專利名稱：：一種制備γ-癸內酯及生物轉化與分離耦合提高產量的方法
技術領域：
：一種制備Y-癸內酯及生物轉化與分離耦合提高產量的方法，屬于生物法制備芳香化合物的
技術領域：
。本發明涉及一種用于制備Y-癸內酯的新型方法。
背景技術：
：Y-癸內酯(g認madecalactone)，又名丙位癸內酯，是五元環內酯化合物。Y-癸內酯因其器官感覺特性而成為一種重要的芳香化合物，它帶有水果味、桃樣香味和芳香性，具有典型的椰子香氣，香氣較桃醛輕飄，它以其誘人的桃香和低香氣閾值的特性而在香料工業得到普遍應用，主要用于配制奶油、桃子、柑橘和椰子等類型香精。一般來說，可以由水果生產Y-癸內酯。然而，它在水果中的含量極少，使得不能通過提取或蒸餾的方法經濟地分離它。從水果中提取的癸內酯具有特定的立體結構，而化學法生產的卻是消旋體，在自然界中尚未大量發現此種香料。隨著人們對Y-癸內酯香料產品需求的增大，利用生物法生產具有光學活性的Y-癸內酯吸引了許多研究人員的關注。目前，利用生物技術可以通過3種途徑得到Y-癸內酯生物合成(主要為真菌發酵生產)、生物轉化和生物催化(脂肪酶催化)。而目前最可能實現產業化的方法是利用微生物進行生物轉化。該方法的轉化底物主要有羥基脂肪酸、非羥基脂肪酸和脂肪酸酯。Y-內酯的直接前體是Y-羥基脂肪酸,不同脂肪酸底物先經過微生物轉化生成直接前體，再轉化成相應內酯，也就是微生物的多酶轉化。常見的微生物包括細菌、酵母菌或真菌，利用天然的羥基脂肪酸，如存在于蓖麻油中的蓖麻醇酸(12-羥基-9-十八碳烯酸)，在微生物轉化過程中，先經過(3-氧化，使鏈長縮短，再轉化成Y-癸內酯。利用非羥基脂肪酸轉化生產Y-癸內酯也有不少報道，但微生物轉化脂肪酸形成內酯的代謝途徑及調節機制尚未完全闡明，轉化過程也較為復雜。因此，近年來已經進行了大量嘗試以生物技術方法來制備Y-癸內酯。大部分方法使用各種酵母進行。
發明內容(1)要解決的技術問題本發明的目的在于提供一種制備Y-癸內酯及生物轉化與分離耦合提高產量的方法。通過全細胞多酶體系的生物轉化以及分離轉化耦合技術制備y-癸內酯，不僅可以降低產物對菌體影響，從而提高產量，而且方便產物的提取，實現產物的有效原位分離。(2)技術方案一種制備Y-癸內酯的方法，使用解脂復膜孢酵母！^row/"一o/聲^CGMCC2.1405培養物進行生物轉化，產物轉化過程中以蓖麻油為底物，添加大孔吸附樹脂用轉化與分離耦合技術提高Y-癸內酯產量并實現產物的分離；①出發菌株解脂復膜孢酵母ya/TovW"一o/,'caCGMCC2.1405;②細胞培養培養基為葡萄糖1020g/L，酵母膏15g/L，磷酸氫二銨1015g/L，KH2P04110g/L，MgS(V7H2O0.1lg/L，吐溫-800.15g/L，初始pH69;培養條件在2040。C，100200r/min條件下培養1236h;③轉化與分離耦合技術于菌株培養1236h后添加蓖麻油2030g/L，添加大孔吸附樹脂60100g/L，pH7.5，2040°C，100200r/min的條件下再繼續轉化4860h。所用大孔吸附樹脂為AB-8樹脂，該樹脂吸附轉化產物以降低高濃度產物對酵母細胞的毒性，進而提高產量。所用樹脂再生后可以重復利用。本發明首先從微生物出發，篩選得到可較好轉化Y-癸內酯的微生物酵母，利用酵母菌，以蓖麻油中的主要組分蓖麻醇酸為底物，經過p-氧化使碳鏈縮短，再內酯化生成Y-癸內酯。采用樹脂吸附技術連續吸附轉化產物，在降低終產物對微生物或酶的抑制和毒害的同時，提高轉化效率，也為下游處理降低了難度。轉化與分離耦合添加蓖麻油開始轉化時，同時添加樹脂AB-8，控制轉化反應pH為7.5，能長時間維持相對較高的比生成速率，有利于產物的積累，表明轉化-吸附耦合工藝適合Y-癸內酯的生產，可以大幅度提高^量。樹脂再生轉化結束后的樹脂AB-8進行再生處理，可重新用于轉化。在容器內加入高于樹脂層10cm的3。/。5。/。鹽酸溶液浸泡2h4h，淋洗通柱。繼用34倍樹脂體積的3%~5%鹽酸溶液通柱，水洗至接近中性；以3%5%的氫氧化鈉溶液浸泡4h，淋洗通柱，以3~4倍樹脂體積的3%~5%氫氧化鈉溶液通柱，再以凈水清洗至pH值為中性，備用。(3)有益效果本發明提供了具有高效轉化能力的菌株解脂復膜孢酵母^rmW"w.CGMCC2.1405，通過細胞培養及全細胞多酶體系的制備，以蓖麻油為底物，通過全細胞多酶體系的生物轉化以及轉化與分離耦合技術制備Y-癸內酯。