專利名稱：環核苷酸測定方法
環核苷酸測定方法
本申請要求享有2005年12月6日提交的美國臨時申請No. 60/742, 922的優先權，其整體并入本文。 發明領域
本發明總體涉及細胞分析工具，更具體涉及檢測或測定樣品中環 核苷酸濃度的方法。
背景技術：
第二信使環腺苷酸(cAMP)和環鳥苷酸(cGMP)是多種細胞功能 的重要胞內介質，所述細胞功能包括細胞生長、分化、凋亡及細胞死 亡。cAMP的產生通過腺苷酸環化酶家族的酶控制，所述酶可將三磷酸 腺苷(ATP )轉化成cAMP和無機的焦磷酸(PPi )。腺苷酸環化酶通過 與膜結合的G蛋白偶聯受體(GPCR) oc亞基直接相互作用而被激活或 抑制。當刺激性GPCR的a亞基(稱為Gas)被激活時，腺苷酸環化 酶將ATP轉化為cAMP和PPi。相反，當抑制性GPCR的ot亞基(稱為G ai)被激活時則發揮對腺苷酸環化酶的抑制效應，無法實現ATP向 cAMP和PPi的轉化。G蛋白偶聯受體在如神經傳遞、心臟輸出及疼痛
調節等廣泛的生物學過程中都發揮著突出作用。其在開發新的藥用化 合物中的重要性已得到充分理解，因此其是藥物發現研究中的熱點靶標。
cAMP的胞內濃度也受另一組酶-環核苷酸磷酸二酯酶(PDE)的 影響，所述酶催化cAMP水解為AMP，催化環cGMP水解為GMP。砩酸二 酯酶與腺苷酸環化酶及鳥苷酸環化酶協同作用以調節cAMP和cGMP介 導的細胞信號轉導機制的幅度和持續時間。因此，磷酸二酯酶調節眾 多重要的對第一信使(如激素、光及神經遞質)的生物反應。有兩類 PDE， I類見于所有真核細胞的細胞質中或結合于胞內細胞器或膜上； 而II類PDE尚未充分表征，只見于低等真核生物中。通過控制cAMP
和cGMP轉化受I類磷酸二酯酶控制的細胞反應包括神經元反應、醛 固酮產生、血小板聚集調節、胰島素調節、嘔吐、平滑肌張力調節、 視覺光轉導及T細胞反應性調節。已知很多臨床上重要的化合物可抑 制磷酸二酯酶，包括咯利普蘭、茶堿及昔多芬。因此，磷酸二酯酶 的抑制劑也是藥物發現中重要的靶標。
已知第二信使cAMP激活依賴于cAMP的蛋白激酶(PKA)。哺乳動 物的全PKA是四聚體，由兩個調節亞基及兩個催化亞基構成。cAMP結 合于調節亞基，從而使全PU解離為其催化亞基和調節亞基。 一旦釋 放，游離的催化亞基能磷酸化多種細胞蛋白質，從而引起細胞功能的 改變，如肌肉收縮、細胞周期活化、轉錄活性激活及DNA加工。
由于GPCR的活化或抑制及隨后腺苷酸環化酶的活化或抑制導致 胞內cAMP的增加或減少，影響其活性的物質是藥物發現的重要靶標。 因為極多的生物學過程與G蛋白偶聯受體有關，所以在全世界銷售的 藥物中有許多靶向GPCR。影響GPCR的藥物實例包括Claritin⑧和 Alavert (氯雷他定)，其用于緩解過敏癥狀；Paxil (鹽酸帕羅西 汀)，其用于緩解抑郁癥；及Vasotec (順丁烯二酸依那普利)，其 用于減輕高血壓。因其重要性，已開發出了多種GPCR測定法來測定激 動劑和拮抗劑對這些系統組分的影響，主要通過測定cAMP水平的升高 或降低。這些方法的局限性包括要求多個分配步驟的非均相測定， 長溫育時間及對昂貴設備的需要。
因此需有的是較現有技術需要較少操作(例如兩步或更少)的測 定法；提供更短溫育時間(例如小于一小時)的測定法；及利用低花 費設備同時保持高通量系統(HTS)能力(如基于發光的設備)的測定 法。這樣的流線化及成本效益將允許在藥物發現中更快更容易地評價 輩巴標。此外，基于發光的測定不傾向于受熒光干擾，其可用于篩選大 化學物質文庫以發現下一個潛在藥物。
發明概述
本發明總體涉及細胞分析工具，更具體涉及檢測或測定樣品中環 核苷酸濃度的方法。環核苷酸如cAMP和cGMP響應多種與細胞蛋白質相互作用的物質 而增加或減少。本文所述方法提供對這種變化的檢測。在一個具體實 施方案中，本文所述方法允許檢測環核苷酸并與刺激物對細胞蛋白質 的作用相關聯。
在一個具體實施方案中，本文所述方法監測環核苷酸與酶的結合， 所述酶依賴于環核苷酸結合以激活該酶(如依賴于cAMP的蛋白激酶， 或PKA)。例如， 一旦cAMP與PKA結合，則PKA將磷酸從三磷酸腺苷 (ATP )轉移到合適的PKA底物(如肯普肽)。用多種已知方法檢測磷 酸化事件，并將每種檢測方法的輸出信號與存在于樣品中的環核苷酸 量相關聯。合適的檢測方法包括但不限于基于發光、放射性及熒光的 方法。
在一個具體實施方案中提供了一種測定樣品中腺苷酸環化酶活性 的方法。所述方法利用PKA的活化提供活性，該活性可被檢測、測量 并隨后與腺苷酸環化酶活性相關聯。例如，如果腺苷酸環化酶受到刺 激，則產生cAMP，其激活PKA,檢測PKA的活性并與腺苷酸環化酶活 性相關聯。
在另一個具體實施方案中提供了一種測定樣品中磷酸二酯酶活性 的方法。所述方法利用PKA的活化提供活性，該活性被檢測、測量并 隨后與磷酸二酯酶活性相關聯。例如，如果磷酸二酯酶被抑制，則cAMP 不轉化成AMP，或cGMP不轉化成GMP，因此cAMP和cGMP可激活PKA， 檢測PKA的活性并與磷酸二酯酶活性相關聯。
在其它具體實施方案中提供了監測激動劑對G蛋白偶聯受體
(GPCR)的活化或拮抗劑對其的抑制的方法。例如，通過PKA的活化 檢測并測量向包含GPCR的樣品中加入激動劑或拮抗劑后發現的cAMP 水平。這樣的活性(或其缺失)通過與cAMP水平或量相關聯的可測量 的輸出信號來檢測。
在一個具體實施方案中，用于實施本文所述方法的樣品包含裂解 物。在一些具體實施方案中，樣品裂解物來自原核生物或真核生物， 如細菌、酵母或哺乳動物細胞。在一些具體實施方案中，所述樣品包
含質膜、細胞膜和/或細胞器膜。本文所述膜制劑已得出了意外結果，
所述膜制劑維持了膜關聯的過程、蛋白質及受體(實施例9-11)的完 整性和功能性。這允許利用本文所述方法進行靶向膜功能測定，而無 見于正常細胞裂解物中的伴隨的細胞裂解物組分。
可測量的輸出信號可為如下形式生物發光、化學發光、放射性 或基于不同熒光技術(如熒光偏振、熒光共振能傳遞及免疫測定)的 差別輸出。在一個具體實施方案中，可測量的輸出信號為生物發光的 形式。例如，鞘翅目(螢火蟲)螢光素酶利用ATP和其他因子將甲蟲 類螢光素轉化成氧化螢光素，反應的副產物是光。 一旦PKA被活化， PKA活化量依賴于存在的cAMP的量，PKA利用來自ATP的磷酸來磷酸 化接受底物，從而使樣品中的ATP濃度降低，由此導致發光或光輸出 的減少。照此，隨著樣品中cAMP濃度的升高，可見相反的發光減少， 所述發光與最初樣品中存在的cAMP、腺苷酸環化酶和/或GPCR活性的 量相關聯。
在一個具體實施方案中，本發明提供一種測定樣品中環核苷酸量 的方法，所述方法包括可能含有環核苷酸的樣品；向所述樣品中加 入能被所述環核苷酸活化的無活性酶；加入能檢測所述被活化的酶的
活性并產生可檢測信號的檢測系統；并基于所述信號測定存在于所述
樣品中的環核苷酸量。在一些具體實施方案中，所述樣品包含裂解物。 在一些具體實施方案中，樣品裂解物來自細菌、酵母或哺乳動物細胞。 在一些具體實施方案中，所述樣品包含質膜、細胞膜和/或細胞器膜。
在一些具體實施方案中，所述環核苷酸是cAMP或cGMP。在一些具體 實施方案中，所述無活性酶是依賴于cAMP的蛋白激酶或依賴于cGMP 的蛋白激酶。在一些具體實施方案中，所述檢測系統包含能被PKA或 PKG磷酸化的底物。在一些具體實施方案中，所述底物包含SEQ ID N0:1。在一些具體實施方案中，所述檢測系統進一步包括能利用ATP 產生發光信號的酶，其中所迷酶是螢光素酶。在一些具體實施方案中， 所述底物包括放射性標記的生物素化底物，其進一步包含SEQ ID NO: 1。在一些具體實施方案中，所述檢測系統進一步包括鏈霉抗生物素包
被的結合表面。在一些具體實施方案中，所述底物包括熒光標記的底
物，其更進一步包含SEQ ID NO: 1，其中所述熒光標記優選羅丹明。 在一些具體實施方案中，本發明的方法進一步包括添加一種或多種磷 酸二酯酶抑制劑和/或添加能影響所述樣品中環核苷酸量的激動劑或
拮抗劑。在一些具體實施方案中，所述激動劑或拮抗劑調節腺苷酸環 化酶活性和/或GPCR活性和/或PDE活性。
在一個具體實施方案中，本發明提供一種測定樣品中腺苷酸環化 酶活性的方法，所述方法包括可能含有腺苷酸環化酶樣品；向所述 樣品中加入能被cAMP活化的無活性酶；加入能檢測所述被活化的酶的 活性并產生可檢測信號的檢測系統；并基于所述信號測定存在于所述 樣品中的腺苷酸環化酶活性。在一些具體實施方案中，所述樣品包含 裂解物。在一些具體實施方案中，所述樣品裂解物來自細菌、酵母或 哺乳動物細胞。在一些具體實施方案中，所述樣品包含質膜、細胞膜 和/或細胞器膜。在一些具體實施方案中，所述無活性酶是依賴于cAMP 的蛋白激酶。在一些具體實施方案中，所述檢測系統包括能被PKA磷 酸化的底物。在一些具體實施方案中，所述底物包含SEQ ID NO: 1。 在一些具體實施方案中，所述檢測系統進一步包括能利用ATP產生發 光信號的酶，其中所述酶是螢光素酶。在一些具體實施方案中，所述 底物包括放射性標記的生物素化底物，其進一步包含SEQ ID NO: 1。 在一些具體實施方案中，所述檢測系統進一步包括鏈霉抗生物素包被 的結合表面。在一些具體實施方案中，所迷底物包括熒光標記的底物， 其更進一步包含SEQ ID NO: 1,其中所述熒光標記優選羅丹明。在一 些具體實施方案中，本發明的方法進一步包括添加一種或多種磷酸二
