微粒特別是生物學(xué)微粒表征和計(jì)數(shù)的方法和裝置的制作方法

專利名稱：微粒特別是生物學(xué)微粒表征和計(jì)數(shù)的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微粒表征和計(jì)數(shù)的方法和裝置，本發(fā)明尋求實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)協(xié)議(biological protocols)的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
G.Medoro所有的PCT/WO 00/69565專利申請描述了通過利用封閉的電介質(zhì)電泳勢能籠框(dielectrophoretic potential cages)對微粒進(jìn)行操作和檢測的裝置和方法。所述方法教導(dǎo)在兩維空間中如何控制獨(dú)立于所有其他微粒的每一微粒。用來捕獲懸浮微粒的力是負(fù)的電介質(zhì)電泳。通過與集成在同一襯底中的電極陣列和傳感器的每一元件有關(guān)的存儲器元件和電路的編程，產(chǎn)生對操縱操作的單獨(dú)控制。但是，受傳感器特性分散約束的固有空間“噪聲”(技術(shù)上稱為“固定型噪聲(Fixed-Pattern-Noise)”)嚴(yán)重地限制細(xì)胞檢測中傳感器本身的可靠性。該專利報(bào)告使用光學(xué)和/或阻抗計(jì)傳感器。即使通過扣除參考圖像對傳感器的增益差別進(jìn)行補(bǔ)償，但結(jié)果還是不完全可靠，因?yàn)槠渌囊蛩乩缯丈涞目臻g差別(對于光學(xué)傳感器)或液體的導(dǎo)電性(對阻抗計(jì)傳感器)，不能得到補(bǔ)償。
專利US 6294063(Becker等人)披露了一種方法和裝置，其通過可編程的力的分配來操縱固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)生物學(xué)材料的包裹(packages)。該專利也提及傳感器的使用。但是，在那種情況下也還是存在固定型噪聲問題。
另一操縱液態(tài)微粒(小滴)的已知方法是電介質(zhì)上電潤濕(EWOD)，描述于T.B.Jones，Journal of Micromechanics and Microengineering，15(2005)1184-1187中。在那種情況下，提供在襯底上的電極施加的電場，使被氣態(tài)包圍的小滴能在受激電極序列所控制的方向上向前推進(jìn)。基于這種原理的裝置能做成包含一個(gè)帽蓋(也可用電介質(zhì)覆蓋)，如Pamula等人的專利申請US 2004/0058450A1所教導(dǎo)的，或者簡化為稱為“鏈”的一條線，與襯底上面的小滴建立電接觸。J.Berthier等人，NSTI Nanotech2005，www.nsti.org，vol.1，2005。
操縱微粒的又一種力是由電流體動(dòng)力學(xué)(EHD)流產(chǎn)生的粘滯摩擦力，例如電熱流(ETF)或AC電滲透。在NG.Green，A.Ramos和H.Morgan，J.Phys.DAppl.Phys.33(2000)中，EHD用來顯示微粒。例如PCT WO2004/071668 A1描述一種利用上述電流體動(dòng)力學(xué)流將微粒濃縮在某些電極上的裝置。
在“Impedance Spectroscopy Flow CytometryOn-Chip Label-Free CellDifferentiation”(Cytometry Part A 65A124-132(2005)，Cheung K，Gawad S，Renuad P)中使用微粒芯片上集成的阻抗差分傳感器來區(qū)分流動(dòng)中的微粒。
在“Near-Field Optical Sensors for Particle Shape Measurements”(IEEESensor Journal，vol.3，No.5，Oct.2003，pp.646-651)中，描述一種基于集成傳感器(光電二極管)陣列檢測微粒形狀的芯片。但是，微粒的移動(dòng)是通過液體流動(dòng)來操作的，這需要例如泵或其他模擬機(jī)械裝置，因此不可能對被分析的微粒的位置進(jìn)行精確的控制。
在Medoro等人的意大利專利申請BO2005A000481中，報(bào)告了一些用電極陣列操縱微粒的方法，以及檢測它們的方法和裝置，但是它有類似于已經(jīng)陳述過的專利PCT/WO 00/69565的區(qū)分不同細(xì)胞的能力方面的限制。
最后，在國際專利申請NO.PCT/IT02/00524中描述了一種方法，其中，第一生物學(xué)實(shí)體通過對第一生物學(xué)實(shí)體有粘合力的第二生物學(xué)實(shí)體來識別(反過來也是這樣)，那里，第一生物學(xué)實(shí)體被停止在至少部分可選擇地激活和尋址的第一電極陣列所限定的表面上，朝向至少一個(gè)第二電極，與經(jīng)過電介質(zhì)電泳籠框移動(dòng)的第二生物學(xué)實(shí)體接觸；優(yōu)選通過以第一頻率輻射激勵(lì)粘合于第二生物學(xué)實(shí)體的熒光團(tuán)組，并經(jīng)過集成在電極中的光學(xué)傳感器以第二頻率檢測熒光發(fā)射，檢測至少一部分第一和第二生物學(xué)實(shí)體之間的相互粘合作用(如果有的話)。因此，再次存在的問題是消除與光學(xué)檢測有關(guān)系的“噪聲”(“固定型噪聲”)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種進(jìn)行任何類型微粒的表征和/或計(jì)數(shù)的方法和裝置，它沒有上述缺點(diǎn)，特別是能對獲得的微粒進(jìn)行精密操縱，同時(shí)對固定型噪聲的不利影響實(shí)際上不敏感。
特別是，本發(fā)明的目的是對存在于樣本中的每一微粒的位置起控制作用，以便以確定性或統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使這些微粒位移，以集成光學(xué)和/或阻抗計(jì)傳感器檢測它們的存在和/或表征它們的類型。
在下面，術(shù)語單數(shù)的“微?！被虻脭?shù)的“微?！币庵缸匀换蛉嗽斓?，微米或納米實(shí)體，如細(xì)胞、亞細(xì)胞組分、病毒、脂質(zhì)體、泡囊(niosomes)、微球(中心體)和納米球，或更小的實(shí)體，如大分子、蛋白質(zhì)、DNA、RNA等等，以及懸浮介質(zhì)中不可混合的液滴，例如水中油、油中水，或氣體中的液滴(如空氣中的水)，或液體中的氣泡(如水中的空氣)。
有時(shí)，將使用術(shù)語細(xì)胞，但除非另有說明，意思是作為檢測和表征上述廣義上的“微粒”的非限制性的示例。
