨床診斷及食品微生物檢驗中，顯色培養基以其獨具的優勢與傳統的培養基展開了競爭，從而引發了顯色培養基開發和應用的熱潮。國外的顯色培養基研究起步很早。目前法國CHROMagar公司、意大利的Biolife公司、英國的Biolog公司和法國的BioMerieux公司已開發出沙門氏菌顯色培養基，但是這些進口顯色培養基價格昂貴，檢測成本很高，且購買不方便，國內一般基層機構和企業很少采用。
發明內容本發明旨在針對傳統方法的不足，提供一種特異性高、檢測周期短、成本低、可操作性強，適用于處理大通量樣本的沙門氏菌顯色培養基、檢測試劑盒及檢測方法。所述的沙門氏菌顯色培養基，其配方為蛋白胨2030g、酵母膏粉37g、氯化鈉47g、膽鹽0.10.5g、瓊脂1215g、混合顯色底物M-galactoside0.050.95g、Na2C030.020.04g、選擇性添加齊U0.010.05g。上述顯色培養基優選的配方為蛋白胨25.6g、酵母膏粉3g、氯化鈉5g、膽鹽O.lg、瓊脂13g、混合顯色底物M-galactoside0.75g、Na2C030.02g、選擇性添加劑0.03g。所述的沙門氏菌檢測試劑盒，其組成為上述沙門氏菌顯色培養基、增菌液A和B。其中，增菌液A為高壓滅菌處理后的緩沖蛋白胨水培養基(BP);增菌液B為高壓滅菌處理后的四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)。所述的沙門氏菌檢測方法，其具體步驟為(l)制備顯色平板每1000mL蒸餾水或去離子水中加入4260g顯色培養基干粉，攪拌加熱煮沸至完全溶解，待冷至405(TC，倒平板，備用；(2)樣品前處理按國標法(GB/T4789.4-2003)對食品樣品進行前處理；(3)—歩增菌(非選擇性增菌)將處理過的樣品25g置于225mL增菌液A中，混合均勻后37。C培養68h;(4)二步增菌(選擇性增菌)取一步增菌液lmL加入到9mL增菌液B中，混合均勻后37"培養1824h;(5)接種培養將二步增菌液接種顯色平板上，37t:培養1824h;(6)結果分析若顯色平板上出現光滑、略突起、直徑13mm、邊緣整齊的品紅色菌落，說明該樣品存在沙門氏菌。本發明針對現有技術中的不足，從生物化學的角度出發，利用細菌特異性酶對其進行快速檢測。首先，在分析沙門氏菌特異性生化反應的基礎上，篩選出細菌特異性酶，然后通過在分離培養基上加入細菌特異性酶的顯色底物，研制出顯色培養基，直接根據菌落顏色就可對菌株作出鑒定，同時結合高效的樣本前處理技術，建立特異性顯色生化檢測方法，用于沙門氏菌的快速診斷和監控，可大大節省檢測成本和時間，具有更廣泛的應用前景。本發明通過篩選沙門氏菌特異性酶及顯色底物，開發了沙門氏菌的顯色培養基，克服了已有顯色培養基價格昂貴和傳統培養基特異性差等缺點；并通過對比各種標準方法的樣本前處理技術，建立了一套系統的沙門氏菌顯色生化快速檢測方法，提高了檢測效率；所建立的沙門氏菌顯色生化快速檢測方法，可對食品和環境中沙門氏菌進行全面、系統、準確的檢測和鑒定，為微生物快速檢測提供了新的途徑。本發明所述的試劑盒配置簡單，檢測方法檢測靈敏度高，周期短、可操作性強、適用于處理大通量的樣本、易于產業化生產，可以廣泛推廣應用到食品衛生等領域。具體實施方式實施例1:本發明所述的沙門氏菌顯色培養基特異性的驗證1、沙門氏菌顯色培養基的配制稱取47.5g顯色培養基干粉，加入1000mL蒸餾水或去離子水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，待冷至405(TC，倒平板，5備用。