專利名稱：：具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的酶解產物及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及a-葡萄糖苷酶抑制劑，具體地說是一種通過胃蛋白酶處理牡蠣可溶性蛋白所得到的酶解產物及其應用。技術背景糖尿病是一種慢性的疾病，嚴重的威脅著人們的身體健康和生活質量。據世界衛生組織調查目前世界糖尿病人數高達約1.8億，而中國的糖尿病人占全球的1/3。糖尿病及其并發癥所引起的致殘性、致死率己成為當前威脅人類健康的"第三大殺手"，若不及時治療，糖尿病人可造成四肢麻木、全身疼痛、失明、腎功能衰竭、腦出血、猝死等嚴重后果。n型糖尿病約占糖尿病患者總數的90%。餐后血糖值過高是n型糖尿病并發癥的直接致病因素，控制餐后血糖值可減緩n型糖尿病患者的糖尿病進程。a-葡萄糖苷酶可將多糖或寡糖降解為單糖葡萄糖，抑制a-葡萄糖苷酶活性可有效的抑制餐后血糖值的升高。因此a-葡萄糖苷酶抑制劑的研究是開發預防糖尿病并發癥藥物的熱點。現有的作為治療高血糖的合成藥物如二甲雙胍、阿卡波糖、伏格波糖、格列美脲等a-葡萄糖苷酶抑制劑均具有很多副作用，而源于食品蛋白的a_葡萄糖苷酶抑制劑無毒副作用，市場前景好。
發明內容本發明提供一種由食品來源的、高安全性的、廉價的、具有可產業化的具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的酶解產物及其應用。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的酶解產物，其可通過胃蛋白酶酶解牡蠣可溶性蛋白獲得。所述胃蛋白酶酶解牡蠣可溶性蛋白的操作過程如下將牡蠣可溶蛋白溶于PI^2-4的磷酸緩沖液中，緩沖體系中蛋白的質量體積濃度為1.5-5%，加入胃蛋白酶，酶與底物牡蠣可溶蛋白的質量比為1:1-1000，在25-40。C條件下酶解1-48小時；所得酶解液加熱至80-100°C，并保持5-30分鐘，使蛋白酶失活；之后調節水解液pH=6-8，離心，經超濾膜過濾，超濾膜的截留分子量MW為8000-12000道爾頓，收集透過超濾膜的小分子組分，其即為具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的酶解產物。進行真空冷凍干燥，為牡蠣寡肽，-2(TC保存；將透過超濾膜的小分子組分經SephadexLH-20柱進行層析分離，用體積濃度20-40%的甲醇溶液洗脫，柱溫為室溫，檢測波長為280納米，按時間收集;收集^有較強a-葡萄糖苷酶抑制活性的組分，對酶解產物進一步純化。所述磷酸緩沖液中鹽的濃度可為0.01-0.2mol/L。所述牡蠣可溶性蛋白可按如下過程獲取將新鮮牡蠣去殼、除內臟，將余下的白色肌肉、鰓和體液用勻漿機在低溫狀態下切碎后，將其加到等體積的PH=6-8的PBS緩沖液中，充分攪拌;于0-8°C條件下，靜置2-10小時后，離心；取上清液，加入硫酸銨，并使其最終濃度達到75-100%，并在0-8。C條件下，靜置2-10小時，離心；將沉淀溶于PI^6隱8的PBS緩沖液中，裝入透析袋，透析袋的截留分子量MW為8000-12000道爾頓，自來水流水透析12-36小時，再用去離子水流水透析12-36小時，然后將透析袋中的內容物真空冷凍干燥，得到牡蠣可溶蛋白。所述的酶解產物及其鹽類，它們具有a-葡萄糖苷酶抑制活性，可在制備治療和預防高血糖藥物中應用。所述藥物可為酶解產物及其鹽類與充填劑所形成的各種形式的散劑、顆粒劑、片劑、膠囊、水溶液、懸浮液、乳化液、噴劑或粉劑，它們具有a-葡萄糖苷酶抑制活性；通過口腔攝取或者是注射液的形式使用；其使用可以采取經口腔和非經口腔的投入方法非經口腔的投入可以采取皮下和靜脈注射，肛腸投入等方式；注射液的制作可以任意選用生理鹽水、葡萄糖、安定劑、防腐劑、懸浮劑、乳化劑等。所述藥物可以添加到各種食品當中，作為控制血糖保健食品；食品的形態可以是液體的，比如像清涼飲料、乳酸飲料、調味品、湯類、固體的奶酪、火腿、點心等。所述鹽類可以為酶解產物與酸反應產生的鹽類(比如說鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸；蟻酸、乙酸、丙酸、甘氨膽酸、蘋果酸、擰檬酸、酒石酸或琥珀酸等有機酸等形成的鹽類；)、與金屬離子形成的鹽類(包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽或銨鹽)或與氨基乙醇、三乙氨或二環乙氨形成的胺類鹽等，沒有特別的限制。