因此本發(fā)明涉及根據(jù)權(quán)利要求1、3、5、9、11、20、22的對上述微粒進(jìn)行表征和/或計(jì)數(shù)的方法和裝置。
特別是利用非均勻、時(shí)變力場和集成光學(xué)傳感器。力場可以是正的或負(fù)的電介質(zhì)電泳、電泳或電流體動(dòng)力學(xué)運(yùn)動(dòng)，其特征在于有關(guān)微粒(固體、液體或氣體)的一組穩(wěn)定平衡點(diǎn)；通過利用國際科學(xué)界稱為電介質(zhì)上電潤濕的效應(yīng)，同樣的方法可適用于操縱小滴(液態(tài)微粒)。
由此可見，現(xiàn)有技術(shù)的限制可通過本發(fā)明予以克服。
根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)現(xiàn)，對照射光的空間差別和固定型噪聲是不敏感的。此外，本發(fā)明能精確地表征和區(qū)分在裝置中被操縱的微粒，而不需要使用泵或者另外產(chǎn)生液流，這些會引起被分析微粒不大確定的定位。
最后，與利用流動(dòng)使微粒移動(dòng)的方法相反，通過利用受控力場使微粒相對于傳感器移動(dòng)，能得到更大量的信息，包括例如順應(yīng)力場的微粒運(yùn)動(dòng)速度。因此能得到表征微粒的附加信息源。這個(gè)信息能有利地用于區(qū)分微粒的不同類型。
本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，從下面參考附圖對非限制性的本發(fā)明實(shí)施例的描述中，將看得很明顯。



圖1示出通過電極陣列產(chǎn)生力場的原理。
圖2示出基于圖4和9的籠框位移檢測和表征方法的有關(guān)波形。
圖3示出(a)聚苯乙烯球、(b)K562細(xì)胞、(c)紅細(xì)胞的微觀圖像。
圖4示出尺寸小于電極的微粒的檢測/表征步驟序列。
圖5示出量級為15-20μm大小的細(xì)胞或球體通過時(shí)所檢測灰度值的典型暫態(tài)過程圖，并指出某些可能的判別參數(shù)。
圖6示出其籠框位移之后的K562細(xì)胞通過時(shí)所檢測灰度值的暫態(tài)演變。
圖7示出小細(xì)胞或微球通過時(shí)所檢測灰度值的典型暫態(tài)過程圖，并指出某些可能的判別參數(shù)。
圖8示出分別在其籠框位移之后的10μm、6μm和3μm的聚苯乙烯球通過時(shí)所檢測灰度值的暫態(tài)演變。
圖9示出可用于尺寸大于一個(gè)電極但小于兩個(gè)電極的微粒的檢測/表征步驟序列。
圖10示出可用于通過所有籠框的移動(dòng)同時(shí)檢測所有微粒的基本步驟序列。
圖11示出執(zhí)行圖10的基本步驟序列可采集到的三個(gè)圖像。
圖12示出不需要移動(dòng)籠框而同時(shí)檢測所有微粒的基本步驟序列。
圖13示出基于激活和無效圖12的籠框的檢測和表征方法的有關(guān)波形。
圖14示出可用于檢測/表征籠框中微粒的另一步驟序列。
圖15示出用于微粒特征的高分辨率研究的裝置總體結(jié)構(gòu)。
圖16示出用于在垂直和水平兩個(gè)方向上實(shí)時(shí)確定微粒位移的裝置總體結(jié)構(gòu)。
圖17示出某些不同照射和光學(xué)檢測模式。
圖18示出用于支持檢測發(fā)熒光的細(xì)胞的專用裝置的頂視圖和截面圖，帶有集成在芯片表面上的發(fā)射濾光器。
圖19示出用于支持檢測發(fā)熒光的細(xì)胞的專用裝置的頂視圖和截面圖，帶有集成在芯片內(nèi)層的發(fā)射濾光器。
圖20示出用于支持檢測發(fā)熒光的細(xì)胞的專用裝置的頂視圖和截面圖，帶有集成在芯片表面上的多個(gè)發(fā)射濾光器。
圖21示出不同類型具體是三種不同類型微粒計(jì)數(shù)的幾何圖形表示。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明的目的是提供一種用于操縱和/或檢測微粒的方法和裝置。
本發(fā)明的方法是基于使用非均勻力場(F)，在其作用下單個(gè)微?；蛭⒘＝M(BEADS)被吸引而趨向穩(wěn)定平衡位置(CAGE)(圖1)。這種力場可以是例如負(fù)的(NDEP)或正的(PDEP)電介質(zhì)電泳場(DEP)，電泳場(EF)或電流體動(dòng)力學(xué)(EHD)運(yùn)動(dòng)場或者還有電介質(zhì)上電潤濕(EWOD)。
檢測可涉及如下幾個(gè)方面之一或它們的組合 1.單個(gè)微粒的計(jì)數(shù)或量化； 2.識別和/或表征； 3.定位。
就此而言，主要的開發(fā)是阻抗變化的測量和/或熒光透射、漫射或發(fā)射的光強(qiáng)度變化的測量。
力的產(chǎn)生 根據(jù)已知的技術(shù)有不同的方法通過提供在襯底上的電極(EL)的陣列產(chǎn)生移動(dòng)微粒的力(圖1)。通常使用覆蓋物(LID)，它本身也可以是一個(gè)電極，它限定一個(gè)微室，其中通常在懸浮液中能發(fā)現(xiàn)微粒(BEAD)。圖1示出某些不同的力圖。在電介質(zhì)電泳(DED)的情況下，所加電壓以正號(+)標(biāo)示的是同相周期電壓(Vphip)，以負(fù)號(-)標(biāo)示的是反相周期電壓(Vphin)。反相電壓意味著電壓相位相差180度。這個(gè)場產(chǎn)生作用于微粒的力，吸引微粒趨向平衡點(diǎn)(CAGE)。在負(fù)的DEP(NDEP)的情況下，根據(jù)已有技術(shù)如果覆蓋物(LID)是導(dǎo)電的電極，可能產(chǎn)生封閉的力籠框；在這種情況下，穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)的提供和每一與Vphin(-)相連的電極對應(yīng)，如果相鄰電極與反相的Vphip(+)相連并且覆蓋物(LID)與同相的Vphin(-)相連的話，這個(gè)平衡點(diǎn)(CAGE)通常在液體中與電極隔離，因此，在穩(wěn)定狀態(tài)下微粒(BEAD)浮起。在正的DEP(PDEP)的情況下，平衡點(diǎn)(CAGE)通常被發(fā)現(xiàn)與提供有電極的表面相對應(yīng)，并且在穩(wěn)定狀態(tài)下微粒(BEAD)與電極接觸。關(guān)于PDEP，在覆蓋物中其他電極的存在是不必要的，因?yàn)镻DEP的平衡點(diǎn)相應(yīng)于電場的極大值。電極陣列可用于電泳以吸引帶電微粒趨向相反極性的電極。關(guān)于電流體動(dòng)力學(xué)(EHD)運(yùn)動(dòng)，電極的配置產(chǎn)生某些流動(dòng)，它們驅(qū)動(dòng)微粒趨向最小流動(dòng)的點(diǎn)。關(guān)于EWOD，一般使用包含介電外層的電極覆蓋物(LID)，并且在微粒(通常為空氣中的液體小滴)必須被吸引的一些點(diǎn)，以相對于覆蓋物的反相信號對電極陣列進(jìn)行激勵(lì)。相反，其上不應(yīng)存在微粒的電極則仍懸浮。關(guān)于EWOD，在操縱空氣中的小滴期間，上述電極陣列、一系列金屬線能替換地用作覆蓋物。
