專利名稱：：一種適用于微囊化cho細胞的無血清培養基及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及細胞培養與移植，具體地說是一種適用于微囊化中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的無血清培養基及其應用。技術背景微囊化細胞培養與移植是有廣闊應用前景的人工器官與藥物釋放技術，可以應用于很多種疾病的治療，包括糖尿病、肝衰竭、腫瘤等。該技術由TMSChang(文獻1.ChangTMS,1964.Semipermeablemicrocapsules.Science146,52"25)于1964年提出。由于微囊膜具有選凈過性與免疫隔離性，從而減少細胞移植過程中免疫抑制劑的使用。另外微囊化技術已開始用于細胞大規模培養、單克隆抗體生產等生物工程領域。目前微囊化細胞培養以及移植前期均釆用含10%牛血清培養基進行培養與保存，血清使用存在下列不足l)含有潛在的細胞毒作用和動物源性污染的危險，在微囊化細胞移植過程中會產生不良影響。2)血清的含量非常復雜，增加生物產品的下游分離純化難度與成本。3)血清批次之間的差異增加了微囊化細胞產品的不穩定性。4)血清中所含蛋白質在微囊化細胞培養時可能導致mt膜污染而影響物質轉運，導致囊內細胞因營養物質失衡而死亡。雖然目前商品化的培養基種類很多(文獻2.—種適合中國倉鼠卵巢細胞培養的無血清培養基.申請號200410018258.0),但尚無針對微囊化細胞代謝特點而設計的專用無血清培養基。DeCastroM(文獻3.DeCastroM,2006.Evaluationofhumanserumalbuminasasubstituteoffoetalbovineserumforcellculture.InternationalJournalofPharmaceutics310(1-2):8-14)等嘗試用人血清蛋白替代血清進行細胞培養取得一定進展。因此，適合微囊內細胞生長與代謝特點的、對微膠囊穩定性無明顯影響的、成分符合臨床移植安全要求的無血清培養基具有很好的巿場前景。
發明內容本發明的目的在于提供一種適合微囊化CHO細胞生長和產物表達的無血清培養基。為實現上述目的，本發明釆用的技術方案為一種適用于微囊化CHO細胞的無血清培養基，其包括DMEM/F12標準培養基和下列添加物，胰島素5-15mg/L,大豆卵磷脂10-40mg/L,吐溫8020-40mg/L，環庚三烯酴酮(Tropolone)1-5pM,梓檬氨鐵(FAC)0.1-1mg/L，亞硒酸鈉2.5-10mg/L,P-巰基乙醇20-50joM,氨基酸需額外添加有如下L-天冬氨酸l-5mg/L，L-甘氨酸3-20mg/L,L-精氨酸1-10m^，L-脯氨酸1-10mg/L,L-組氨酸1-10mg/L,L-賴氨酸1-10mg/L,L-半胱氨酸3-20mg/L,L-谷氨酰氨100~400mg/L。其中1.胰島素作用是促進細胞的生長、對葡萄糖和氨基酸的利用以及糖原和脂肪酸的合成。2.環庚三烯酚酮(Tropolone)與檸檬氨鐵(FAC):兩者聯合可與細胞表面受體結錄遞鐵離子，代替傳統培養基中轉鐵蛋白的作用。3.大豆卵磷脂(PA):促進細胞的生長與產物合成并且與微囊制備過程中的鈣鹽無反應。4.p-巰基乙醇促進胱氨酸的吸收，可使谷胱甘肽處于還原狀態，從而保護細胞免受過氧化氫的損害。5.亞硒酸鈉對細胞有著顯著的生長支持效應，其作用與硒作為谷胱甘肽過氧化酶的成分有關，它保護細胞不受過氧化物的毒性影響。6.氨基酸類滿足細胞生長需要。根據微囊化細胞氨基酸代謝特點，在DMEM/F12標準培養基基礎上添加一定量的氨基酸。