專利名稱：一株用于脫硫的放射形土壤桿菌及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及到一株新篩選的菌株放射形土壤桿菌。該放射形土壤桿菌能夠選擇性斷裂含碳物質的C-S鍵，保持含碳物質的生熱值基本不變。本發明的放射形土壤桿菌特別適用于含有有機硫化合物的物質脫硫，如用于脫除含硫的煤炭或原油及其餾分中的硫。
背景技術：
硫元素是石油中繼碳元素和氫元素之后的第三大元素，并且它無論在已加工或未加工的燃油中都是不受歡迎的組分。石油中的硫元素造成石油精煉過程中對設備的腐蝕，另外，含硫燃油燃燒產生的SO2會造成環境污染。環境部門對石油產品如汽油與柴油中硫含量的限制越來越嚴格。
無機的硫鐵礦硫和有機硫各占煤炭的3.5％(w/w)左右。硫鐵礦硫相對容易被脫除。微生物如真菌(HE De-wen，CHAI Li-yuan，SONG Wei-feng，″Experimental Research on Factors Affecting Desulfurization Mechanism of Fungi，″Environmental Science and Technology，27(1)5-6)等通過氧化或還原方式代謝無機硫和有機硫為水溶性硫酸鹽。
Kodama等人曾在1973年報道一個在有氧條件下，通過“kodama”途徑裂解二苯并噻吩(DBT)導致DBT芳香環斷裂的轉化過程(Kodama K.，Umehara K.，Shimizu K.，Nakatanni S.，Minoda Y.，Yamada K.1973.Identification of microbialproducts from dibenzothiophene and its proposed oxidation pathway.Agr.Biol.Chem.3745-50)，但是在這個過程中DBT的硫元素并沒有被釋放出來，“kodama”途徑見圖1。Van Afferden M等人也在1990年報道了一個利用DBT作為單一碳源、硫源與能源的特異性路徑(Van Afferden M.，Schacht S.，Klein J.，Trüper H.G.1990.Desulfurization of dibenzothiophene by Brevibacterium sp.DO.Arch.Microbiol.153324-328)。這兩個路徑都導致了芳香環中C-C鍵的斷裂，造成燃油中燃燒熱值降低，因此這兩個代謝途徑都不是在BDS過程中希望利用的路徑。
Kilbane等人1989年在Rhodococcus rhodochrous IGTS8(US 5,002,888)和Bacillus sphaericus strain ATCC No.53969(US 5,104,801)中發現一個選擇性斷裂C-S鍵的路徑，命名為“4S”路徑。Rhodococcus rhodochrous IGTS8能夠執行一個針對雜環分子，如噻吩、硫化物、二硫化物、硫醇、亞砜和砜中的硫原子的選擇性逐步氧化過程，而碳骨架不被代謝(Kayser K.J.，Bielaga-Jones B.A.，Jackowski K.，Odusan O.，Kilbane J.J.1993.Utilization of organosulfur compoundsby axenic and mixed cultures of Rhodococcus rhodochrous IGTS8.J.Gen.Microbiol.1393123-3129)。特別是通過“4S”途徑Rhodococcus rhodochrous IGTS8能夠降解DBT產生2-羥基聯苯(2-HBP)和硫酸鹽(Gallagher J.R.，Olson E.S.，StanleyD.C.1993.Microbial desulfurization of dibenzothiophenea sulfur specific pathway.FEMS Microbiol.Lett.10731-36)，“4S”途徑見圖2。
