專利名稱：一種靈芝脫氧核糖核酸酶及其提取純化方法
技術領域：
本發明涉及一種酶及其提取純化方法，特別是一 種靈芝脫氧核糖核酸酶及其提取純化方法，屬于生物化學領域。
背景技術：
脫氧核糖核酸酶在核酸代謝過程和基礎遺傳機制中參
與DNA復制、修復、重組及突變；控制基因表達，參與基因的置換、轉 座及重組；作為宿主系統中的重要組分，降解外源核酸分子，同時在免 疫方面也具有重要作用。脫氧核糖核酸酶主要有2種脫氧核糖核酸酶 I，簡稱DNaseI;脫氧核糖核酸酶II，簡稱DNaseII。 20世紀60年代末 首先在牛胰腺中發現DNaseI，隨后在牛脾和胸腺中發現DNaseII。其中 DNaseI是一種降解雙鏈或單鏈DNA的核酸內切酶，產生帶5'-磷酸末端 的單核苷酸及寡核苷酸。其活性依賴二價金屬陽離子，DNaseI的切割位 點是隨機分布。另外DNaseI也是一種重要的分子生物學工具酶，如可用 于切口平移反應，.體外轉錄模板DNA的分解去除等。
目前己經從多種生物中分離純化了 DNaseI。尤其是動物的脫 DNaseI研究較為廣泛和深入。根據報道已經分離純化的DNaseI的 分子量都在30-40KD，如入類DNaseI為38kD，牛DNaseI分子量 為31kD，豬DNaseI為34kD。老鼠DNaseI為36kD;蛇DNaseI 為40kD;魚DNaseI為33kD。
目前用于分離脫氧核糖核酸酶的方法有多種。主要通過離子 交換層析，疏水柱層析和親和層析。分離介質有DEAE-Sepharose， Phenyl Sepharose， Sephadex G-75, Con Aagarose resins。 其中較常 用的Phenyl Sepharose為疏水柱層析。近年來，發展了一些新的分 離介質用于脫氧核糖'核酸酶的分'離。例如采用.DEAE cellulose, Double-stranded DNA cellulose禾n AF扁Blue TOYOPEARL層析從C
"V7WM"'.中分離純化了一種斬的脫氧核糖核酸酶；采用.
DEAE-cellulose， phenyl-Sepbar6se， Source 15Q從海星中分離了 一禾中脫氧核豐唐核酸酶；采用concanavalin A禾卩wheatgerm agglutinin
兩種凝集素混合制備的親和層析柱一步法純化了兔子、鼠等的脫 氧核糖核酸酶I。發明內容本發明的目的是提供靈芝子實體中的一種脫氧核糖核 酸酶及其提取純化方法。該酶的提取純化方法也可用于分離提純其它食 用菌、藥用菌子實體中的脫氧核糖核酸酶。
本發明的一種靈芝脫氧核糖核酸酶的特征為
1) 采用美國ABI公司的MALDI-TOF， Voyager DE-STR測定，
其精確分子量為'13807Da。.
2) 將純化的靈芝脫氧核糖核酸酶經電轉印至PVDF膜上，采用 Edman降解法，在美國ABI公司的Procise491型蛋白測序儀上測定， 其N-端的氨基酸序列為PLDTGRYHIY。
3) 用胰蛋白酶酶解后，'采用美國ABI公司的4700串聯飛行時間 質譜儀質譜分析結果表明，具有QVETVVDRLDELPIR和 ESPGLQGVSSVPLR商個肽段。
一種靈芝脫氧核糖核酸酶的提取純化方法，以新鮮靈芝子實體為原 料，經干燥處理后粉碎，保存備用；具體提取方法經粗酶抽提、(NH4)2S04 鹽析后，再由以下步驟完成
1) Blue-SepHarose 6 Fast Flow.親和層析，以含有0 1moL.L"NaCl梯度 洗脫，流速為20-60mL/h;.
