抗乙型肝炎病毒核酶核酸的制作方法

專利名稱：抗乙型肝炎病毒核酶核酸的制作方法
技術領域：
本發明屬于重組DNA技術領域，尤其涉及核酶技術，特別涉及抗乙型肝 炎病毒(HBV)核酶的設計。
背景技術：
世界范圍內乙型肝炎病毒(HBV)感染很多人。接種疫苗是行之有效的預 防措施，然而對于感染HBV的人來說，已經長久期待一種高效的療法。介入 治療提供給HBV患者唯一的希望是通過阻止HBV的復制從而降低疾病的進 展。已經提出很多抗HBV的療法，并且可在一定程度上減輕該疾病，但是沒
有提供與該病毒作斗爭的有效的療法。
HBV基因組由3. 2 kb的部分雙鏈環狀DNA組成。HBV利用前基因組RNA 進行復制。前基因組RNA表征為3. 5 kb的序列，比基因組(3.2 kb)長，通 過病毒聚合酶反轉錄。這種RNA的兩端具有獨特的由60個堿基組成的莖-環 結構，這種莖-環結構稱為s環。已知5'端的s環在前基因組RNA的包衣殼化
中起到重要作用，并且也在反轉錄前為聚合酶提供結合位點。
通過利用重組DNA/RNA以調節基因表達并且特異靶向病毒基因組以終止 其復制的方法己經提供了十分有效的治療工具。核酶是特異靶序列的催化性 RNA分子，以前已經被用來除去HBV。已經設計了抗HBV的錘頭結構核酶來 減少前基因組RNA和其蛋白質的m歴A。這些核酶被設計成能靶向HBV前基 因組RNA上的三個不同位點(von Weizsacker等人，1992)。其他研究人員 設計錘頭結構核酶可結合并適度切割s-環區(Beck和Nassal， 1995)。錘頭 型核酶也被用來靶向HBV序列中編碼基因X的RNA序列(Kim等人，1999， 及Weinberg等人，2000)。 由于設計和合成方法的原因，先前設計的抗HBV的錘頭結構核酶不能有
效切割它們的靶。根據本發明的HBV核酶可在體外完全切割耙朋V序列。利 用根據本發明的兩個或更多核酶可導致在兩個或更多不同的位點切割耙HBV 信使RNA或者前基因組RNA。嚴格地，核酶是切割耙RNA的RNA分子。 一些 文獻使用該術語來描述轉錄為西A的DNA分子，因此產生了核酶本身。在本 說明書中，術語"核酶DNA"指可轉錄為核酶本身的DNA。
發明概述
本發明的核酶及其在體內轉錄的相應核酶DNA分子被設計成能切割在 HBV信使RNA或者前基因組RNA中的CUC位點。眾所周知，通常核酶的 治療用途是通過使用配對物DNA，通常將其并入載體諸如質粒載體的方式 來完成的。
根據本發明的核酶的設計和構建將在下文詳細描述，本文通過制備三個 名為MAZI、 SGIII和DGII的錘頭結構核酶舉例說明。表1顯示相對于HBV 序列(表示為cDNA)這些示例的核酶在HBVmRNA上的切割位點。
從GCG(Acc.No. Y07587)獲得HBV序列(AYW菌株)、s-環區域 (1848-1910)的上游500個堿基和下游500個堿基的序列。利用計算機程序 'mfoId，(http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfold-simple.html)予頁湖!j HBV RNA的二級結構以確定無NUX位點，即不涉及形成鏈的強結合，并針對無 NUX位點設計的錘頭型核酶設計二級結構。選擇的NUX位點全部都是 CUC位點。
通過已經設計的三個反式作用錘頭結構核酶作為實例，作為HBVRNA 有效切割劑的全部三個錘頭結構核酶在5'端由穩定環為先導并且后面有一個 或多個額外的莖環結構。通常在反式作用元件的3'端后有順式作用核酶。整 個說明書中常常將核酶的設計稱為RNA核苷酸，這些RNA核苷酸是在 HBVRNA靶位點有效的分子種類。然而值得注意的是體內施用的可實現切 割HBV RNA的治療劑則需存在于合適的載體系統中的相應的DNA多核苷 酸。
一方面，本發明提供一種包含至少一個DNA載體的載體系統，該載體 包含在對人類細胞有效的啟動子控制下的靶向切割的錘頭型核酶DNA序 列，其一旦轉錄為RNA將在CUC切割位點切割從編碼HBV RNA的耙基因 轉錄的mRNA。
核酶DNA序列與啟動子的連接可以是直接的，并且僅僅需要使用單個 載體。然而，優選間接連接，其可增強啟動子的作用。通常這樣的間接連接 將需要兩個或更多載體。因此，本發明包括包含至少兩個DNA載體的載體 系統，其中第一個載體包含對人類細胞有效的第一啟動子，第一啟動子有效 連接于可表達產生能作用于第二啟動子的激活蛋白的基因，和第二個載體包 含有效連接于上述靶向切割錘頭結構核酶DNA序列的第二啟動子。核酶 DNA序列可包含在兩個或更多位點切割HBVRNA的復合序列。本文使用 的術語"載體系統"是包含單個載體或者試劑盒或者組合物或者兩個或更多 載體的通用術語。
此外，本發明包括核酶DNA，其本身和包含在載體內的核酶DNA序 列，該核酶DNA進一步包含，靶向切割核酶序列的下游，3'自催化的錘頭 結構核酶DNA序列，因此當核酶DNA轉錄為RNA時它表現為雙錘頭結 構，具有靶向HBVRNA的靶向切割核酶的第一和第二莖及3'自催化核酶的 第一和第二莖，及常規的連接這兩個錘頭的第三莖。第三莖優選在接近 HBV核酶序列3'端有至少4個堿基，并能與接近自催化核酶序列3'端的至少 4個堿基的互補序列堿基配對，以至于當堿基配對時形成所述的常規莖連接 靶向切割核酶和3'自催化核酶的錘頭。
本文使用的動詞"包含(comprise)"，無論以任何語法形式出現，意指 由…組成(consist of)或包括(include)。
附圖簡述


圖1描述本發明MAZI核酶的靶向切割核酶序列。 圖2描述本發明SGIII核酶的靶向切割核酶序列。 圖3描述本發明DGII核酶的靶向切割核酶序列。
圖4顯示在切割位點附近連接子HBV RNA的MAZI核酶。 圖5顯示在切割位點附近連接了 HBV RNA的SGIII核酶。 圖6顯示在切割位點附近連接了 HBVRNA的DGII核酶。 圖7表明以反式/順式雙核酶與自催化核酶結合的MAZI核酶。 圖8表明以反式/順式雙核酶與自催化核酶結合的SGIII核酶。 圖9表明以反式/順式雙核酶與自催化核酶結合的DGII核酶。 圖10、 11和12是含溴化乙錠瓊脂糖凝膠的照片，包含人類HBVRNA 及與MAZI、 SGin和DGII核酶孵育，MAZI、 SGIII和DGII核酶分別相應 于本發明載體系統提供的核酶DNA序列；這些照片表明在孵育4小時后 HBV RNA如何已經被切割。
