甜瓜抗蔓枯病基因位點的分子標記方法

專利名稱：：甜瓜抗蔓枯病基因位點的分子標記方法
技術領域：
：本發明公開了甜瓜抗蔓枯病基因位點的分子標記方法，屬于生物
技術領域：
。專用于甜瓜抗蔓枯病的分子標記輔助選擇，開展甜瓜蔓枯病抗病品種的選育與種質資源的利用。二
背景技術：
：甜瓜是世界十大水果之一。由蔓枯病菌引起的甜瓜蔓枯病是嚴重的全球性真菌病害之一。它的發生常會導致毀滅性的后果。除危害甜瓜外，蔓枯病菌還侵染黃瓜、西瓜、南瓜和西葫蘆等其它葫蘆科作物，造成不同程度的減產。因此，研究防治甜瓜蔓枯病成了當前甜瓜育種中的一個迫切任務。培育抗病品種是防治甜瓜蔓枯病危害的最安全、有效而且節約成本的措施之一。遺傳研究表明，甜瓜蔓枯病抗性主要由單基因顯性控制和單基因隱性控制兩種類型。但是目前對蔓枯病抗性基因位點的信息仍知之甚少，同時由于在選育抗病材料時傳統方法是通過接種鑒定，根據植株的表型形態學特征進行篩選，該方法有時會因為接種不充分或發病條件不適宜而影響選擇效率，難以準確、快速地篩選出具有抗病基因的個體植株。分子標記輔助選擇可以將傳統的表型選擇轉變為直接選擇基因型，在早代就可以對抗病植株進行選擇，從而大大提高選擇效率。但迄今為止，仍未見有關甜瓜蔓枯病抗性基因分子標記的研究報道。目前在蔓枯病抗性遺傳基礎的研究及抗病育種的利用上多集中在最早發掘的抗性資源PI140471上，而對其他抗源的利用研究很少。PI420145具有與PT140471相近的蔓枯病抗性，且其抗性由一對顯性單基因控制(Wolukauetal.2007)。三、
發明內容技術問題本發明涉及甜瓜蔓枯病抗性基因的分子標記方法，目的是針對傳統育種方法選育穩定甜瓜蔓枯病抗病品系難度較大、周期較長的缺陷，發掘出甜瓜蔓枯病抗病基因資源，為甜瓜的蔓枯病抗病育種提供基因資源和標記輔助選擇的技術，從而大大提高選擇效率，加快培育優良抗蔓枯病甜瓜品系的進程。技術方案甜瓜PI420145抗蔓枯病基因的分子標記方法，其特征在于，該抗性基因為完全顯性基因，有四個AFLP標記與之連鎖，分別為1)標記EcoRI-TG/MseI-CTC2。(,，用AFLP選擇性標記引物EcoRI-TG:5'陽GACTGCGTACCAATTCTG-3'禾口Msel-CTC:5'-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3'組合擴增出長度為200bp的DNA標記片段條帶；2)標記EcoRI-AT/MseI_CTG9。，用AFLP選擇性標記引物EcoRI墨AT:5'-GACTGCGTACCAATTCAT陽3'禾口MseI-CTG:5'-GATGAGTCCTGAGTAACTG陽3'組合擴增出長度為90bp的DNA標記片段條帶；3)EcoRI-TC/MseI-CAGB。，用AFLP選擇性標記引物EcoRI-TC:5'-GACTGCGTACCAATTCTC-3'禾口Msel-CAG:5'-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3'組合擴增出長度為60bp的DNA標記片段條帶；4)標記EcoR工-TG/Msel-CTA70，用AFLP選擇性標記引物EcoRI-TG:5'陽GACTGCGTACCAATTCTG-3'和Msel-CTC:5'-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3'組合擴增出長度為70bp的DNA標記片段條帶。即用上述l)一4)組標記引物中任一對、二對、三對或四對引物擴增甜瓜PI420145抗蔓枯病材料的DNA，如果擴增出其對應大小的標記片段條帶，則標志著甜瓜PI420145抗蔓枯病基因的存在。有益效果本發明所提供的與甜瓜抗蔓枯病基因位點緊密連鎖的AFLP分子標記具有以下優點(1)通過本發明在國際上首次獲得4個與甜瓜抗蔓枯病基因緊密連鎖的AFLP分子標記；(2)通過本發明分子標記方法定位的抗蔓枯病基因位點位置明確，鑒定方便。通過檢測這些與抗蔓枯病基因位點連鎖的分子標記，可以預測甜瓜植株的蔓枯病抗性，進而快速篩選抗病品種或品系用于甜瓜育種。抗病基因位點的檢測方便快速，不受環境影響；(3)輔助育種選擇目標明確，節約成本。在傳統育種方法中，首先要收集具有抗病基因的親本與栽培品種進行一系列雜交，而且要對蔓枯病抗性進行單株選擇。對甜瓜蔓枯病進行接種鑒定，因接種不充分或發病條件不適宜而影響選擇效率。因此抗病育種不僅費時，而且難度大，成本高。通過檢測抗蔓枯病基因位點，可以在苗期就鑒定出高抗蔓枯病的單株，淘汰其它植株，不僅節約生產成本而且大大提高抗蔓枯病甜瓜的選擇效率。(4)通過本發明分子標記方法，生產上通過檢測這些與抗蔓枯病基因位點連鎖的分子標記，可以快速鑒定抗病品種或品系的純度。四圖1EcoRI-TG/Msel-CTC引物組合在&代單株的擴增結果表明在抗蔓枯病單株出現一條200bp的特異帶。