Kilbane等人公布了他們的工作之后各國科技工作者又先后篩選出一大批與IGTS8相似的能夠選擇性斷裂有機硫化合物中C-S的菌株，這些菌株如有Sphingomonas sp.Strain AD109(US 5,132,219)，Norcardia sp.CKYS2(US6,197,570)，Gordona sp.CYKS1(US 6,204,046)，Mycobacterium(CN 1379084A)，Pseudomonas delafildii R-8(CN 1386847A)，中國科學院化工冶金研究所緱仲軒等人篩選出的紅平紅球菌LSSE-1(CN 1418948A)。紅平紅球菌LSSE-1能夠專一性斷裂有機硫化合物中的C-S鍵，對礦質燃料如石油，煤等脫硫不損失燃燒熱值，具有較高的應用價值。利用紅平紅球菌LSSE-1制備的生物催化劑能夠對加氫精制柴油進行深度脫硫，從263ppm降低到50ppm以下。LSSE-1在以DBT為單一硫源的基本培養基中生長84h達到指數生長期，菌體濃度為4.18OD(600nm處，下同)，168h達到穩定生長期，菌體濃度為5.87OD，生長84h和168h的細胞的比脫硫活力分別為0.22和0.14mg(S)·g-1(DCW)·h-1(李珊，邢建民，緱仲軒等人，紅平紅球菌LSSE8-1的培養及其對二苯并噻吩中硫元素脫除的影響，過程工程學報，2(3)257-261)。
雖然已經分離出很多能夠用于燃油BDS過程的菌株，但未見有放射形土壤桿菌用于生物脫硫的報道。而且還有很多限制因素阻礙了石油BDS過程的商業化應用。這些限制因素例如有用于脫硫的菌株生長周期太長，脫硫菌株的專一催化活性不夠高，脫硫過程中產生的硫酸鹽嚴重的抑制生物催化劑的活性，以及石油對脫硫菌株的毒性縮短了生物催化劑的壽命等等。
因此迫切需要一株具有增強的專一性催化活性，和增強的催化穩定性的菌株用于生物脫硫過程。
發明內容
本發明目的在于克服以往的脫硫菌株的缺點，提供一株從被石油污染的土壤中新篩選出的，生長周期短、脫硫活性高、同時還能耐受高濃度硫酸根離子、具有良好的耐油性，以及催化活性穩定的能專一性斷裂含有機硫的化合物中C-S鍵的菌株。以及該菌株在含硫的煤炭或原油及其餾分脫硫中的應用。
本發明提供一種用于生物脫硫的放射形土壤桿菌，放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3，于2004年11月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC NO.1254。
本發明提供的放射形土壤桿菌革蘭氏染色為陰性；細胞形態桿狀。在pH4～9均能良好生長，生長溫度28～42℃，屬于好氧菌。
本發明放射形土壤桿菌FD-3對含硫有機物中的C-S鍵進行專一性降解，不破壞有機物中的C-C鍵，因此可以作為生物催化劑對所有含硫化合物如原油、柴油、汽油、煤炭等進行脫硫處理方法。
本發明的放射形土壤桿菌FD-3無論是生長細胞，休止細胞，細胞抽提液，以及細胞中與生物脫硫有關的酶的提取液都可以用于所有含硫化合物如原油、柴油、汽油、煤炭等的脫硫處理。如放射形土壤桿菌在原油、柴油、汽油、煤炭進行脫硫處理中的應用；放射形土壤桿菌生長細胞在含硫化合物脫硫中的應用；放射形土壤桿菌休止細胞在含硫化合物脫硫中的應用；放射形土壤桿菌固定化細胞在含硫化合物脫硫中的應用；放射形土壤桿菌細胞抽提液在含硫化合物脫硫中的應用等等。
本發明放射形土壤桿菌FD-3制備的休止細胞在4℃條件可以長期保存并保持脫硫活性。
本發明提供的放射形土壤桿菌FD-3主要應用于含硫化合物如石油、煤炭等的脫硫，含硫化合物中的硫元素為有機硫或無機硫。本發明提供的放射形土壤桿菌FD-3利用的硫源廣泛，如可以利用硫酸鹽、磺酸鹽、砜類、噻吩及其衍生物、苯并噻吩及其衍生物以及二苯并噻吩(DBT)及其衍生物作為單一硫源生長，見圖3。本發明的放射形土壤桿菌FD-3對含硫有機物如DBT及其衍生物中的C-S鍵進行專一性降解，不破壞烴結構中的C-C鍵，因此不損失燃料的燃燒值。本發明放射形土壤桿菌FD-3的生長周期短、脫硫活性高、同時還能耐受高濃度硫酸根離子、具有良好的耐油性。
圖1是DBT降解的“kodama”途徑。
圖2是R.erythropolis IGTS8降解DBT的“4S”途徑。
圖3是FD-3菌株以不同含硫化合物為單一硫源生長時的菌體濃度，其中DSMO、T、BT、MTP、MT、DMT、TXTO、DMDBT、MBT、DBT、MPS分別代表二甲基亞砜、噻吩、苯并噻吩、2-甲基硫茚、2-甲基噻吩、2，5-二甲基噻吩、噻吩-9-酮、4，6-二甲基二苯并噻吩、3-甲基苯并噻吩和二苯并噻吩、鄰甲基苯磺酸。
圖4是HBP濃度與OD關系曲線。
圖5是FD-3降解DBT生成2-HBP與培養時間的關系。
圖6加氫柴油深度生物脫硫前后的GC-AED圖譜。
具體實施例方式 本發明的FD-3是以山東孤島油田采取的被石油污染的土壤為菌源，DBT作為選擇壓力分離出的一株能夠專一性斷裂DBT中C-S鍵的菌株，其生理生化試驗結果見表1。
表1 FD-3的生理生化試驗結果
經“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”鑒定，該菌株屬于放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)，命名為FD-3。