圖13是顯示本發明3-質粒載體系統的示意圖，第一個質粒包含驅動從 T7聚合酶基因轉錄mRNA的CMV啟動子，第二個質粒包含驅動從T7聚合 酶基因轉錄mRNAT7的啟動子，第三個質粒包含驅動從核酶DNA盒轉錄 RNA的T7啟動子，其中核酶DNA盒在三個不同位點靶向HBVRNA。
圖14是慢病毒載體包裝和被膜構建體示意圖。 pCMVAR8.91(http:〃www.medecine.unige.ch/~salmon/main/R891 .gif)及pCMV-VSV-G (www.brc.riken.jp/lab/cfm/map/pCMV-VSV-G%20map.pdf)。
圖15是慢病毒載體基因轉移構建體pHRcRT7HBVRz示意圖，其包含 HBV核酶MAZI、 DGII和SGIII的表達系統。與紅色熒光蛋白融合的T7 RNA聚合酶在CMV啟動子調控下表達，并且從它們的各自的DNA盒克隆 下游轉錄MAZ、 DG和SG核酶。這些載體用于結合包裝質粒以生成Lenti-HBVRz病毒。
圖16是HBV靶序列表達構建體的示意圖。pHBVl是包含HBV基因組 1-1579 (Accession no.Y07587)片段的哺乳動物表達載體。該載體存在MAZI Rz的切割位點。pHBV2也是包含HBV片段1500-3182(Accession no.Y07587) 的哺乳動物表達載體。該載體存在核酶DGII和SGIII的切割位點。
圖17是用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠染色的照片，顯示利用慢病毒遞 送MAZI、 SGIII和DGII后HBV靶序列的切割。
優選實施方案描述
本發明的核酶可以是錘頭型。核酶具有能在目標耙位點切割RNA的催 化序列。錘頭型核酶的催化序列通常是這種形式(5'到3') (1) cuganga...和 (2)...gaa，其中n指任何核苷酸。在本發明中n優選u。它們通過穩定結構分 隔，穩定結構優選莖環。本發明的核酶DNA可以具有這種形式(以胸腺嘧 啶取代尿嘧啶)。
對于本發明的目的，HBVRNA中最優選的耙序列是 MAZI:5， ggcuc謹cguccc3， (SEQIDNO:l)
SGIII: 5， cc腦gc翻guaucg 3 ， (SEQ. ID NO: 2)
DGII: 5， gaggacucuugga 3， (SEQIDNO:3)
下劃線部分是對于本發明的錘頭型核酶所需的三個堿基的必要序列。 催化序列的即時上游和下游是靶向結合(即靶識別)序列。靶是 RNA，并且也是一種RNA的核酶與靶RNA互補，(不考慮存在于靶中的 額外的c核苷酸，見下文所解釋的)。
涉及優選耙和結合到靶上的核酶的序列概括如下
MAZI
(a) 5' ggcucu c* ucguccc 3'(革巴RNA)
(b) 3 ccgaga-cat.seq.畫s丄-cat seq.畫agcaggg 5 (rzRNA)
(c) 5' ggctct -cat.seq,s丄-cat seq.誦tcgtccc 3' (rz DNA;豐連"
(d) 3' ccgaga -cat.seq.匿s.l-cat seq.畫agcaggg 5' (rz DNA; f連2)
<formula>formula see original document page 11</formula>
uguaucg 3，(耙RNA)
(b) 3'
(c) 5，
ggagucga-cat.seq.-s.l.-cat.seq -acauagc cctcagct-cat. seq. -s. 1 -cat. seq. -tgtatcg ggagtcga-cat seq. -s. 1. -cat. seq. -acatagc
5' (rz RNA) 3'(rzDNA;鏈1) 5'(rzDNA;鏈2)
DGII
(a) 5,
gaggacu
uugga
(革巴RNA)
(b) 3'
(c) 5，
(d) 3,
cuccuga-cat.seq.-s丄-cat.seq.-aaccu gaggct-catseq.-s丄畫cat，seq.-ttgga ctcctga-cat.seq.-s丄-cat.seq.-aacct
(rz RNA) (rzDNA;鏈1) (rzDNA;鏈2)
(* =切割的核苷酸,cat.seq.=催化位點；s丄=莖環)
對于耙向HBV RNA的核酶MAZI， 5'gaggacu3'是第一個耙識別序列而 5'ucguccc3'是第二個靶識別序列。在該靶序列中的切割位點是cuc、加星號 的c核苷酸是切割位點并且在核酶中沒有配對物。MAZI核酶的序列(a)和(b) 顯示于附圖的圖l中。
對于革E向HBV RNA的核酶SGIII， 5'ccucagcu3'是第一個革E識別序列而 5'uguaucg3'是第二個靶識別序列。在該耙序列中的切割位點是cuc、加星號
的c核苷酸是切割位點并且在核酶中沒有配對物。SGIII核酶的序列(a)和(b) 顯示于附圖的圖2中。
對于靶向HBV RNA的核酶DGII， 5'gaggacu3'是第一個靶識別序列而 5'uugga3'是第二個靶識別序列。在該靶序列中的切割位點仍是cuc^。用于本 發明的核酶的優選亞屬具有這些耙識別序列。DGII核酶的序列(a)和(b)顯示 于附圖的圖3中。
在下文的描述中，錘頭結構核酶的結構以RNA形式被討論，但是應當 理解被它們用作模板轉錄的核酶DNA與之對應，其中胸腺嘧啶取代了尿嘧 啶。本文顯示的這些核酶構象也可理解為是那些明顯來自堿基配對及其他能 量考量的，然而本發明不局限于這些附圖，即本發明包括同樣分子的其他構 象。
錘頭結構核酶通過兩個莖環來維持，第一個莖環("莖I")在第一個 靶識別序列前，第二個莖環("莖II")位于第一個和第二個靶識別序列之 間。這兩個莖環可具有任何所需的形式，但通常包括3到5個形成的莖的互 補堿基對和環中的4或5個堿基。
接著的第二個催化序列是第三個莖，其由第二個靶識別序列組成或包含 第二個耙識別序列。在本發明的一個實施方案中，如果所述莖in不是天然 存在，則在MAZI和SGIII的3'端莖III可以部分或全部地增加guc特異序 列。其中，在這里，對于SGIII， g是天然末端，uc作為突出端添加，而對 于MAZI guc作為突出端添加，因此其最后的幾個堿基與第二個催化序列的 堿基配對。對于DGII， c是作為突出端添加的。圖4顯示MAZI結合到它的 耙位點，圖5顯示SGIII附著于它的靶區域以及圖6顯示DGII結合到它的靶 位點。這些圖表通過a-u和g-c堿基配對完成。