2、接種將鼠傷寒沙門氏菌(6^^0/7e^St7P力J'/K/2^朋)、傷寒沙門氏菌(5:、腸炎沙門氏菌(6".e/^eW&VA)、豬霍亂沙門氏菌(6:、甲型副傷寒沙門氏菌C5^,sOT^'力、乙型副傷寒沙門氏菌(6^,W，M歷、湯卜遜沙門氏菌CS:Mo順s朋)、大腸菌群(&"7>"歷)、變形桿菌(尸r。te〃s)、福氏志賀氏菌d'^/7a/7ex/er力、糞鏈球菌(6Y_rept。cccc〃5"/secs"'5")、金黃色葡萄球菌(5"tap力y"coccwsawrei/s)在營養瓊脂復蘇24h后，分別劃線接種上述顯色培養基平板，37。C培養1824h。3、結果及分析沙門氏菌在顯色平板上均出現品紅色菌落，大腸菌群在顯色平板上均出現藍綠色菌落，變形桿菌和福氏志賀氏菌在顯色平板上均出現無色菌落，糞鏈球菌、金黃色葡萄球菌在顯色平板上均無生長現象，說明沙門氏菌顯色培養基具有較高的特異性。實施例2:本發明所述的沙門氏菌顯色培養基靈敏度及特異性的驗證1、沙門氏菌顯色培養基的配制稱取47.5g顯色培養基干粉，加入1000mL蒸餾水或去離子水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，待冷至405(TC，倒平板，備用。2、接種將鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、湯卜遜沙門氏菌、檸檬酸桿菌、產氣腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌25922、陰溝腸桿菌、大腸桿菌44113、大腸桿菌8099、普通變型桿菌、奇異變型桿菌、白色念珠菌、痢疾志賀氏菌、阪崎腸桿菌、銅綠假單胞菌、粘質沙雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌和糞鏈球菌在營養瓊脂復蘇24h后，按以下菌種的組合，分別用接種環挑取1環，加入到10mL0.85%生理鹽水中配成原液，然后進行10倍梯度稀釋，取10—510—6濃度混合菌液各0.lmL，分別涂布上述顯色培養基平板(簡稱HKSAL)、傳統的SS平板、國外兩種品牌的沙門氏菌顯色培養基平板(簡稱ZWSALI和ZWSALII)，37。C培養1824h。菌種組合1)豬霍亂沙門氏菌+檸檬酸桿菌+糞鏈球菌+金黃色葡萄球菌+白色念珠菌2)傷寒沙門氏菌+產氣腸桿菌+糞鏈球菌+金黃色葡萄球菌+痢疾志賀氏菌3)甲副傷寒沙門氏菌+肺炎克雷伯氏菌+金黃色葡萄球菌+銅綠假單胞菌+奇異變型桿菌4)腸炎沙門氏菌+大腸桿菌25922+糞鏈球菌+銅綠假單胞菌+粘質沙雷伯氏菌5)鼠傷寒沙門氏菌+陰溝腸桿菌+糞鏈球菌+銅綠假單胞菌+阪崎腸桿菌6)乙副傷寒沙門氏菌+大腸桿菌44113+金黃色葡萄球菌+銅綠假單胞菌+普通變型桿菌7)湯卜遜沙門氏菌+大腸桿菌8099+金黃色葡萄球菌+銅綠假單胞菌+糞鏈球菌3、結果及分析混合菌液涂布各平板靈敏度試驗結果如表1，對各培養基的菌落數進行t檢驗分析，表明本發明所述的沙門氏菌顯色培養基與傳統的ss平板及國外其中一種品牌的沙門氏菌顯色培養基平板(ZWSALI)的沙門氏菌檢出率沒有顯著差異(P〉0.05)，三種培養基可以達到相同的檢測限；而與國外另一種品牌的沙門氏菌顯色培養基平板(ZWSALII)的沙門氏菌檢出率有顯著差異(P<0.05)，稍優于ZWSALII;混合菌液涂布各平板特異性試驗結果如表2，在本發明所述的沙門氏菌顯色培養基平板上沙門氏菌仍呈特殊的品紅色菌落，其他腸道菌受抑或呈現藍色或呈無色菌落。