FMA培養基配方5g/l葡萄糖、2g/l NH4Cl、14.04g/l Na2HPO4、2.24g/lKH2PO4、0.2g/l MgCl2·6H2O，微量元素溶液母液和維生素溶液母液的加入量各為1.0ml/l，pH值7.0～7.2。微量元素母液含有0.5g/l FeCl2·4H2O、0.5g/l ZnCl2、0.5g/l MnCl2·4H2O、0.1g/l NaMoO4·2H2O、0.05g/l CuCl2、0.05g/l NaWO4·2H2O和120mmol/l HCl。維生素母液含有400mg/l泛酸鈣、200mg/l肌醇、400mg/l煙酸、400mg/l鹽酸吡哆醇、200mg/l對氨基甲苯和0.5mg/l VB12；FMAD培養基即FMA培養基中加入適量DBT，如0.1～10mmol/l。
本發明的菌株放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3能夠在豐富培養基，如LB中迅速生長，也可以在加有無機硫源如Na2SO4，或有機硫源如DBT的FMA中生長。菌株FD-3在pH4～9均能良好生長，最佳pH6～8；生長溫度28～42℃，最佳溫度30～32℃；屬于好氧菌。
本發明的放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3幾乎能夠降解所有的含硫化合物，如磺酸鹽、砜類、噻吩及其衍生物、苯并噻吩及其衍生物以及二苯并噻吩(DBT)及其衍生物，釋放其中的硫元素為無機硫化合物溶解于水相中。圖6是一種經過加氫處理的柴油利用放射形土壤桿菌Agrobacteriumradiobacter FD-3處理前后含硫化合物含量的變化圖。
本發明提供的以放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3為生物催化劑的生物脫硫方法是(1)生長細胞脫硫利用放射形土壤桿菌Agrobacteriumradiobacter FD-3接種于無硫礦質培養基FMA中，并加入適量的需進行生物脫硫處理的含硫化合物如DBT，石油或煤炭作為單一硫源，放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3邊生長邊對底物脫硫；(2)休止細胞脫硫利用FMAD培養基(FMA培養基中加入適量DBT)或豐富培養基如LB培養基培養放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3到對數期末期，收集細菌，然后利用0.85％的生理鹽水洗滌兩次，重新懸浮于pH7.0的磷酸鹽緩沖液中，加入1％的葡萄糖，做成休止細胞，再往休止細胞中加入適量的需進行生物脫硫處理的含硫化合物如DBT，石油或煤炭培育一段時間，即可實現對這些化合物的脫硫；(3)固定化細胞脫硫按照(2)中制備休止細胞的方法制備放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3的菌體懸浮液，利用海藻酸鈉、聚丙烯酰氨凝膠、瓊脂糖、殼聚糖等制備成含有FSD-2菌株的珠子，以這些珠子作為生物催化劑可以對需進行生物脫硫處理的含硫化合物如DBT，石油或煤炭進行脫硫；(4)細胞抽提液脫硫按照(2)中制備休止細胞的方法制備放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3的菌體懸浮液，利用細胞破碎儀破碎細胞，離心去除細胞碎片，得到的細胞抽提液中加入適量需進行生物脫硫處理的含硫化合物如DBT，石油或煤炭進培育合適的時間即可實現生物脫硫。
本發明的放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3耐油性強。菌體濃度為10g(DCW)·l-1的休止細胞，按油水比(OWR)2∶5加入柴油，對柴油進行生物脫硫處理，30℃培育12小時，平均比脫硫活性為0.6mg(S)·g-1(DCW)·h-1，比OWR為1∶5時平均比脫硫活力的0.5mg(S)·g-1(DCW)·h-1還高16.7％。
本發明的放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3催化活性穩定。利用休止細胞對柴油脫硫，OWR為1∶5時，經過處理柴油18小時后的細胞的脫硫活性與處理柴油3小時后的細胞的脫硫活性僅降低了0.05mg(S)·g-1(DCW)·h-1。
本發明的放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3能夠耐受高濃度的硫酸鹽。利用休止細胞對柴油脫硫，OWR為1∶5，加入Na2SO4到終濃度為20mM時，30℃培育12小時，平均比脫硫活性為0.58mg(S)·g-1(DCW)·h-1，比未加入Na2SO4的休止細胞處理柴油時比脫硫活力僅降低5％。