更優選，核酶包含3'自催化序列。這樣的序列本身是已知的，尤其可來 自PCT專利申請出版物N° WO 97/17433 (Medical University of South CaroUna)。 3'自催化序列優選如下設計，接近靶向切割核酶的3'端序列與自 催化序列的下游部分在或接近于其3'端堿基配對。這些優選的構建體在莖 ni中至少有4個堿基對。它們也可有多至IO個這樣的堿基對。通常，延伸
于莖III外的非堿基配對的突出端僅僅是靶切割核酶序列3'端的l或2個和 自催化序列3'端的0到5個。這樣的構建體在圖7的MAZI、在圖8的SGI11 及在圖9的DGII舉例說明。這里的3'自催化(=自切割)序列是錘頭結構核 酶形式，其包含3'切割位點(對于MAZI和SGin是guc，對于DGII是 cue)，第一個莖環("scrz莖I")，第二個莖環("scrz莖II")和第三個 莖("scrz莖III")，第三個莖與靶向切割核酶的莖III堿基配對。切割發生 在3'切割位點guc的c后。在scrz莖I和scas莖II之間的催化序列
(cugauga)幫助穩定錘頭結構并且也用于WO 97/17433。莖II和III之間提 供gaa催化位點。
用于本發明的核酶可包含5'自催化序列，例如如WO 97/17433中描述 的。WO 97/17433提供一種雙重核酶，其包含位于中心的BglII克隆位點 agatct，該克隆位點可插入任何需要的靶識別和催化序列。在WO 97/17433 中，該插入片斷為42個堿基。其包括第一個靶識別序列(8個堿基)，催化 和結構穩定序列(23個堿基)和第二個靶識別序列(ll個堿基，其最后兩 個是BglII位點的ag)。略作修改，相同的構建體可適合于本發明，例如用 與圖1中13-48位36個堿基等效的DNA取代WO 97/17433的23個堿基， 在其3'端增加為克隆入BglIl位點所需的核苷酸。在該構建體中，可除去莖I 并由WO 97/17433中包含5'自催化位點的5'序列取代莖I。然而，WO 97/17433中催化位點間的序列部分不是緊密的莖環形式因此呈現出較低的結 構穩定性。
聚合酶載體的工程
關于圖13，聚合酶載體pCS2P包含來自巨細胞病毒(CMV)的啟動子和 T7聚合酶基因。完整的T7聚合酶DNA序列可以從Genbank/EMBL獲得， 登錄號為AccessionNo.M.38308。在該實例中，修飾的T7聚合酶DNA通過 在質粒pT7Autol[J,Dubendorff和F. Studier， J. Mol. Biol. 219, 61-68 (1991)]上 利用PCR獲得并放大。用于PCR的引物在正向引物的5'端引入EcoRI和
Ncol限制酶切位點；在反向引物的5'端引入BamHI。
(BamHI以后用于自 主聚合酶載體的克隆。)如下是引物序列，下劃線表示重疊的T7聚合酶。
正向
5' acgaattccatggacacgattaacatcg 3' EcoRI位點=gaattc; Ncol位點=ccatgg
反向
5' atataaggatccttacgcgaacgcgaac 3' BamHI位點=ggatcc
利用Vent聚合酶(該聚合酶在PCR產物中形成"平端")實施該 PCR。通過正向引物引入的NcoI位點是額外的克隆位點，其通過改變T7聚 合酶的第二個密碼子形成，將其DNA從天冬酰胺Asn(aac)改為天冬氨酸 Asp(gac)。這沒有改變T7聚合酶的活性。
將T7聚合酶的PCR產物克隆入pCS2-NLS質粒(R.A.W. Rupp等人， Genes and Development 8， 1311-1323 (1994)和D丄.Turner & H. Weintraub ibid. 1434-1447)。在pCS2-NLS中的EcoRI位點和SnaBl (平端)位點引入T7 聚合酶DNA， T7聚合酶DNA位于NLS順時針方向稍后位置。pCS2中的 NLS序列在此階段對于現目的不是必需的，并且由于NLS序列位于兩個 Ncol位點之間其可通過限制性內切酶Ncol切割而除去。然后通過Ncol位點 再連接該質粒。從而如圖13所示的聚合酶質粒載體(pCS2P)完成了。它包含 可開啟產生T7聚合酶的CMV啟動子(已存在于pCS2載體中)。核酶DNA 載體和自身聚合酶載體都需要T7聚合酶，詳見下文。
自身聚合酶(autopolymerase)載體的工程
該載體的用途是提供穩定并且充足的T7聚合酶供給。T7啟動子用來開 啟T7聚合酶的產生。該聚合酶進行自主催化產生更多的T7啟動子，T7啟 動子可產生更多T7聚合酶(圖13)。
利用轉染載體通過非哺乳動物啟動子產生的mRNAs在哺乳動物細胞細 胞質中通常不能被識別而不能通過細胞翻譯成蛋白質。為了誘使細胞翻譯由 啟動子轉錄的T7聚合酶mRNA，增加了腦心肌炎(EMC)病毒UTR (非翻譯 區)序列(Moss等人，Nature 348, 91-92 (1990))。該序列充當翻譯增強 子，為核糖體提供結合位點，該序列通過從pTMl載體PCR擴增EMCUTR 而獲得；參見B.Moss等人，Nature 348, 91-92 (1990)。所使用的引物在正相 鏈中包含XbaI限制酶切位點。反向引物不引入限制酶切位點，因為從該載 體中獲得的EMC序列包含幾個工程化的限制酶切位點，諸如BamHI和 Ncol。如下是引物序列，下劃線表示重疊的EMC序列
正向
5' gctctagaccacaacggtttccctctag 3' Xbal《立點尸tctaga,
反向
5， cagcttcctttcgggctttgttagcagc 3'
然后利用Xbal和BamHI位點將EMC序列克隆入pETl la (Novagen Ltd.)。圖譜參見例如R&D Systems Ltd.的1996/97目錄，Abingdon, Oxfordshire, England.第74頁。EMC UTR序列其3'端在BamHI位點前天然 包含Ncol限制酶切位點。因此，如上第6節所述的包含Ncol和BamHI位 點的T7聚合酶序列容易克隆入質粒EMC UTR序列的下游，如X.Chen等 人，Nucleic Acids Research 22, 2114-2120 (1994)描述的。參見例如圖13的質 粒pZEQ。
關于圖13，該核酶載體包含編碼MAZI、 DGII和SGIII的核酶DNA。 一直以來都希望可在HBV的侵染、增殖和復制周期的一個以上點攻擊 HBV。因此相同的載體可包含一個或多個其他種類的核酶DNA，這些核酶 DNA將靶向對HBV增殖或復制重要的由HBV產生或者形成新HBV基因組 所需的其他RNA。因此，圖13說明包含MAZI、 DGII和SGIII三種核酶 DNA的載體。
