專利名稱：抑制蘭屬植物組織培養褐變發生的方法
技術領域：
本發明涉及一種抑制蘭屬植物組織培養過程發生褐變的方法。(二) 背景技術植物組織培養技術日趨完善，并在科學研究與現代化農業生產中 充分顯示出其優越性。在農林作物的脫毒快繁、突變誘發、改革作物 栽培、細胞工程和基因工程育種以及種質保存等方面都發揮巨大的作 用，是一項具有廣闊發展潛力的高新技術。目前蘭屬植物的組織培養 方法一般包括的步驟為先對葉片或假球莖外植體消毒(一般采用75%乙醇和0. l — O. 2%升汞表面消毒)，然后誘導外植體產生不定芽(將 已經表面消毒的外植體切塊，放在加入細胞分裂素類物質的MS、 B5 或White固體或液體培養基中，誘導不定芽發生)，再培養生根(將 試管苗分切成單株在生根培養基上培養)。植物組織離體培養時，外植體褐變是影響組織培養的關鍵因素之 一。褐變是指植物組織在離體培養過程中,從自身表面向培養基釋放 褐色物質，以致培養基逐漸變成褐色，外植體也隨之進一步褐變而死 亡的現象。在植物的組織培養中，培養材料(又稱外植體)褐化是影 響培養成功的重要因素(Choi YE, Yang DC, Choi KT， Induction of somatic embryos by macrosalt stress from mature aygotic embryos of g7,m"ewg:Plant Cell,Tissue and Organ Culture, 1998,52:177-181 )， 褐變產生的褐色物質不僅使培養基變褐，嚴重影響培養材料的生長和 分化，并最終導致其死亡。植物組織培養過程中產生褐變的因素是復雜的，是多種因素共同 作用的結果。培養材料的生理狀態、基因型、同一基因型的不同栽培 條件、營養狀況、生長部位和大小以及培養基的成分、培養條件等都
影響外植體的褐變(葉梅等.植物組織培養外植體褐變的研究進展.生物技術通訊，2004,15(4) :426-428)。幼齡材料一般比成齡材料褐 變輕。用油棕幼嫩器官或組織,如胚等外植體進行培養,褐變較輕，而用 高度分化的葉片作外植體,接種后則很容易褐變。此外，消毒時間也 影響到外植體的褐變， 一般來講,外植體消毒時間越長，褐變也越嚴重。 褐變分為酶促褐變和非酶促褐變兩種。引起褐變的酶的底物主要 是酚類化合物，如鞣質等(于守超等.植物組織培養過程中外植體褐 變機理研究進展.山東林業科技，2004,5:61-63.)。鞣質(又稱單寧) 是指廣泛存在于植物體內的一類多元酚類化合物。大多鞣質為無定形 粉末，僅少數為晶體。鞣質的分子量通常為500至3000，具較多的 酚羥基，鄰位酚羥基易被氧化，可與多種金屬離子絡合，產生特征顏 色反應。如鞣質的水溶液遇三價鐵產生藍(黑)色或綠(黑色)色或 沉淀。有報道指出鞣質是褐變的原因，是褐變發生酶促的底物。褐變外 植體分泌到培養基中褐色或黑色的物質主要是鞣質或是被氧化的酚 類(Thorpe TA " o/.， Application of micropropagation to forestry. In: Debergh PC, Zimmerman RH (eds) Microprogation. Kluwer, Dordrecht 1991,311-336 )。用丙酮提取蝴蝶蘭葉片離體培養發生褐變的培養基 中的褐色成分，與三氯化鐵等反應，呈現出鞣質具有的顏色，經質譜 分析證實具有縮合鞣質的吸收光譜特性(許傳俊等.蝴蝶蘭褐變外植 體的顯微結構觀察以及褐變成分的初步分析.園藝學報，2005， 32 (6) :1111--1113)。目前尚無抑制鞣質物質的報道。一般用于抑制植物組織褐變的物質有活性炭、抗壞血酸、檸檬 酸、聚乙烯吡咯烷酮、植酸(Chang et al.， Plant Cell Reports,2001,20:664-669);這些物質只能減少組織發生褐變的程度， 同時又傷害了植物組織，降低了培養材料的存活率，影響其生長發育。 處理的方法是將一定濃度的抑制物質溶解后，加入培養基中，培養 材料按照常規方法進行表面消毒后，放置培養基中，在弱光、27。C條 件下培養。(三)發明的內容本發明的目的是針對現有技術無法很好解決褐變的問題，提供一種抑制蘭屬植物組織培養過程發生褐變的方法。該方法操作簡便，抑 制褐變效果好。