表明其他腸道菌基本不影響沙門氏菌的檢測，顯色培養基對沙門氏菌的特異性高。表l七種組合中的沙門氏菌在各培養基上的靈敏度試驗結果(均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>備注査表T(6)0.05=2.45，T(5)0.05=2.57，T(4)0.05=2.78上表T值大于査表所得數據，則表示檢驗差異有顯著性意義；反之，T值小于查表所得數據，則表示檢驗差異無顯著性意義。"*"表示檢驗差異有顯著性意義；"+*"表示NO.l好，表示NO.l稍差。表2七種組合中各種菌在各培養基上的特異性試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例3:生豬肉中沙門氏菌檢測的模擬試驗1、制備顯色平板稱取47.5g顯色培養基干粉(含蛋白胨25.6g、酵母膏粉3g、氯化鈉5g、膽鹽O.lg、瓊脂13g、混合顯色底物M-galactoside0.75g、Na貝0.02g、選擇性添加劑0.03g)，加入1000mL蒸餾水或去離子水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，待冷至4050。C，倒平板，備用。2、前增菌稱取25g豬肉樣品2份，其中l份添加l10cfu沙門氏菌，模擬實際樣品混合2h，無菌操作將2份樣品分別加到含有225mLBP增菌液的三角瓶中，37。C培養4h。3、選擇性增菌各取lmL樣品前增菌液分別加入到9mLTTB中進行二次增菌，37"C培養18h。4、接種培養各取1環二次增菌液，劃線接種顯色培養基，37。C培養1824h，觀察記錄菌落大小、顏色和形態。5、結果觀察和分析未添加沙門氏菌的樣品增菌后在顯色平板上無品紅色菌落；添加沙門氏菌的樣品增菌后在顯色平板上呈現光滑、略突起、直徑13mm、邊緣整齊的品紅色菌落。檢測過程中，前增菌需4h，選擇性增菌18h，顯色平板培養1824h，陽性結果時間最長需46h。檢測靈敏度可以達到110cfu。實施例4:雞蛋中沙門氏菌的檢測1、制備顯色平板稱取47.5g顯色培養基干粉(含蛋白胨25.6g、酵母膏粉3g、氯化鈉5g、膽鹽O.lg、瓊脂13g、混合顯色底物M-galactosideO.75g、Na2C030.02g、選擇性添加劑0.03g)，加入1000mL蒸餾水或去離子水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，待冷至405(TC，倒平板，備用。2、前增菌在無菌條件下，稱取已去殼25g雞蛋，無菌操作將樣品加到含有225mLBP增菌液的三角瓶中，37。C培養4h。3、選擇性增菌取lmL樣品前增菌液加入到9mLTTB中進行二次增菌，37'C培養18h。4、接種培養取1環二次增菌液，劃線接種顯色培養基，37。C培養1824h，觀察記錄菌落大小、顏色和形態。以沙門氏菌標準菌株劃線接種顯色培養基作對照，對比分析檢測結果。5、結果分析顯色平板上呈現光滑、略突起、直徑l3mm、邊緣整齊的品紅色菌落，菌落顏色和形態與標準菌株相符，說明雞蛋樣品中存在沙門氏菌。實施例5:本發明所述的沙門氏菌檢測方法與國家標準檢測法(簡稱國標法)和國外同類產品(ZWSALI)的比較從超市和菜市場購買實際樣品共40份，按國標法(GB/T4789.4-2003，食品衛生微生物學檢驗沙門氏菌檢驗)和本發明所述的檢測方法對沙門氏菌進行檢測，檢測陽性樣本用VITEK32的GNI十鑒定試劑條進行驗證，比較三種檢測方法的靈敏度。