為了 "誘使起始"啟動子，希望提供不同來源的聚合酶是可取的，為了 該目的可以是酶本身，也可以是更優選的另外載體形式，也可以優選質粒。 參見圖13的質粒pCS2P。
關于圖13， pCS2P包含驅動T7聚合酶基因轉錄的CMV啟動子，第二 個質粒pZEQ包含用于產生T7聚合酶的T7自身基因系統，和第三個質粒， 其中由前兩個質粒產生的聚合酶激活的T7啟動子驅動被引入到核酶載體中 的HBV核酶的轉錄，如圖13中顯示。可利用其他的翻譯增強子代替圖13 中顯示的那些。
在一些實施方案中，優選慢病毒載體。由HIV獲得的慢病毒載體在體 外和體內基因轉移中是長期穩定的。這些載體因為可傳遞大的轉基因(高達 l汰b)并且有能力穩定轉導分裂細胞和非分裂細胞而有吸引力。這樣的系統 通常利用無腸HIV基因組以阻止復制，并且除去可導致侵染和毒性的病毒 基因。為了進一步增加該系統的安全性并減少有復制能力的反轉錄病毒產生 的可能性，通常通過在體外共轉染3個質粒進入細胞系而裝配慢病毒基因轉 移載體；包裝構建體，包膜構建體和基因轉移構建體。這樣的載體也可自我 失活。參見Zuffrey等人，J Virology 72, 9873-9880 (1998)。為了擴大該載體 的向性并改善其生化性質，這樣的載體往往來自水泡性口膜炎病毒(VSV-G)，且是具有包膜蛋白的假型。在當前的實施方案中，圖14顯示包裝構建 體，圖15顯示VSV-G包膜構建體，以及圖16顯示包含核酶MAZI、 SGIII 和DGII的基因轉移構建體。
所使用的遞送方法包括給藥載體的膠囊化，特別是；經逆轉錄病毒(包 括慢病毒)載體轉導和與膽固醇接合的脂質體。
給藥載體對系統和局部給藥都是有效的。它們可設計成為緩釋容器，或 者直接遞送其內容物到靶細胞。這樣專門的給藥載體的實例為脂質體、水凝 膠、環糊精、生物可降解的納米微囊及生物粘附微球。
優選脂質體。它們是由類似細胞膜脂質方式排列的脂質組成的空心球形 囊泡。它們具有截留水溶性成分的內部含水空間，其直徑大小范圍從0.05到
幾個微米。脂質體可遞送DNA到細胞，因此該核酸保持生物學活性。
它們可通過混合DNA與脂質體形式的脂質諸如二烷基的或者甘油二酯 或者磷脂酰膽堿而容易制備。如本領域已知的脂質體生成，參見J.J.Rossi 等人，AIDS Research and Human Retroviruses 8, 183-189 (1992)。
對本發明有用的脂質體制劑包括(a)包含聚陽離子脂質摩爾比率的 lipofectamine試齊U(GIBCO BRL, Ga他ersburg, MD USA), (b)陽離子脂質， DDAB和DOPE,比率為2:1 ， R. Philip， Mol. Cell. Biol. 14, 2411-2418， (1994);和(c)DMRIE，選擇性地與DOPE結合，例如以1:1的摩爾比率 (VICAL Corp. San Diego, CA， USA)。也可使用新型脂質體，例如血清抗性陽 離子脂質GS 2888, J. G. Lewis等人，Proc. Natl, Acad. Sci. USA 93, 3176 (1996)及包含聚賴氨酸/DNA復合物的脂質體，S. Li和L. Huang， J. Liposome Research 7， 63-75 (1997)。
已經發展納米顆粒和水凝膠傳遞體用于化療劑和基于蛋白質的藥物，并 且必然可適合于本發明目的的核酶遞送。
另一個遞送方法是通過T細胞。適合的T細胞，優選患者自己的T細胞 感染本發明核酶DNA，例如經電穿孔然后灌輸這些細胞到患者。帶有DNA 的T淋巴細胞的電穿孔描述于PCT出版物WO 96/22638的實施例6中(Gene Shears Pty Ltd.)并且該方法可應用到本發明。
藥物用途的組合物通常包含鎂鹽，優選氯化鎂緩沖液，這是核酶功能所 需要的。它們也可包含含有助懸劑或者乳化劑的載體或者稀釋劑。
本發明的載體系統，優選慢病毒載體系統，優選全身施用，例如經靜脈 注射、皮下注射、腹腔內、鼻內或者鞘內途徑。由載體系統提供的核酶劑量
取決于疾病指征和給藥途徑但是應該達到200 mg/kg，并且通常每天最低以 重量計為10mg/kg。劑量學將取決于臨床試驗的有效數據。
以下實例舉例說明本發明。本文使用的所有DNA寡核苷酸可通過標準 的合成法制備，例如利用磷酸三酯法的固相合成。
MAZI核酶DNA盒
構建具有核苷酸序列如SEQIDNO : 4所示的完整的核酶DNA盒
aaggtaccta atacgactca ctatagggcg
aaagcccggg acgactgatg agcgcgaaag
cgcga犯g昭 ccgtcgtgca cgcga,cg
tgcacctgat gaggccggaa ￡iggccg￡i￡i￡ic
ggctctttgg atcctctaga tt (143)
它由編碼序列1到80位的正向寡聚物和143到58位的反向寡聚物利用 寡核苷酸合成儀合成。該寡聚物3'端的26個堿基彼此完全互補并退火這兩 條鏈。在PCR儀上利用DNA聚合酶延伸它們使其成為完整的雙鏈。利用分 別針對5'端和3'端的Kpnl和Xbal位點將長143的雙鏈DNA盒克隆入 pUC19。通過DNA測序確認序列。該盒包含T7啟動子，市場上可買到的 pUC19不包含該位點。
5， aaaggtacc taatacgactcactata gggcgaaagccc gggacga KpnI/ T7啟動子 穩定萃 M4ZI莖I
ctgatgagcgcgaaagcgc gaa agagcc gtc
,眾舒賴鍵 差// C加Z^m
gtgcacgcgaaagcgtgcac ctgatga ggccggaaaggcc gaa
拔朦游莖/ C"f. Z)， 著// Sc. ￡>。w
acggctcttt ggatcc tctaga tt 3,
從5'端起始，最初的9個堿基組成Kpnl限制酶切位點，其后有17個堿 基形成隨后的T7啟動子序列，12個堿基折疊成維持穩定的莖環結構，后面 是互補于1493-1486的7個堿基的靶特異區，形成莖I。催化結構域 ctgatga……gaa居間莖II序列形成夾心形式。莖III結構由隨后的反向互補于 HBV序列1485-1480的5個堿基組成。最后的3個堿基提供3'順式作用核酶 的NUX位點并且是突出端。隨后20個堿基形成順式作用核酶的莖I，后面 是莖II位于中間的催化結構域堿基。最后是莖m。最后的14個堿基組成 Bamffl和Xbal酶的兩個限制酶切位點。圖1顯示反式作用MAZI核酶和圖 7顯示順式和反式作用MAZI核酶的結構。
