專利名稱：一種酶類活性的傳感分析方法
技術領域：
本發明屬于生物分析和生物傳感技術領域，特別涉及一種酶類活性的傳感分析方法。
背景技術：
現有技術納米生物技術已經到了迅猛發展的時期，在這一領域中生物分子-金屬納米顆粒相關課題得到了高度的關注。生物分子-金屬納米顆粒復合物可用作光學傳感器的標記，也可作為催化標記放大生物識別反應中的電學、電化學、微量分析的信號。例如，在核酸功能化的金納米顆粒中，金顆粒相互作用產生等離共振吸收峰的變化可用來分析DNA和單個堿基的錯配。當結合分子內熒光基團的金納米顆粒與作為分子信標的DNA結構相互作用發生淬滅，以及分子信標開啟以后的熒光再激活，兩者都可用來分析DNA。結合分子的金納米顆粒的表面增強拉曼散射光譜(SERS)可用來放大核酸雜交。同時，結合生物分子的金納米顆粒可作為抗原-抗體、DNA復合物光學檢測的表面標記物。金屬顆粒的催化性能使得各種金屬能通過化學方法沉積在納米顆粒上，這樣就放大了生物識別過程的信號。與生物識別復合物連接的金納米顆粒標記物能在催化下長大，這就能使電極間建立橋聯通路，從而通過測量傳導率便能檢測到抗體-抗原復合物、雜交DNA等。金屬納米顆粒表面的金屬沉積可用作標記，通過沉積金屬的溶出伏安法來放大生物識別過程。連接在生物識別復合物上的金屬納米顆粒的催化長大，重量改變，通過石英微量天平進行敏感的DNA微量測定，從而放大了識別信號。某些氧化酶能和底物反應生具有還原性的物質，如多巴胺、腎上腺素、H2O2等。這些產物能在金納米顆粒的催化下還原AuCl4-，從而促使金納米顆粒長大。利用這種金納米顆粒長大導致的光學信號的變化可以發展成一種酶活性和底物檢測的檢測方法(WO 2006/008742A1)。但現有的直接基于過渡金屬納米顆粒長大的方法用于分析時，其靈敏度和檢測底限不能滿足高精度樣品的分析。本發明基于過渡金屬納米殼長大放大酶催化反應，具有很高的靈敏度和較低的檢測底限。
發明內容
本發明針對上述技術問題，提供了一種酶類活性的傳感分析方法，該方法靈敏度高，檢測底線低。
本發明的技術解決方案為將過渡金屬納米顆粒與氨基化的膠體混合得草莓狀膠體復合物；將上步處理后得到的草莓狀膠體復合物、過渡金屬鹽與經酶催化后能產生還原性產物的底物混合，再向混合液中加入待測樣品進行酶催化底物反應，其中草莓狀膠體復合物的終濃度為0.01-10×1010個/ml，過渡金屬鹽的終濃度為0.001-25μM/ml，底物終濃度為0.001-50μM/ml，經過上述反應產生的產物將過渡金屬鹽還原成過渡金屬并沉積在草莓狀膠體復合物表面，形成過渡金屬納米殼；將上述形成的過渡金屬納米殼進行表征，計算待測樣品中酶活性。
本發明與現有技術相比，具有如下優點1.本發明的檢測生物樣品中組分的方法與基于納米顆粒的傳感分析相比，局域等離共振峰的遷移量大，基于納米顆粒的傳感分析局域等離共振峰的遷移量最大為15nm，而本發明的檢測生物樣品中組分的方法的局域等離共振峰的遷移量最大約為100nm。
2.本發明的檢測生物樣品中組分的方法與基于納米顆粒的傳感分析相比，本發明的檢測生物樣品中組分的方法的局域等離共振峰可以遷移至近紅外區域，因此可以用于可見光不透明的生物樣品的分析。
四
圖1為檢測反應流程2為檢測葡萄糖酶活力的光學表征結果，不同量葡萄糖氧化酶催化底物后的金納米殼的光譜圖；圖3為檢測葡萄糖酶活力的光學表征結果，不同量葡萄糖氧化酶催化底物后的金納米殼的等離激元共振峰的位置；圖4是檢測葡萄糖氧化酶活性的電化學表征方法的標準曲線。
圖5是檢測葡萄糖氧化酶活性的微重力表征方法的標準曲線。
圖6是檢測酪氨酸酶的顯微表征方法，其中A110nm/草莓狀膠體復合物；B119±5nm/0.2μg酪氨酸酶；C135±6nm/1μg酪氨酸酶；D146±5nm/15μg酪氨酸酶。
五具體實施例方式
實施例1 SiO2膠體的氨基化取適量直徑為100nm的SiO2醇溶膠，置于一只洗凈的100mL燒杯中，用移液器移取30μL的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)加入其中，用保鮮膜包好并置于磁力攪拌器上。80℃下，以600rpm攪拌3小時。攪拌結束后，將上述溶液置于洗凈的離心管中，以10,000rpm離心30min。取出離心管底部SiO2溶質，加入等量的無水乙醇，超聲分散15～20min。以上過程重復5次以除去多余的APTES。