所述無血清培養基適用于根據聚電解質絡合原理制備的含CHO細胞的生物微膠囊，適于微囊化CHO細胞的培養。所述微膠囊為海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)微膠囊或海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉(ACA)微膠囊。本發明培養基具有以下特點1.根據微囊化CHO細胞氨基酸代謝特點添加成分，從而促進細胞生長。2.添加成分均為明確的小分子物質，易于微囊化細胞吸收，同時利于提高移植生物安全性。3.蛋白含量低，除胰島素外均為非動物源性成分，減少微囊化CHO細胞產生的生物產品的下游分離純化難度與成本，同時利于提高移植生物安全性。4.不添加任何動物血清成分。添加成分對微膠囊性能無明顯不良影響。本發明的無血清培養基能使微囊化CHO細胞旺盛的生長，細胞密度、產物表達和活性都達到或優于有血清培養基細胞培養的水平，說明本發明的無血清培養基可以替代有血清的培養基用于微囊化CHO細胞的培養與移植，大幅降低培養成本，提高微囊化動物細胞的生物安全性。圖1為本發明的無血清培養基培養的微囊化CHO細胞顯微鏡圖片。圖2為含10%胎牛血清培養基培養的微囊化CHO細胞顯微鏡圖片。圖3為本發明兩個實施例與對比例(含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基)的細胞生長曲線。其中-■-實施例l;--實施例2;-▲-對比例具體實施方式實施例1①培養基按下列配方配制本發明中的培養基是個混合物，由商品化的DMEM/F12標準培養基(購自Sigma公司具體成分見表1)和下列添加物所組成胰島素15mg/L大豆卵磷脂40mg/L吐溫8020mg/L環庚三烯酴酮(Tropolone)1(jM才寧檬氨鐵(FAC)0.1mg/L亞硒酸鈉2.5mg/L(3-巰基乙醇20|oML-天冬氨酸1mg/LL-甘氨酸8mg/LL-精氨酸5mg/LL-脯氨酸1mg/LL-組氨酸4mg/LL-賴氨酸3mg/LL-半胱氨酸10mg/LL-谷氨酰氨100mg/L以上所有物質均為分析純化學試劑。本發明所述的培養基釆用常規的混拌方法配制而成。本發明所述的培養基可按常規的微囊化CHO細胞培養過程進行使用。②微囊化CHO細胞的制備海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)微囊化細胞的制備方法參照文獻(文獻4.MaXJ，1994.Generationofalginate-poly畫L-lysinealginate(APA)biomicrocapsules:therelationshipbetweenthemembranestrengthandthereactionconditions.ArtCellsBloodSubsandImmobBiotech,22(1):43—69)。對數生長期的細胞與無菌的1.5。/。(w/v)海藻酸鈉溶液混合均勻，細胞濃度為2xl06cells/mL。利用微膠囊制備儀將該懸液滴入1.1%(w/v)氯化鈣溶液中進行凝膠化反應，形成含有細胞的海藻酸錦膠珠。膠珠與適量的多聚賴氨酸溶液進行成膜反應，形成聚賴氨酸-海藻酸鈉微膠囊。然后將微膠囊重新懸浮于0.15%(w/v)的海藻酸鈉溶液中和表面電荷。用3%(w/v)的獰檬酸鈉液化微膠囊內的海藻酸鉤凝膠，再用生理鹽水洗去微膠囊和細胞碎屑，即制備出實驗所需微囊化CHO細胞。③微囊化細胞于37。C,5%(302培養箱中培養7天后的細胞密度為18xl06cells/ml微囊。如圖1所示。