酯酶抑制劑和/或添加能影響腺苷酸環化酶活性的激動劑或拮抗劑。 在一個具體實施方案中，本發明提供一種測定樣品中磷酸二酯酶
活性的方法，所述方法包括可能含有磷酸二酯酶的樣品；向所述樣 品中加入能被cAMP活化的無活性酶；加入能檢測所述被活化的酶的活 性并產生可檢測信號的檢測系統；并基于所述信號測定存在于所述樣 品中的磷酸二酯酶活性。在一些具體實施方案中，所述樣品包含裂解
物。在一些具體實施方案中，所述樣品裂解物來自細菌、酵母或哺乳 動物細胞。在一些具體實施方案中，所述樣品包含質膜、細胞膜和/ 或細胞器膜。在一些具體實施方案中，所述磷酸二酯酶是環核苷酸磷
酸二酯酶。在一些具體實施方案中，所述環核苷酸是cAMP或cGMP。 在一些具體實施方案中，所述無活性酶是依賴于cAMP的蛋白激酶或依 賴于cGMP的蛋白激酶。在一些具體實施方案中，所述檢測系統包括能 被PKA或PKG磷酸化的底物。在一些具體實施方案中，所述底物包含 SEQIDN0:1。在一些具體實施方案中，所述檢測系統進一步包括能利 用ATP產生發光信號的酶，其中所述酶是螢光素酶。在一些具體實施 方案中，所述底物包括放射性標記的生物素化底物，其進一步包含SEQ ID N0: 1。在一些具體實施方案中，所述檢測系統進一步包括鏈霉抗 生物素包被的結合表面。在一些具體實施方案中，所述底物包括熒光 標記的底物，其更進一步包含SEQ ID NO: 1，其中所述熒光標記優選 羅丹明。在一些具體實施方案中，本發明的方法進一步包括添加一種 或多種磷酸二酯酶活性抑制劑。
在一個具體實施方案中，本發明提供一種測定樣品中G蛋白偶聯
受體活性的方法，所述方法包括可能含有GPCR的樣品；向所述樣品 中加入能被cAMP活化的無活性酶；加入能檢測所述被活化的酶的活性 并產生可檢測信號的檢測系統；并基于所述信號測定存在于所述樣品 中的GPCR活性。在一些具體實施方案中，所述樣品包含裂解物，更優 選來自哺乳動物細胞的裂解物。在一些具體實施方案中，所述樣品包 含質膜。在一些具體實施方案中，所述無活性酶是依賴于cAMP的蛋白 激酶。在一些具體實施方案中，所述檢測系統包括能被PKA磷酸化的 底物。在一些具體實施方案中，所述底物包含SEQ ID N0: 1。在一些 具體實施方案中，所述檢測系統進一步包括能利用ATP產生發光信號 的酶，其中所述酶是螢光素酶。在一些具體實施方案中，所述底物包 括放射性標記的生物素化底物，其進一步包含SEQ ID NO: 1。在一些 具體實施方案中，所述檢測系統進一步包括鏈霉抗生物素包被的結合 表面。在一些具體實施方案中，所述底物包括熒光標記的底物，其更
進一步包舍SEQ ID NO: 1,其中所述熒光標記優選羅丹明。在一些具 體實施方案中，本發明的方法進一步包括添加一種或多種磷酸二酯酶 活性抑制劑和/或添加GPCR的激動劑或拮抗劑。
在一個具體實施方案中，本發明提供一種測定樣品中環核苷酸濃 度的試劑盒，其包括環核苷酸、蛋白激酶、ATP、蛋白激酶底物及使 用所述試劑盒測定所述蛋白激酶底物的所述濃度的說明書。在一些具 體實施方案中，所述試劑盒進一步包括發光檢測系統。在一些具體實 施方案中，所述試劑盒進一步包括熒光檢測系統。在一些具體實施方 案中，所述試劑盒進一步包括放射性檢測系統。
在一個具體實施方案中，本發明提供一種測定樣品中環核苷酸磷 酸二酯酶活性的試劑盒，其包括cAMP和cGMP的底物、蛋白激酶、 蛋白激酶底物及使用所述試劑盒測定所述環核苷酸磷酸二酯酶的所述 活性的說明書。在一些具體實施方案中，所迷試劑盒進一步包括發光 檢測系統。在一些具體實施方案中，所述試劑盒進一步包括熒光檢測 系統。在一些具體實施方案中，所述試劑盒進一步包括放射性檢測系 統。
圖1顯示G蛋白偶聯受體信號轉導途徑。G蛋白偶聯受體亞基G。s 刺激腺苷酸環化酶，由ATP產生cAMP。環AMP結合PKA的調節亞基， 釋放催化亞基，后者磷酸化PKA的底物。相反，抑制性GPCR亞基G。i 抑制腺苷酸環化酶，從而阻斷PKA底物的磷酸化。磷酸二酯酶通過水 解cAMP成AMP及水解cGMP成GMP而影響PKA底物的磷酸化，其中AMP 和GMP不結合PKA的調節亞基。
圖2為顯示隨著cAMP濃度增加而樣品發光相應降低的圖。
圖3為顯示隨著毛喉素(一種腺苷酸環化酶的直接刺激物)濃度 增加而樣品發光降低的圖。
圖4顯示(A)證實隨著激動劑誘導D293細胞中表達的多巴胺受 體Dl (Gcts蛋白偶聯受體)而發光降低的圖；和(B)證實在激動劑 存在下向表達多巴胺受體Dl的D293細胞中加入拮抗劑導致發光增加
的圖。
圖5顯示在cAMP存在下隨著磷酸二酯酶II濃度升高而發光增加。 圖6展示無論環核苷酸是cAMP還是cGMP，隨著環核苷酸濃度升
高而發光增加，但親和力不同。
圖7顯示(A)證實在cGMP存在下隨著磷酸二酯酶V濃度升高而
發光增加的圖；和(B)證實在cGMP存在下隨著磷酸二酯酶V抑制劑
-扎普斯特增加而發光降低的圖。
圖8展示來自不同哺乳動物細胞的質膜制劑中的cAMP產生A) 人胚胎腎(HEK) 293細胞；及B)中國倉鼠卵巢(CH0 )細胞。
圖9顯示使用ljag DRD1-D293質膜制劑，毛喉素的EC50。
圖IO展示通過加入多巴胺激活后質膜制劑中的Dl受體活化。通 過測量cAMP產生評價多巴胺受體的活化。
圖11顯示A)在10)iM毛喉素存在下，用穩定轉染D2的D293細 胞，以激動劑喹吡羅對多巴胺D2受體的示例性滴定；和B)在100nM喹 吡羅及10uM毛喉素存在下，用穩定轉染D2的D293細胞，拮抗劑雷 氯必利對D2多巴胺D2受體的示例性滴定。
定義
如本文所用，術語"樣品"以其最廣義使用。在一種意義上，它 意在包括得自任何來源的標本或培養物以及生物樣品和環境樣品。生 物樣品可得自動物(包括人)并包括液體、固體、組織及氣體。生物 樣品包括血制品、細胞裂解物及細胞裂解物組分。環境樣品包括環境 物質，如表面物質、土壤、水、晶體及工業樣品。樣品可包含或不包 含調節環核普酸濃度的物質。但是這些實例不應理解為限制適用于本 發明的樣品類型。
如本文所用，術語"激動劑"指任何可刺激受體、酶或其它蛋白 質的活性的物質。
如本文所用，術語"拮抗劑"指任何可抑制受體、酶或其它蛋白 質的活性的物質。
如本文所用，術語"底物，，指任何被酶或其它蛋白質作用的多肽。
如本文所用，術語"抑制劑"指任何抑制酶活性或生物化學反應 的化合物。
如本文所用，術語"檢測"指定性或定量測定樣品中物質存在與
否。例如，本文所述的檢測方法包括，但不限于發光、放射性及熒 光。
如本文所用，術語"裂解物"以其最廣義指細胞膜破裂或溶解時 從細月包釋》文出的細胞碎片及液體。例如，如本文所述可應用于本發明 的裂解物包括，但不限于源于原核細胞如細菌的裂解物，及源于真 核細胞的裂解物如酵母、植物及哺乳動物細胞裂解物。作為真核細胞 溶胞產物的細胞碎片包括，但不限于細胞器(如內質網、細胞核、 核糖體、線粒體等)、細胞結構組分如微管、質膜、細胞器膜、細胞 膜等。
發明詳述
在一個具體實施方案中，本發明的方法提供了通過監測由于環核 苷酸激活所引起的蛋白激酶活性變化來監測對細胞蛋白質的調節。環 核普酸的細胞水平反映環化酶活性與環核苷酸磷酸二酯酶活性之間的 平衡(圖1 )。環AMP結合四聚體PKA的調節亞基。環GMP結合依賴 于cGMP的蛋白激酶或PKG的調節亞基。本發明不限于特定的機制。事 實上，對機制的理解不是實施本發明所必需的。盡管如此，發現不僅 cAMP結合II型PKA的調節亞基，cGMP也結合II型PKA調節亞基。因 此， 一旦cAMP或cGMP結合PKA的調節亞基，PKA活性催化亞基就能 通過將磷酸從ATP轉移至底物磷酸化位點而磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋 白激酶底物。照此，PKA活性可作為存在于樣品中的cAMP或cGMP的 量的指示。
如前所述，環化酶和磷酸二酯酶直接影響存在于樣品中的環核苷 酸的量。例如，當存在腺苷酸環化酶的活化劑或抑制劑時，cAMP濃度 將分別升高或降低，從而導致PKA活性的升高或降低。同樣的現象也 見于鳥苷酸環化酶的活化劑或抑制劑。腺苷酸環化酶是GPCR相關的信 號轉導途徑的一部分。GPCR的激動劑或拮抗劑將影響腺苷酸環化酶的
活性，從而影響PKA活性。相反，磷酸二酯酶水解cAMP為AMP，水解 cGMP為GMP，因此如果樣品中存在這種酶的激動劑或拮抗劑，環核苦 酸濃度將分別降低或升高，從而導致PKA活性的降低或升高。照此， 本文所述方法提供對cAMP、腺普酸環化酶、cGMP、磷酸二酯酶及GPCR 的調節的監測。
