專利名稱：一種果樹主要病毒的pcr檢測試劑盒及使用方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及果樹主要病毒的檢測。
背景技術：
果樹病毒病是難以控制的病害，一旦侵染，在自然條件下難以清除，終生保存在樹體內。感染病毒病的果樹，體內的生理機能遭到破壞，生長不良、產量下降、品質變劣，并且對果樹形成長期的慢性危害，嚴重時致樹體死亡，給生產帶來巨大的經濟損失。
果樹病毒種類多，危害持久，迄今尚無有效的藥物可以控制。目前較為可行的控制措施是實行檢疫，控制其擴展。因此，建立高效靈敏的檢測技術，成為解決種苗檢疫、抗病性早期鑒定等基本問題的前提，并能為果樹無毒化栽培提供基本保障。
果樹病毒常用的檢測方法有植物學癥狀鑒定法、指示植物鑒定法、電子顯微鏡技術檢測法、血清學檢測法、分子生物學檢測法等。每一類方法都有其優缺點，在使用上也具有一定的局限性，其中分子生物學檢測法以其靈敏度高、特異性更強、檢測病毒范圍廣、可批量檢測等優勢正逐漸受到廣泛的重視。
逆轉錄—多聚酶鏈式反應(RT-PCR)技術是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法，是近幾年被廣泛的應用于生物學各個領域的前沿性生物技術，該技術用于植物病毒的檢測具有特異性強、靈敏度高、快速簡便、結果可靠等優點，目前我國在這一領域的研究還剛剛起步。
本發明經過反復驗證，此次申報的試劑盒及檢測方法在原有的基礎上進一步優化。具有如下特點1.檢測成本進一步降低，不足國外同類檢測成本的一半。
2.檢測所需時間縮短，3-4h即可檢測完畢。
3.該試劑盒使用簡便，重復性強，準確性高。
4.該試劑盒檢測果樹病毒時，不受檢測時間和檢測部位的限制，可以周年使用。
發明內容
本發明旨在提供一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒，該試劑盒由果樹病毒RNA提取試劑和PCR檢測試劑組成。該試劑盒需要保存在-70℃的低溫下。
果樹病毒RNA提取試劑為液氮、RNA提取緩沖液、酚、氯仿、異戊醇、氯化鋰、0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液、3mol/L醋酸鈉(pH5.3)、無水乙醇。
PCR檢測試劑為dNTPs 100μmol/L、0.67mol/L Buffer緩沖液(pH8.8)、RNasin(RNA酶抑制劑)、MgCl2、Pc引物、Ph引物、Mo-MLV RTase(逆轉錄酶)、總RNA模板、Taq酶、無菌雙蒸水。
反應中所使用的Pc引物為Cl-Pc(蘋果褪綠葉斑病毒互補引物)5′-cagaccctta ttgaagtcga a-3′Sg-Pc(蘋果莖溝病毒互補引物)5′-ctgcaagacc gcgaccaagt tt-3′Ap-Pc(蘋果花葉病毒互補引物)5′-ttctagcagg tcttcatcga-3′Nr-Pc(李屬壞死環斑病毒互補引物)5′-acgcgcaaaa gtgtcgaaat ctaaa-3’Lr-Pc(葡萄卷葉病毒互補引物)5′-cggcacgatc gtactttcta a-3′Pd-Pc(李矮縮病毒互補引物)5′-tagtgcaggt taaccaaaag gat-3′反應中所使用的Ph引物為Cl-Ph(蘋果褪綠葉斑病毒同源引物)5′-ggcaaccctg gaacaga-3′Sg-Ph(蘋果莖溝病毒同源引物)5′-cccgctgttg gatttgatac acctc-3Ap-Ph(蘋果花葉病毒同源引物)5′-caaccgagag gttggca-3′Nr-Ph(李屬壞死環斑病毒同源引物)5′-tggtcccact cagagctcaa caaag-3Lr-Ph(葡萄卷葉病毒同源引物)5′-gatgctttcg cgtatttctt g-3′Pd-Ph(李矮縮病毒同源引物)5′-atggatggga tggataaaat agt-3′本發明中，果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒的使用方法包括以下步驟第一步果樹病毒RNA提取①取200-300mg果樹組織，加液氮研磨成粉末狀，并快速移入1.5ml離心管中，加300-600μl RNA提取緩沖液和500-800μl熱酚，振蕩30-60秒，4℃，10000-12000轉/分，離心5-10分鐘；②取水相，加入1-2倍體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，4℃，10000-12000rpm，離心5-10分鐘；③取水相，加入2.5倍體積的氯化鋰，于4℃條件下保存2小時；④沉淀溶于0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液250μl中，室溫下放置1.5小時后，再用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提兩次，4℃，10000-12000rpm，離心5-10分鐘；⑤取水相，加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉(pH5.3)和2.5倍體積的無水乙醇，-20℃放置0.5小時后，于4℃，10000-12000rpm，離心5-10分鐘；⑥沉淀用70％乙醇洗1-2次，干燥后溶于30-50μl無菌雙蒸水或0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液中，得到總RNA模板，于-20℃或-70℃保存備用；第二步逆轉錄取dNTPs 