本發明相關的a-葡萄糖苷酶抑制劑，使用量沒有特別的限制，具體的要根據血糖偏高的程度，患者的年齡，體重，身體狀況和給與的方法等因素，適當地確定。本發明應用現代酶催化技術對牡蠣可溶蛋白進行酶解，利用生物分子分離技術對具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的酶解產物進行了初步分離，對分離得到的活性組分在體內、體外對a-葡萄糖苷酶抑制活性進行了研究，結果表明此活性組分在體外有較強的a-葡萄糖苷酶的抑制活性；此活性組分經4-10(TC不同溫度條件處理后仍能保持原有對a-葡萄糖苷酶的抑制活性；此活性組分經pH=2-12不同酸堿條件處理后仍能保持原有對a-葡萄糖苷酶的抑制活性；此活性組分經模擬胃腸道條件處理后仍能保持原有對a-葡萄糖苷酶的抑制活性；此活性組分分子量小，屬寡肽類小分子物質，進入體內容易吸收，同時不易產生免疫原性；離體回腸蠕動實驗表明此活性組分的攝入不會影響回腸的正常蠕動；此活性組分屬天然食品經胃蛋白酶降解所得，不產生合成類藥物常見的毒副作用；動物實驗結果表明此活性組分在體內有較強的降血糖效果。因此，可以將此活性組分及其衍生物或者其鹽類作為糖尿病患者的長期治療藥物，或者作為食品添加劑制成保健食品。圖1為SephadexLH-20柱分離酶解產物液相圖譜；圖2為酶解產物初步分離所得活性組分的濃度與ci-葡萄糖苷酶抑制活性關系曲線。具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一步的闡述實施例1牡蠣可溶蛋白的制備將新鮮牡蠣去殼、除內臟，將余下的白色肌肉、鰓和體液用勻漿機在低溫狀態下切碎后，將其加到等體積的PI^6的PBS緩沖液中，充分攪拌；于0"C條件下，靜置2小時后，離心；取上清液，加入硫酸銨，并使其最終濃度達到75%，并在0。C條件下，靜置2小時，離心；將沉淀溶于PH=6的PBS緩沖液中，裝入透析袋，透析袋的截留分子量為8000道爾頓，自來水流水透析12小時，再用去離子水流水透析12小時，然后將透析袋中的內容物真空冷凍干燥，得到牡蠣可溶蛋白。實施例2牡蠣可溶蛋白的制備將新鮮牡蠣去殼、除內臟，將余下的白色肌肉、鰓和體液用勻漿機在低溫狀態下切碎后，將其加到等體積的Pf^8的PBS緩沖液中，充分攪拌；于8"C條件下，靜置10小時后，離心；取上清液，加入硫酸銨，并使其最終濃度達到100%，并在8"C條件下，靜置10小時，離心；將沉淀溶于PH=8的PBS緩沖液中，裝入透析袋，透析袋的截留分子量為12000道爾頓，自來水流水透析36小時，再用去離子水流水透析36小時，然后將透析袋中的內容物真空冷凍干燥，得到牡蠣可溶蛋白。實施例3牡蠣可溶蛋白的酶解將牡蠣可溶蛋白溶于PI^2的磷酸緩沖液中，蛋白濃度1%，加入胃蛋白酶，酶與底物牡蠣可溶蛋白的質量比為1:1(質量比)，在25。C條件下酶解1小時。所得酶解液加熱至8(TC，并保持5分鐘，使蛋白酶失活。之后調節水解液pf^6，離心，經超濾膜過濾，超濾膜的截留分子量為8000道爾頓，收集透過超濾膜的小分子組分，其即為具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的酶解產物。實施例4牡蠣可溶蛋白的酶解將牡蠣可溶蛋白溶于PH=4的磷酸緩沖液中，緩沖體系中蛋白的質量體積濃度為5。％，加入胃蛋白酶，酶與底物牡蠣可溶蛋白的質量比為1:1000，在40。C條件下酶解48小時；所得酶解液加熱至IO(TC，并保持30分鐘，使蛋白酶失活；之后調節水解液p1^8，離心，經超濾膜過濾，超濾膜的截留分子量為12000道爾頓，收集透過超濾膜的小分子組分，其即為具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的酶解產物。實施例5酶解產物的初步分離由牡蠣可溶蛋白酶解液15ml經SephadexLH-20柱進行層析分離(如圖1所示)，用30%的甲醇溶液洗脫，柱溫為室溫，檢測波長為280納米，按管數收集，20分鐘/管，收集具有較強a-葡萄糖苷酶抑制活性的組分。實施例6a-葡萄糖苷酶抑制活性的測定a-葡萄糖苷酶抑制活性的測定根據Yong-MuKim的方法略有改動(見CarZw/y^/rateiasearc/z，Volume339，2004，Pages715-717)。