為了達到本發明的目的，本發明是在現有組織培養方法包括步 驟(1)外植體表面消毒、步驟(2)誘導不定芽發生和歩驟(3)試 管苗培養生根的基礎上，對步驟(1)和(2)進行如下改進在步驟(1)中，在外植體消毒后，用0.01—0.1%生長調節物質赤霉酸和/ 或生長素類物質(吲哚乙酸、吲哚丁酸或萘乙酸)在常溫下浸泡5 — 30分鐘；在歩驟(2)中的培養基中加入0.001—0.01%的6-BA (6-芐基腺嘌呤)、4-PU (4-吡效隆)或TDZ (噻唑隆)，培養的光照強度 為2000 — 3000勒科斯。在上述方法中，歩驟(1)最好用0.03 — 0.05%赤霉酸浸泡10 — 15分鐘；步驟(2)的培養基的優選方案是加入0.002 — 0.003。/。6-BA 或0.002% 4-PU，光照強度最好為2000勒科斯。本發明具有如下的優點或效果1. 由于本發明采用赤霉酸作為主要成分，抑制蘭屬植物在組織 培養過程中，組織發生褐變，降低鞣質含量，.同時能促進植物組織的 生長發育，為抑制植物組織褐變提供有效、簡便的方法，達到了本發 明的目的。2. 本發明方法與已有的降低褐變的物質相比，無需增加專用設 備，使用濃度小，成本低，操作簡便。(四)具體的實施方式下面結合實施例對本發明進行進一步的說明。在下列實施例中， 所述內容均為改進部分，其他均采用現有技術。 實施例1 :(1) 蝴蝶蘭外植體用0.01%萘乙酸在常溫下浸泡5分鐘；(2) 培養基加入0.001%的TDZ，光照強度為2000勒科斯。 經實驗證明，蝴蝶蘭對照葉片褐變發生率為62.3%，經本方法處理的葉片褐變發生率為52.2%。實施例2:(1)春蘭外植體用0.03%赤霉酸在常溫下浸泡10分鐘； (2)培養基加入0.002%的4-PU，光照強度為3000勒科斯。 經實驗證明，春蘭對照葉片褐變發生率為60.3%，經本方法處理 的葉片褐變發生率為45.2%。 實施例3:(1) 蝴蝶蘭外植體用0.05%的赤霉酸浸泡15分鐘；(2) 培養基加入0.003%的6-BA，光照強度為3000勒科斯。 經實驗證明，蝴蝶蘭對照葉片褐變發生率為58.0%，經本方法處理的葉片褐變發生率為23.0%，有效降低鞣質含量。實施例4:(1) 建蘭外植體用0.1%的赤霉酸和吲哚乙酸的混合液浸泡30分鐘；(2) 培養基加入0.02%的6-BA，光照強度為2000勒科斯。 經實驗證明，建蘭對照葉片褐變發生率為80.65%，經本方法處理的葉片褐變發生率為48.42%。
權利要求
1、一種抑制蘭屬植物組織培養褐變發生的方法，其特征在于對現有組織培養方法的步驟(1)外植體表面消毒和步驟(2)誘導不定芽發生進行如下改進在步驟(1)中，在外植體消毒后，用0.01-0.1％生長調節物質赤霉酸和/或生長素類物質在常溫下浸泡5-30分鐘；在步驟(2)中的培養基中加入0.001-0.01％的6-BA、4-PU或TDZ，培養的光照強度為2000-3000勒科斯。
2、 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的生長素類物 質采用吲哚乙酸、吲哚丁酸或萘乙酸。
3、 如權利要求l所述的方法，其特征在于步驟(1)中外植體 用0.03 — 0.05%赤霉酸浸泡10—15分鐘；
4、 如權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于在步驟(2) 的培養基中加入0.002 — 0.003%的6-BA或0.002%的4-PU，光照強 度為2000勒科斯。
全文摘要
抑制蘭屬植物組織培養褐變發生的方法，其操作是對現有組織培養方法的步驟(1)外植體表面消毒和步驟(2)誘導不定芽發生進行如下改進步驟(1)中，外植體消毒后用0.01-0.1％生長調節物質赤霉酸和/或生長素類物質在常溫下浸泡5-30分鐘；在步驟(2)中的培養基中加入0.001-0.01％的6-BA、4-PU或TDZ，培養的光照強度為2000-3000勒科斯。該方法操作簡便，抑制褐變效果好。
文檔編號C12N5/04GK101148653SQ200710030069
公開日2008年3月26日 申請日期2007年9月4日 優先權日2007年9月4日
發明者玲 李, 許傳俊, 譚汝芳 申請人:華南師范大學