100-300μmol/L、0.67mol/L Buffer緩沖液(pH8.8)1.0μl、RNasin(RNA酶抑制劑)8-10U、氯化鎂0.5-1.1mmol/L、Pc引物0.35-0.60μmol/L、Mo-MLV RTase(逆轉錄酶)50U、總RNA模板0.5-1.0μl，以無菌雙蒸水或焦碳酸二乙酯的水溶液補足10μl，于37-42℃反應1h，再于95℃反應5min；第三步PCR擴增取上述RT反應產物10μl、dNTPs 80-100μmol/L、PCR Buffer2.5μl、MgCl20.6-1.2mmol/L、引物0.3-0.5μmol/L、Ph0.35-0.6μmol/L、TaqE 1U，用無菌雙蒸水補足25μl，于90-94℃反應30-6s，再于50-60℃反應30s-2min，接著于72℃反應1-2min，反應循環30-35次，最后一輪反應延伸7min。
第四步對擴增產物進行電泳、染色，產生特異DNA譜帶，進行結果判斷。
本發明主要用于蘋果褪綠葉斑病毒、蘋果莖溝病毒、蘋果花葉病毒、李屬壞死環斑病毒、葡萄卷葉病毒和李屬矮縮病毒的PCR檢測。
本發明中所使用的無菌雙蒸水與0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液可以相互替換。
本發命中所使用的RNA提取緩沖液的組成為50mmol/L TrisCl pH8.0、140mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA、1％SDS、2％PVP、10U RNasin、2％巰基乙醇，其中的RNasin和2％巰基乙醇為臨用前加入。
具體實施例方式
實施例一一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒，由果樹病毒RNA提取試劑和PCR檢測試劑組成，其中，果樹病毒RNA提取試劑為液氮、RNA提取緩沖液、酚、氯仿、異戊醇、氯化鋰(LiCl)、焦碳酸二乙酯的水溶液(濃度？)、3mol/L NaAc(pH5.3)、無水乙醇；PCR檢測試劑為dNTPs 100μmol/L、0.67mol/L Buffer緩沖液(pH8.8)、RNA酶抑制劑(RNasin)、MgCl2、引物、Mo-MLV RTase(逆轉錄酶)、總RNA模板、Taq酶、無菌雙蒸水。
該試劑盒用于檢測蘋果褪綠葉斑病毒時按如下程序操作第一步果樹病毒RNA提取①取200果樹組織，加液氮研磨成粉末狀，并快速移入1.5ml離心管中，加300μl RNA提取緩沖液和500μl熱酚，振蕩30秒，4℃，10000轉/分，離心5分鐘；②取水相，加入1倍體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，4℃，10000rpm，離心5分鐘；③取水相，加入2.5倍體積的LiCl，于4℃條件下保存2小時；④沉淀溶于250μl 0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液中，室溫下放置1.5小時后，再用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提兩次，4℃，10000rpm，離心5分鐘；⑤取水相，加入1/10體積的3mol/L NaAc(pH5.3)和2.5倍體積的無水乙醇，-20℃放置0.5小時后，于4℃，10000rpm，離心5分鐘；⑥沉淀用70％乙醇洗1次，干燥后溶于30μl DEPC H2O(焦碳酸二乙酯的水溶液)中，得到總RNA模板，于-20℃保存備用；第二步逆轉錄取dNTPs 100μmol/L、0.67mol/L Buffer緩沖液(pH8.8)1.0μl、RNasin(RNA酶抑制劑)10U、MgCl20.8mmol、Cl-Pc 0.40uM、Mo-MLV RTase(逆轉錄酶)50U、總RNA模板1.0μl，用DEPC ddH2O補足10μl，混合，于42℃溫育1h，再于95℃反應5min；第三步PCR擴增取dNTPs 80μmol/L、PCR Buffer2.5μl、MgCl21.2mmol/L、C1-Pc 0.5μmol/L、Cl-Ph0.5μmol/L、TaqE 1U、RT產物10μl，用DEPC水補足25μl，依次于94℃反應30s；55℃反應1min；72℃反應1min；將反應循環30次，最后延伸7min；第四步對擴增產物進行電泳、染色，產生特異DNA譜帶，進行結果判斷。
實施例二一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒，其組成同實施例一，用于檢測葡萄卷葉病毒時按如下程序操作第一步果樹病毒RNA提取，同實施例一；第二步逆轉錄取dNTPs 100μmol/L、0.67mol/L Buffer(10x)緩沖液(pH8.8)1μl、RNasin10U、MgCl20.8mmol/L、GLR-Pc 0.4μmol/L、MMLV RTase50U、總RNA 1μl(0.5-1.0μg)。用DEPC ddH2O補足10μl，混合后于42℃溫育1h；第三步PCR擴增取dNTPs 80μmol/L、PCR Buffer 2.5μl、MgCl21.0mmol/L、GLR-Pc0.45μmol/L、GLR-Ph0.50μmol/L、Taq DNA聚合酶1U，用DEPC ddH2O補足25μl。混合后依次于94℃反應30s，52℃反應1min，72℃反應1min，將反應循環30次，最后一輪延伸7min；第四步對擴增產物進行電泳、染色，產生特異DNA譜帶，進行結果判斷。