利用樹脂吸附Y-癸內酯進行耦合轉化后，總產量達到2.17g/L，不僅可以降低產物對菌體影響提高產量，而且方便產物的提取，實現產物的有效原位分離，樹脂再生后可以重復利用，具有良好的工業化前景。圖1蓖麻油不同添加方式對Y-癸內酯的轉化的影響。圖2不同樹脂添加量對Y-癸內酯轉化的影響。圖3蓖麻油濃度對轉化的影響。圖4樹脂AB-8轉化分離耦合體系的過程曲線。具體實施例方式以下實施例所用菌株和細胞培養按照上述技術方案所述，對轉化與分離耦合技術的影響因素舉例如下。實施例1蓖麻油不同添加方式對Y-癸內酯轉化的影響。對比生長細胞培養法和以蓖麻油為碳源直接發酵兩種不同制備方式。生長細胞轉化，即當菌體生長至平衡期后葡萄糖基本耗盡后，直接添加蓖麻油，使微生物在繁殖生長的同時進行生物轉化。采用生長過程轉化，加入蓖麻油轉化48h后癸內酯產量明顯較高。以蓖麻油為碳源直接發酵時，也可以制備產物，但產量較低。結果如圖l所示。實施例2不同樹脂添加量對Y-癸內酯的轉化產量的影響。添加樹脂AB-8，添加量(g/L)分別為25、50、75、100、125，y-癸內酷的轉化情況如圖2所示。隨著樹脂量的增加，其對Y-癸內酯的吸附量逐步上升，樹脂加量為75時總體濃度最高，達1.73g/L，繼續增大樹脂用量，總體產量沒有明顯提高。實施例3不同蓖麻油用量對Y-癸內酯轉化的影響。樹脂量恒定，加入不同蓖麻油量轉化后，測定Y-癸內酯含量，結果見圖3。由圖3可見，底物濃度為25g/L時癸內酯產量較高。底物加量存在最佳值，其后隨著底物濃度的增加，產量則會下降。實施例4吸附轉化耦合。75g/L的樹脂添加量，蓖麻油濃度為25g/L，此時的轉化過程曲線如圖4所示。由圖4可見，添加樹脂后，Y-癸內酯產量在56h達到最大值2，17g/L，與未添加樹脂相比產量提高92%。添加樹脂，轉化體系能長時間維持相對較高的比生成速率，有利于產物的積累，這表明轉化-吸附分離耦合工藝適合Y-癸內酯的生產，可以大幅度提高產量。實施例5樹脂的再生利用。轉化結束后的樹脂AB-8進行再生處理，重新投入轉化，轉化效果如表l所示。可見，使用再生樹脂對最終產量影響不大，表明回用樹脂對Y-癸內酯的吸附能力變化不大，可以多次重復利用，但在操作上樹脂數量有一定損失。表1再生樹脂的重復利<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>權利要求1.一種制備γ-癸內酯的方法，其特征在于使用解脂復膜孢酵母YarrowialipolyticaCGMCC2.1405培養物進行生物轉化，產物轉化過程中以蓖麻油為底物，添加大孔吸附樹脂用轉化與分離耦合技術提高γ-癸內酯產量并實現產物的分離；(1)出發菌株解脂復膜孢酵母YarrowialipolyticaCGMCC2.1405；(2)細胞培養培養基為葡萄糖10～20g/L，酵母膏1～5g/L，磷酸氫二銨10～15g/L，KH2PO41～10g/L，MgSO4·7H2O0.1～1g/L，吐溫-800.1～5g/L，初始pH6～9；培養條件在20～40℃，100～200r/min條件下培養12～36h；(3)轉化與分離耦合技術于菌株培養12～36h后添加蓖麻油20～30g/L，添加大孔吸附樹脂60～100g/L，pH7.5，20～40℃，100～200r/min的條件下再繼續轉化48～60h。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所用大孔吸附樹脂為AB-8樹脂，該樹脂吸附轉化產物以降低高濃度產物對酵母細胞的毒性，進而提高產量。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所用樹脂再生后可以重復利用。全文摘要一種制備γ-癸內酯及生物轉化與分離耦合提高產量的方法，屬于生物法制備芳香化合物的
技術領域：
。本發明提供了具有高效轉化能力的菌株復膜孢酵母Yarrowiasp.CGMCC2.1405，通過細胞培養及全細胞多酶體系的制備，以蓖麻油為底物，通過全細胞多酶體系的生物轉化，產物轉化過程中添加大孔吸附樹脂用轉化與分離耦合技術提高γ-癸內酯產量并實現產物的分離。利用樹脂吸附γ-癸內酯進行轉化與分離耦合后，γ-癸內酯總產量達到2.17g/L，不僅可以降低產物對菌體影響，從而提高產量，而且方便產物的提取，實現產物的有效原位分離，樹脂再生后可以重復利用，具有良好的工業化前景。文檔編號C12R1/645GK101096692SQ200710024049公開日2008年1月2日申請日期2007年7月12日優先權日2007年7月12日發明者偉于,巖徐,棟王申請人:江南大學