表1DMEM/F12細胞培養基<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>L德酸59.05鹽聯比眵醛2L"賴氨麟麟91.25鹽跑t脾醇0.031L陽蛋鎌17.24核髓0.219L"苯丙氨酸35.482.17L-絲氨酸26.25胸苷0.365L陽蘇氨酸53.45維生素B20.68L-丙鎌4.45L-天門冬翻安7.5L"天門冬氨酸6.65L國半胱氨^^4fc17.56L-谷氨酸7.35L-脯氨酸17.25實施例2①培養基按下列配方配制在1LDMEM/F12培養基中加入如下添加物，然后在培養瓶中加入該培養基，CHO細胞成微囊化后的細胞密度為2xl06cells/ml,培養7天。胰島素5mg/L大豆卵磷脂lOmg/L吐溫8020mg/L環庚三烯酚酮(Tropolone)3pM檸檬氨鐵(FAC)1mg/L亞硒酸鈉lOmg/LP-巰基乙醇50pML-天冬氨酸5mg/LL-甘氨酸20mg/LL-精氨酸10mg/LL-脯氨酸5mg/LL-組氨酸10mg/LL-賴氨酸8m^LL-半胱氨酸20mg/LL-谷氨酰氨400mg/L②微囊化CHO細胞的制備(同實施例1)③微囊化細胞于37°C,5%C02培養箱中培養7天后的細胞密度為16xl06cells/ml《^^o實施例3①培養基按下列配方配制在1LDMEM/F12培養基中加入如下添加物，然后在培養瓶中加入該培養基,CHO細胞成微囊化后的細胞密度為2xl06cells/ml,培養7天。胰島素lOmg/L大豆卵磷脂30mg/L吐溫8040mg/L環庚三烯酚酮(Tropolone)5pM機氨鐵(FAC)0.5mg/L亞硒酸鈉8mg/LP-巰基乙醇30|oML-天冬氨酸3mg/LL-甘氨酸3mg/LL-精氨酸1mg/LL-脯氨酸10mg/LL-組氨酸1mg/LL-賴氨酸10mg/LL-半胱氨酸3mg/LL-谷氨酰氨200mg/L②微囊化CHO細胞的制備(同實施例1)③微囊化細胞于37°C,5%C02培養箱中培養7天后的細胞密度為15xl06cells/ml《li^實施例4①培養基按下列配方配制在1LDMEM/F12培養基中加入如下添加物，然后在培養瓶中加入i亥培養基,CHO細胞成微嚢化后的細胞密度為2xl06cdls/ml，培養7天。胰島素8mg/L大豆卵磷脂20mg/L吐溫8030mg/L環庚三烯酸酮(Tropolone)2fiM杼檬氨鐵(FAC)0.2mg/L亞硒酸鈉6mg/LP-巰基乙醇25nML-天冬氨酸2mg/LL-甘氨酸10mg/LL-精氨酸8mg/LL-脯氨酸8mg/LL-組氨酸6mg/LL-賴氨酸lmg/LL-半胱氨酸15mg/LL-谷氨酰氨300mg/L②微囊化CHO細胞的制備海藻酸鈉_殼聚糖-海藻酸鈉(ACA)微囊化細胞的制備方法參照文獻(文獻5付穎麗等2002;海藻酸鈉/殼聚糖微膠囊生物相容性的研究自然科學進展12(8):845-847)對數生長期的細胞與無菌的1.5%(w/v)海藻酸鈉溶液混合均勻,細胞濃度為2xl06cells/mL。禾擁微膠囊制^f義將該懸液滴入1.1%(w/v)氯化努溶液中進行凝膠化反應，形成含有細胞的海藻酸鉤膠珠。膠珠與適量的0.5%(w/v)的殼聚糖溶液進行成膜反應，形成殼聚糖-海藻酸鈉微膠囊。然后將微膠囊重新懸浮于0.15%(w/v)的海藻酸鈉溶液中和表面電荷。用3%(w/v)的檸檬酸鈉液化微膠囊內的海藻酸鉤凝脫再用生理鹽水洗去微膠囊和細胞碎屑，即制備出實驗所需微囊化CHO細胞。③微囊化細胞于37°C，5%C02培養箱中培養7天后的細胞密度為17xl06cells/ml微囊。實施例5①培養基按下列配方配制在1LDMEM/F12培養基中加入如下添加物，然后在培養瓶中加入該培養基,CHO細胞成微囊化后的細胞密度為2xl06cells/ml,培養7天。