一種固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素g?；傅姆椒?

專利名稱：一種固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素g酰化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化工中對酶進行固定化的工藝，具體地說是一種新穎
環(huán)氧基載體ZH—EP固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶的方法。
背景技術(shù)：
自從1929年弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素以來，青霉素為人類的醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)作 出了巨大的貢獻。然而伴隨著使用以致濫用，細菌對青霉素的耐藥性也在 不斷增加。研制新型抗生素是解決問題的有效措施。20世紀60年代科研人 員發(fā)現(xiàn)了青霉素G?；?PGA; EC 3.5丄11)，并開發(fā)了固定化酶技術(shù)用來 水解青霉素和頭孢菌素G生產(chǎn)6—氨基青霉烷酸(6—APA)和7—氨基脫 乙酰頭孢烷酸(7—ADCA)。而6—APA和7—ADCA是半合成抗生素的重 要醫(yī)藥中間體。固定化青霉素?；甘前牒铣?3-內(nèi)酰胺抗生素的生產(chǎn)得以 進行的重要手段。而隨著社會需求的發(fā)展需要更好性能、更高效率的催化 劑，來增加工業(yè)生產(chǎn)的競爭力。
近年來，人們已從自然界篩選到多種不同性質(zhì)的青霉素?；?，在所 有已知來源的青霉素G?；钢?，糞產(chǎn)堿桿菌"/ca//gwM/aeca/&)青霉 素G?；傅幕蛑钡?994年才被克隆(文獻1，美國專利5695978)，其 具有許多有工業(yè)價值的特點糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；笇Φ孜镉懈叩?親和力，其Km比其他青霉素?；付嫉投鋕cat是所有青霉素G?；?中最高的；糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶是青霉素G?；讣易逯形ㄒ辉谝?級結(jié)構(gòu)中具有二硫鍵的成員，其熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性都很高；對手性分子 的識別能力，糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；妇哂懈叩倪x擇性；糞產(chǎn)堿桿菌 青霉素G?；冈谟袡C溶劑中有很高的穩(wěn)定性；在催化(3-內(nèi)酰胺抗生素合 成時合成/水解率高等。所以糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；冈诎牒铣煽股毓?業(yè)中有著更好的應(yīng)用前景。
固定化能夠改善酶的性質(zhì)，使固定化酶比游離酶具有更好的穩(wěn)定性和 更高的使用效率，并且使酶能夠回收利用，極大節(jié)約生產(chǎn)成本。固定化技 術(shù)是酶能夠應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一。經(jīng)過兒十年的研究和發(fā)展， 先后開發(fā)了多種性能多樣的固定化載體和方法，固定化技術(shù)取得了長足的 進步，然而仍不能滿足理想生物催化劑的所有要求，真正能投入工業(yè)應(yīng)用 的固定化酶卻不多，主要原因是固定化使用的試劑和載體成本高，其次是 固定化效率低，穩(wěn)定性差；并且出于商業(yè)保密，很多工藝過程細節(jié)沒有公 開。我國相關(guān)工作起步較晚，尚需依靠進口來滿足半合成抗生素的生產(chǎn)， 因此研究高效的固定化青霉素?；妇哂兄匾饬x。
近代生物工程的技術(shù)進步可以對酶進行分子水平上的改造改善酶的結(jié) 構(gòu)功能獲得活力更高的酶，并依靠酶工程的進步將酶固定化獲得更適合大 規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的生物催化劑。我們已將糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；富?， 轉(zhuǎn)化在大腸桿菌中構(gòu)建了高表達糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅幕蚬こ?br> 菌，無需誘導(dǎo)即可進行組成型高表達(文獻2，袁中一等，中華人民共和國 專利，ZL200310108792.6)。在獲得糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶的基礎(chǔ)上， 申請人:又進行了糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；腹潭ɑ傅难芯?。
考察一種新載體的固定化條件，其工藝流程為考察酶濃度、pH、鹽濃 度、溫度等條件，以固定化酶活力、溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及使用穩(wěn)定性 為評價指標。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是篩選新的固定化載體應(yīng)用于糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；?的固定化，獲得固定化酶產(chǎn)品；并以糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶為模型，建 立起應(yīng)用新載體對酶進行固定化的一般工藝流程。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅姆椒?，固定化糞產(chǎn)堿桿菌青 霉素G?；傅妮d體為ZH—EP，于緩沖溶液體系中，以ZH—EP進行固 定化時，酶濃度為100-160 mg/ml，固定化時間106-120 h，緩沖溶液pH 8.5 —10.0，反應(yīng)體系中鹽，濃度1.0-1.5 M，載體與緩沖溶液的重量體積比例 為lg載體4一6ml緩沖溶液。