2) SP Sephorose Fast Flow柱層析，.以0 0.3MNaCl梯度洗脫，流速為 20-40mL/h;
該靈芝脫氧核糖核酸酶是一種非限制性內切酶，.可作用于超螺旋 DNA，線狀DNA， ssDNA利dsDNA，是一種非限制性內切酶。其酶活 性依賴于二價金屬陽離子Mg、 lOmmoL丄.1 EDTA可完全抑制其酶活 性。最適pH值范圍為pH,7.5 pH9.0，在15'C條件下，就具有酶活性， 可以將超螺旋DNA切割成環狀DNA，并進一步切割成線狀DNA形式。 其活性隨溫度增高，酶活性增加，4CTC時相對活性最高。在75'C條件下 加熱15min后完全喪失活性。靈芝脫氧核糖核酸酶水解DNA的產物末 端的基團為3' -OH， 5'-磷酸。
本發明的優點與'積極效果
,1)首次從靈芝中分離純化出一種新的脫氧核糖核酸酶，該方 法具有快速提純脫氧核糖核酸酶的特點，純度高，能保持較高的 酶活性。2)通過本發明方法所提取'的具有酶活性的脫氧核糖核酸酶， 有良好的應用前景，其一，依據此氨基酸序列進行人工合成和進
一步開發利用。其二'，依據氨基酸序列設計引物，克隆其cDNA，
進一步在原核細胞或真核細胞中表達該酶。其三，用于分子生物 學研究。
圖1為靈芝脫氧核糖核酸酶經SP Sephorose Fast Flow柱層析后 的電泳檢測圖。
其中，l為靈芝脫氧核糖核酸酶；2為蛋白標準分子量。
具體實施例 為充分公開本發明的一種靈芝脫氧核糖核酸酶及 其提取純化方法，現結合具體實施例加以說明。
實施例"種靈芝脫氧核糖核酸酶的提取純化方法，包括以下歩驟:
(1) 樣品前處理鮮靈芝經冷凍干燥后粉碎，'取凍干粉加入15倍
體積的0.02moL'L"pH6.2的磷酸緩沖液，4。C浸提16h，然后離心12000 Xg， 20min，獲得上清液A;
(2) 硫酸銨鹽析在上清液A中加入(NH4)2S04粉末，0。C條件下 邊加邊攪拌至80%飽和度，，待全部溶解后，4"C靜置6h， 12000Xg， 4 °C離心20 min，收集沉淀，并用蒸熘水透析除鹽后再用0.02moL丄" pH7.5的Tris-HCl進行充分透析平衡，12000Xg， 4"C離心5min，得到溶
液B;
(3) Blue-SepHarose 6FastFlow層析將所述的溶液B，通過蠕動 泵使流速為0.2mL/min;上到預先用0.02moL'L-1 pH7.5的Tris-HC1 緩沖液平衡好的親和層析介質中；洗脫至A達0.002，用含0 1 moL'U'NaCl的O.OSmoL'L-1 pH7.5的Tris-HCl梯度洗脫,，洗脫體積為 10倍的柱體積，流速為20-60mL/h，測定OD，，收集洗脫峰；經PEG20000 濃縮至l/5體積，然后再用0.02moLL"pH5.8的磷酸緩沖液平衡，得 到溶液C;
(4) SP Sephorose Fast Flow層析將所述的溶液C加入用 0.02moL丄"pH5.8的磷酸緩沖液平衡好的SP Sephorose Fast Flow中，洗 脫至A280<0.02;然后，以含0 0.3 moL'L"NaCl的0.02moL丄"pH5.8的
磷酸緩沖液梯度洗脫，j先脫體積為10倍的柱體積，流速40mL/h;測定OD28。，收集有酶活性的洗脫液，即洗脫液D;
(5) 超濾濃縮所述洗脫液D至所需的酶活性，即可獲得靈芝脫氧核
糖核酸純酶。
(6) 活性檢測其酶反應體系如下表
試劑名稱_上樣量
^物DNA (ljig卞i;1)
脫氧核糖核酸酶 '10)LiL
10XTris-HCl(0.2M ,pH8.0) 2pL
Mg2+(0.2mM) 12. 5|iL
蒸餾水_____71. 5|iL
H雨 f^j57—
37卩水浴30min。加入等體積的10%的三氯乙酸終止反應，冰上10min,12 OOOrpm， 20min。測定上清液體在260nm的吸收值。
酶活單位是在上述條件下，以小牛胸腺DNA為底物，在37。C、pH8.0 的條件下，1分鐘內使反應液的260nm吸光度增加0.001所需要的酶量 定義為1個活性單位。