實施例三一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒，其組成同實施例一，用于檢測蘋果莖溝病毒時按如下程序操作第一步果樹病毒RNA提取①取300mg果樹組織，加液氮研磨成粉末狀，并快速移入1.5ml離心管中，加600μl RNA提取緩沖液和800μl熱酚，振蕩60秒，4℃，12000轉/分，離心10分鐘；②取水相，加入2倍體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，4℃，12000rpm，離心10分鐘；③取水相，加入2.5倍體積的LiCl，于4℃條件下保存2小時；④沉淀溶于250μl 0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液中，室溫下放置1.5小時后，再用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提兩次，4℃，12000rpm，離心10分鐘；⑤取水相，加入1/10體積的3mol/L NaAc(pH5.3)和2.5倍體積的無水乙醇，-20℃放置0.5小時后，于4℃，12000rpm，離心5-10分鐘；⑥沉淀用70％乙醇洗2次，干燥后溶于50μl DEPC H2O(焦碳酸二乙酯的水溶液)中，得到總RNA模板，于-70℃保存備用；第二步逆轉錄取dNTPs 100μmol/L、0.67mol/L Buffer緩沖液(pH8.8)1.0μl、RNasin 10U、MgCl20.8mmol/L、Sg-Pc 0.40μmol/L、Mo-MLV RTase 50U、總RNA 1.0μl，用無菌雙蒸水補足10μl，混合后依次于42℃溫育1.5h，95℃溫育5min；第三步PCR擴增取dNTPs 80μmol/L、PCR Buffer 2.5μl、MgCl21.0mmol/L、Sg-Pc 0.30μmol/L、Sg-Ph0.35μmol/L、TaqE 1U、RT產物10μl，用DEPC ddH2O補足25μl。混合后依次于94℃反應1min，60℃反應1min，72℃反應1min，將反應循環30次，最后延伸7min；第四步對擴增產物進行電泳、染色，產生特異DNA譜帶，進行結果判斷。
實施例四一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒，其組成同實施例一，用于檢測蘋果花葉病毒時按如下程序操作第一步果樹病毒RNA提取，同實施例一；第二步逆轉錄取0.67mol/L Buffer(5×)緩沖液(pH8.8)2μl、Pc0.7μmol/L；RNasin 6U、dNTPs0.25 mmol/L、MgCl20.5mmol/L、Mo-MLV RTase 100U、總RNA 2μl，用無菌雙蒸水補足10μl，混合后依次于37℃溫育30分鐘，95℃溫育5分鐘；第三步PCR擴增取0.2mmol/L dNTPs、10×PCR Buffer 2.5μl、MgCl20.5mmol/L、Pc0.68μmol/L、Ph 0.84μmol/L、Taq DNA聚合酶1U，用無菌雙蒸水補足25μl，混合后依次于90℃反應45秒、50℃反應45秒、72℃反應45秒，將反應循環40次，之后在72℃下延伸7分鐘；第四步對擴增產物進行電泳、染色，產生特異DNA譜帶，進行結果判斷。
實施例五一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒，其組成同實施例一，用于檢測李矮縮病毒時按如下程序操作第一步果樹病毒RNA提取，同實施例二；第二步逆轉錄取0.67mol/L Buffer(5×)緩沖液(pH8.8)2μl、Pd-Pc 0.6μmol/L、RNasin 8U、dNTPs125μmol/L、MgCl20.5mmol/L、M-MLV RTase 50U、總RNA 0.5μl，用無菌雙蒸水補足10μl，混合后于37℃溫育30分鐘；第三步PCR擴增取100μmol/L dNTPs、10×PCR Buffer 2.5μl、MgCl20.9mmol/L、Pd-Pc0.3μmol/L、Pd-Ph0.3μmol/L、Taq DNA聚合酶1U，用無菌雙蒸水補足25μl，依次于94℃預變性3分鐘、94℃反應45秒、60℃反應30秒、72℃反應45秒，將反應循環30次，最后一輪延伸為72℃7分鐘，4℃保存；第四步對擴增產物進行電泳、染色，產生特異DNA譜帶，進行結果判斷。