1-10:感蔓枯病單株，11-23:抗蔓枯病單株；箭頭示抗蔓枯病單株中出現的特異帶五具體實施例方式本發明篩選甜瓜抗蔓枯病基因分子標記的實施程序包括(1)將抗病材料PI420145(罕)和PI136170U)進行雜交獲得F！(PI420145和PI136170見參考文獻Wolukauetal.，2007,ResistancetoGummyStemBlightinMelon(CucumismeloL.)GermplasmandInheritanceofResistancefromPlantIntroductions157076,420145,and323498.HortScience42(2):215-221.)，F,自交產生F2，同時進行回交產生BC,代。2006年春季于南京農業大學實驗農場種植獲得的F2代和BC,代分離群體。對其進行人工接種并統計各個單株的發病情況，利用卡方測驗分析蔓枯病抗性的遺傳規律。分析發現，63株BQ代回交群體中，29株為抗病，37株為感病，其分離比完全符合l:l的單基因分離比。同時對F2代分離群體統計表明，89株群體中，69株為抗病，20株為感病，也符合3:1的單顯性基因的遺傳模式。(2)利用AFLP(AmplificationFragmentLengthPolymorphism,擴增片段長度多態性，Vosetal.，1995)技術結合BSA(BulkedSegregantAnalysis,混合分離分析法，Michelmoreetal.，1991)技術進行全雌性基因的連鎖標記檢測分析。共篩選分析了上海生工公司提供的64對選擇性引物，獲得12對引物在抗病和感病DNA池間表現多態性，利用F2代單株驗證后，確證EcoRI-TG/Msel-CTC，EcoRI-AT/Msel-CTG，EcoRI-TC/Msel-CAG和EcoRI-TG/Msel-CTA引物4對組合能在抗蔓枯病單株中擴增出特異性條帶，而在感蔓枯病單株中則沒有，連鎖分析表明這四個標記與抗蔓枯病位點的連鎖距離分別在2.0，6.0，5.4和6.0cM。4對引物組合為:1)標記EcoRI-T(;/Msel-CTC，，用AFLP選擇性標記引物EcoRI-TG:5'-GACTGCGTACCAATTCTG-3'和Msel-CTC:5'-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3'組合擴增出長度為200bp的DNA片段；2)標記EcoRI-AT/Msel-CTGM，用AFLP選擇性標記引物EcoRI-AT:5'-GACTGCGTACCAATTCAT-3'和Msel-CTG:5'-GATGAGTCCTGAGTAACTG陽3'組合擴增出長度為90bp的DNA片段；3)EcoRI-TC/Msel-CAG6。，用AFLP選擇性標記引物EcoRI陽TC:5-GACTGCGTACCAATTCTC-3'禾口Msel-CAG:5-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3'組合擴增出長度為60bp的DNA片段；4)標記EcoRI-TG/Msel-CTA70，用AFLP選擇性標記引物EcoRI-TG:5-GACTGCGTACCAATTCTG-3'禾口MseI-CTC:5-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3'組合擴增出長度為70bp的DNA片段。即用上述1)一4)組標記引物中任一對、二對、三對或四對引物擴增甜瓜PI420145抗蔓枯病材料的DNA，如果擴增出其對應大小的標記條帶，則標志著甜瓜PI420145抗蔓枯病基因的存在。這四個標記與抗蔓枯病位點的連鎖距離分別在2.0,6.0，5.4和6.0cM。這-一結果為蔓枯病抗性的分子標記輔助選擇和定位克隆蔓枯病抗性基因奠定基礎。具體技術過程如下①基因組DNA的提取和DNA池的構建基因組DNA提取采用CTAB法(Murrayetal.，1980)。利用瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠顯色進行DNA濃度的定量。F2單株DNA提取后，利用BSA法各取10個抗病和感病單株DNA等量混合，構建成抗病和感病DNA池用于AFLP引物的多態性篩選。②酶切和接頭的連接取0.5ug基因組DNA，采用EcoRI和Msel進行雙酶切。酶切后與EcoRI和Msel接頭連接。EcoRI和Msel接頭序列為EcoRI接頭5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'3'-CATCTGACGCATGGTTAA-5'Msel接頭5'-GACGATGAGTCCTGA-3，3'-TACTCAGGACTCAT-5'③酶切連接產物的擴增取5ul酶切連接產物為模板進行預擴增。