為了使僅樣品中的環核苷酸能激活所述方法中的PKA的事件最大 化，所述方法中的PKA應為盡可能純的PKAII型全酶(例如PKA的調 節亞基和催化亞基相連)。優選PKAII型全酶基本上沒有非結合的活 性催化亞基。PKA全酶的純度應足以允許監測與對照相比對環化酶和 GPCR的調節。類似地，如果如本文所述應用PKG，其應類似地基本上 不含非結合的活性催化亞基。為了使本文所述方法最大化，用于所述 方法的PKA全酶應含有〈10y。 (>90%純)，優選<5%(>95%純)，更優 選<1%(>99%純)，最優選<0. 1% ( >99. 9%純)非結合的活性催化亞 基。檢測非結合的活性催化亞基的百分比的測定法是例如比較PKA全 酶測試樣品的活性與含有滅活全酶的對照樣品的活性的那些測定法。。
本發明的一個具體實施方案提供了測定樣品中環核苷酸的濃度。 在一些具體實施方案中，本方法可用于測定樣品中cAMP或cGMP的量。 本方法的樣品包括，但不限于細胞培養基、緩沖溶液、細胞及細胞 裂解物。在一些具體實施方案中，所述樣品包含裂解物。在一些具體 實施方案中，所述樣品裂解物來自細菌、酵母或哺乳動物細胞。在一 些具體實施方案中，所述樣品包含質膜、細胞膜和/或細胞器膜。
在一個具體實施方案中，為了測定樣品中的環核苷酸濃度，本發 明包括蛋白激酶、底物及ATP。在一些具體實施方案中，本發明包括 PKA或PKG，使得隨著環核苷酸結合所述激酶的調節亞基，活性的催化 亞基能利用ATP來磷酸化底物。在一些具體實施方案中，本發明包括 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶底物，所述底物顯示出對PKA或PKG提高的親 和力。在一些具體實施方案中，所述方法包括底物，其包含多肽序列 LRRASLG ( SEQ ID NO: 1 )。
使用本方法用于測定樣品的cAMP濃度的檢測方法包括，但不限
于使用生物發光、化學發光、比色法、放射性或基于不同熒光技術 的差別輸出。在一個具體實施方案中，在本文所述方法中測量激酶活 性，并可用任何合適的激酶測定法。例如，已知的激酶測定法包括， 但不限于發光測定法，如激酶-GloTM發光激酶測定(Promega公司， Madison WI )和PKLight HTS蛋白激酶測定(Cambrex， New Jersey ); 焚光觀'J定法，i口 Kinome Hunter (DiscoverX， Fremont CA )和 HUHunte,FP激酶測定(DiscoverX, Fremont CA )和ProFluor PKA 觀'〗定(Promega 乂>司，Madison WI );及方文射寸生觀'J定'法，i口 SignaTECT 依賴于cAMP的蛋白激酶(PKA)測定系統(Proraega公司，Madison WI )。
預期就PKA活性而言，不同的發光檢測方法會表現出不同的發光 輸出模式。在一個具體實施方案中，發光檢測法是一種檢測激酶活性 的方法。在一些具體實施方案中，本文所述的發光檢測方法包括酶、 底物及合適的緩沖液。在一些具體實施方案中，本發明通過生物發光 檢測cAMP濃度的變化。在一些具體實施方案中，本發明利用螢光素酶 檢測cAMP濃度的變化。在一些具體實施方案中，本發明利用鞘翅類昆 蟲的螢光素酶檢測cAMP濃度的變化。例如，隨著環核苷酸結合PKA 的調節亞基，催化亞基能利用ATP進行底物磷酸化，且ATP被消耗。 鞘翅類昆蟲的螢光素酶利用ATP及其它輔因子將其相應底物螢光素轉 化成氧化螢光素，反應的副產物是發光或光。隨著樣品中ATP減少， 可用于螢光素酶的ATP減少，并可看到發光的減少。用發光輸出(相 對光單位或RLU)檢測相對于對照而言樣品發光的變化。對于PKA活 性，其它發光檢測方法可顯示出差別的光輸出。
在一個具體實施方案中，本發明提供一種檢測系統，其中通過放
射性手段測定樣品中的環核苷酸濃度。就PKA活性而言，不同的放射 性檢測方法可顯示出不同的放射性輸出模式。在一些具體實施方案中， 放射性檢測法是一種檢測激酶活性的方法。在一些具體實施方案中， 本文所述的放射性檢測方法包括經修飾的底物、合適的緩沖液及能捕 獲所述經修飾的底物的表面。在一些具體實施方案中，所述放射性方 法包括S ignaTECT⑧依賴于cAMP的蛋白激酶(PKA )測定系統(Promega
公司，Madison WI)。在一些具體實施方案中，所述放射性檢測方法 包括放射性ATP。在一些具體實施方案中，所述放射性檢測方法包括 y32p-atp或y33p-atp。
在一個具體實施方案中，所述放射性檢測方法進一步包括能被 PKA磷酸化的底物。在一些具體實施方案中，所述放射性檢測方法包 括能被連接配體的PKA磷酸化的底物。在一些具體實施方案中，所述 放射性檢測方法包括生物素化的底物，所述底物包含多肽序列 lrraslg (seq id N0: 1)。在一些具體實施方案中，本文所述的檢測 方法進一步包括表面，其上存在有可捕獲底物/配體的化合物。例如， 所述表面是用鏈酶抗生物素包被的膜。隨著環核苷酸結合PKA的調節 亞基，催化亞基利用放射性標記的ATP并將放射性磷酸轉移到底物上， 從而使底物具有放射性。放射性配體偶聯底物在表面上被捕荻，該表 面上存在有將捕獲配體(如鏈酶抗生物素)的化合物。在一些具體實 施方案中，洗掉表面過剩的放射性，并測量被捕獲在捕獲表面上的放 射性。用放射性輸出(每單位時間的計數)檢測相對于對照而言樣品 放射性的變化。
在一個具體實施方案中，本發明提供一種檢測系統，其中通過熒 光手段測定樣品中的環核苷酸濃度。就PKA活性而言，不同的熒光檢 測方法可顯示出不同的熒光輸出模式。在一些具體實施方案中，熒光 檢測法是一種檢測激酶活性的方法。在一些具體實施方案中，本發明 方法的熒光檢測方法包括酶、經修飾的底物及合適的緩沖液。在一 些具體實施方案中，所述熒光方法包括ProFluorTMpKA測定(Promega 公司，Madison， WI)。在一個具體實施方案中，本發明的熒光檢測方 法包括熒光團。在一些具體實施方案中，所述熒光檢測方法包括熒光 團羅丹明-110。
在一個具體實施方案中，本文所述的熒光檢測方法進一步包括底 物。在一些具體實施方案中，所述熒光檢測方法的底物包含多肽序列 LRRASLG ( SEQ ID N0: 1)。在一些具體實施方案中，所述熒光檢測方 法包括酶。在一些具體實施方案中，本文所述的熒光檢測方法的酶是
蛋白酶。在一些具體實施方案中，所述熒光檢測方法的蛋白酶在其未 被磷酸化時能消化底物。
在一個具體實施方案中，所述熒光檢測方法包括與熒光團相連的
底物。在一些具體實施方案中，所述焚光檢測方法包括兩個與熒光團 相連的底物，使得與不與底物相連的熒光團相比，當熒光團與底物相
連時熒光降低。例如，隨著環核苷酸結合PKA的調節亞基，催化亞基 能磷酸化相應底物。所述熒光檢測方法的底物與焚光團偶聯，使得當 與底物結合時該熒光團表現出降低的熒光。本文所述的蛋白酶消化底 物直至磷酸化時。因此，如果樣品中的環核苷酸濃度升高，更多的底 物將被磷酸化并且熒光將保持低。相反，如果樣品中的環核苷酸濃度 低，則較少的底物將被磷酸化，蛋白酶對非磷酸化底物的消化將完全， 從而釋放熒光團，焚光將升高。檢測熒光輸出(相對熒光單位)，測 定相對于對照而言樣品熒光的變化。
在一個具體實施方案中，本發明提供測定樣品中的環核苷酸濃度 并將所述環核苷酸濃度與樣品中的環化酶活性相關聯。在一個具體實 施方案中，待檢測的環核苷酸是cAMP或cGMP。本方法的樣品包括， 但不限于細胞培養基、緩沖溶液、細胞及細胞裂解物。在一些具體 實施方案中，所述樣品包含裂解物。在一些具體實施方案中，所述樣 品裂解物來自細菌、酵母或哺乳動物細胞。在一些具體實施方案中， 所述樣品包含質膜、細胞膜和/或細胞器膜。在一些具體實施方案中， 本發明的環化酶選自腺苷酸環化酶和鳥苷酸環化酶。在一個具體實施 方案中，本發明的環化酶是腺苷酸環化酶。在一些具體實施方案中， 本發明用于尋找對腺苷酸環化酶活性有影響的物質。例如，本發明的 方法被用于尋找刺激(如增加)或抑制(如降低)腺苷酸環化酶活性 的物質。刺激腺苷酸環化酶活性的物質實例包括，但不限于毛喉素 及毛喉素衍生物如7-去乙酰-毛喉素、6-乙酰-7-去乙酰-毛喉素及7-去乙酰-7-0-半琥珀酰-毛喉素。抑制腺苷酸環化酶活性的物質實例包 括，但不限于細胞可透性抑制劑，如9-(四氫呋喃基)-腺噤呤、2， ，5， -雙脫氧腺苷及9-(環戊基)-腺噪呤；竟爭性抑制劑，如底物類似物P
-L-2， ，3，-雙脫氧-腺苷-5，-三砩酸、腺苷-5，-三磷酸及腺苷 -5， -(P Y-亞曱基)-三磷酸；非竟爭性抑制劑，如9-(阿拉伯呋喃糖 基)-腺嘌呤、9-(木呋喃糖基)-腺嘌呤及2， ，5，-雙脫氧腺苷3，四磷 酸；其它抑制劑，如順-N-(2-苯基環戊基)氮雜環十三烷-l-烯-2-胺、 9-(2-二磷酰膦酰甲氧乙基)腺嘌呤及聚腺苷酸。
在一個具體實施方案中，為測定物質對腺苷酸環化酶活性的影響，