本發明的放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3的休止細胞在4℃條件保存1個月，比脫硫活力在0.5～0.8mg(S)·g-1(DCW)·h-1之間，變化不大，便于保藏。
本發明的放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3的生長周期短，該菌株對數中后期培養物以10％接種量接入到FMAD培養基中，24小時即可到穩定期，穩定期菌體濃度為12OD，即3.2g(DCW)·l-1，比生長速率0.13g(DCW)·l-1·h-1。
本發明的放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3對含硫化合物降解后不斷裂碳骨架，因此對烴類結構影響不大，不損失燃燒值，表2是利用MS-GC分析法測定的FD-3的休止細胞處理前后柴油中各種烴類含量百分比變化。
表2 FD-3的休止細胞處理前后柴油中各種烴類質量含量百分比變化
實施例1FD-3菌株的篩選 從山東孤島油田附近采取被石油污染的土壤樣品，經過一個三步驟過程篩選分離純化對石油選擇性脫硫的微生物。第一步，加入0.5g被石油污染的土壤樣品到50ml含有終濃度為1mmol/l DBT的無硫基本培養基FBM中(FBM培養基含有10.0g/l葡萄糖，2.0g/l NH4Cl，6.3g/l KH2PO4，8.0g/l K2HPO4，0.2g/lMgCl2·6H2O，等等，含有1mmol/l DBT的FBM培養基為FBMD培養基)，30℃振蕩培養5天，以10％接種量轉接到FBMD培養基中，相同條件培養2天，反復轉接2-3次。第二步，經過如此2-3次富集培養后，取1ml培養物，于3000rpm離心5min，取上清0.5ml做Gibb’s分析(DBT經“4S”途徑降解后，生成的產物2-HBP與2，6-二氯醌-4-亞胺在堿性環境下反應生成蘭色化合物)。第三步，把Gibb’s反應成蘭色的培養物取出100μl，涂于FBMD瓊脂平板上，30℃靜置培養2-3天，挑取單菌落按上述方式在FBMD液體培養基中培養，挑選生長狀態良好的菌株培養物做Gibb’s分析，有蘭色反應的菌株培養物則表明該菌株有很大可能性能夠專一選擇性斷裂DBT中的C-S鍵，并生成了2-HBP。
一共挑選了500株菌株，篩選得到1株生長狀態良好，對DBT具有專一性脫硫能力的放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3，并于2004年11月24日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號 實施例2FD-3菌株代謝物分析 挑取FMAD瓊脂斜面培養的FD-3菌株，接種到50ml FMAD液體培養基中。FMAD液體培養基的成分5g/l葡萄糖、2g/l NH4Cl、14.04g/l Na2HPO4、2.24g/lKH2PO4、0.2g/l MgCl2·6H2O，微量元素溶液母液和維生素溶液母液的加入量各為1.0ml/l，DBT終濃度1.0mmol/l，pH值7.0～7.2。微量元素母液含有0.5g/lFeCl2·4H2O、0.5g/l ZnCl2、0.5g/l MnCl2·4H2O、0.1g/l NaMoO4·2H2O、0.05g/l CuCl2、0.05g/l NaWO4·2H2O和120mmol/l HCl。維生素母液含有400mg/l泛酸鈣、200mg/l肌醇、400mg/l煙酸、400mg/l鹽酸吡哆醇、200mg/l對氨基甲苯和0.5mg/lVB12。30℃，150轉/分培養24-48小時，取10ml培養物，加入2ml二氯甲烷萃取培養物中的代謝產物，萃取液采用PE Autosystem GC/Q-Mass 910氣相色譜-質譜聯用儀分析。DBT經過放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3降解后，最終被轉化為2-HBP，這與“4S”途徑的最終產物一致，說明該菌株通過C-S鍵斷裂方式降解DBT。