通過在"Ribomax"溶液中加入T7聚合酶來生產核酶RNA，如 Promega "Protocols and Applications Guide"手冊中描述的。"Ribomax"是一 種包含核酶活性必需的鎂離子的平衡鹽溶液。T7聚合酶引發T7啟動子從 DNA轉錄RNA。通過利用無RNase的DNase，繼之RNA的酸/苯酚分離， 然后乙醇沉淀來分離轉錄物。按照上述引用的"Molecular Cloning-A Laboratory Manual"中的描述進行。
當在瓊脂糖凝膠上電泳RNA時，切割前的核酶(103個堿基，圖7)明 顯與切割后的核酶分離(50個堿基，圖l)。
MAZI耙向切割 HBV基因組DNA克隆入pcDNA3 ，其被用于生產HBV的RNA轉錄物 (上述引用的"Molecular Cloning-A Laboratory Manual")。
從上述第2節描述的質粒轉錄的核酶與HBV RNA轉錄物以1摩爾核酶 對1摩爾HBVRNA轉錄物的摩爾比率孵育。在37T:孵育4小時，使得 HBVRNA靶的完全切割。在含溴化乙錠的1。/。瓊脂糖凝膠上電泳RNA。圖 IO顯示紫外線照射下的凝膠照片。泳道1為分子量標準參照物，泳道2為與 24mM MgC12在37'C孵育4小時的HBV轉錄物，泳道3為和等摩爾MAZI 核酶轉錄物與24mM MgC12在37'C孵育4小時的HBV轉錄物。可以清楚地 看到MAZI核酶切割了 HBVRNA。關于圖10，右惻的泳道顯示產物孵育4 小時后已完全切割靶RNA。圖lO中代表未切割的mRNA的條帶已經消失并 且在低分子量處已經被對應的已切割產物3'端的條帶替代。包含HBVRNA 5'端的片段在比圖IO中更低分子量處可見。未見含有MAZI核酶地條帶。這 是因為核酶分子尺寸小。
SGIII核酶DNA盒
構建具有核苷酸序列如SEQ ID NO : 5所示的完整的核酶DNA盒
aattcgagct ctaatacgac tcactatagg
gcgaaagccc gatacactga tgagcgcgaa
agcgcgaaag ctgaggtcca cgtagaaata
cgtgctgatg aggacgaaag tccgaaacct
cagctttgaa ttcgataa (137)
它由編碼序列1到80位的正向寡聚物和137到58位的反向寡聚物利用 寡核苷酸合成儀合成。該寡聚物3'端的22個堿基彼此完全互補并退火這兩 條鏈。在PCR儀上利用DNA聚合酶延伸它們使其成為完整的雙鏈。利用分 別針對5'端和3'端的Sacl和EcoRI位點將長137的雙鏈DNA盒克隆入 pUC19。通過DNA測序確認該序列。該盒包含T7啟動子，市場上可買到的 pUC19不包含該位點。
5' aattcgagctc taatacgactcactata gggcgaaagccc gataca
ctgatga gcgcgaaagcgc gaa agctgagg tc
Gw. Do附 f//C^f.Z)ow SG///^7//
cacgtagaaatacgtgctgatga ggacgaaagtcc gaa Sc荃/ 6"c Ca/. Z)應 5"c.吝// Co/,
acctc3gcttt gaattcg3加3 ，
從5'端起始，最初的9個堿基組成SacI限制酶切位點，其后17個堿基 形成T7啟動子序列，12個堿基折疊成維持穩定的莖環結構，后面是互補于 2017-2012的5個堿基的耙特異區，形成莖I。催化結構域以夾層形式插入莖 II序列。莖III結構由隨后的反向互補于HBV序列2010-2002的8個堿基組 成。最后的2個堿基形成3'順式作用核酶的NUX位點并且是突出端。隨后 16個堿基形成順式作用核酶的莖I，后面是莖II在中間地催化結構域堿基。 最后是莖m。最后的ll個堿基組成EcoRI酶的兩個限制酶切位點。
通過在"Ribomax"溶液中增加T7聚合酶來生產核酶RNA，如 Promega "Protocols and Applications Guide"手冊中描述的。"Ribomax"是一 種包含核酶活性必需的鎂離子的平衡鹽溶液。T7聚合酶引發T7啟動子從
DNA轉錄RNA。通過利用無RNase的DNase，繼之RNA的酸/苯酚分離， 然后乙醇沉淀來分離轉錄物。如上述引用的"MolecularCloning-A Laboratory Manual"中的描述進行。在瓊脂糖凝膠上電泳RNA，切割前的核 酶(102個堿基，圖8)明顯與切割后的核酶分離(51分堿基，圖2)。通 過含溴化乙錠的凝膠顯示RNA (在紫外線燈下顯像)。
SGIII耙向切割
HBV基因組DNA克隆入pcDNA3，其被用于生產HBV的RNA轉錄物 (上述引用的"Molecular Cloning-A Laboratory Manual")。
從上述第2節描述的質粒轉錄得到的核酶與HBV RNA轉錄物以1摩爾 核酶對1摩爾HBVRNA轉錄物的摩爾比率孵育。在37t:孵育4小時，使得 HBVRNA耙的完全切割。在含溴化乙錠的1。/。瓊脂糖凝膠上電泳RNA。圖 ll顯示紫外線照射下的凝膠照片。泳道l為分子量標準參照物，泳道2為與 等摩爾SGIII核酶轉錄物和24mM MgC12在37。C孵育4小時后的HBV轉錄 物，泳道3為與24mMMgC12在37。C孵育4小時后的HBV轉錄物。清楚地 看到SGIII核酶切割了 HBV RNA。關于圖11，右側的泳道顯示產物孵育4 小時后已完全切割靶RNA。圖11中代表未切割的mRNA的條帶已經消失并 且在低分子量處己經被對應于切割產物5'端的條帶替代。包含HBV RNA 3' 端的片段在比在圖ll更低分子量處可見。未見包含SGIII核酶的條帶。這是 因為核酶分子的尺寸小。
DGII核酶DNA盒
構建具有核苷酸序列如SEQIDNO : 6所示的完整的核酶DNA盒
tatctagagg tacctaatac gactcactat
aaagcccggg ccctcc肌ct gatgsgcgcg
肌agcgcgaa atcctctcca atcctctcca
aggatcgaaa gatccgaaa gaggactgg
agctcgaatt c 131