當體系中緩沖溶液的濃度低于1.0-1.5 M，體系中不足的離子強度可以 用可溶性鹽補充，使反應(yīng)體系中鹽的濃度1.0-1.5 M (如，采用濃度0.05M 的緩沖溶液，補加1.0-1.5 MNaC1。)。
本發(fā)明建立了環(huán)氧基團為活性基團的環(huán)氧載體對糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G ?；傅墓潭ɑ?。
本發(fā)明還對糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；覆捎霉I(yè)化通用載體Eupergit C 進行了固定化，并對其固定化條件進行了研究，確定了以Eupergit C進行固 定化時，其最佳條件為80-160 mg/ml，固定化200-320 h，緩沖溶液pH 7.0 一9.5，緩沖溶液濃度0.4-0.8 M。
本發(fā)明具有如下特點
1.本發(fā)明采用商業(yè)化載體Eupergit C對目前研究較少的糞產(chǎn)堿桿菌青霉 素G?；高M行了首次固定化，獲得了性能比自由酶大為改善的固定化酶； 并篩選出了一種適于固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶的載體ZH—EP， ZH 一EP的價格比EupergitC低，采用此種載體對酶進行固定化不僅大大降低了 生產(chǎn)成本，所需固定化時間比也比EupergitC大為減少，獲得的固定化酶活 力也更高。建立的工藝方法適用于對所有蛋白質(zhì)分子進行固定化，改善性 能，提高其穩(wěn)定性及使用效率。
2.本發(fā)明通過對酶濃度、固定化時間、pH以及緩沖溶液濃度等條件 的考察，確定了最優(yōu)固定化條件，建立了采用新載體固定化的工藝流程。
固定化酶的溫度、pH穩(wěn)定性都比自由酶有了改善。經(jīng)過連續(xù)多批水解青霉 素G鉀鹽，固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；革@示出良好的操作穩(wěn)定性， 表現(xiàn)出比自由酶的優(yōu)勢。


圖1為酶濃度和固定化時間對載體Eupergit C固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素 G酰化酶的影響；固定化條件pH7.5, 1 M磷酸緩沖液；室溫。( ), 10 mg 蛋白質(zhì)/ml; (口),40 mg蛋白質(zhì)/ml; (△), 80 mg蛋白質(zhì)/ml; (x), 120 mg蛋白 質(zhì)/ml;(+)， 160 mg蛋白質(zhì)/ml.
圖2為酶濃度和固定化時間對載體ZH—EP固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G 酰化酶的影響；固定化條件pH 7.5, 1 M磷酸緩沖液；室溫。(<>),10mg蛋 白質(zhì)/ml; (□)， 40 mg蛋白質(zhì)/ml; (△), 80 mg蛋白質(zhì)/ml; (x), 120 mg蛋白質(zhì) /ml;(+)， 160 mg蛋白質(zhì)/ml,
圖3為pH對載體Eupergit C和ZH—EP固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G ?；傅挠绊懀还潭ɑ瘲l件100 mg蛋白質(zhì)/ g載體;室溫;固定化時間對 Eupergit C、 ZH畫EP分別為150h、 48h。 (O),Eupergit C; (口),ZH-EP
圖4為離子強度對載體Eupergit C和ZH—EP固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉 素G?；傅挠绊?；固定化條件100mg蛋白質(zhì)/g載體；室溫；pH8.0;固 定化時間對Eupergit C、 ZH-EP分別為150h、 48h。 (O),Eupergit C; (口),ZH-EP
圖5 pH對自由糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；负凸潭ɑ谳d體Eupergit C、 ZH—EP上糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；富盍Φ挠绊?；( ),自由AfPGA; (□), 固定化AfPGA /Eupergit C; (△),固定化AfPGA / ZH-ER
圖6溫度對自由糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；负凸潭ɑ谳d體Eupergit C、 ZH—EP上糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；富盍Φ挠绊?；( ),自由AfPGA; (□),固定化AfPGA/Eupergit C;(A),固定化AfPGA/ ZH-ER
圖7自由糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶和固定化在載體Eupergit C、 ZH 一EP上糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶的pH穩(wěn)定性;(O),自由AfPGA; (□),固 定化AfPGA / Eupergit C; (△),固定化AfPGA / ZH-EP.