實施例3FD-3菌株生長細胞降解DBT 挑取FMAD瓊脂斜面培養的FD-3菌株，接種到50ml FMAD液體培養基中。FMAD液體培養基的成分5g/l 葡萄糖、2g/l NH4Cl、14.04g/l Na2HPO4、2.24g/lKH2PO4、0.02g/l MgCl2·6H2O，微量元素溶液母液和維生素溶液母液的加入量各為1.0ml/l，DBT終濃度0.5mmol/l，pH值7.0～7.2。微量元素母液含有0.5g/lFeCl2·4H2O、0.5g/l ZnCl2、0.5g/l MnCl2·4H2O、0.1g/l NaMoO4·2H2O、0.05g/l CuCl2、0.05g/l NaWO4·2H2O和120mmol/l HCl。維生素母液含有400mg/l 泛酸鈣、200mg/l肌醇、400mg/l煙酸、400mg/l鹽酸吡哆醇、200mg/l對氨基甲苯和0.5mg/lVB12。30℃，150轉/分培養，定期取樣做Gibb’s分析。Gibb’s分析方法如下培養物于5000轉/分離心，取上清0.5ml，加入3.5ml pH10的0.05M硼砂-0.2NNaOH緩沖液調pH8.0以上，加入10μl 1％的2，6-二氯醌-4-亞胺(Gibb’s試劑)，30℃反應20分鐘，利用可見分光光度計于590nm測定吸光度。吸光度值代入到標準曲線(圖4)即可得到培養物中HBP的濃度。本發明的放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3培養32h后，FMAD培養基中的0.5mmol/l DBT88％被降解，見圖5。
實施例4FD-3菌株休止細胞對加氫柴油深度脫硫 挑取FMAD瓊脂斜面培養的FD-3菌株，接種到50ml FMAD液體培養基中。FMAD液體培養基的成分5g/l葡萄糖、2g/l NH4Cl、14.04g/l Na2HPO4、2.24g/lKH2PO4、00.2g/l MgCl2·6H2O，微量元素溶液母液和維生素溶液母液的加入量各為1.0ml/l，DBT終濃度0.2mmol/l，pH值7.0～7.2。微量元素母液含有0.5g/lFeCl2·4H2O、0.5g/l ZnCl2、0.5g/l MnCl2·4H2O、0.1g/l NaMoO4·2H2O、0.05g/l CuCl2、0.05g/l NaWO4·2H2O和120mmol/l HCl。維生素母液含有400mg/l泛酸鈣、200mg/l肌醇、400mg/l煙酸、400mg/l鹽酸吡哆醇、200mg/l對氨基甲苯和0.5mg/lVB12。30℃，150轉/分培養24-48小時，按10％接種量轉接同樣的FMAD液體培養基，培養到對數期中后期，離心收集菌體，菌體用0.85％生理鹽水洗滌兩次，在用pH7.0的磷酸緩沖液重新懸浮到菌體濃度為12g(DCW)·l-1的懸浮液，加入1％(w/v)的葡萄糖作為能源，即制備成可用于柴油生物脫硫的休止細胞。按OWR為1∶5加入精制柴油，30℃，150轉/分培育12小時，回收柴油，采用庫侖儀分析柴油中的總硫含量，見表3。
表3 FD-3休止細胞對精制柴油深度脫硫前后總硫含量
然后對深度生物脫硫前后的加氫柴油進行了GC-AED分析，見圖6。
權利要求
1. 一株用于生物脫硫的放射形土壤桿菌，放射形土壤桿菌Agrobacteriumradiobacter FD-3，2004年11月24日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCC NO.1254。
2. 按照權利要求1所述的放射形土壤桿菌，其特征在于該菌株革蘭氏染色為陰性性，細胞形態桿狀。
3. 按照權利要求1所述的放射形土壤桿菌，其特征在于所述的該放射形土壤桿菌對含硫有機物中的C-S鍵進行專一性降解，不破壞有機物中的C-C鍵。
5. 按照權利要求1所述的放射形土壤桿菌，其特征在于所述的該放射形土壤桿菌在pH4～9均能良好生長，生長溫度28～42℃，屬于好氧菌。
6. 權利要求1所述的放射形土壤桿菌在原油、柴油、汽油、煤炭進行脫硫處理中的應用。
7. 權利要求1所述的放射形土壤桿菌生長細胞在含硫化合物脫硫中的應用。
8. 權利要求1所述的放射形土壤桿菌休止細胞在含硫化合物脫硫中的應用。
9. 權利要求1所述的放射形土壤桿菌固定化細胞在含硫化合物脫硫中的應用。
10. 權利要求1所述的放射形土壤桿菌細胞抽提液在含硫化合物脫硫中的應用。
全文摘要
本發明涉及一株用于生物脫硫的放射形土壤桿菌及應用。該菌株為放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter FD-3，于2004年11月24日保藏于CGMCC，保藏號為CGMCC NO.1254。本發明的放射形土壤桿菌FD-3是以山東孤島油田采取的被石油污染的土壤為菌源，DBT作為選擇壓力篩選分離得到，生長周期短、脫硫活性高、能耐受硫酸根離子、具有良好的耐油性，催化活性穩定，能專一性斷裂含有機硫的化合物中C-S鍵。本發明還涉及一個利用放射形土壤桿菌FD-3或其細胞抽提液作為生物催化劑對含有有機硫化合物的礦質燃料進行生物脫硫的方法。
文檔編號C12S1/00GK101240252SQ200710010380
公開日2008年8月13日 申請日期2007年2月9日 優先權日2007年2月9日
發明者全 張, 高會杰, 佟明友, 黎元生, 唐似茵 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院