在下面，為了簡便起見，僅考慮通過本發(fā)明目的的非限制性示例，使用封閉的負(fù)的電介質(zhì)電泳籠框作為執(zhí)行力來描述本發(fā)明的方法和裝置(為此就得使用起電極作用的帽蓋)。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，如何推廣下述使用不同的執(zhí)行力和不同類型的微粒的方法和裝置，是明顯的。
所使用的傳感器 始終為簡化起見，下面僅參考使用光學(xué)傳感器的情況，這些傳感器使能檢測與電極集成的光電二極管上的入射光功率。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不同的情況下如何推廣下述方法和裝置包括可替換或組合地使用集成的阻抗計(jì)傳感器，是明顯的。
下面，為簡便起見，術(shù)語“灰度級”也將用作“從集成傳感器來的出射信號”的同義語。這個(gè)信號本身也許正比于“入射光功率”(在光學(xué)傳感器例如光電二極管上)，或者正比于所檢測的電阻抗(假如使用集成的阻抗計(jì)傳感器)。
使用光學(xué)傳感器的方法 在光學(xué)傳感器的情況下，將涉及亮場(或BF)型照射。在這種情況下，光線照射在傳感器上。暗場(或DF)照射的方法或基于熒光也是可以的，也在本發(fā)明的目的范圍內(nèi)，但為簡便起見，它們將不列入下面論述的所有方法中，而僅在這里討論。
在圖17中，示出一些使用光學(xué)傳感器的方法。該圖涉及帶有集成在襯底(SUB)中的光學(xué)傳感器(PIXEL)的裝置截面。在傳感器與提供電極(EL)的不同金屬化層之間的電介質(zhì)，可簡單地由氧化物(OX)層組成或也包括濾光層(DFL)，例如用薄膜分色鏡技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
在亮場檢測圖(圖17-BF)中，光線(LIGHT)從覆蓋物(LID)射入，由傳感器測得的光功率實(shí)際上隨微粒(BEAD)所引起的畸變和吸收情況而變化。
在暗場檢測圖(圖17-DF)中，光線(LIGHT)以不直接到達(dá)傳感器(PIXEL)的入射角經(jīng)過覆蓋物(LID)射入，由傳感器檢測到的光功率實(shí)際上隨被直射光(LIGHT)或者隨后電極的反射光(RLIGHT)照射的微粒(BEAD)所發(fā)出的漫輻射(SLIGHT)而變化。
在亮場熒光檢測的圖(圖17-BFF)中，激勵(lì)光(EXLIGHT)從覆蓋物(LID)射入，由傳感器測得的光功率基本上隨微粒(BEAD)所發(fā)射的熒光(EMLIGHT)而變化。在這種情況下，為了使發(fā)射光(EMLIGHT)信號不被激勵(lì)(EXLIGHT)功率壓倒，使用下面的一種或多種技巧是可行的 ·使用激勵(lì)所發(fā)射的輻射波長的濾光層(DEL)； ·使用的激勵(lì)頻率是光學(xué)傳感器(PIXEL)對其有低的量子效率(即對該波長相對不靈敏)的頻率。例如可以使用相當(dāng)深的p-n結(jié)，以及使用波長在UV段中激勵(lì)輻射，特別是波長低于380nm更好。
在暗場熒光檢測圖(圖17-DFF)中，激勵(lì)光(EXLIGHT)以不直接到達(dá)傳感器(PIXEL)的入射角從覆蓋物(LID)射入，并且傳感器所檢測光功率基本上隨被直射光(EXLIGHT)或隨后經(jīng)電極反射的光(RLIGHT)照射的微粒(BEAD)所發(fā)射的熒光而變化。但為了使發(fā)射光(EMLIGHT)信號不被微粒的漫射光(SLIGHT)功率軟化(degrade)，希望使用上述亮場熒光情況下的一種或多種技巧，以便改善系統(tǒng)的選擇性。
通過籠框的激活或無效來檢測滿籠框的方法 圖12示出根據(jù)本發(fā)明方法的一種可能的步驟序列，以便檢測哪個(gè)籠框是滿的(至少關(guān)進(jìn)一個(gè)微粒)，哪個(gè)是空的，而不需要移動(dòng)籠框本身。這種方法特別適合于電極的應(yīng)用圖形密集，不允許籠框位移的情況。此外，如果裝置中不存在使籠框位移的電路時(shí)，這種方法也是有利的。
這種方法是基于俘獲/釋放籠框(CAGE)中的微粒(BEAD)和進(jìn)行感測這兩個(gè)執(zhí)行階段的交替，其間用集成傳感器(PIXEL)采集一個(gè)或多個(gè)圖像。圖13示出簡略的波形。
在籠框無效時(shí)，微粒因穩(wěn)定而開始淤積，和/或由于布朗運(yùn)動(dòng)從它們被關(guān)進(jìn)籠框時(shí)采取的穩(wěn)定平衡位置(PEQ)開始橫向使它們本身位移(圖12右面部分t_sense)。由于這些位移，在滿籠框中所檢測的灰度級變化，相對于與空籠框有關(guān)的傳感器(PIXEL)上所產(chǎn)生的與讀出電路和/或光學(xué)系統(tǒng)的噪聲有關(guān)的灰度級變化而言，顯著向較高的方向變化。
空的或滿的籠框的分類方法如下 1.通過交替地操作籠框(激活或使無效，時(shí)間為幾秒至幾分之一秒量級)以及感測一幅或多幅圖像(時(shí)間為幾分之一秒例如100ms至幾十秒量級)，采集(感測)一系列圖像。
2.對于一系列圖像NIMG，就與CAGE_IJ有關(guān)的每一傳感器PIXEL_IJ，計(jì)算傳感器上的非歸一化灰度級標(biāo)準(zhǔn)偏差(在這一特殊情況下正比于入射光功率)，定義為 其中(系列圖像NIMG中的PIXEL_IJ的灰度級平均值)。
3.計(jì)算空的參考傳感器(PIXEL_REF)上的非歸一化灰度級標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值和非歸一化標(biāo)準(zhǔn)偏差的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 4.分類閾值定義為 THR＝MREF-NIMG+α·σREF-NIMG+Δ典型值為α＝1，Δ＝0。
5.籠框IJ被分類為滿的根據(jù)是其余的籠框則被分類為空的，因?yàn)橹档米⒁獾氖沁@種方法與固定型噪聲(受制于光電二極管特性的分散性的固定空間噪聲)無關(guān)，因?yàn)樗紤]的是相對于每一傳感器平均值的信號功率，不考慮這種平均值的絕對值。
為得到高于95％的精度，進(jìn)行NIMG＝50至100這樣數(shù)目的測量(也就是采集多幅圖像)一般是足夠的。
考慮使參考像素的標(biāo)準(zhǔn)偏差(歸一化) 收斂而趨向它的漸近值所要求的圖像數(shù)目，可獲得必須采集的圖像的數(shù)目NIMG的動(dòng)態(tài)測量。