實施例2 2～5nm金納米顆粒制備利用還原氯金酸(HAuCl4，上海化學試劑一廠)的方法，制備2～5nm的金納米粒子。將1g HAuCl4配成1％的水溶液，4℃冷藏。將預冷的40mL三蒸水取出，加入0.6mL 1％的HAuCl4溶液，再加入0.2mL濃度為0.2M的K2CO3溶液。在不斷攪拌下，快速加入新鮮配制0.5mg mL-1的NaBH4水溶液0.4mL。一般重復加3～5次，直到溶液的藍紫色變為橙紅色為止。再攪拌5min，獲得膠體金直徑一般在2～5nm。
實施例3 草莓狀聚苯乙烯膠體復合物的制備取直徑為250nm的氨基化的聚苯乙烯(APTES-PS)膠體溶液0.07mL，稀釋至50mL，加入到100mL的分液漏斗中。向不斷攪拌的40mL直徑為10-15nm納米銀溶膠中，逐滴加入稀釋的納米銀溶膠，時間約為30min。通過靜電作用，銀納米粒子吸附到APTES-PS表面，形成覆蓋有銀納米粒子的Ag/PS復合顆粒。然后，將上述混合液以600rpm攪拌90min，并以3,000rpm離心30min，輕輕倒掉上層液體，加入三蒸水，超聲分散。再次離心，超聲分散，重復三次。
實施例4 葡萄糖氧化酶活力的測定取1.5mL 0.24mM氯金酸(上海化學試劑一廠)水溶液，0.5ml草莓狀膠體SiO2復合物(4.5×1010個/ml)和0.5ml 0.25×10-4mM/ml葡萄糖(上海化學試劑商店)溶液混勻，迅速加入待測樣品中，室溫振蕩10分鐘。草莓狀膠體SiO2復合物形成SiO2金納米殼，溶液由無色變為淡藍色，這標志著葡萄糖氧化酶的存在并催化了葡萄糖。
葡萄糖氧化酶活力的計算是先測定系列量的葡萄糖氧化酶催化定量萄萄糖后金納米殼等離激元共振峰波長，擬合的標準曲線方程。再將待測樣品所得的等離激元共振峰波長帶入標準曲線方程，即得樣品中葡萄糖氧化酶的活力。
圖2和圖3是檢測葡萄糖氧化酶的電化學和微重力表征方法的標準曲線。計算方法同前。
實施例5 酪氨酸酶活力的測定取2mL 0.24mM氯金酸(上海化學試劑一廠)水溶液，1ml草莓狀膠體SiO2復合物(7.5×109個/ml)和0.5ml 0.5×10-5mM/ml酪氨酸(上海四維)溶液混勻，迅速加入待測樣品中，室溫振蕩10分鐘。草莓狀膠體SiO2復合物形成SiO2金納米殼，溶液由無色變為淡藍色，這標志著酪氨酸酶的存在并催化了酪氨酸。酪氨酸酶活力計算方法同實施例4。
實施例6 谷氨酸脫氫酶活力的測定取2mL 0.01mM硝酸銀(南京化學試劑一廠)水溶液，1ml草莓狀膠體PS復合物(0.1×109個/ml)和0.5ml 0.5×10-5mM/ml谷氨酸(上海四維)溶液混勻，迅速加入待測樣品中，室溫振蕩30分鐘。草莓狀膠體PS復合物形成PS銀納米殼，溶液由無色變為淡藍色，這標志著谷氨酸脫氫酶的存在并催化了谷氨酸。谷氨酸脫氫酶活力計算方法同實施例4。
權利要求
1.一種酶類活性的傳感分析方法，其特征在于步驟為A.將過渡金屬納米顆粒與氨基化的膠體混合得草莓狀膠體復合物；B.將上步處理后得到的草莓狀膠體復合物與過渡金屬鹽和經酶催化后能產生還原性產物的底物混合，再向混合液中加入待測樣品進行酶催化底物反應，其中草莓狀膠體復合物的終濃度為0.01-10×1010個/ml，過渡金屬鹽的終濃度為0.001-25μM/ml，底物終濃度為0.001-50μM/ml，經過上述反應產生的產物將過渡金屬鹽還原成過渡金屬并沉積在草莓狀膠體復合物表面，形成過渡金屬納米殼；C.將上述形成的過渡金屬納米殼進行表征，計算待測樣品中酶類活性。
2.如權利要求1所述的一種酶類活性的傳感分析方法，其特征在于所述的氨基化的膠體顆粒直徑為5-50000nm。
3.如權利要求1所述的一種酶類活性的傳感分析方法，其特征在于所述的過渡金屬顆粒直徑為1-50nm。
全文摘要
一種酶類活性的傳感分析方法，將過渡金屬納米顆粒與氨基化的膠體混合得草莓狀膠體復合物；將上步處理后得到的草莓狀膠體復合物與過渡金屬鹽和經酶催化后能產生還原性產物的底物混合，再向混合液中加入待測樣品進行酶催化底物反應，其中草莓狀膠體復合物的終濃度為0.01－10×10
文檔編號C12Q1/26GK101058829SQ20071002142
公開日2007年10月24日 申請日期2007年4月12日 優先權日2007年4月12日
發明者錢衛平, 王毅, 劉亮亮, 董健 申請人:東南大學