它由編碼序列1到80位的正向寡聚物和131到51位的反向寡聚物利用 寡核苷酸合成儀合成。該寡聚物3'端的19個堿基彼此完全互補并退火這兩 條鏈。在PCR儀上利用DNA聚合酶延伸它們使其成為完整的雙鏈。利用分 別針對5'端和3'端的Kpnl和Sacl位點將長131的雙鏈DNA盒克隆入 pUC19。通過DNA測序確認序列。該盒包含T7啟動子，市場上可買到的 pUC19不包含該位點。
5' TATACTAGAGGTACC TAATACGACTCACTATA GGGCGAAAGCCC 一/ T7y0動f 穩定翠
UCCAA CUGAUGA GCGCGAAAGCGC GAA AGUCCUCU
Cat.Dom結合位點 莖II CatDom莖III
C CACGUAGAAAUACGUG CUGAUGA
突忠端 5"c莖/ 6bC"fZ)麵
GGAUCGAAAGAUCCGAA AGAGGACUG GAGCTCGAATTC 3'
從5'端起始，最初的15個堿基包含Kpnl限制酶切位點，其后有17個 堿基形成T7啟動子序列，12個堿基折疊成維持穩定的莖環結構，接著是互
補于1672-1667的5個堿基的靶特異區，形成莖I。催化結構域以夾層形式 插入莖II序列。莖m結構由隨后的反向互補于HBV序列1665-1658的8個 堿基組成。最后的堿基形成3'順式作用核酶的NUX位點并且是突出端。隨 后16個堿基形成順式作用核酶的莖I，后面是莖II位于中間的催化結構域。 隨后是莖III并且最后是Sacl和EcoRI的限制酶切位點。
通過在"Ribomax"溶液中增加T7聚合酶來生產核酶RNA，如 Promega "Protocols and Applications Guide"手冊中描述的。"Ribomax"是一 種包含核酶活性必需的鎂離子的平衡鹽溶液。T7聚合酶引發T7啟動子從 DNA轉錄RNA。通過利用無RNase的DNase，繼之RNA的酸/苯酚分離， 然后乙醇沉淀來分離轉錄物。如上述引用的"Molecular Cloning - A Laboratory Manual"中的描述進行。
在瓊脂糖凝膠上電泳RNA，切割前的核酶(103個堿基)明顯與切割后 的核酶(48個堿基，圖3)分離。通過含溴化乙錠的凝膠顯示RNA (在紫 外線燈下顯像)。
DGII耙向切割
HBV基因組DNA克隆入pcDNA3 ，其被用于pcDNA3生產HBV的 脂A轉錄物(上述引用的"Molecular Cloning-A Laboratory Manual")。
從上述第2節描述的質粒轉錄得到的核酶與HBV RNA轉錄物以1摩爾 核酶對1摩爾HBVRNA轉錄物的摩爾比率孵育。在37t:孵育4小時，使得 HBVRNA耙完全切割。在含溴化乙錠的1。/。瓊脂糖凝膠上電泳RNA。圖12 顯示紫外線照射下的凝膠照片。泳道l為分子量標準參照物。泳道2為 3.2kb的HBV轉錄物。泳道3為與等摩爾的DGII核酶孵育4小時后的HBV 轉錄物。由于與DGII孵育，如泳道3所表明的3.2kb的HBV轉錄物已經被 切割為2 1.6kb的切割產物，因此顯然DGII核酶切割了 HBV RNA。未見 包含DGII核酶的條帶。這是因為核酶分子的尺寸小。
MAZI、 SGIII和DGII的慢病毒遞送
根據標準方法，利用如圖14、 15和16所示的包裝和包膜構建體裝配核
酶MAZI、 SGIII和DGII的慢病毒遞送系統。
為了提供用于證明慢病毒遞送MAZI、 SGIII和DGII核酶切割HBV基 因組的模型，構建體外系統，在該體外系統中培養細胞表達RNA，該RNA 來自表達部分HBV基因組的DNA質粒。為了切割HBV基因組，這些轉染 的細胞隨后經表達MAZI、 SGIII和DGII核酶的慢病毒轉導。
圖16顯示分別表達HBV基因組l-1579和1500-3182序列的質粒 pHBVl和pHBV2。利用pHBVl和HBV2載體轉染H293T細胞(5.0 E5) (Superfect,QIAGENUK)， 72小時后重復該轉染。24小時后再轉染，利用 Lenti-HBVRZ病毒(MOI:100)轉導細胞(1.0x106)。轉導48小時后，收集細 胞用于RNA和DNA。
設計PCR引物使得PCR產物包含MAZI、 SGIII和DGII切割位點。根 據HBV序列HBVAYGEN登錄號Accession No:Y07587設計這些引物，如下 顯示這些引物和由這些引物對在HBV模板上產生的PCR產物的長度。
MAZI弓(物
1 GGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGT
1,414: GCGCG GGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGT CGGCG
2 /Rev GACCACGGGGCGCACCTCTCTTTA
1,517: CGACC GACCACGGGGCGCACCTCTCTTTA CGCGG PCR產物長度- 127
DGII引物
1 CACGTCGCATGGAGACCACCGT
1，602: CTCTG CACGTCGCATGGAGACCACCGT GAACG 2 /Rev CTGCAATGTCAACGACCGACCTTG
1，677:ACTCT CTGCAATGTCAACGACCGACCTTG AGGCA PCR產物長度- 99
SGIII引物
1 ACGTGATCTTCTAGATACCGCCTC
1,983: TCAGT ACGTGATCTTCTAGATACCGCCTC AGCTC
2 /Rev AGCTACCTGGGTGGGTGGTAATTT
2，106:ACTCT AGCTACCTGGGTGGGTGGTAATTT GGAAG PCR產物長度二147
總之，引物對如下
MAZI引物
1 GGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGT
2 TAAAGAGAGGTGCGCCCCGTGGTC
DGII引物
1 cacgtcgcatggagaccaccgt
2 caaggtcggtcgttgacattgcag
sgiii引物
1 acgtgatcttctagataccgcctc
2 aaattaccacccacccaggtagct
利用上述弓I物分別通過PCR和RTPCR分析來自有和沒有經Lenti-HBVRZ轉導的表達HBV靶序列(來自pHBVl和pHBV2)的H293T細胞
中的DNA和RNA。圖17是顯示這些PCR產物的瓊脂糖凝膠照片。泳道1 到4顯示轉染pHBVl的對照細胞，MAZI耙序列存在于DNA和RNA中