這個(gè)漸近值是常數(shù)，如果忽略受制于輕微變化的噪聲1/f(其中f是其中考慮了噪聲的綜合頻率)。
因此，從更一般的意義上說，上面僅具體參考使用光學(xué)傳感器的情況所描述的方法，使能檢測微粒(BEAD)的存在，這些微粒(若有的話)存在于作用在微粒(例如細(xì)胞)上的、由電極(EL)的陣列產(chǎn)生的任何力場(F)(因此不僅是電介質(zhì)電泳一種)的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)。這種方法包括以下步驟 i.使力場(F)無效； ii.測量在無效以后并被選擇作為無效場中的微粒所經(jīng)歷的穩(wěn)定和/或布朗運(yùn)動(dòng)的動(dòng)態(tài)函數(shù)的至少一個(gè)時(shí)間間隔中，測量由與穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)有關(guān)的第一傳感器(PIXEL_IJ)和由與所述力場(F)的當(dāng)前配置下肯定不能被微粒占據(jù)的空間區(qū)域有關(guān)的第二傳感器(PIXEL_REF)產(chǎn)生的灰度級； iii.重新激活力場(F)； iv.重復(fù)若干次步驟i)至iii)，基本上與假定作為參考的第二傳感器(PIXEF_REF)所檢測灰度級值的方差向其漸近值的收斂速度相當(dāng)； v.將這樣的平衡點(diǎn)分類為被微粒占據(jù)的點(diǎn)，如果在所考察的暫態(tài)系列測量中，與這個(gè)穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)有關(guān)的傳感器上所檢測灰度級值的標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果大于預(yù)定閾值(THR)的話。
通過籠框的移動(dòng)和灰度級靜態(tài)值差值的測量來檢測滿籠框的方法 圖10示出根據(jù)本發(fā)明通過移動(dòng)籠框并分析灰度級靜態(tài)值的方法的系列操作步驟。
1.在第一瞬間(t0)，籠框(CAGE)將微粒(BEAD)放置在各組初始的光學(xué)傳感器(PIXEL_STA)上。采集具有與所述配置相對應(yīng)的灰度級的圖像。
2.在下一瞬間(t1)，一旦與籠框移動(dòng)有關(guān)的暫態(tài)過程耗盡，微粒本身以與最終的光學(xué)傳感器(PIXEL_TGT)相對應(yīng)的方式排列。采集與這種配置相應(yīng)的帶有灰度級的新圖像。
3.確定與點(diǎn)1和2的圖像有關(guān)的灰度級的差圖像。
4.確定差圖像的絕對值。
5.確定與每一籠框的開始和最終位置有關(guān)的像素對(PIXEL_STA，PIXEL_TGT)合成的灰度級。
6.從步驟1至4重復(fù)NDIFF次，并累計(jì)與步驟5所確定的絕對變化有關(guān)的每一籠框的灰度級。
7.類似于上述關(guān)于籠框的激活/無效的分類方法，確定分類閾值THR，這時(shí)，對所有NDIFF次采集到的差圖像，考察與某些肯定是空的傳感器(PIXEL)(例如，籠框行之間的像素)相應(yīng)的差值絕對值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
從更一般的意義上說，關(guān)于微粒(BEAD)(若有的話)存在于由電極(EL)的陣列產(chǎn)生的作用在所述微粒上的力場(F)的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)上的檢測，采用下列步驟進(jìn)行 i)首先，在力場(F)的這個(gè)第一當(dāng)前配置下，測量由與穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)有關(guān)的第一傳感器(PIXEL_STA)和由與肯定不能被微粒占據(jù)的空間區(qū)域有關(guān)的參考傳感器(PIXEL_REF)產(chǎn)生的灰度級； ii)接著，改變力場(F)，從而向其應(yīng)用第二當(dāng)前配置，其中穩(wěn)定平衡點(diǎn)與第二傳感器(PIXEL_TGT)相對應(yīng)地位移，第二傳感器不同于第一傳感器。
iii)然后，在力場(F)的第二當(dāng)前配置下，測量由第二傳感器(PIXEL_TGT)和由與肯定不能被微粒占據(jù)的空間區(qū)域有關(guān)的參考傳感器(PIXEL_REF)產(chǎn)生的灰度級； iv)確定前面各點(diǎn)所檢測灰度級之間的差值(DIFF_IMG)； v)重復(fù)步驟i)至iv)； vi)處理差分灰度級值，以區(qū)分被微粒占據(jù)的和未被微粒占據(jù)的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)。
這些處理包括以下步驟vii)確定灰度級差值的絕對值，以及viii)將與如下傳感器相關(guān)的平衡點(diǎn)分類為被占據(jù)的平衡點(diǎn)，所述傳感器所檢測變化實(shí)際大于在力場(F)的第一和第二配置下不能被微粒占據(jù)的參考傳感器的灰度級平均變化。
這種基于圖像差值絕對值的方法也不受固定型噪聲的影響，與用籠框的激活/無效的方法相同，對照射的不均勻性相當(dāng)不靈敏。
關(guān)于第一種方法，其缺點(diǎn)是要求使籠框位移的電路以及籠框之間的距離，這個(gè)距離使它們的移動(dòng)能以單義方式確定被關(guān)進(jìn)籠框的細(xì)胞(若有的話)的位移。
這種方法的優(yōu)點(diǎn)之一是，為得到一定的分類質(zhì)量(低的偶然誤差)，通常只要幾幅圖像和較少的時(shí)間，而用籠框激活/無效的方法則需要較多的圖像和較多的時(shí)間。
在圖11中，示出用單一步驟(NDIFF＝1)就能得到的結(jié)果。在圖11(a)中，給出由光學(xué)顯微鏡可檢測到的圖像，在圖11(b)中，示出相應(yīng)灰度值的映射(有固定型噪聲補(bǔ)償)，相反，在圖11(c)中示出具有初始灰度值的圖像和右移之后之間的差值的絕對值歸一化圖像。
通過籠框的移動(dòng)和灰度級動(dòng)態(tài)值的測量來檢測滿籠框的方法 圖2示出通過籠框本身的位移，動(dòng)態(tài)檢測籠框中微粒存在的方法步驟的波形。
一開始，進(jìn)行籠框的位移但不等待微粒在它們的新平衡位置上穩(wěn)定，同時(shí)檢測光學(xué)傳感器的信號變化，而包含在移動(dòng)籠框中的細(xì)胞(微粒)正在所述傳感器上運(yùn)動(dòng)。
圖4示出步驟序列，其包括籠框在IJ位置上的移動(dòng)和穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)的位移，這個(gè)位移確定微粒(BEAD)在光學(xué)傳感器(PIXEL_IJ)上的通過。