材料與儀，pH6.S的緩沖液配制稱取KH2P04，2.72克；KOH，0.64克；MgCl，2.6克；H20，0.13克的實驗藥品溶解，定容至100mL。實驗試劑的配制用緩沖液配制0.1unit/ml的a-葡萄糖苷酶、底物(3mmol/L對硝基酚吡喃糖苷溶于緩沖液)。實驗方法在20jliL實驗樣品中加入20的a-葡萄糖苷酶，在37"C恒溫水浴器中，保溫5分鐘，再加入底物溶液20pL，反應30分鐘，加入終止劑0.1mol/LNa2CO340pL，之后測定405納米波長的吸光值。具體實驗將酶解產物分離得到的活性組分分別配制不同濃度檢測a-葡萄糖苷酶抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>如圖2所示，經計算最終IC5o=8.8mg/ml權利要求1.一種具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的酶解產物，其特征在于其可通過胃蛋白酶酶解牡蠣可溶性蛋白獲得。2.按照權利要求1所述酶解產物，其特征在于所述胃蛋白酶酶解牡蠣可溶性蛋白的操作過程如下將牡蠣可溶性蛋白溶于PP^2-4的磷酸緩沖液中，緩沖體系中蛋白的質量體積濃度為1-5%，加入胃蛋白酶，酶與底物牡蠣可溶蛋白的質量比為1:1-1000，在25-40。C條件下酶解l-48小時；所得酶解液加熱至80-100°C，并保持5-30分鐘，使蛋白酶失活；之后調節酶解液pJ^6-8，離心，經超濾膜過濾，超濾膜的截留分子量MW為8000-12000道爾頓，收集透過超濾膜的小分子組分，其即為具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的酶解產物。3.按照權利要求2所述酶解產物，其特征在于將透過超濾膜的小分子組分經SephadexLH-20柱進行層析分離，用體積濃度20-40%的甲醇溶液洗脫，柱溫為室溫，檢測波長為280納米，按時間收集；收集具有較強a-葡萄糖苷酶抑制活性的組分，對酶解產物進一步純化。4.按照權利要求2所述酶解產物，其特征在于所述磷酸緩沖液中鹽的濃度為0.01-0.2mol/L。5.按照權利要求1或2所述酶解產物，其特征在于所述牡蠣可溶性蛋白可按如下過程獲取將新鮮牡蠣去殼、除內臟，將余下的白色肌肉、鰓和體液用勻漿機在低溫狀態下切碎后，將其加到等體積的PH=6-8的PBS緩沖液中，充分攪拌;于0-8°C條件下，靜置2-10小時后，離心；取上清液，加入硫酸銨，并使其最終濃度達到75-100%，并在0-8。C條件下，靜置2-10小時，離心；將沉淀溶于PH二6畫8的PBS緩沖液中，裝入透析袋，透析袋的截留分子量MW為8000-12000道爾頓，自來水流水透析12-36小時，再用去離子水流水透析12-36小時，然后將透析袋中的內容物真空冷凍干燥，得到牡蠣可溶蛋白。6.—種權利要求1所述的酶解產物及其鹽類在制備治療和預防高血糖藥物中的應用。7.按照權利要求6所述的酶解產物及其鹽類的應用，其特征在于所述藥物為酶解產物及其鹽類與充填劑所形成的散劑、顆粒劑、片劑、膠囊、水溶液、懸浮液、乳化液、噴劑或粉劑，它們具有a-葡萄糖苷酶抑制活性。8.按照權利要求6所述的酶解產物及其鹽類的應用，其特征在于所述藥物可以添加到各種食品當中，作為控制血糖保健食品。9.按照權利要求6所述的酶解產物及其鹽類的應用，其特征在于所述鹽類可以為酶解產物與酸反應產生的鹽類、與金屬離子形成的鹽類或與氨基乙醇、三乙氨或二環乙氨形成的胺類鹽。全文摘要本發明涉及α-葡萄糖苷酶抑制劑，具體地說是一種具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的酶解產物，其可通過胃蛋白酶酶解牡蠣可溶性蛋白獲得。本發明應用現代酶催化技術對牡蠣可溶性蛋白進行酶解，利用生物分子分離技術對酶解產物進行初步分離，對具有α-葡萄糖苷酶抑制活性組分的抑制機制進行了研究，并研究了此組分在體內、體外對α-葡萄糖苷酶抑制活性及穩定性，結果表明此酶解產物有較強的降血糖效果。因此，可以將此活性組分及其衍生物或者其鹽類作為糖尿病患者的長期治療藥物，或者作為食品添加劑制成保健食品。文檔編號C12P21/06GK101323640SQ20071001168公開日2008年12月17日申請日期2007年6月13日優先權日2007年6月13日發明者徐俊光,杜昱光,王佳培,白雪芳申請人:中國科學院大連化學物理研究所