(泳道1和2)。其中經Lenti-HBVRZ轉導，DNA仍存在，但是因為已經 被MAZI切割由該質粒翻譯的RNA減少很多(泳道3和4)。泳道5到8顯 示轉染pHBV2的對照細胞，DGII耙序列存在于DNA和RNA中(泳道5和 6)。其中經Lenti-HBVRZ轉導，DNA仍存在，但是因為已經被DGII切割 由該質粒翻譯的RNA己不存在(泳道7和8)。泳道9到12顯示轉染 pHBV2的對照細胞，DGII耙序列存在于DNA和RNA中(泳道9和10)。 其中經Lenti-HBVRZ轉導，DNA仍存在，但是因為已經被DGII切割由該 質粒翻譯的RNA己不存在(泳道11和12)。
這些結果顯而易見的證明當通過慢病毒載體遞送時，細胞中的核酶 MAZI、 SGIII和DGII有切割耙HBV RNA的活性。
HBV序歹lJ(登記入冊號Y07587.1 GI:1514493)
1犯ctccacaa ccttccacca aactctgcaa gatcccagag tg昭aggcct gtatttccct 61 gctggtggct ccagttcagg aacagtaaac cctgttccga ctactgtctc tcccatatcg
1321 acattctcgg gacggataac tctgttgttc tctcccgcaa atatacatcg tttccatggc 1381 tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg
切割位點
1441 <formula>formula see original document page 28</formula>1501 <formula>formula see original document page 28</formula>切割位點
1621 cgtgaacgcc caccaattct tgcccaaggt cttacataa gaggactcttgga ctctctgc
核酶DGII
1681 aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgttcaaag actgggagga 1741 gttgggggag gagattaggt taaaggtctt tgtattagga ggctgtaggc ataaattggt 1801 ctgcgcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatcttttg ttcatgtcct 1861 actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat tgatccttat 1921 aaagaatttg gagctactgt ggagttactc tcttttttgc cttctgactt ctttccttca
切割位點
1981 gtacgtgatc ttctagatac eg cctcagctctgtatcgg gaagccttaga gtctcctgag
核酶SGin
2041 cattgttcac ctcaccatac tgctctcagg caagcaattc tgtgctgggg ggaactaatg 2101 actctagcta cctgggtggg tggtaatttg gaagatccaa tatccaggga cctagtagtc 2161 agttatgtca acactaatat gggcctaaag ttccggcaac tattgtggtt tcacatttct 2221 tgtctcactt ttggaagaga aacagttata gaatatttgg tgtctttcgg agtgtggatt 2281 cgcactcctc cagcttatag accaccaaat gcccctatct tatcaacact teeggagact 2341 actgttgtta gacgacgagg caggtcccct aga卿ag犯ctccctcgcc tegcagaega
3061 agggcattct acaaaccttg ccagcaaatc cgcctcctgc ctctaccaat cgccagtcag 3121 gaaggcagcc taccccgctg tctccacctt tgagaaacac tcatcctcag gccatgcagt 3181 gg
圖表l
序列
ggcucucucguccc SEQ ID NO: 1
ccucagcucuguaucg SEQ. ID NO: 2
gagga堅uugga SEQ ID NO: 3
aaggtaccta atacgactca ctatagggcg aaagcccggg acgactgatg agcgcgaaag cgcgaaagag ccgtcgtgca cgcgaaagcg tgcacctgat gaggccggaa aggccgaaac ggctctttgg atcctctaga tt SEQ ID NO: 4
aattcgagct ctaatacgac tcactatagg gcgaaagccc gatacactga
tgagcgcgaa agcgcgaaag ctgaggtcca cgtagaaata cgtgctgatg aggacgaaag tccgaaacct cagctttgaa ttcgataa SEQ ID NO: 5
tatctagagg tacctaatac gactcactat aaagcccggg ccctccaact gatgagcgcg aaagcgcgaa atcctctcca atcctctcca aggatcgaaa gatccgaaa gaggactgg agctcgaatt c SEQ ID NO: 權利要求
1.可轉錄為RNA的核酶DNA，其將在CUC位點切割HBV RNA。
2. 根據權利要求1的核酶DNA，可轉錄為具有催化(切割)序列的 RNA，所述催化(切割)序列的兩部分中間夾有具有GCGCGAAAGCGC序列的居間穩定莖。
3. 根據權利要求1或2的核酶DNA，具有如SEQ ID NO : 4(MAZ1)所示的核苷酸序列。
4. 根據權利要求1或2的核酶DNA，具有如SEQ ID NO : 5(SGIII)所示的核苷酸序列。
5. 根據權利要求1或2的核酶DNA，具有如SEQ ID NO : 6(DGII)所示的核苷酸序列。