如果微粒(BEAD)的尺寸大于電極的尺寸，傳感器將測量變化但它達(dá)不到其上沒有微粒的像素的基礎(chǔ)值。在這種情況下，可采用稍有不同的圖如圖9。這種情況通過測量尺寸比電極大的籠框邊緣像素(PIXEL_IJ)上的灰度值，再現(xiàn)相應(yīng)于電極尺寸為實(shí)際電極的雙倍的情況。
這種技術(shù)使能在一次感測中，通過檢測細(xì)胞水平截面整體(如果光電二極管與細(xì)胞一樣大并且細(xì)胞垂直移動(dòng))入射功率的有關(guān)灰度值，對細(xì)胞進(jìn)行掃描。改變執(zhí)行的占空因數(shù)

能實(shí)現(xiàn)不同的掃描。
這些操作使能基于籠框滿時(shí)產(chǎn)生的發(fā)光度的峰和谷，檢測微粒是否存在。通過處理傳感器的信號，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠容易地檢測到一系列參數(shù)(例如灰度值的峰間幅度)，這些參數(shù)使能辨別空籠框和滿籠框。
因此，根據(jù)本發(fā)明方法的這種變型，通過執(zhí)行下列步驟能檢測實(shí)在的微粒(BEAD)(若有的話)在作用于其上的、由電極(EL)的陣列產(chǎn)生的力場(F)的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)上的存在 i.改變力場(F)，以使微粒(BEAD)與有關(guān)的傳感器(PIXEL_IJ)相對應(yīng)地通過而移動(dòng)穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)。
ii.以顯著高于微粒在新平衡位置上的穩(wěn)定時(shí)間的頻率，測量與不同穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)的移動(dòng)有關(guān)的傳感器(PIXEL_IJ)所產(chǎn)生的灰度級。
iii.通過對傳感器所產(chǎn)生的灰度級量度暫態(tài)演變的特征參數(shù)的測量，例如在光學(xué)傳感器情況下基于入射光功率，區(qū)分微粒存在或不存在。
傳感器所產(chǎn)生的灰度級即照射在傳感器上的光功率的測量，顯然能交替地執(zhí)行激活作用在微粒上的力場和使其無效的步驟，而后測量入射功率從而得到灰度級；其優(yōu)點(diǎn)是，能避免傳感器讀出時(shí)的執(zhí)行電壓之間的任何干擾，盡管在原則上這不是必然的，如果傳感器基本上與執(zhí)行電壓的激勵(lì)無關(guān)的話。
光功率量度暫態(tài)演變的參數(shù)最好包括灰度級的峰間幅度，并且最好通過與閾值比較的方法進(jìn)行分類，這個(gè)閾值的確定是從所考慮的力場(F)配置下不能被微粒占據(jù)的參考傳感器上的光功率即灰度級峰間量度出發(fā)，提高與參考傳感器的峰間值標(biāo)準(zhǔn)偏差成比例的一個(gè)系數(shù)。
由此，由參考傳感器上存在的環(huán)境照射所致的噪聲1/f也得以補(bǔ)償。
采用誤差補(bǔ)償?shù)幕跐M籠框數(shù)目的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 通過上述方法，能夠確定滿籠框的數(shù)目。本發(fā)明的目的也在于找出一種對籠框中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法。由此，只要已知所考察的樣本的體積，就能得到細(xì)胞的濃度。
作為第一級近似，特別是如果每一籠框細(xì)胞平均數(shù)顯著低于約0.1的話，滿籠框的數(shù)目就會近似等于細(xì)胞的數(shù)目(在這種情況下，細(xì)胞數(shù)低估大約5％)。根據(jù)本發(fā)明，對于較高的細(xì)胞平均數(shù)，每一籠框的細(xì)胞分布統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)能被補(bǔ)償，以便獲得以較高精度接近芯片上的實(shí)際細(xì)胞數(shù)的計(jì)數(shù)。
我們假定有下列前提條件 1.細(xì)胞在每一體積單位內(nèi)是均勻分布的；這個(gè)假說，在樣本被注入空的微室的情況下一般是正確的。相反，如果樣本被注入此前已充有緩沖液的微室，那末樣本只能是局部均勻的，因?yàn)榧?xì)胞濃度受樣本的流動(dòng)分布的約束而有所變化。
2.與每一籠框最大細(xì)胞數(shù)目有關(guān)的約束被忽略。
這個(gè)假說，在細(xì)胞的總體積(一個(gè)細(xì)胞的平均體積乘以細(xì)胞的平均數(shù))合理地小于籠框體積(意指每一籠框的引力盆(basin of attraction)的體積)時(shí)是正確的。
在這些假說中，細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)分布采用二項(xiàng)分布表示。我們定義如下 NCAGES＝芯片中(或所考察部分)的籠框數(shù) n＝NCELLS＝芯片中(或所考察部分)的細(xì)胞數(shù) 其中，用“芯片”表示由電極(EL)的陣列形成的組，它通常精密地與傳感器PIXEL一起集成在單一的多層芯片中。
那末，一個(gè)細(xì)胞屬于任何籠框引力盆的概率是 p＝1/NCAGES 每一籠框有k個(gè)細(xì)胞的概率從下面的公式導(dǎo)出 其中 是n個(gè)目標(biāo)一次取k個(gè)的組合數(shù)(二項(xiàng)分布)。
每一籠框細(xì)胞平均數(shù)(ACPC)是 因?yàn)樵谛酒贤ǔＳ性S多籠框，所以每一籠框具有1、2、…k個(gè)細(xì)胞的概率乘以籠框數(shù)很接近于具有1、2、…k個(gè)細(xì)胞的實(shí)際籠框數(shù)。考慮到這一點(diǎn)并檢測空和滿籠框的總數(shù)，通過計(jì)算與檢測值相應(yīng)的滿和空籠框的期望數(shù)，就能估算每一籠框的細(xì)胞平均數(shù)(ACPC)。
空籠框的期望值計(jì)算為 以實(shí)際檢測到的空籠框數(shù)代之便可得細(xì)胞的計(jì)數(shù)值，這個(gè)計(jì)數(shù)值能簡單推算為 因此能得到較好的細(xì)胞數(shù)目估算，并且計(jì)數(shù)結(jié)果的精度對于ACPC高于1的情況也是適用的，只要空和滿籠框的數(shù)目是統(tǒng)計(jì)有效的；由此可見，事實(shí)上，它會減輕別的只對滿籠框計(jì)數(shù)有關(guān)的低估細(xì)胞數(shù)目所導(dǎo)致的誤差。很明顯，空籠框的檢測數(shù)目(ECmeasure)應(yīng)該大于零，并且低于或等于籠框的數(shù)目NCAGES。