圖8自由糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；负凸潭ɑ谳d體Eupergit C、 ZH 一EP上糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶的溫度穩(wěn)定性；( ),自由AfPGA; (□), 固定化AfPGA / Eupergit C; (△),固定化AfPGA / ZH-EP.
圖9固定化在載體Eupergit C、ZH—EP上糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；?的使用穩(wěn)定性。(口),固定化AfPGA/EupergitC;(x),固定化AfPGA/ZH-ER
具體實施例方式
首先按常規(guī)方法培養(yǎng)產(chǎn)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅木w，細胞破碎， 提純，獲得糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶。然后是對選擇出的載體進行固定 化條件的研究，獲得的固定化酶對其進行性質(zhì)研究以評價固定化效果及其 工藝應(yīng)用潛力。
實施例
先進行初步實驗篩選出有潛力的載體，再對選擇出的載體進行詳細的 固定化條件研究，獲得固定化酶后研究其性質(zhì)和溶液酶比較。
1載體的選擇經(jīng)過對多種候選載體的試驗，最終篩選出香港GeneRad Biotech Laboratory有限公司開發(fā)的載體ZH—EP。 ZH-EP，類似已工業(yè)化應(yīng) 用的載體Eupergit C，具有環(huán)氧活性基團。作為對照，Eupergit C也被用于 固定化。
2固定化條件的考察
2. 1糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅臐舛纫约肮潭ɑ瘯r間 一般，共價固定化遵循兩步法機理首先是載體和蛋白之間快速的物 理吸附，然后是被吸附的蛋白和載體的活化基團之間發(fā)生共價反應(yīng)。第一 步意味著酶濃度對于固定化是個重要因素。不同性質(zhì)載體其最適酶濃度不 同，采用最適酶濃度固定化可以在避免浪費酶的情況下獲得高活力的固定 化酶。
通常情況下不需要采用純度高的酶進行固定化，本發(fā)明中采用比活334 U/g蛋白的酶進行固定化。固定化體系為lg載體、4一6ml緩沖溶液。
采用不同的酶濃度體系進行固定化，根據(jù)考察結(jié)果(圖l、圖2)，為獲 得最高固定化酶活力，確定采用載，Eupergit C，其最適蛋白濃度為120 mg/ml，固定化260h;對于ZH—EP采用蛋白濃度120mg/ml、固定化116 h。
2. 2pH
常用的磷酸、Tris鹽酸等緩沖溶液緩沖范圍不足，因此采用 Britton-Robinson緩沖溶液(1.0M硼酸-1.0M乙酸-1.0M磷酸的混合 液，其pH由NaOH調(diào)節(jié))。
在不同pH的體系中對酶進行固定化，通過對獲得的固定化酶活力進行 比較(圖3)，對于用載體Eupergit C固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；?， 其最適固定化pH范圍7.5—9.0;對于ZH—EP，其最適固定化pH范圍8.5 一IO.O。
2. 3離子強度
酶在載體上的兩歩法固定化機理第一步要求蛋白和載體表面具有較強 的相互作用力，而蛋白和載體之間的作用力受到引起蛋白和載體表面疏水 作用的鹽濃度或者緩沖溶液濃度的影響。
在不同離子強度的體系中對酶進行固定化，通過對獲得的固定化酶活力 進行比較(圖4)，對于用載體Eupergit C固定化糞產(chǎn)堿t干菌青霉素G酰化酶， 其最適緩沖溶液濃度0.5 M;對于ZH—EP，其最適緩沖溶液濃度1.5M。
2, 4溫度
經(jīng)考察，溫度對于固定化的影響不是十分顯著，從經(jīng)濟方便的角度考慮， 采用室溫。對于溫度敏感型酶可以考慮其適宜的溫度。 3固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅男再|(zhì)
3. 1最適pH
采用不同pH的Britton—Robinson緩沖溶液(0.05 M硼酸一0.05 M冰醋 酸一0.05 M磷酸，NaOH調(diào)節(jié)pH)測定pH對溶液酶及固定化酶活力的影響。 自由酶的最適pH為7.5，固定化酶均向堿性范圍發(fā)生了偏移，AfPGA/Eupergit C最適pH為8.0， AfPGA/ZH-EP最適pH為10.0-11.0 (圖5)。
3. 2最適溫度
在不同的溫度測定溶液酶及固定化酶的活力。自由酶的最適溫度為 50°C，固定化酶的最適溫度均有所提高，為55 60。C (圖6)。 3. 3pH穩(wěn)定性