預擴增程序為94°Clmin，56°C1min，72°C1min，36個循環；72。C延伸7min。預擴增產物l:30稀釋，作為選擇性擴增的模板。選擇性引物組合共64對，由8個帶兩個選擇性堿基的EcoRI-NN弓l物，禾卩8個帶三個選擇性堿基的MseI-NNN引物組成。選擇性擴增程序為94。C預變性30s;94°C30s，65°C30s，72°C120s，然后每個循環退火溫度降低0.7'C，經13個循環后，退火溫度降至56。C;再進行23個循環的擴增94°C30s，56°C30s，72°C120s。擴增反應在PTC-100PC.R儀上進行。所用預擴增和選擇性擴增引物序列見表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>④變性聚丙烯酰胺凝膠電泳選擇性擴增產物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠(6%丙烯酰胺，0.32%甲叉丙烯酰胺，7mol'L-l尿素，IXTBE)中電泳分離。電泳緩沖液為1XTBE，恒功率60W預電泳30min后，將擴增產物加入等體積的上樣緩沖液(98。/。甲酰胺，10mmol*L-lEDTA，0.25%溴酚藍)95。C變性5min后，立即轉移至冰浴中冷卻，然后每個樣品取8uL上樣，60W電泳23h。⑤銀染電泳后，小心分開兩塊玻璃板，將附著凝膠的長玻璃板放入10%冰醋酸中固定30min;后用去離子水漂洗2次，每次5min;然后轉入染色液(2g硝酸銀，3mL37。/。甲醛溶于2L去離子水)中染色30min，后用2L去離子水快速漂洗56s，立即轉入顯影液(60g碳酸鈉，3mL37Q/。甲醛，400yL10%硫代硫酸鈉溶于2L去離子水)中，輕搖至條帶清晰后，加入等體積的10%冰醋酸停顯，約IOmin后用去離子水漂洗干凈。自然干燥保存。⑥連鎖性分析利用Mapmaker(Version3.0)軟件對F2代分離群體單株的標記和感病類型表現數據進行連鎖分析，并利用Kosambi函數將重組率轉化為遺傳圖距(cM)。權利要求1、甜瓜PI420145抗蔓枯病基因的分子標記方法，其特征在于，該抗性基因為完全顯性，有四個AFLP標記與之連鎖，分別為1)標記EcoRI-TG/MseI-CTC200，用AFLP選擇性標記引物EcoRI-TG5′-GACTGCGTACCAATTCTG-3′和MseI-CTC5′-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3′組合擴增出長度為200bp的DNA標記片段條帶；2)標記EcoRI-AT/MseI-CTG90，用AFLP選擇性標記引物EcoRI-AT5′-GACTGCGTACCAATTCAT-3′和MseI-CTG5′-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3′組合擴增出長度為90bp的DNA標記片段條帶；3)EcoRI-TC/MseICAG60，用AFLP選擇性標記引物EcoRI-TC5′-GACTGCGTACCAATTCTC-3′和MseI-CAG5′-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3′組合擴增出長度為60bp的DNA標記片段條帶；4)標記EcoRI-TG/MseI-CTA70，用AFLP選擇性標記引物EcoRI-TG5′-GACTGCGTACCAATTCTG-3′和MseI-CTC5′-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3′組合擴增出長度為70bp的DNA標記片段條帶；即用上述1)-4)組標記引物中任一對、二對、三對或四對引物擴增甜瓜PI420145抗蔓枯病材料的DNA，如果擴增出其對應大小的標記片段條帶，則標志著甜瓜PI420145抗蔓枯病基因的存在。全文摘要本發明涉及一種甜瓜抗蔓枯病基因的分子標記方法，屬于生物
技術領域：
。有四個AFLP分子標記與抗蔓枯病基因連鎖，標記EcoRI-TG/MseI-CTC₂₀₀為200bp條帶；標記EcoRI-AT/MseI-CTG₉₀為90bp條帶；EcoRI-TC/MseI-CAG₆₀為60bp條帶；標記EcoRI-TG/MseI-CTA70為70bp條帶；連鎖距離分別為2.0，6.0，5.4和6.0cM。通過本發明提供的分子標記方法檢測PI420145及其衍生品種(系)中是否含有該基因，預測其蔓枯病抗性水平，提高選擇效率，有利于加速我國優良抗蔓枯病甜瓜品種的選育進程，生產上用于抗蔓枯病甜瓜品種純度鑒定。文檔編號C12Q1/68GK101173311SQ20071002553公開日2008年5月7日申請日期2007年8月3日優先權日2007年8月3日發明者周曉慧,婁群峰,張永兵,英李,錢春桃,陳勁楓,鳩瑟夫·瓦魯考申請人:南京農業大學