本發明的方法包括蛋白激酶、底物及ATP。在一些具體實施方案中， 本方法包括依賴于cAMP的蛋白激酶(PKA)，使得環核苷酸結合所述 激酶的調節亞基而釋放活性的催化亞基，后者能利用ATP來磷酸化絲 氨酸/蘇氨酸蛋白激酶底物。在一些具體實施方案中，本方法包括絲氨 酸/蘇氨酸蛋白激酶底物，所述底物顯示出提高的對PKA的游離催化亞 基的親和力。在一些具體實施方案中，本方法包括底物，所述底物包 含多肽序列LRRASLG(SEQ IDN0: 1)。腺苷酸環化酶從ATP產生cAMP, 因此影響腺苷酸環化酶活性的物質可影響樣品中cAMP的濃度。在之前 的具體實施方案中已描述過檢測方法，那些檢測方法同樣適用于此。 例如，隨著物質影響樣品中腺香酸環化酶的活性，cAMP濃度將升高或 降低，從而導致經由PKA的底物磷酸化的升高或降低。之前描述的檢 測方法輸出用于測定cAMP濃度的升高或降低，后者與相對于對照而言 樣品的腺苷酸環化酶活性的升高或降低相關聯。因此，當樣品中存在 腺苷酸環化酶的激動劑從而刺激腺苷酸環化酶活性時，cAMP產生增 加，其反應在所用檢測方法的輸出中。相反，如樣品中存在腺苷酸環 化酶的拮抗劑從而抑制腺苷酸環化酶活性時，cAMP產生減少，其反映
在所用檢測方法的輸出中。
在一個具體實施方案中，本發明測定樣品中環核苷酸的濃度并將
所述環核苷酸濃度與磷酸二酯酶活性相關聯。在一些具體實施方案中， 待檢測的環核苷酸是cAMP或cGMP。在一些具體實施方案中，如果cGMP 是用于檢測的環核苷酸，則樣品具有相對于cAMP過量的cGMP。在一 些具體實施方案中，當cGMP是用于檢測的環核苷酸時，則磷酸二酯酶 IV(—種cAMP特異性磷酸二酯酶)存在于樣品中。在一些具體實施方
案中，本發明的樣品包括，但不限于細胞培養基、緩沖溶液、細胞 及細胞裂解物。在一些具體實施方案中，所述樣品包含裂解物。在一 些具體實施方案中，所述樣品裂解物來自細菌、酵母或哺乳動物細胞。 在一些具體實施方案中，所述樣品包含質膜、細胞膜和/或細胞器膜。
在一個具體實施方案中，所述磷酸二酯酶是環核苷酸磷酸二酯酶。 在一些具體實施方案中，當檢測cAMP對PKA的活化時，待測定的環核 苷酸磷酸二酯酶活性來自下組磷酸二酯酶II、磷酸二酯酶III及磷 酸二酯酶IV。在一些具體實施方案中，當檢測cGMP對PKA的活化時， 待測定的環核苷酸磷酸二酯酶活性來自下組磷酸二酯酶II、磷酸二 酯酶III及磷酸二酯酶IV和磷酸二酯酶V。在一些具體實施方案中， 本發明的方法用于尋找對磷酸二酯酶活性有影響的物質。在一些具體 實施方案中，本發明用于尋找刺激(如增加)或抑制(如降低)磷酸 二酯酶活性的物質。抑制磷酸二酯酶II活性的物質實例包括，但不限 于赤-9-(2-羥基-3-壬基)腺嘌呤。抑制磷酸二酯酶III活性的物質 實例包括，但不限于1，6-二氫-2-甲基-6-氧代-(3，4，-聯吡啶)-5-腈、1， 3-二氫-4-甲基-5-(4-甲硫基苯曱酰基)-2H-咪唑-2-酮及鹽酸曲 喹辛。抑制磷酸二酯酶IV活性的物質實例包括，但不限于4-[3-(環 戊氧基)-4-甲氧基苯基]-2-吡咯烷酮、4- (3-丁氧基-4-甲氧基芐基) 咪唑烷-2-酮及l-乙基-4-[91-甲基亞乙基-肼基]1H-吡唑并[3， 4-b] 吡啶-5-甲酸乙酯鹽酸鹽。抑制磷酸二酯酶V活性的物質實例包括，但 不限于1， 4-二氫-5-(2-丙氧基苯基)-7H-l， 2， 3-三唑并(4， 5-d)嘧啶 -7-酮(扎普斯特)、雙嘧達莫及1-[4-乙氧基-3-(6,7-二氫-l-曱基 -7-氧代-3-丙基-lH-吡唑并[4， 3-d]嘧啶-5-基-苯磺酰基]-4-甲基哌 溱檸檬酸鹽。是環核苷酸磷酸二酯酶的非選擇性抑制劑的物質的實例 是3-異丁基-l-甲基黃嘌呤。
在一個具體實施方案中，為測定物質對磷酸二酯酶活性的影響，
本發明包括環核苷酸、蛋白激酶、底物及ATP。在一些具體實施方案 中，本發明包括PKA,使得環核苷酸(cAMP或cGMP )結合所述激酶的 調節亞基，催化亞基被釋放并能利用ATP來磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白
激酶底物。在一些具體實施方案中，本發明包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激
酶底物，所述底物顯示出提高的對依賴于cAMP的蛋白激酶的親和力。 在一些具體實施方案中，本發明包括底物，所述底物包含多肽序列 LRRASLG ( SEQ ID NO: 1)。
磷酸二酯酶水解環核苷酸cAMP至AMP，水解環核苷酸cGMP至GMP。 在之前的具體實施方案中已描述過檢測方法，那些檢測方法同樣適用 于此。例如，隨著物質調節樣品中的磷酸二酯酶活性，環核普酸濃度 升高或降低，從而導致經由PKA的底物磷酸化的升高或降低。本文所 述的檢測方法輸出用于測定環核苷酸濃度的升高或降低，其與相對于 對照而言樣品的磷酸二酯酶活性的升高或降低相關聯。因此，當樣品 中存在磷酸二酯酶的激動劑從而刺激磷酸二酯酶活性時，cAMP向AMP 或cGMP向GMP的水解增加，其反映在所用檢測方法的輸出中。相反， 如果樣品中存在磷酸二酯酶的拮抗劑從而抑制磷酸二酯酶活性，則 cAMP向AMP或cGMP向GMP的水解降低，其反映在所用檢測方法的輸 出中。
在一個具體實施方案中，本文所述的方法測定樣品中環核苷酸的 濃度并將所述環核苷酸濃度與G蛋白偶聯受體(GPCR)活性相關聯。 在一些具體實施方案中，待檢測的環核苷酸是cAMP或cGMP。在一些 具體實施方案中，本發明的樣品包括，但不限于細胞培養基、緩沖 溶液、細胞及細胞裂解物。在一些具體實施方案中，所述樣品包含裂 解物。在一些具體實施方案中，所述樣品裂解物來自細菌、酵母或哺 乳動物細胞。在一些具體實施方案中，所迷樣品包含質膜、細胞膜和/ 或細胞器膜。在一些具體實施方案中，本發明的方法用于尋找對GPCR 活性有影響的物質。在一些具體實施方案中，本發明用于尋找刺激(如 增加)或抑制(如降低)GPCR活性的物質。代表性的G蛋白偶聯受體 的歹寸表可見于Hermans, E. , 2003， Pharmacology & Therapeutics 99: 25-44，其通過引用整體并入本文。GPCR的實例包括，但不限于多 巴胺受體Dl (SEQ ID NO: 2)(美國專利No. 5, 389, 543 )及p-2-腎上腺素能受體和前列腺素El受體。提高多巴胺受體Dl ( SEQ ID NO:2)活性的物質實例包括，但不限于多巴胺、阿樸嗎啡、1-苯基 -2, 3,4，5-四氫-(lH)-3-苯并吖庚因-7，8-二醇(SKF 38393 )及6-氯 -7， 8-二羥基-3-烯丙基-l-苯基-2， 3, 4， 5-四氫-1H-3-苯并吖庚因氫溴 酸鹽(SKF 82958 )。其它多巴胺受體包括，但不限于D2、 D3、 D4 及D5受體。提高p-2-腎上腺素能受體活性的物質實例包括但不限于 異丙腎上腺素。提高前列腺素E2受體活性的物質實例包括但不限于 CP-533， 536。其它前列腺素受體包括，但不限于EP1、 EP3及EP4。
在一個具體實施方案中，為測定物質對GPCR活性的影響，本發明 的方法包括環核苷酸、蛋白激酶、底物及ATP。在一些具體實施方案 中，本發明包括PKA，使得環核苷酸結合所述激酶的調節亞基，活性 的催化亞基能利用ATP來磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶底物。在一些 具體實施方案中，本發明包括PKA，在環核苷酸結合其亞基后，產生 催化亞基的激酶活性，利用ATP來磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶底 物。在一些具體實施方案中，本發明包括PKA,在環核苷酸結合其調 節亞基后，產生催化亞基的激酶活性，利用ATP來磷酸化絲氨酸/蘇氨 酸蛋白激酶底物。在一些具體實施方案中，所述底物包含多肽序列 LRRASLG ( SEQ ID NO: 1)。
G蛋白偶聯受體是膜內在蛋白質，其參與從胞外到胞內的信號轉 導。有多種疾病是由GPCR功能失常引起的，因此，本發明方法能確定 物質是否對GPCR活性有影響在學術上和臨床上都是重要的。隨著物質 刺激或抑制G蛋白偶聯受體，相關聯的腺苷酸環化酶受影響，其中其 活性分別升高或降低。由于腺苷酸環化酶活性受經GPCR刺激或抑制的 調節，轉化成cAMP的ATP量受影響，從而控制可與PKA的調節亞基結 合的cAMP量，后者又控制樣品中發生的底物磷酸化的量。
在之前的具體實施方案中已描述過檢測方法，那些檢測方法同樣 適用于此。隨著物質影響樣品中GPCR的活性，環核苷酸濃度相應改變， 其導致經由PKA的底物磷酸化的升高或降低。檢測方法輸出用于測定 cAMP濃度的升高或降低，其與相對于對照而言樣品的GPCR活性的升 高或降低相關聯。因此，當樣品中存在與Gas偶聯的GPCR激動劑時，
腺苷酸環化酶活性受刺激，導致cAMP產生增加，其反映在所用檢測方 法的輸出中。
相反，如果樣品中存在與Gots偶聯的GPCR拮抗劑，則腺苦酸環 化酶活性受抑制，cAMP產生減少，其反映在所用檢測方法的輸出中。 當樣品中存在偶聯于Goc i的GPCR激動劑時，腺苷酸環化酶活性受抑 制，導致cAMP產生減少，其反映在所用檢測方法的輸出中。當樣品中 存在與Gai偶聯的GPCR拮抗劑時，腺苷酸環化酶活性不受抑制，因 此實現cAMP產生的潛在增加，其反映在所用檢測方法的輸出中。