下面的表格以數(shù)字示出有6400個(gè)籠框和不同細(xì)胞濃度的特定例子的情況。如能注意到的那樣，計(jì)數(shù)誤差急劇地減少，特別是對于每籠框細(xì)胞的平均濃度高的情況。實(shí)際上，所報(bào)告的值只不過是基于概率密度的值，但給出大量的籠框，概率估算能很好地接近可能的測量值。
表1 換句話說，根據(jù)這種方法，從對滿和空籠框的計(jì)數(shù)，根據(jù)至止已描述過的方法中的任何一種，能得出實(shí)際存在于注入由電極(EL)的陣列和覆蓋物(LID)限定的微室的樣本中的微粒(例如細(xì)胞)總數(shù)的計(jì)數(shù)(若有的話)；根據(jù)本發(fā)明在統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)上的估算方法，對前面已經(jīng)檢測到總體存在的單個(gè)微粒進(jìn)行計(jì)數(shù)的步驟如下 a)通過傳感器測量存在于由電極(EL)的陣列產(chǎn)生的力場(F)中的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)的數(shù)目(ECmeasure)，穩(wěn)定平衡點(diǎn)，此后也表示為“籠框”，其不包含任何微粒(BEAD)。
b)微粒(BEAD)的計(jì)數(shù)(NCELLS)由穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)數(shù)(NCAGES)的對數(shù)和不包含任何微粒的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)的測量數(shù)(ECmeasure)的對數(shù)之間的差，與穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)數(shù)(NCAGES)的對數(shù)和穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)數(shù)減1(NCAGES-1)的對數(shù)之間的差兩者之比來確定。
通過籠框的移動(dòng)和灰度級動(dòng)態(tài)值的測量來表征籠框中的細(xì)胞的方法 如圖3所示，因?yàn)榍?例如圖3(a))、某一類細(xì)胞(例如K562，如圖3(b))或者另一類細(xì)胞(例如紅細(xì)胞，如圖3(c))有不同的大小、形狀、吸收率分布和折射指數(shù)，所以使籠框在傳感器上通過，不僅能檢測籠框是否為滿，而且根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，能表征所存在的微粒(若有的話)的類型。
細(xì)胞(以及某些類型的微球體)呈現(xiàn)出光的畸變(一種透鏡效應(yīng))，它引起帶有負(fù)峰的灰度級(細(xì)胞的暗邊緣)和灰度級的正峰(細(xì)胞集光處的較亮的中心)的變化。
灰度級的動(dòng)態(tài)演變的約束參數(shù)如圖5報(bào)告的一個(gè)重要的但不被限制的例子，例如灰度級的負(fù)(Gnp)和正(Gpp)峰的幅值量度，以及例如籠框的移動(dòng)與初次灰度變化的檢測之間的延時(shí)(td)或者變化的暫態(tài)長度，能夠用來獲得附加信息和區(qū)分細(xì)胞的種類。
公式 作為第一級近似，位移速度正比于電介質(zhì)電泳遷移率，結(jié)果v∝k·R2。作為第一級近似，灰度級的變化長度與微粒的半徑成反比(當(dāng)R增加時(shí)它減小)。力場(F)的改變和灰度變化開始之間的時(shí)間延遲td作為第一級近似(圖4的情況，單個(gè)電極上有一個(gè)細(xì)胞)等于(它也是隨R的增加而減小)。
圖6示出K562細(xì)胞測量的實(shí)際過程。
圖7示出關(guān)于非透明球體或小細(xì)胞所預(yù)期的典型過程，與上述“透鏡”效應(yīng)相比吸收率效應(yīng)是主要的。
圖8示出在其籠框位移之后聚苯乙烯球通過10μm、6μm和3μm時(shí)所檢測灰度值的暫態(tài)演變過程。
通過提取合適的判別參數(shù)，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，顯然能確定類似于上述關(guān)于滿和空籠框的分類的分類準(zhǔn)則。
特別是，識別方法可包括提取微粒的判別特征，以及使用基于中性網(wǎng)絡(luò)、首次逼近ks、閾值算法和/或主分量分析或它們的組合的算法。
圖14示出基于相同原理的一種可替換的技術(shù)，這種技術(shù)采用使細(xì)胞在傳感器上橫向移動(dòng)的方法，能在細(xì)胞的水平截面以較高的分辨率對細(xì)胞進(jìn)行掃描。事實(shí)上，被考察的細(xì)胞“切片”(“Slice”)具有較小的尺寸。根據(jù)細(xì)胞經(jīng)過時(shí)的灰度值的導(dǎo)數(shù)，能計(jì)算沿細(xì)胞水平截面的灰度值的正點(diǎn)值(punctual value)，其水平分辨率等于采集期間的點(diǎn)數(shù)，垂直分辨率等于電極之間的間隔(距離)。
基于上面的描述，很明顯，本發(fā)明也能通過執(zhí)行下面的步驟表征存在于由電極(EL)的陣列產(chǎn)生的作用在所述微粒上的力場(F)的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)上的微粒(BEAD)(即例如建立它們的物理特性)，所述步驟如下 a.改變力場(F)，以使所述穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)位移而使得所述微粒(BEAD)的通過與有關(guān)傳感器(PIXEL_IJ)相對應(yīng)； b.以顯著高于微粒在新平衡點(diǎn)上的穩(wěn)定時(shí)間的頻率，測量可被傳感器(PIXEL_IJ)檢測的灰度級，所述灰度級與包含微粒的不同穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)的移動(dòng)有關(guān)； c.處理用于估計(jì)微粒性質(zhì)的灰度級量度暫態(tài)演變的特征參數(shù)。
總體上通常不受傳感器可檢測的背景“噪聲”即固定型噪聲的影響。