實施例六一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒，其組成同實施例一，用于檢測李屬壞死環斑病毒時按如下程序操作第一步第一步果樹病毒RNA提取，同實施例二；第二步逆轉錄取dNTPs125μmol/L、0.67mol/L Buffer緩沖液(pH8.8)1.0μl、RNasin 8U、MgCl21.13mmol/L、Nr-Pc 0.496μmol/L、Mo-MLV RTase 50U、總RNA 0.5μl，用無菌雙蒸水補足10μl，依次于37℃溫育1小時，95℃溫育5分鐘；第三步PCR擴增取dNTPs100μmol/L、PCR Buffer 2.5μl、MgCl21.2mmol/L、Nr-Pc0.396μmol/L、Nr-Pb0.456μmol/L、TaqE 1U、RT產物1U，用無菌雙蒸水補足25μl，混合后依次于94℃反應30秒、54℃反應1分鐘、72℃反應1分鐘，將反應循環25次，最后一輪延伸為5分鐘；第四步對擴增產物進行電泳、染色，產生特異DNA譜帶，進行結果判斷。
SEQUENCE LISTING<110>侯義龍<120>一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒及使用方法<160>12<210>1<211>21<212>RNA<213>蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus)<400>1cagaccctta ttgaagtcga a 21<210>2<211>22<212>RNA<213>蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus)<400>2ctgcaagacc gcgaccaagt tt 22<210>3<211>20<212>RNA<213>蘋果花葉病毒(Apple mosaic virus)<400>3ttctagcagg tcttcatcga 20<210>4<211>25<212>RNA<213>李屬壞死環斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus)<400>4acgcgcaaaa gtgtcgaaat ctaaa 25
<210>5<211>21<212>RNA<213>葡萄卷葉病毒(Grapevine leaf roll-associated virus)<400>5cggcacgatc gtactttcta a 21<210>6<211>23<212>RNA<213>李矮縮病毒(Prune dwarf virus)<400>6tagtgcaggt taaccaaaag gat 23<210>7<211>17<212>RNA<213>蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leafspot virus)<400>7ggcaaccctg gaacaga 17<210>8<211>25<212>RNA<213>蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus)<400>8cccgctgttg gatttgatac acctc 25<210>9<211>17<212>RNA<213>蘋果花葉病毒(Apple mosaic virus)<400>9caaccgagag gttggca 17
<210>10<211>25<212>RNA<213>李屬壞死環斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus)<400>10tggtcccact cagagctcaa caaag 25<210>11<211>21<212>RNA<213>葡萄卷葉病毒(Grapevine leaf roll-associated virus)<400>11gatgctttcg cgtatttctt g 21<210>12<211>23<212>RNA<213>李矮縮病毒(Prune dwarf virus)<400>12atggatggga tggataaaat agt 2權利要求
1.一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒，其特征在于由果樹病毒RNA提取試劑和PCR檢測試劑組成，其中，果樹病毒RNA提取試劑為液氮、RNA提取緩沖液、酚、氯仿、異戊醇、氯化鋰、0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液、3mol/L醋酸鈉(pH5.3)、無水乙醇；PCR檢測試劑為dNTPs 100μmol/L、0.67mol/L Buffer緩沖液(pH8.8)、RNA酶抑制劑、氯化鎂、Pc引物、Ph引物、Mo-MLV RTase、總RNA模板、Taq酶、無菌雙蒸水。
2.根據權利要求1所述的一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒，其特征在于反應中所使用的Pc引物為Cl-Pc5′-cagaccctta ttgaagtcga a-3′Sg-Pc5′-ctgcaagacc gcgaccaagt tt-3′Ap-Pc5′-ttctagcagg tcttcatcga-3′Nr-Pc5′-acgcgcaaaa gtgtcgaaat ctaaa-3’Lr-Pc5′-cggcacgatc gtactttcta a-3′Pd-Pc5′-tagtgcaggt taaccaaaag gat-3′