在一個具體實施方案中，本發明提供試劑盒，其包括一種或多種 用于實施本文所述任何方法的試劑。在一些具體實施方案中，所述試 劑足以實施本文所述的方法。在一些具體實施方案中，所述試劑盒中 的試劑包括，但不限于對照、說明書、緩沖液、用于數據分析的軟 件、用于實施本文所述的檢測方法的設備、包含一種或多種用于實施 本文所述方法的試劑的一個或多個容器及組織培養細胞。在一些具體 實施方案中，所述試劑盒包括環核苷酸，如cAMP或cGMP。在一些具 體實施方案中，所述試劑盒包括酶，如PKA和PKG。在一些具體實施 方案中，所述試劑盒包括細胞裂解緩沖液或溶液。在一些具體實施方 案中，所述試劑盒包括反應緩沖液。在一些具體實施方案中，所述試 劑盒包括凍干或溶液形式的蛋白激酶底物。在一些具體實施方案中， 所述試劑盒包含可應用于特定檢測系統或方法(如發光、熒光或放射 性檢測系統)的緩沖液和試劑。
本文采用的術語旨在描述，不應視為限制。此外，本文所述的具 體實施方案是對通過使用本發明的試劑盒、方法或組合物所實施的技 術方案的例示。它們不意在限制，且任何本領域技術人員都會認識到 其中體現的等同方案。
實施例
提供以下實施例以展示并進一步說明本發明的某些優選的具體實 施方案及方面，不應理解為限制其保護范圍。 實施例1 -哺乳動物細胞的培養
除非另作說明，對于所有細胞培養相關實驗，按以下方式培養哺
乳動物細胞HEK D293 (人胚胎腎)。細胞以5-10， 000細胞/孔的密 度接種于聚-D-賴氨酸包被的96孔白色透明底組織培養板(BD BioCoat Poly-D-Lysine Multiwell Plates)中。細胞培養基組成 為:Dulbecco，s改良Eagles培養基(DMEM),添加10 %胎牛血清(FBS )、 1個單位的青霉素及1 mg/ml的鏈霉素。對于穩定表達多巴胺受體Dl 的細胞系，向培養基中加入500 u g/ml的新霉素用于選擇及維持目的。 于37。C/5。/。C02條件下培養細胞約24小時直至60-75 %匯合，于此時 進行轉染、誘導或其它細胞操作。 實施例2 - cAMP濃度的測定
進行本實驗以證實本發明可用于測定樣品中的cAMP濃度，且本發 明可用多種檢測技術來測定樣品的cAMP濃度。
反應在聚-D-賴氨酸包被的白色透明底96孔板中進行，然而反應 也可通過按比例減少添加試劑的量而在384孔板中進行。通過相應地 按比例減少體積添加還可潛在使用更高密度的板，如1536孔板。
在2 x誘導緩沖液(240mMNaCl、 7.0mMKCl、 3. 0mMCaCl2、 2. 4mM MgS04、 2.4raM NaH2P04、 50mM NaHC03、 20mM葡萄糖、200 |aM 3-異丁 基-1-甲基黃嘌呤(IBMX) 、 100jnM4-(3-丁氧基-4-甲氧基爺基)咪唑 烷-2-酮(RO 201724 ))中從25 p M開始進行cAMP的3倍系列稀釋， 將每一稀釋度的10 |j 1轉移至96孔板的單獨孔中。向每個cAMP稀釋 度孔中加入10/al 2 x誘導緩沖液及60ju 1 PKA/底物試劑(100ng/孔 全酶-R-II oc蛋白激酶A (BIAFFIN GmbH & Co. ， Kassel， Germany)、 25jliM肯普肽、ljLiM rATP、 20mM MgCl2)。樣品板于室溫溫育20分 4中后力口入80jul '激酵一GloTM試齊'J (Promega/^司，Madison WI)。力口 入激酶-G 1 oTM試劑后1Q分鐘讀取發光值，輸出記錄為相對光單位(RLU， n=2)，用GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版)(GraphPad Software, San Diego， CA )相對于cAMP濃度作圖。
在圖2中可見，隨著cAMP濃度增加，發光降低。當使用SignaTECT PKA測定系統(放射性計數，Promega/^司，Madison H )及ProFluor
PKA測定系統(相對熒光，Promega/^司，Madison WI)時，均看到同 樣的相反反應。因此，用本發明及標準曲線可估計未知樣品中的cAMP 濃度。類似地，用此標準曲線可估計經激動劑或拮抗劑處理的細胞的 細胞提取物中的cAMP濃度。
實施例3-監測毛喉素存在下的腺苷酸環化酶活化
反應在聚-D-賴氨酸包被的白色透明底96孔板中進行，然而反應 也可通過按比例減少添加試劑的量而在384孔板中進行。通過相應地 按比例減少體積添加還可潛在使用更高密度的板，如1536孔板。
進行250jaM毛喉素在2x誘導緩沖液中的2倍系列稀釋。如實施 例1所述培養D293細胞至匯合。從培養細胞中除去培養基，將細胞用 磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗三次，將每一毛喉素稀釋度的10jil加入到 96孔D293細胞培養板的孔中。通過向幾個孔的D293細胞中加入10 ia 1不含毛喉素的2x誘導緩沖液，將對照包括在內。于室溫將含有及 不含毛喉素的細胞溫育15分鐘，之后加入10 ji 1 2x裂解緩沖液(80mM Tris-HCl ( pH 7. 5 ) 、 2mM EDTA ( pH 8. 0 ) 、 2raM EGTA ( pH 7. 2 )、 0.4% Tergitol NP-9、 20%甘油、100mM NaF、 200 |i M Na3V04、 400 jaM亮抑酶肽、40jjg/ml抑肽酶、400 jiM 1-氯-3-甲苯磺酰氨基-7-氨基-2-庚酮(TLCK) 、 400juM1-氯-3-甲苯磺酰氨基-4-苯基-2-丁酮 (TPCK ) 、 200 u M 4- (2-氨基乙基)苯磺酰氟-HCi ( ABSF ) 、 200 |i M IBMX 及4 m M rATP (最后加TPCK，加TPCK前將緩沖液渦旋混勻以避免沉淀 并將裂解緩沖液置于冰上)。使細胞于4C裂解15_30分鐘，通過顯 微鏡評價驗證完全裂解。裂解后，每孔中加入60jLi1 PKA/底物試劑， 反應于室溫再溫育20分鐘，之后加入80ul激酶-GloTM試劑。加入激 酶-GloTM試劑后10分鐘讀取發光值，輸出記錄為相對光單位(RLU, n -2),用GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版)相對于毛喉素濃度作圖。
如圖3所示，隨著毛喉素濃度增加，發光降低，從而證實本發明 可用于檢測腺苷酸環化酶活性的升高。由于毛喉素直接刺激腺苷酸環 化酶，由ATP產生cAMP， cAMP又結合PKA的調節亞基，從而釋放活性 的PKA催化亞基，后者繼而利用ATP來磷酸化肯普肽底物。隨著肯普肽磷酸化的增加，可被激酶-GloTM試劑中的螢光素酶使用的ATP減少， 導致發光降低。毛喉素對腺普酸環化酶的該效應見于圖3，隨著毛喉 素濃度增加，腺苷酸環化酶活性也增加，其與發光的降低相關聯。因 此，本發明能利用cAMP監測腺苷酸環化酶受刺激物的誘導。
實施例4-監測響應激動劑和拮抗劑的多巴胺受體D1活性
在哺乳動物細胞中進行實驗以證實本發明測定激動劑和拮抗劑對 GPCR多巴胺受體D1 (DRD1， 一種Gccs偶聯受體)的影響的能力。
用標準的分子生物學技術創建穩定表達DRD1的D293細胞系。簡 言之，依生產商的操作流程(Promega公司，TM044 )，用聚合酶鏈式 反應從含有cDNA的載體(ATCC， HGR213-1)擴增編碼DRD1的基因 (Genbank NM000794 )并將其克隆到pTargetTM哺乳動物表達載體中。 細胞如實施例1所述培養并在接種后24小時用pTarget-DRDl載體轉 染。轉染后一天，將細胞用胰酶消化并以多種稀釋度重新平板接種， 應用含有500jug/ml選擇藥物-新霉素的新鮮培養基。每2-3天更換 培養基，直到明顯建立抗藥性克隆。選出幾個新霉素抗性克隆以進一 步表征并檢測多巴胺受體Dl反應。擴充顯示最高反應的克隆并制備冷 凍原種貯存。將克隆的細胞系之一用于隨后的檢測。
在2x誘導緩沖液中稀釋10jiM貯存濃度的激動劑多巴胺、SKF 38393、阿樸嗎啡及SKF 82958的3倍稀釋液。為測試拮抗劑SCH 23390， 還在含有100nM的激動劑SKF 38393的2 x誘導緩沖液中進行拮抗劑 SCH 23390 ( 5 uM)的2倍系列稀釋。
反應在聚-D-賴氨酸包被的白色透明底96孔板中進行，然而反應 也可通過按比例減少添加試劑的量而在384孔板中進行。通過相應地 按比例減少體積添加還可潛在使用更高密度的板，如1536孔板。
如實施例1所述接種表達DRD1的D293穩定細胞。次日將細胞用 PBS洗3次并向特定孔中加入每一激動劑稀釋度的10 u 1。對于對照反 應，使用lOjLi 1不含激動劑的2x誘導緩沖液。使誘導在室溫進行30 分鐘，此時向每孔中加入10p 1 2x裂解緩沖液。裂解進行20-30分 鐘，并通過顯微鏡評價驗證完全裂解。 一旦細胞完全裂解，加入60"