樣品在不同pH的緩沖溶液中室溫保溫1 h后測定其殘余活力，和未經(jīng) 保溫的樣品活力相比，在整個酸性到堿性范圍(pH 4.0-10.0)固定化酶的 pH穩(wěn)定性明顯比自由酶的好(圖7)。由于青霉素G?；覆粌H能在堿性 環(huán)境下催化水解反應(yīng)還能在酸性催化合成反應(yīng)，因此固定化后在酸性以及 堿性范圍內(nèi)提高了其穩(wěn)定性有著重要意義。
3. 4溫度穩(wěn)定性
在工業(yè)中采用較高的反應(yīng)溫度，有以下一些優(yōu)勢較高的反應(yīng)速率、改 變反應(yīng)平衡、更好的底物溶解性、較低的反應(yīng)介質(zhì)粘度以及微生物污染可 能性降低等。因此熱穩(wěn)定性的酶對于工業(yè)應(yīng)用具有重要意義。
樣品在不同溫度保溫1 h后，測定其殘余活力，和未經(jīng)保溫的樣品相比， 評價其溫度穩(wěn)定性。溶液酶及固定化酶均表現(xiàn)出了良好的溫度穩(wěn)定性，而 固定化酶在55。C以上表現(xiàn)出了其穩(wěn)定作用(圖8)。
3. 5使用穩(wěn)定性
固定化酶在柱式反應(yīng)器中催化水解青霉素G鉀鹽產(chǎn)生6-APA和苯乙 酸，NaOH溶液自動加入保持反應(yīng)體系pH為8.0，固定化酶的活力和NaOH 的初始消耗速率成正比。在反應(yīng)過程中，青霉素G鉀鹽的水解速度逐漸降 低，NaOH的加入速率也相應(yīng)降低，當最終NaOH停止消耗時反應(yīng)結(jié)束， 然后重復(fù)操作開始下一批反應(yīng)。經(jīng)過連續(xù)反應(yīng)40余批，固定化酶活力沒有 明顯損失，表現(xiàn)出了良好的使用穩(wěn)定性(圖9)。
實施例1以載體EupergitC固定化 采用比活334 U / g蛋白的糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶，酶溶解在pH 8.0 的磷酸緩沖液中，濃縮或者稀釋酶液至120 mg/ml。 1 g濕載體Eupergit C 加入5ml酶液，室溫下均勻混合地反應(yīng)260小時。用沙芯漏斗抽濾，所得 固定化產(chǎn)物用磷酸緩沖液洗滌3 —5次,固定化結(jié)束。
實施例2以載體ZH—EP固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；?采用比活334 U / g蛋白的糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶，酶溶解在 pH9.0的磷酸緩沖液中，濃縮或者稀釋酶液至120mg/ml。 1 g濕載體ZH— EP加入5 ml酶液，室溫下均勻混合地反應(yīng)116小時。用沙芯漏斗抽濾， 所得固定化產(chǎn)物用磷酸緩沖液洗滌3_5次，固定化結(jié)束。
權(quán)利要求
1一種固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶的方法，其特征在于固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅妮d體為ZH—EP，于緩沖溶液體系中，以ZH—EP進行固定化時，酶濃度為100-160mg/ml，固定化時間106-120h，緩沖溶液pH8.5—10.0，反應(yīng)體系中鹽的濃度1.0-1.5M，載體與緩沖溶液的重量體積比例為1g載體4—6ml緩沖溶液。
2.按照權(quán)利要求1所述固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅姆椒?，其 特征在于當體系中緩沖溶液的濃度低于1.0-1.5 M，體系中不足的離子強 度可以用可溶性鹽補充，使反應(yīng)體系中鹽的濃度1.0-1.5 M。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物化工中對酶進行固定化的工藝，具體地說是一種固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅姆椒ǎ潭ɑS產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅妮d體為ZH-EP，于緩沖溶液體系中，以ZH-EP進行固定化時，酶濃度為100-160mg/ml，固定化時間106-120h，緩沖溶液pH 8.5-10.0，反應(yīng)體系中鹽的濃度1.0-1.5M，載體與緩沖溶液的重量體積比例為1g載體4-6ml緩沖溶液。本發(fā)明固定化酶的溫度、pH穩(wěn)定性都比自由酶有了改善。經(jīng)過連續(xù)多批水解青霉素G鉀鹽，固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；革@示出良好的操作穩(wěn)定性，表現(xiàn)出比自由酶的優(yōu)勢。
文檔編號C12N9/78GK101381718SQ200710012710
公開日2009年3月11日 申請日期2007年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月5日
發(fā)明者健 孫, 袁中一, 許國旺 申請人:中國科學院大連化學物理研究所