6. 根據權利要求1或2的核酶DNA，其可轉錄為結合HBV識別位點的 RNA，所述HBV識別位點具有核苷酸序列GGCUCUCUCGUCCC(MAZ1)。
7. 根據權利要求1或2的核酶DNA，其可轉錄為結合HBV識別位點的 RNA，所述HBV識別位點具有核苷酸序列 CCUCAGCUCUGUAUCG(SGIII)。
8. 根據權利要求1或2的核酶DNA，其可轉錄為結合HBV識別序列的 RNA，所述HBV識別序列具有核苷酸序列GAGGACUCUUGGA(DGII)。
9. 根據前述任一項權利要求的核酶DNA，其轉錄為錘頭結構核酶。
10. 核酶DNA，當其轉錄為RNA時，將對存在于HBVRNA中的靶 RNA序列上的三個位點切割，所述位點包含如下的識別序列(5'到3')GGCTCTCTCGTCCC對于核酶MAZI CCTCAGCTCTGTATCG對于核酶SGIII GAGGACTCTTGGA 對于核酶DGII。
11.載體系統，包含至少一個DNA載體，該載體包含在對人類細胞有效 的啟動子控制下的靶向切割的核酶DNA序列，所述靶向切割的核酶DNA 序列一旦轉錄為RNA將在CUC位點處切割從HBV靶基因組轉錄的RNA。
12. 根據權利要求11的載體系統，包含可切割從HBV耙基因組轉錄的 mRNA的MAZI、 DGII和SGIII核酶中的一個或多個的耙向切割核酶序列。
13. 根據權利要求11或12的載體系統，包含至少兩個DNA載體，其中第一個載體包含對人類細胞有效的第一啟動子，第一啟動子有效連接于可表達產生能作用于第二啟動子的激活蛋白的基因，和第二個載體包含第二啟動子，所述第二啟動子有效連接于MAZIRNA、 DGIIRNA和SGIIIRNA耙向切割核酶DNA序列和耙HBV RNA的耙向切割核酶DNA序列的一個或多 個。
14. 根據權利要求13的載體系統，包含至少三個DNA載體，其中第二 個載體包含MAZI靶向切割核酶DNA和其中第三個載體包含切割轉錄自 HBV耙RNA的mRNA的SGIII耙向切割核酶DNA。
15. 根據權利要求14的載體系統，包含至少四個DNA載體，其中第二 個載體包含MAZI靶向切割核酶DNA，第三個載體包含SGIII靶向切割核酶 DNA和第四個載體包含用于切割由HBV耙RNA轉錄的mRNA的DGII靶 向切割核酶DNA。
16. 根據權利要求15的載體系統，包含至少五個DNA載體，其中第二 個載體包含MAZI靶向切割核酶DNA和其中第三個載體包含SGIII靶向切 割核酶DNA，第四個載體包含DGII靶向切割核酶DNA和第五個載體包含 由HBV耙RNA轉錄的另一核酶切割mRNA的靶向切割核酶DNA。
17. 根據權利要求13到16任一項的載體系統，其中第二啟動子是T7聚 合酶啟動子，和激活蛋白是T7聚合酶。
18. 根據權利要求17的載體系統，其中T7啟動子中的一個或兩個進一 步包含提供內部核糖體進入位點(IRES)的DNA，用于幫助翻譯人類細胞中 T7聚合酶基因。
19. 根據權利要求11到18任一項的載體系統，其中核酶序列是錘頭型核酶。
20. 根據權利要求11到19任一項的載體系統，其中核酶DNA序列進一 步包含在靶向切割核酶序列下游的3'自催化的錘頭結構核酶DNA序列，因此當核酶DNA轉錄為RNA時，它表現為雙錘頭結構，其具有耙向HBV RNA的靶向切割核酶的第一個和第二個莖及3'自催化核酶的第一個和第二 個莖。
21. 根據權利要求20的載體系統，其中第一個和第二個結構穩定莖環分 別位于第一個識別序列的兩側。
22. 根據權利要求21的載體系統，其中第二個識別序列位于第二個結構 穩定莖環的下游。
23. 根據權利要求22的載體系統，其中耙向切割核酶序列順次(5'到 3')包含第一個結構穩定莖環；第一個靶識別序列； —第一個催化序列；第二個結構穩定莖環；第二個催化序列；和第二個耙識別序列。
24. 根據權利要求11到23任一項的載體系統，其中靶向切割核酶DNA 序列，當轉錄為RNA時，將切割存在于HBVRNA中的靶RNA序列，其包 含識別序列(5'到3'):GGCTCTCTCGTCCC 對于核酶MAZICCTCAGCTCTGTATCG 對于核酶SGIII GAGGACTCTTGGA 對于核酶DGII。
25. 包含根據權利要求11到24任一項載體系統的慢病毒。
26. 藥學上可接受的載體，其包含根據權利要求1到IO任一項的核酶 DNA，定義為權利要求11到24任一項的載體系統或根據權利要求25的慢 病毒。
27. 根據權利要求26的載體，其以脂質體形式存在。
28. 藥物組合物，其包含根據權利要求27的載體和稀釋劑。
29. 根據權利要求1到10任一項的核酶DNA，根據權利要求11到24任 一項的載體系統或根據權利要求25的慢病毒，用于制備治療與HBV感染相 關的疾病的制劑。
30. 根據權利要求1到10任一項的核酶DNA，根據權利要求11到24任 一項的載體系統或根據權利要求25的慢病毒，用于制備治療與HBV感染相 關的疾病的藥物。
31. 根據權利要求1到IO任一項核酶DNA、根據權利要求11到24任一 項載體系統或根據權利要求25慢病毒的用途，用于生產治療HBV感染相關 疾病的藥劑。
32. 核酶DNA包含，(l)在對人類細胞有效的啟動子控制下的靶向切割錘 頭型核酶DNA序列，并且其一旦轉錄為RNA將切割由HBV基因組編碼的 耙基因轉錄的mRNA，和其下游(2)3'自催化的錘頭型核酶DNA序列，因此 當核酶DNA轉錄為RNA時，它表現為雙錘頭的形式，具有靶向HBVRNA 的靶向切割核酶的第一和第二莖及3'自催化核酶的第一和第二莖，及常規的連接這兩個錘頭的第三莖。
33. 核酶DNA，當其轉錄為RNA時，將在存在于HBV RNA中的靶 RNA序列上的三個位點切割，其包含如下的識別序列(5'到3')GGCTCTCTCGTCCC對于核酶MAZI CCTCAGCTCTGTATCG對于核酶SGIII GAGGACTCTTGGA 對于核酶DGII
全文摘要
本發明涉及在CUC位點切割乙型肝炎病毒(HBV)的核酶。適當的核酶可以是，例如，在HBV RNA的GGCUCUCUCGUCCC、CCUCAGCUCUGUAUCG或GAGGACUCUUGGA識別序列切割。提供有用的核酶DNA、載體系統和藥物組合物，例如用于治療HBV感染。
文檔編號C12N15/113GK101365792SQ200680049638
公開日2009年2月11日 申請日期2006年11月3日 優先權日2005年11月4日
發明者彼得·安東尼·明特·伊格爾斯, 阿梅爾·庫雷希 申請人:倫敦國王學院