在所述例子中，使用的傳感器是光學(xué)傳感器，灰度級的測量是對照射在傳感器上的光功率的測量，這種測量最好用下面的步驟交替進(jìn)行 i.激活作用在微粒上的場； ii.使場無效并測量入射光功率； 或者使用上述對籠框中微粒的存在進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測的同樣的優(yōu)選系統(tǒng)。光功率量度的暫態(tài)演變參數(shù)包括基于上述內(nèi)容的由下列參數(shù)組成的組中選擇的至少一種參數(shù) i.力場(F)的變化與光功率的初始變化之間的延時(shí)(td)； ii.光功率的暫態(tài)變化的長度(tw)； iii.光功率值的正峰幅度(Gpp)； iv.光功率值的負(fù)峰幅度(Gnp)； 對非均質(zhì)樣本中不同種類的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法 根據(jù)本發(fā)明，通過對用于單一群體的細(xì)胞計(jì)數(shù)的分類研究法的組合，可以對單個(gè)籠框中的顆粒的特征進(jìn)行表征，以確定具有非均質(zhì)質(zhì)型微粒的樣本的成分。
通常，區(qū)分含有多于一個(gè)細(xì)胞的籠框中的微粒成分是不容易的。但是，通過對上述作為一個(gè)籠框的內(nèi)容表征而記錄的動(dòng)態(tài)灰度級進(jìn)行處理，判定該籠框是包含單一微粒還是包含多種微粒(MC)，則是相當(dāng)簡單的。
因?yàn)榭梢约俣ú煌愋偷奈⒘Ｖg的分布是獨(dú)立(正交的)，所以通過組合在具有單個(gè)顆?；\框中獲得的每種類型的微粒的數(shù)目，以及與空籠框(EC)和籠框籠框總數(shù)有關(guān)的信息，可以采用數(shù)值方法確定不同群體的微粒數(shù)的估算。問題是對于各不相同的NPT(這里NPT＝微粒類型數(shù))使函數(shù)最簡化。在圖21中，報(bào)告了NPT＝3的情況下的問題表示法。
對于微粒t＝1、…NPT的每一類型，一旦已假定若干微粒(NCELLS)存在，代表單獨(dú)存在于籠框中的t類型微粒(略去其他類微粒)的直至NPT維空間超立方體的體積事實(shí)上保持固定(Pt_1)。參考圖21(a)，對于第一類微粒，我們將得到單一籠框中的微粒P1_1，多個(gè)籠框中的微粒P1_M和沒有P1類微粒的籠框P1_0(所示體積的量度)。但是所檢測得的單一籠框中的t類微粒數(shù)必須考慮其他類型的一個(gè)或多個(gè)微粒也可能出現(xiàn)在同一籠框中。因此，如圖21(d)所示，每一t類單個(gè)微粒的檢測值(Pt_1_MEAS)對應(yīng)于t類微粒的超立方體的體積(Pt_1)減去超立方體Pt_1和Pq_h(q<>t，h>0)之間相交的超立方體的體積，它們包含不同類型的至少一個(gè)微粒。空籠框的超立方體的體積(EC_MEAS)隨即可知。
數(shù)值NCELLSt，t＝1、…、NTP的多元組(tuple)用數(shù)值方法計(jì)算，借此，(統(tǒng)計(jì))期望值能較好地相應(yīng)于實(shí)測得的具有每一t類單一微粒的籠框數(shù)(Pt_1)和空籠框數(shù)(EC_MEAS)。
基于剛才所述內(nèi)容，很明顯，本發(fā)明也能通過下面的步驟對存在于由電極(EL)的陣列產(chǎn)生的作用在所述微粒上的力場(F)的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)上的多種類型(NTP)的微粒(BEAD)進(jìn)行計(jì)數(shù)，步驟如下 a.改變力場(F)，以使所述穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)位移而使得所述微粒(BEAD)的通過與有關(guān)的傳感器(PIXEL_IJ)相對應(yīng)； b.以顯著高于微粒在新平衡點(diǎn)上的穩(wěn)定時(shí)間的頻率，測量可被傳感器(PIXEL_IJ)檢測的灰度級，所述傳感器與包含微粒的不同穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)的通過有關(guān)； c.處理與每一穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)有關(guān)的灰度級的暫態(tài)演變參數(shù)，用以檢測有關(guān)的籠框是否空的，是否包含某類的一個(gè)微粒，或者是否包含更多個(gè)微粒； d.用數(shù)值方法確定每一類微粒計(jì)數(shù)(NCELLSt)的組合，它較好地近似帶有每一類單個(gè)微粒(Pt_1_MEAS)的籠框和空籠框(EC_MEAS)的測量值。
用于通過籠框的移動(dòng)和灰度級動(dòng)態(tài)值的測量高分辨率地表征籠框中的細(xì)胞的裝置 為了提高至此所述的動(dòng)態(tài)檢測方法的分辨率，根據(jù)本發(fā)明，能夠以較高空間分辨率為特征，組合與光電二極管(PIXEL_V1、…、PIXEL_VN)關(guān)聯(lián)的一系電極(圖15)，通過在不同的電極上連續(xù)地移動(dòng)微粒，連續(xù)地分析微粒的不同截面。
分辨率的極限決定于光刻分辨率的最小幾何形狀，并且不需要配置用于對電極(PIXEL)尋址的不同的晶體管，這會增加面積。例如，某些開口(SLITS)能通過在光電二極管上安排金屬化來實(shí)現(xiàn)，使光電二極管的敏感僅與同樣的開口相對應(yīng)。
這樣，進(jìn)一步的步驟能在至此所述的所有方法中實(shí)現(xiàn)，其中所述穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)被位移，使所述微粒(BEAD)的通過與多個(gè)有關(guān)所述傳感器(PIXEL_IJ)相對應(yīng)；另外，其中傳感器(PIXEL_IJ)是光學(xué)傳感器并且被遮蔽(通過前述的備有預(yù)定的和較小幅度的開口SLITS的金屬化層)，以便用傳感器檢測顯著小于微粒和傳感器本身尺寸的空間部分上的入射光功率。
自動(dòng)控制籠框的位移速度以操縱細(xì)胞的方法 用自動(dòng)控制籠框的位移速度來進(jìn)行操縱的方法，可以基于上述對細(xì)胞的通過的檢測。對于在芯片(與電極的陣列一起)上移動(dòng)的具有細(xì)胞的籠框，可以監(jiān)控灰度級的演變過程，并且可以檢測到新的平衡點(diǎn)上的穩(wěn)定瞬態(tài)的結(jié)束，從而立即開始沿路線進(jìn)行后面的步驟。除了時(shí)間上的最佳化以外，通過動(dòng)態(tài)地使它們適應(yīng)不同瞬間不同微粒的速度，這種方法也使能證明每一細(xì)胞沒有停留在堵塞狀態(tài)。
如果單個(gè)光學(xué)傳感器在例如兩個(gè)電極之間的垂直間隔(距離)中與每一電極聯(lián)系，如圖4中那樣，這個(gè)方法就能利用1×2個(gè)電極寬度(水平位置為1×垂直位置為2)的籠框來執(zhí)行。在水平位移中，事實(shí)上微粒本身以全速度定位在兩個(gè)電極之間的傳感器上，它的移動(dòng)能通過監(jiān)視與初始和/或最終平衡點(diǎn)相對應(yīng)的傳感器進(jìn)行跟隨。這引起對籠框形狀的約束，然而這能通過下述裝置予以克服。