lPKA/底物試劑，并于室溫再溫育反應20分鐘。溫育后，加入80pl 激酶-GloTM試劑，室溫溫育IO分鐘后讀取發光值。輸出記錄為RLU(n =2)，用GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版)相對于激動劑濃度作圖。 圖4A展示隨著激動劑濃度升高，發光信號降低，從而顯示每種激動劑 對含有DRD1的細胞的腺苷酸環化酶的誘導效應。如圖4A所示，各種 激動劑的E"值不同，顯示每種激動劑對DRD1活性有不同的影響。
為測試拮抗劑的抑制作用，在100nM的激動劑SKF 38393存在下， 將表達DRD1的D293穩定細胞與10 p 1拮抗劑SCH 23390稀釋液在室 溫溫育30分鐘。如上所述進行PKA/底物試劑及激酶-GloTM試劑的添加 和隨后的溫育及讀數。
輸出記錄為RLU (n= 2)并用GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版)相 對于激動劑濃度作圖。圖4B顯示，隨著拮抗劑濃度升高，發光也增加。 該增加是由于SCH 23390對激動劑SKF 38393的拮抗效應而對腺苷酸 環化酶的抑制作用。因此，本發明可用于監測激動劑和拮抗劑對與G ocs途徑偶聯的GPCR的腺苷酸環化酶組分的影響。
實施例5 — cAMP和cGMP與PDE活性的關聯
進行實驗以展示PKA在環核苷酸及相應的環核苷酸磷酸二酯酶存 在下監測cAMP和cGMP濃度變化的能力。還進行實驗以監測在環核苷 酸磷酸二酯酶的激活劑或抑制劑存在下PDB活性的變化。
反應在白色96孔板中進行，然而反應也可通過按比例減少添加試 劑的量而在384孔板中進行。通過相應地按比例減少體積添加還可潛 在使用更高密度的板，如1536孔板。
在減去IBMX和R0 201724的2 x誘導緩沖液中通過以1/10增量 (lmU、 0. 9mU、 0. 8mU等)稀釋1mU貯存液而進行牛腦磷酸二酯酶II (Sigma, PDE II)的系列稀釋，所述牛腦磷酸二酯酶II可將cAMP 水解成AMP。將每一稀釋度的12. 5 jli 1等分試樣加入到96孔白色平板 中12.5jal含有50mMTris-HCl ( pH 7. 5 ) 、 10mMMgCl2、 50fjMCaCl2、 0. lmg/ml BSA、 20|aM 4丐調素(CaM)及0. 5或10 u M cAMP的溶液中 (總體積25 ju 1 )。酶反應在室溫溫育15分鐘，加入12. 5 ju 1終止緩
沖液(40mM Tris-HCl ( pH 7.5) 、 20mM MgCh、 0. lmg/ml BSA、 375 ju M IBMX及4 ja M ATP )終止反應。加入IBMX溶液后，加入25 p 1 PKA/ 底物試劑，反應再溫育20分鐘，加入50jal激酶-GloTM試劑。加入激 酶-GloTM試劑后10分鐘測量發光，輸出記錄為RLU (n=2)并用 GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版)相對于PDE濃度作圖。在圖5中可見， 發光隨著增加的PDE II濃度而增加，證實PDE II對cAMP濃度的影響。 隨著cAMP被PDE II水解為AMP， cAMP濃度降低，從而導致發光增加。
為展示cGMP活化PKA的能力，用本測定系統進行對cAMP和cGMP 的并列滴定。在不含ATP和IBMX、但添加2|iiM ATP的終止緩沖液中 制備cAMP和cGMP (二者初濃度均為40juM)的2倍系列稀釋液。將 25 ju 1的稀釋液等份加入到白色96孔板中后加入25 ju 1 PKA/底物試 劑，所述PKA/底物試劑含有100ng/孔的全酶-R-IIoc蛋白激酶A、 20 ILiM肯普肽、40mMTris-HCl ( pH 7. 5 ) 、 20mMMgCl2及0. lmg/ml BSA。 使反應在室溫溫育20分鐘，加入50jil激酶-GloTM試劑后再溫育10 分鐘。加入激酶-GloTM試劑后10分鐘測量發光，輸出記錄為RLU (n =2)并用GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版)相對于環核苷酸(cNMP ) 濃度作圖。如圖6所示，隨著環核苷酸濃度升高，相對光單位降低。 圖6展示盡管其親和力低于cAMP， cGMP能結合PKA的調節亞基，從而 釋放活性的催化亞基。
實施例6-監須'J cGMP-PDE (PDE V)活性
以總體積25jul，在含有50mMTris-HCl (pH7.5) 、 10mMMgCl2、 0. 5mM EGTA、 0. 1 mg/ml BSA及5 mM cGMP的溶液中進行磷酸二酯酶 PDEV的系列稀釋，始于50U濃度。使酶反應在室溫進行60分鐘，之 后加入12. 5 ja 1終止緩沖液。向反應孔中加入25 ja 1含有100ng/孔的 全酶-R-IIcc蛋白激酶A、 40juM肯普肽、40mM Tris-HCl ( pH 7.5) 及30mM MgCh的PKA/底物試劑，然后室溫溫育20分鐘。加入等體積 (50pl)激酶-GloTM試劑，反應再溫育10分鐘，測量發光值，輸出 記錄為RLU (n = 2)并用GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版)相對于磷酸 二酯酶PDEV濃度作圖。在圖7A中可見，隨著磷酸二酯酶PDE V濃度
升高，樣品的相對發光也升高。圖7A證實本測定法不僅能監測特異于 cAMP水解的磷酸二酯酶，還能監測特異于cGMP水解的磷酸二酯酶。 實施例7-監測在抑制劑存在下cGMP-PDE (PDE V)的活性 進行磷酸二酯酶PDE V選擇性抑制劑扎普斯特(Sigma)的滴定。 在不含IBMX和ATP、添加10jiM cGMP的終止緩沖液中進行扎普斯特 (20uM)的2倍系列稀釋。還制備含有PDEV的酶溶液，使得每12. 5 ju 1的酶溶液中含有15U (不含IBMX和ATP的終止緩沖液)的酶。將 每一稀釋度的等分試樣(12. 5 )a 1 )加入到反應孔中，再加入等量磷酸 二酯酶PDEV酶溶液以起始反應。平板于室溫溫育30分鐘，之后加入 添加1.5mM IBMX和4 jaM ATP的終止緩沖液以終止反應。向每孔中加 入等體積PKA/底物試劑(含有100ng/孔的全酶-R-IIot蛋白激酶A、 40 |j M肯普肽、40mM Tr is-HCl( pH 7. 5 )、 20mMMgCU 0. lmg/ml BSA )， 平板再溫育20分鐘，加入50 jn 1激酶-GloTM試劑。加入激酶-GloTM試 劑后IO分鐘測量發光，輸出記錄為RLU(n-2)并用GraphPad Prism 軟件(4. 0版)相對于扎普斯特濃度作圖。如圖7B所示，隨著磷酸二 酯酶PDE V抑制劑扎普斯特的量增加，相對光單位降低。圖7B展示了 發光與扎普斯特濃度之間的關聯，從而證實所述測定法可用于確定 cGMP特異性磷酸二酯酶PDE V的潛在抑制劑。圖7B進一步展示在本 試驗中計算的扎普斯特的IC5。，與文獻(Turko 1998 )中所記載的相 比，再次證實了所述測定法可用于監測相應的cGMP磷酸二酯酶活性的 變化。因此，本發明可用于測量cAMP濃度及在抑制劑存在和不存在下 其相應的磷酸二酯酶的活性，以及監測cGMP濃度及在抑制劑存在或不
存在下其相應的磷酸二酯酶的活性。 實施例8-檢測cGMP濃度
為測定生物樣品中的cGMP濃度，樣品最初應加熱至95t: 5分鐘， 之后加入cAMP選擇性磷酸二酯酶如PDE IV，再于室溫溫育30分鐘。 然后可向樣品中加入等分試樣的PKA底物試劑，于室溫溫育20分鐘， 之后加入激酶-GloTM試劑(Promega公司，Madison WI )。加入激酶-Glo 試劑后10分鐘測量發光，記錄輸出(RLU)，并相對于不同的樣品體
積作圖。然后可用繪圖程序如GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版)并將 樣品發光輸出與cGMP標準曲線相比較來確定樣品中的cGMP量。
為測量生物樣品中cAMP或cGMP磷酸二酯酶的活性，樣品應該經 透析以除去內源性cAMP和cGMP，例如用截斷值為500 Da的透析膜。 留在透析膜內的樣品可用于隨后的試驗。樣品將與如先前實施例中所 述的底物和試劑溫育。因此，對于cAMP或cGMP磷酸二酯酶，將分別 使用底物cAMP或cGMP。可如之前所述使用檢測方法，通過比較檢測 輸出與對照，確定磷酸二酯酶的活性。
實施例9-檢測質膜中的cAMP
本試驗提供利用低滲裂解法或氮空蝕(nitrogen cavitation)裂 解法制備質膜制劑的示例方法。