(1)國標法樣本一TTB(或醒)與SC增菌24h—劃線接種DHL平板一無色半透明菌落一生化鑒定。(2)本發明所述的檢測法:樣本一BP前增菌4h—TTB選擇性增菌18h—劃線接種本發明所述的顯色培養基(HKSAL)和國外同類產品(ZWSALI)—直接觀察有無品紅色菌落。通過40份超市和菜市場代表性食品中沙門氏菌的國標法和本發明所述的檢測方法以及國外同類產品(ZWSALI)的檢測方法，結果如表3，說明用本發明所述的沙門氏菌檢測方法在檢測生奶和生雞肉樣品時檢出率與國標法以及國外同類產品相同，但在檢測熟食時本發明所述的沙門氏菌檢測方法的檢出率高于其他兩種培養基。表3實際樣品中沙門氏菌的檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權利要求1、一種沙門氏菌顯色培養基，其特征在于配方為蛋白胨20～30g、酵母膏粉3～7g、氯化鈉4～7g、膽鹽0.1～0.5g、瓊脂12～15g、混合顯色底物M-galactoside0.05～0.95g、Na2CO30.02～0.04g、選擇性添加劑0.01～0.05g。2、如權利要求1所述的顯色培養基，其特征在于配方為蛋白胨25.6g、酵母膏粉3g、氯化鈉5g、膽鹽O.lg、瓊脂13g、混合顯色底物M-galactoside0.75g、Na2C030.02g、選擇性添加劑O.03g。3、一種沙門氏菌檢測試劑盒，其特征在于其包括增菌液A:高壓滅菌處理后的緩沖蛋白胨水培養基；增菌液B:高壓滅菌處理后的四硫磺酸鈉煌綠增菌液；以及如權利要求1或2所述的沙門氏菌顯色培養基。4、一種使用如權利要求3所述的檢測試劑盒檢測沙門氏菌的方法，其特征在于包括以下歩驟(1)制備顯色平板每lOOOmL蒸餾水或去離子水中加入4260g顯色培養基干粉，攪拌加熱煮沸至完全溶解，待冷至405(TC，倒平板，備用；(2)樣品前處理按國標法對食品樣品進行前處理；(3)—步增菌將處理過的樣品25g置于225mL增菌液A中，混合均勻后37。C培養68h;(4)二步增菌取一步增菌液lmL加入到9mL增菌液B中，混合均勻后37。C培養1824h;(5)接種培養將二步增菌液接種顯色平板上，37。C培養1824h;(6)結果分析若顯色平板上出現光滑、略突起、直徑13mm、邊緣整齊的品紅色菌落，說明該樣品存在沙門氏菌。5、如權利要求4所述的方法，其特征在于在制備顯色平板步驟中每1000mL蒸餾水或去離子水中加入47.5g顯色培養基干粉。全文摘要本發明涉及的一種沙門氏菌顯色培養基、檢測試劑盒及檢測方法，屬于食品微生物安全監測領域。檢測試劑盒由加入了0.1～0.5g細菌特異性酶的混合顯色底物M-galactoside的顯色培養基與增菌液A緩沖蛋白胨水培養基、B四硫磺酸鈉煌綠增菌液組成；檢測時，對食品樣品進行前處理，先后利用增菌液A、B進行增菌培養，最后將二次增菌液接種至顯色培養基上培養，若出現光滑、略凸起、直徑1～3mm、邊緣整齊的品紅色菌落，說明樣品存在沙門氏菌。所述的顯色培養基成本低廉，試劑盒配置簡單，檢測方法檢測靈敏度高，周期短、可操作性強、適用于處理大通量的樣本、易于產業化生產，可以廣泛推廣應用到食品衛生、環境監測等領域。文檔編號C12N1/20GK101186891SQ200710032778公開日2008年5月28日申請日期2007年12月21日優先權日2007年12月21日發明者盧勉飛,吳清平,蔡芷荷申請人:廣東環凱微生物科技有限公司