胰島素15mg/L大豆卵磷脂10mg/L吐溫8020mg/L環庚三烯酴酮(Tropolone)1jjM才寧檬氨鐵(FAC)0.5mg/L亞硒酸鈉6mg/LP-巰基乙醇50joML-天冬氨酸1mg/LL-甘氨酸10mg/LL-精氨酸8mg/LL-脯氨酸1mg/LL-組氨酸10mg/LL-賴氨酸10mg/LL-半胱氨酸3mg/LL-谷氨酰氨100mg/L②微囊化CHO細胞的制備(同實施例4)④微囊化細胞于37。C,5。/。c02培養箱中培養7天后的細胞密度為16.5xl06cells/ml微囊。實施例6①培養基按下列配方配制在1LDMEM/F12培養基中加入如下添加物，然后在培養瓶中加入該培養基,CHO細胞成微囊化后的細胞密度為2xl06cells/ml,培養7天。胰島素8mg/L大豆卵磷脂20mg/L吐溫8030mg/L環庚三烯,(Tropolone)5pM檸檬氨鐵(FAC)lmg/L亞硒酸鈉2.5mg/L|3-巰基乙醇50mML-天冬氨酸5mg/LL-甘氨酸20mg/LL-精氨酸10mg/LL-脯氨酸5mg/LL-組氨酸10mg/LL-賴氨酸8mg/LL-半胱氨酸20mg/LL-谷氨酰氨250mg/L②微囊化CHO細胞的制備(同實施例4)③微囊化細胞于37。C,5。/。C02培養箱中培養7天后的細胞密度為18.4xl06cells/ml微囊。對比例釆用與實施例1和2相同的培養方法，所用培養基為添加了10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，CHO細胞成微囊化后的細胞密度為2x106cells/ml,微囊化細胞于37。C,5。/。C02培養箱中培養7天后的細胞密度為14xl06cells/ml微囊。如圖2所示。由以上實施例對比發現，本發明的微囊化CHO細胞無血清培養基可以替代含血清培養基用于微囊化細胞培養與移植。如圖3所示。權利要求1.一種適用于微囊化CHO細胞的無血清培養基，其特征在于其包括DMEM/F12標準培養基和下列添加物，胰島素5-15mg/L，大豆卵磷脂10-40mg/L，吐溫8020-40mg/L，環庚三烯酚酮1-5μM，檸檬氨鐵0.1-1mg/L，亞硒酸鈉2.5-10mg/L，β-巰基乙醇20-50μM，氨基酸需額外添加有如下L-天冬氨酸1-5mg/L，L-甘氨酸3-20mg/L，L-精氨酸1-10mg/L，L-脯氨酸1-10mg/L，L-組氨酸1-10mg/L，L-賴氨酸1-10mg/L，L-半胱氨酸3-20mg/L，L-谷氨酰氨100-400mg/L。2.—種權利要求l所述無血清培養基的應用，其特征在于其適用于根據聚電解質絡合原理制備的含CHO細胞的生物微膠囊，適于微囊化CHO細胞的培養。3.按照權利要求2所述無血清培養基的應用，其特征在于所述微膠囊為海藻酸鈉_聚賴氨酸-海藻酸鈉微膠囊或海藻酸鈉-殼聚糖_海藻酸鈉微膠囊。全文摘要本發明涉及細胞培養與移植，具體地說是一種適用于微囊化CHO細胞的無血清培養基，其以DMEM/F12為基礎培養基，針對微囊化細胞生長代謝特點，并添加一定比例的胰島素、大豆卵磷脂、吐溫80、環庚三烯酚酮(Tropolone)、檸檬氨鐵(FAC)、亞硒酸鈉、β-巰基乙醇、氨基酸。本發明的無血清培養基能使微囊化CHO細胞旺盛的生長，細胞密度、產物表達和活性都達到或優于有血清培養基細胞培養的水平，說明本發明的無血清培養基可以替代有血清的培養基用于微囊化CHO細胞的培養與移植，大幅降低培養成本，提高微囊化動物細胞的生物安全性。文檔編號C12N5/071GK101319200SQ20071001163公開日2008年12月10日申請日期2007年6月8日優先權日2007年6月8日發明者于煒婷,呂國軍,孫志杰,娜李,林軍章,為王,馬小軍申請人:中國科學院大連化學物理研究所