對于低滲裂解，以500 xg離心5分鐘收集3xl(T個細胞并用PBS 洗兩次。將細胞沉淀重懸于10ml低滲裂解緩沖液(lmM HEPES ( pH 7. 5) 、 lmM EDTA、 0. 2mM亮抑酶肽及40 jj g/ml抑肽酶)，細胞懸液 用派勒克斯杜恩斯玻璃勻漿器攪勻(20擊)。在一些情況下，將細胞 懸液勻漿3次以起始低滲細胞裂解。為調節細胞懸液的低滲性，在一 些細胞懸液中，加入HEPES和甘油至終濃度分別為25mM和10% 。向 其它細胞懸液中加入等體積的2 x緩沖液A( 2 x : 50mM HEPES( pH 7. 5 )、 2raM EDTA、 0. 5M蔗糖、0. 4mM亮抑酶肽及80 u g/ml抑肽酶)。通過 再擊17次搗勻所有懸液。
對于氮空蝕裂解，以500 xg離心5分鐘收集3x 108個細胞并用 PBS洗兩次。將細胞沉淀重懸于15ml緩沖液A ( 0. 25raM蔗糖、25mM HEPES (pH7.5) 、 lmMEDTA、 0. 2mM亮抑酶肽及40 ju g/ml抑肽酶)。 細胞懸液在氮空蝕炸彈(Parr儀器公司，Moline， IL)中以350Psi 預平衡20分鐘，緩慢釋放壓力，收集細胞裂解物。
對于這兩種裂解法，質膜部分按下列操作收集。對細胞裂解物進 行低速離心(1000 xg) 10分鐘以去除細胞碎片。收集上清液并進行 高速離心(50， 000 xg) 30分鐘以收集質膜。將質膜部分重懸于緩沖 液A、緩沖液B (25mM HEPES ( pH 7. 5 ) 、 lmM EDTA、 0. 2mM亮抑酶
肽及40jug/ml抑肽酶)或含有終濃度為10。/。的甘油的緩沖液B。
評估不同的制備方法以確定最佳方法，其中膜完整性得以維持， 并且更重要的是使受體-G蛋白-腺苷酸環化酶復合物保持完整。圖8 顯示對不同細胞類型使用不同的裂解法和緩沖液的不同膜制劑的測試 數據。盡管膜制劑顯示出誘導的cAMP產生，只通過低滲裂解法裂解并 重懸于緩沖液B的膜顯示出比在含有甘油的緩沖液B或含有蔗糖的緩 沖液A中裂解的膜低的反應。未看出重懸于含有甘油的緩沖液B和含 有蔗糖的緩沖液A中的膜制劑之間的差異。
實施例10 -檢測質膜中毛喉素刺激的腺苷酸環化酶活性 反應在聚-D-賴氨酸包被的白色透明底96孔板中進行，然而反應 也可通過按比例減少添加試劑的量而在384孔板中進行。通過相應地 按比例減少體積添加還可潛在使用更高密度的板，如1536孔板。
在刺激緩沖液(25raMHEPES ( pH 7. 5 ) 、 10mMMgCl2、 IOOjliMI匿 及O. 1%吐溫-20)中進行250jliM毛喉素的2倍系列稀釋。按照實施 例9所述方法從如實施例4所述的穩定表達DRD1的HEK293細胞制備 質膜制劑。向96孔板的孔中加入質膜(l]Lig蛋白于25ja 1刺激緩沖 液中)和IOiliM GDP，并于室溫溫育10分鐘。向質膜制劑中加入15 U 1每一毛喉素稀釋液。通過向含有預溫育的質膜制劑的幾個孔中加 入15 p 1不含毛喉素的刺激緩沖液而將對照包括在內。在室溫溫育含 有或不含有毛喉素的質膜制劑15分鐘。為檢測cAMP產生，向每孔中 加入40nl PKA/底物試劑，并使反應于室溫再溫育20分鐘，之后加 入80jli 1激酶-GloTM試劑。加入激酶-GloTM試劑后1G分鐘讀取發光值， 輸出記錄為相對光單位(RLU)并用GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版) 相對于毛喉素濃度作圖。
如圖9所示，隨著毛喉素濃度升高，發光降低，從而證實本發明 可用于檢測質膜制劑中受毛喉素刺激的腺苷酸環化酶活性。因此，本 發明能檢測經刺激物誘導腺苷酸環化酶后質膜制劑中的cAMP產生。 實施例ll-監測質膜中響應激動劑的多巴胺受體Dl活性 進行實驗以證實本發明能測定質膜制劑中激動劑對腺苷酸環化酶
活性對GPCR多巴胺受體Dl ( DRD1)的影響。
在含有50juMATP和0. 2jjMGTP的刺激緩沖液中稀釋10juM貯存 濃度的激動劑多巴胺和SKF38393的2倍稀釋液。還制備10jjM貯存濃 度的非特異性DRD1配體-喹吡羅的2倍稀釋液。
反應在聚-D-賴氨酸包被的白色透明底96孔板中進行，然而反應 也可通過按比例減少添加試劑的量而在384孔板中進行。通過相應地 按比例減少體積添加還可潛在使用更高密度的板，如1536孔板。
根據實施例7所述方法從如實施例4所述的穩定表達DRD1的 HEK293細胞制備質膜制劑。向96孔板的孔中加入質膜(ljig蛋白于 25ju 1刺激緩沖液中)和IO)jM GDP,并于室溫溫育10分鐘。向特定 孔中加入20 |j 1的每一化合物稀釋液。在室溫進行誘導15分鐘后加入 40 u 1 PKA/底物試劑。使反應再溫育20分鐘，之后加入80jLi 1激酶 -GloTM試劑。加入激酶-GloTM試劑后10分鐘讀取發光值，輸出記錄為 相對光單位(RLU)并用GraphPad Prism⑧軟件(《G版)相對于毛喉 素濃度作圖。
圖IO展示，在已知的特異性DRD1激動劑(多巴胺和SKF38393 ) 的情況下，隨著激動劑濃度升高，發光信號降低；但在喹吡羅(一種 非特異性DRD1受體的配體)的情況下并非如此，從而顯示可在膜制劑 中檢測DRD1受體的活化。因此，本發明可用于通過測量cAMP濃度的 變化監測質膜制劑中受激動劑/拮抗劑誘導的GPCR受體活化。
以與實施例4中類似的方式，可進行對DRD1拮抗劑的試驗。例如， 為檢測質膜中拮抗劑對DRD1的抑制，在100nM激動劑SKF 38393存在 下，將10ju 1拮抗劑SCH 23390的稀釋液加入含有DRD1的質膜制劑中， 并于室溫溫育反應0分鐘。可如上所述進行PKA/底物試劑和激酶-Gl()tm 試劑的添加和隨后的溫育及讀數。
實施例12-監測響應激動劑和拮抗劑的多巴胺受體D2(DRD2)活
性
進行實驗以證實本發明能測定激動劑和拮抗劑對GPCR多巴胺受 體D2(DRD2)(—種Goti蛋白偶聯受體)的影響。
如實施例4中對于DRD1所述，使用標準的分子生物學技術創建穩 定表達DRD2的D293細胞系。
細胞用磷酸鹽緩沖鹽水溶液簡短清洗以去除痕量血清，并在克雷 布斯林格緩沖液(100jaM IBMX和100 jaM Ro-20-1724 )中于10jaM 毛喉素存在下以20 m1 (96孔板)或7. 5jul ( 384孔板)與多種濃度 的D2-受體激動劑溫育。室溫溫育15分鐘后，用20pl (96孔板)或 7.5m 1 ( 384孔板)裂解緩沖液裂解細胞。于室溫裂解15分鐘后，用 40 m 1含有pka的反應緩沖液(在96孔板中40 m 1，在384孔板中15 jul)進行激酶反應，激酶反應在室溫進行20分鐘。在激酶反應結束 時加入等體積的激酶-GloTM試劑并于室溫溫育IO分鐘，用發光計讀板。
對于基于拮抗劑的測定，將細胞與10laM毛喉素及ECs。濃度的D2 受體激動劑于含有lOOjaM IBMX和100iliM Ro-20-1724的克雷布斯林 格緩沖液中與或不與拮抗劑一起溫育，并如上所述進行測定。如圖1U 所示，得到與文獻報道相似的喹吡羅EC5Q-0. 5nM。除細胞與lGpM毛 喉素和10 OnM D2激動劑喹吡羅及與遞增濃度的拮抗劑雷氯必利溫育以 外，利用類似的試驗設計測試拮抗劑。如圖IIB所示，得到與文獻報 道相似的雷氯必利ICs。值-0. 8nM。所迷多巴胺D2受體是G(Xi蛋白偶 聯受體。因此，此測定法不僅能監測對Gocs蛋白偶聯受體的調節，還 能監測對G(Xi蛋白偶聯受體的調節，從而證實此測定法可用于搜尋這 兩類受體的調節劑的HTS篩選程序中。
所有在本申請中提到的出版物和專利通過引用并入本文。對本發
見的而不偏離本發明的范圍和精神。盡管就特定優選的具體實施方案 描述了本發明，但應了解，所要求保護的發明不應不適當地局限于這 些特定的具體實施方案中。實際上，相關領域技術人員顯而易見的對 所述具體實施方式
的各種修改均意圖包含在下列權利要求范圍之內。
權利要求
1.測定樣品中環核苷酸量的方法，包括a) 提供可能含有環核苷酸的樣品，b) 向所述樣品中加入能被所述環核苷酸活化的無活性酶，c) 加入能檢測所述被活化的酶的活性并產生可檢測信號的檢測系統，及d) 基于所述信號測定存在于所述樣品中的環核苷酸的量。
2. 權利要求l的方法，其中所述樣品包含裂解物。
3. 權利要求2的方法，其中所述裂解物來自真核細胞。
4. 權利要求l的方法，其中所述樣品包含質膜。
5. 權利要求l的方法，其中所述環核苷酸是cAMP或cGMP。
6. 權利要求1的方法，其中所述無活性酶是依賴于cAMP的蛋白 激酶或依賴于cGMP的蛋白激酶。
7. 權利要求1的方法，其中所述檢測系統包括能被依賴于cAMP 的蛋白激酶或依賴于cGMP的蛋白激酶磷酸化的底物。
8. 權利要求7的方法，其中所述底物包含SEQ ID N0: 1。
9. 權利要求7的方法，其中所述檢測系統進一步包括能利用ATP 產生發光信號的酶。
10. 權利要求9的方法，其中所述酶是螢光素酶。 權利要求7的方法，其中所述底物包括放射性標記的生物素化
11. 底物。
12. 權利要求ll的方法，其中所述底物進一步包含SEQ ID N0: 1。 權利要求11的方法，其中所述檢測系統進一步包括鏈霉抗生 物素結合表面。
13.