(7)電泳檢測電泳檢測結果如附圖l所示，所提取的靈芝脫氧核 糖核酸為單一 的蛋白質條帶。說明經SP Sephorose Fast Flow層析后分 離得到的靈芝脫氧核糖核酸酶中已沒有其他雜蛋白組分存在。
該靈芝脫氧核糖核酸酶可作用,于超螺旋DNA，線狀DNA， ssDNA 和dsDNA，對ssDNA的活性略高于dsDNA，是一種非限制性內切酶。 其酶活性依賴于二價金屬陽離子Mg2+， 10mmoL丄"EDTA可完全抑制其 酶活性。最適pH值范圍為pH7.5 pH9.0，最適pH值為8.4。在15'C條 件下，就具有酶活性，4(TC時相對活性最高。在75。C條件下加熱15min 后完全喪失活性。該酶水解DNA的產物末端的基團為,3' -OH， 5'-磷 酸。
本發明的一種靈芝脫氧核糖核酸酶具有DNaseI的性質，屬于 DNaseI家族的一個成員。從靈芝中提取脫氧核糖核酸酶方法，具有 方法簡單、成本低等優點，還可以從其他藥用菌或食用菌中獲得高純度 的脫氧核糖核酸酶。從靈芝中提取脫氧核糖核酸酶可用于分子生物學 研究。
權利要求
1、一種靈芝脫氧核糖核酸酶，其特征在于(1)分子量為13807Da；(2)N-端的氨基酸序列為PLDTGRYHIY；(3)具有QVETVVDRLDELPIR和ESPGLQGVSSVPLR兩個肽段。
2、 一種靈芝脫氧核糖核酸酶的提取純化方法，其特征在于包括以下步驟(1) 樣品前處理鮮靈芝經冷凍干燥后粉碎，'取凍干粉加入15倍體積的0.02moL丄"pH6.2的磷酸緩沖液，4'C浸提16h，然后離心12000 Xg， 20min，獲得上清液A;(2) 硫酸銨鹽析在上清液A中加入(NH4)2S04粉末，OX:條件下 邊加邊攪拌至80%飽和度，'待全部溶解后，4"C靜置6h， 12000Xg， 4 °C離心20 min，收集沉淀，并用蒸餾水透析除鹽后再用0.02moL-L—
pH7.5的Tris-HCl進行充分透析平衡，12000Xg， 4。C離心5min，得到溶液B;(3) Blue-SepHarose6FastFlow層析將所述的溶液B，通過蠕動 泵使流速為0.2mL/min;上到預先用O.OZmoL.L-1 pH7.5的Tris-HCl緩 沖液平衡好的親和層析介質中；洗脫至A，0.002，用含0 1 moL丄"NaCl的0.02moL丄"pH7.5的Tris-HCl梯度洗脫，洗脫體積為 10倍的柱體積，流速為20-60mL/h，測定OD28Q，收集洗脫峰；經PEG20000 濃縮至l/5體積，然后再用0.02moL丄"pH5.8的磷酸緩沖液平衡，得 到溶液C;(4) SP Sephorose Fast Flow層析將所述的溶液C加入用 0.02moL'U1 pH5.8的磷酸緩沖液平衡好的SP Sephorose Fast Flow中，洗 脫至A280<0.02;然后，以含0 0.3 moL丄"NaCl的0.02moL丄"pH5.8的磷酸緩沖液梯度洗脫，洗脫體積為IO倍的柱體積，流速40mL/h;測定 OD28Q，收集有酶活性的洗脫液,，即洗脫液D;(5) 超濾濃縮所述洗脫液D至所需的酶活性。
全文摘要
靈芝脫氧核糖核酸酶的分子量為13807Da、N-端氨基酸序列為PLDTGRYHIY、具有QVETVVDRLDELPIR和ESPGLQGVSSVPLR兩個肽段。該酶可作用于超螺旋DNA，線狀DNA，ssDNA和dsDNA，是一種依賴于二價金屬陽離子Mg<sup>2+</sup>的非限制性內切酶，水解DNA的產物末端的基團為3′-OH，5′-磷酸。該酶的提取純化方法，以新鮮靈芝子實體為原料，經干燥處理后粉碎、粗酶抽提、硫酸銨鹽析、親和層析，梯度洗脫，再用SP Sephorose Fast Flow柱層析，以0～0.3M NaCl梯度洗脫，即可獲得靈芝脫氧核糖核酸酶。
文檔編號C12N9/22GK101294150SQ20071000891
公開日2008年10月29日 申請日期2007年4月28日 優先權日2007年4月28日
發明者吳祖建, 林奇英, 雯 祝, 謝東揚, 謝聯輝 申請人:福建農林大學