3.根據權利要求1所述的一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒，其特征在于所使用的Ph引物為Cl-Ph5′-ggcaaccctg gaacaga-3′Sg-Ph5′-cccgctgttg gatttgatac acctc-3Ap-Ph5′-caaccgagag gttggca-3′Nr-Ph5′-tggtcccact cagagctcaa caaag-3Lr-Ph5′-gatgctttcg cgtatttctt g-3′Pd-Ph5′-atggatggga tggataaaat agt-3′
4.根據權利要求1所述的一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒需要保存在-70℃的低溫下。
5.根據權利要求1所述的一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒，其特征在于使用時按如下方法進行操作第一步果樹病毒RNA提取①取200-300mg果樹組織，加液氮研磨成粉末狀，并快速移入1.5ml離心管中，加300-600μl RNA提取緩沖液和500-800μl熱酚，振蕩30-60秒，4℃，10000-12000轉/分，離心5-10分鐘；②取水相，加入1-2倍體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，4℃，10000-12000rpm，離心5-10分鐘；③取水相，加入2.5倍體積的氯化鋰，于4℃條件下保存2小時；④沉淀溶于250μl 0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液中，室溫下放置1.5小時后，再用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提兩次，4℃，10000-12000rpm，離心5-10分鐘；⑤取水相，加入1/10體積的3mol/L NaAc(pH5.3)和2.5倍體積的無水乙醇，-20℃放置0.5小時后，于4℃，10000-12000rpm，離心5-10分鐘；⑥沉淀用70％乙醇洗1-2次，干燥后溶于30-50μl DEPC H2O(焦碳酸二乙酯的水溶液)中，得到總RNA模板，于-20℃保存備用；第二步逆轉錄取dNTPs 100-300μmol/L、0.67mol/L Buffer緩沖液(pH8.8)1.0μl、RNA酶抑制劑8-10U、MgCl20.5-1.1 mmol/L、Pc引物0.35-0.60μmol/L、Mo-MLV RTase50U、總RNA模板0.5-1.0μl，以無菌雙蒸水補足10μl，于37-42℃反應1h，再于95℃反應5min；第三步PCR擴增取上述逆轉錄反應產物10μl、dNTPs 80-100μmol/L、PCR Buffer2.5μl、氯化鎂0.6-1.2mmol/L、Pc引物0.3-0.5μmol/L、Ph引物0.35-0.6μmol/L、Taq酶1U，用無菌雙蒸水補足25μl，于90-94℃反應30-60s，再于50-60℃反應30s-2min，接著于72℃反應1-2min，反應循環30-35次，最后一輪反應延伸7min；第四步對擴增產物進行電泳、染色，產生特異DNA譜帶，進行結果判斷。
6.根據權利要求1所述的一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒，其特征在于可用于蘋果褪綠葉斑病毒、蘋果莖溝病毒、蘋果花葉病毒、李屬壞死環斑病毒、葡萄卷葉病毒和李屬矮縮病毒的PCR檢測。
7.根據權利要求1所述的一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒，其特征在于所使用的無菌雙蒸水可以由焦碳酸二乙酯的水溶液替換。
8.根據權利要求1所述的一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒，其特征在于RNA提取緩沖液的組成為50mmol/L TrisCl pH8.0、140mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA、1％SDS、2％PVP、10U RNasin、2％巰基乙醇。
9.根據權利要求1所述的一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒，其特征在于其RNA提取緩沖液中的RNasin和2％巰基乙醇為臨用前加入。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種果樹主要病毒的PCR檢測試劑盒及其使用方法。該試劑盒由RNA提取試劑和PCR檢測試劑組成，利用PCR技術原理，根據科學研究優化的試劑組合結果整合而成，可用于蘋果褪綠葉斑病毒、蘋果莖溝病毒、蘋果花葉病毒、李屬壞死環斑病毒、葡萄卷葉病毒和李矮縮病毒的PCR檢測，需要配合PCR儀和高速冷凍離心機等的使用。具有靈敏度高、專一性強、操作簡便、用時短等特點。適用于植病檢疫檢驗部門、高等院校、科研院所。
文檔編號C12Q1/68GK101016571SQ20071001056
公開日2007年8月15日 申請日期2007年3月9日 優先權日2007年3月9日
發明者侯義龍 申請人:大連大學