14. 權利要求7的方法，其中所述底物包括熒光標記的底物。
15. 權利要求14的方法，其中所述底物進一步包含SEQ ID N0: 1。
16. 權利要求14的方法，其中所述熒光標記是羅丹明部分。
17. 權利要求1的方法，進一步包括添加一種或多種磷酸二酯酶抑 制劑。
18. 權利要求1的方法，進一步包括添加能影響所述樣品中環核普 酸量的激動劑或拮抗劑。
19. 權利要求18的方法，其中所述激動劑或拮抗劑調節腺苷酸環 化酶活性。
20. 權利要求18的方法，其中所述激動劑或拮抗劑調節G蛋白偶 聯受體活性。
21. 權利要求18的方法，其中所述激動劑或拮抗劑調節磷酸二酯 酶活性。
22. 測定樣品中腺苷酸環化酶活性的方法，包括a) 提供可能含有腺苷酸環化酶的樣品，b) 向所述樣品中加入能被cAMP活化的無活性酶，c) 加入能檢測所述活化的酶的活性并產生可檢測信號的檢測 系統，及d) 基于所述信號測定存在于所述樣品中的腺苷酸環化酶活性。
23. 權利要求22的方法，其中所述樣品包含裂解物。
24. 權利要求23的方法，其中所迷裂解物來自真核細胞。
25. 權利要求22的方法，其中所述樣品包含質膜。
26. 權利要求22的方法，其中所述無活性酶是依賴于cAMP的蛋白
27. 權利要求22的方法，其中所述檢測系統包括能被依賴于cAMP的蛋白激酶磷酸化的底物。
28. 權利要求27的方法，其中所述底物包含SEQ ID NO: 1。
29. 權利要求27的方法，其中所述檢測系統進一步包括能利用ATP產生發光信號的酶。
30. 權利要求29的方法，其中所述酶是螢光素酶。
31. 權利要求27的方法，其中所述底物包括放射性標記的生物素 化底物。
32. 權利要求31的方法，其中所述底物進一步包含SEQ ID N0: 1。
33. 權利要求31的方法，其中所述檢測系統進一步包括鏈霉抗生 物素結合表面。
34. 權利要求27的方法，其中所述底物包括熒光標記的底物。
35. 權利要求34的方法，其中所述底物進一步包含SEQ ID N0: 1。
36. 權利要求34的方法，其中所述熒光標記是羅丹明部分。
37. 權利要求22的方法，進一步包括添加一種或多種磷酸二酯酶抑制劑。
38. 權利要求22的方法，進一步包括添加腺苷酸環化酶活性的激 動劑或拮抗劑。
39. 測定樣品中磷酸二酯酶活性的方法，包括a) 提供可能含有磷酸二酯酶的樣品，b) 向所述樣品中加入能被cAMP活化的無活性酶，c) 加入能檢測所述被活化的酶的活性并產生可檢測信號的檢測 系統，及d) 基于所述信號測定存在于所述樣品中的磷酸二酯酶活性。 權利要求39的方法，其中所述磷酸二酯酶是環核苷酸磷酸二
40.權利要求39的方法，其中所述磷酸二酯酶是環核苷酸二酯酶。
41.權利要求40的方法，其中所述環核苷酸是cAMP或cGMP。
42.權利要求39的方法，其中所述樣品包含裂解物。
43. 權利要求39的方法，其中所述裂解物來自真核細胞。
44. 權利要求39的方法，其中所述樣品包含質膜。
45. 權利要求39的方法，其中所述無活性酶是依賴于cAMP的蛋白 激酶或依賴于cGMP的蛋白激酶。
46. 權利要求39的方法，其中所述檢測系統包括能被依賴于cAMP 的蛋白激酶或依賴于cGMP的蛋白激酶磷酸化的底物。
47. 權利要求46的方法，其中所述底物包含SEQ ID N0: 1。
48. 權利要求46的方法，其中所述檢測系統進一步包括能利用ATP 產生發光信號的酶。
49. 權利要求48的方法，其中所述酶是螢光素酶。
50. 權利要求46的方法，其中所述底物包括放射性標記的生物素 化底物。
51. 權利要求50的方法，其中所述底物進一步包含SEQ ID NO: 1。
52. 權利要求46的方法，其中所述檢測系統進一步包括鏈霉抗生 物素結合表面。
53. 權利要求46的方法，其中所述底物包括熒光標記的底物。
54. 權利要求53的方法，其中所述底物進一步包含SEQ ID NO: 1。
55. 權利要求53的方法，其中所述熒光標記是羅丹明部分。
56. 權利要求39的方法，進一步包括添加一種或多種磷酸二酯酶 抑制劑。
57. 測定樣品中G蛋白偶聯受體活性的方法，包括a) 提供可能含有G蛋白偶聯受體的樣品，b) 向所述樣品中加入能被cAMP活化的無活性酶，c) 加入能檢測所述被活化的酶的活性并產生可檢測信號的檢測 系統，及d) 基于所述信號測定存在于所述樣品中的G蛋白偶聯受體活性。
58. 權利要求57的方法，其中所述樣品包含裂解物。
59. 權利要求58的方法，其中所述裂解物來自真核細胞。
60. 權利要求57的方法，其中所述樣品包含質膜。
61. 權利要求57的方法，其中所述無活性酶是依賴于cAMP的蛋白 激酶。
62. 權利要求57的方法，其中所述檢測系統包括能被依賴于cAMP的蛋白激酶磷酸化的底物。
63. 權利要求62的方法，其中所述底物包含SEQ ID NO: 1。
64. 權利要求62的方法，其中所述檢測系統進一步包括能利用ATP 產生發光信號的酶。
65. 權利要求64的方法，其中所述酶是螢光素酶。
66. 權利要求62的方法，其中所述底物包括放射性標記的生物素 化底物。
67. 權利要求66的方法，其中所述底物進一步包含SEQ ID NO: 1。
68. 權利要求66的方法，其中所述檢測系統進一步包括鏈霉抗生 物素結合表面。
69. 權利要求62的方法，其中所述底物包括熒光標記的底物。
70. 權利要求69的方法，其中所述底物進一步包含SEQ ID N0: 1。
71. 權利要求69的方法，其中所述熒光標記是羅丹明部分。
72. 權利要求57的方法，進一步包括添加一種或多種磷酸二酯酶抑制劑。
73. 權利要求57的方法，進一步包括添加G蛋白偶聯受體活性的 激動劑或拮抗劑。
74. 測定樣品中環核苷酸濃度的試劑盒，包括a) 環核苷酸，b) 蛋白激酶，c) 蛋白激酶底物，d) ATP，及e) 使用所述試劑盒測定所述樣品中所述環核苷酸的所述濃度的 說明書。
75. 測定樣品中環核苷酸磷酸二酯酶活性的試劑盒，包括a) cAMP和cGMP的底物，b) 蛋白激酶，c) 蛋白激酶底物，d) ATP，及e) 使用所述試劑盒測定所述樣品中所述環核苷酸磷酸二酯酶的 所述活性的說明書。
全文摘要
本發明總地涉及細胞分析工具，更特別涉及檢測或測定樣品中的環核苷酸濃度的方法。
文檔編號C12P21/08GK101365721SQ200680052453
公開日2009年2月11日 申請日期2006年12月6日 優先權日2005年12月6日
發明者J·維度吉里尼, M·庫馬, S·A·高利, 肖圭玄 申請人:普羅梅格公司