自動(dòng)控制籠框的位移速度以操縱細(xì)胞而不約束籠框尺寸的裝置 在圖16中，示出具有用于在水平(PIXEL_H)和垂直(PIXEL_V)兩個(gè)方向上的移動(dòng)判定的傳感器(像素)的裝置圖。這種裝置有利于以閉合鏈控制實(shí)現(xiàn)對微粒的操縱，以整體方式采用一種籠框位移速度進(jìn)行。利用這種裝置，可以采用1×1的籠框執(zhí)行水平位移，因?yàn)樵谌魏吻闆r下，細(xì)胞/微粒在沿水平軸設(shè)置在兩個(gè)電極之間的傳感器(PIXEL_H)上通過。
*** 采用下面描述的附加方法和裝置，可實(shí)現(xiàn)上述微粒檢測和表征的所有方法中都適用的步驟，這個(gè)步驟包括對與包含微粒的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)的通過有關(guān)的傳感器可檢測的灰度級中的變化過程進(jìn)行控制，以便確定新平衡位置上的微粒穩(wěn)定瞬態(tài)的結(jié)束，并且從這個(gè)量度回到新穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)上的微粒(BEAD)的位移速度上來。在這個(gè)穩(wěn)定瞬態(tài)結(jié)束時(shí)，由電極本身所產(chǎn)生的力場(F)的變化因此能自動(dòng)地產(chǎn)生(例如通過在另一類已知的電極陣列EL(圖15)的控制單元CTRL中執(zhí)行的適當(dāng)軟件，其目的是使穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)沿預(yù)定所希望的路徑(圖15中用箭頭示出)發(fā)生新的位移)。
具有借助熒光檢測和/或表征籠框中細(xì)胞的集成分色濾光器的裝置 關(guān)于熒光檢測和/或表征細(xì)胞，這里報(bào)告根據(jù)本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施裝置。這些實(shí)現(xiàn)裝置整合濾光器元件，它允許熒光發(fā)射通過，但能減輕激發(fā)。這些濾光器元件能與芯片所執(zhí)行的下游處理步驟整合，如以具有恰當(dāng)折射指數(shù)的材料沉積薄膜實(shí)現(xiàn)分色濾光器。濾光器效應(yīng)能夠減輕傳感器(PIXEL)所檢測的激發(fā)譜帶內(nèi)的光功率部分，因此降低了對傳感器本身的動(dòng)態(tài)范圍的要求。
在圖18中，示出特別適用于檢測和/或表征發(fā)熒光的細(xì)胞的裝置圖。允許相應(yīng)發(fā)射頻率通過的分色濾光器(DEL)，以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)被沉積在芯片上。在沉積之后，有時(shí)為了改善電極(EL)與液體之間的電接觸，在分色濾光層上開一些與電極本身相應(yīng)的窗口。這樣，例如在電泳的情況下可使用甚高導(dǎo)電性的溶液，而沒有與分色濾光器所構(gòu)成的介電層有關(guān)的電壓降。這個(gè)執(zhí)行方案與標(biāo)準(zhǔn)的CMOS晶片制造是相容的，并且僅包括晶片的后處理。
另一種方法，分色濾光器能在電極下面實(shí)現(xiàn)，如圖19中所示。如果CMOS工藝能改變的話，這可能是很有用的。然而在不改變CMOS工藝的情況下，這個(gè)圖也能以進(jìn)行后處理的方法實(shí)現(xiàn)，盡管這個(gè)后處理更復(fù)雜，意味著應(yīng)用濾光器、在CMOS頂部金屬上作接觸開口以及為實(shí)現(xiàn)電極(EL)而附加金屬化。不管是在電極(EL)上面或下面，組建具有不同通帶(DEL1、DELN)的空間組織的多重分色濾光器是有利的，如圖20所示。這對于以不同發(fā)射頻率區(qū)分和分別檢測細(xì)胞/微粒的熒光是有用的。
顯然，通過檢測細(xì)胞的位置，就能在不同的傳感器上按順序分析它們，例如存在不同的熒光團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明剛才描述的這個(gè)方面，本發(fā)明涉及如上所述檢測和/或表征微粒的裝置，但進(jìn)一步包括傳感器遮蔽裝置和開口，這些開口在數(shù)目上每一傳感器至少一個(gè)，穿過遮蔽裝置而獲得并且具有小于被檢測/表征的微粒的預(yù)定尺寸。
根據(jù)本發(fā)明的裝置可進(jìn)一步包括至少一個(gè)具有預(yù)定通帶的分色濾光器，安排成至少部分地遮蔽傳感器(PIXEL)(如果這些是光學(xué)傳感器的話)，最好包括多個(gè)分色濾光器，每一個(gè)具有不同于其他的通帶，它們之間的安排有重疊但至少要部分地遮蔽傳感器(PIXEL)。如果至少一個(gè)分色濾光器被安排來覆蓋電極(EL)，則裝備有與每一電極的至少一部分相對應(yīng)的阻斷開口。
對激發(fā)進(jìn)行過濾 裝置可采用或不采用這樣的實(shí)際操作，即就被分析的熒光團(tuán)，對(外部)激發(fā)源進(jìn)行過濾和最佳化。這一點(diǎn)采用未集成在裝置上的濾光器很容易實(shí)現(xiàn)。此外，另一種方法是芯片的帽蓋整合與下面的分色濾光器相應(yīng)的激發(fā)過濾部分，按芯片的逐個(gè)像素變化或不變化。
如果將激發(fā)過濾器集成在帽蓋上，則必須在較寬的區(qū)域用均勻的分色濾光器來實(shí)現(xiàn)，以避免不同像素激發(fā)之間的串?dāng)_。這樣，測試下的細(xì)胞必須覆蓋較大的距離以便分析不同的熒光團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)附加方面，至此所描述的裝置可包括至少一個(gè)具有預(yù)定通帶的，安排成與帽蓋(LID)相對應(yīng)的分色濾光器，所述帽蓋與電極一起限定一個(gè)小室或微室，其適用于接收和容納包含被檢測/表征的微粒的液體樣本。
照射噪聲的補(bǔ)償方法 在上述所有方法中，當(dāng)使用光學(xué)傳感器時(shí)，檢測或表征微粒的信號依賴于照射功率。因此，這種類型的變化能引起被檢測的光功率等級的某些變化，而它們與信號(微粒的存在和/或位置)沒有關(guān)系。雖然這一般不是問題，但這些方法的性能(較高的精度、較快的速度)，可以通過使用參考像素(無疑與空籠框相對應(yīng)的像素，有關(guān)于它的光入射功率僅受照射功率的影響)的平均檢測值的歸一化值補(bǔ)償上述變化，而得到改善。
這主要對低頻照射噪聲來說是很確實(shí)的，因?yàn)樵肼暪β实淖V密度(正比于1/f)使得它的影響更多地產(chǎn)生。
阻抗計(jì)傳感器的噪聲補(bǔ)償方法 在上述所有方法中，當(dāng)使用阻抗計(jì)傳感器時(shí)，檢測和表征微粒的信號依賴于微粒的懸浮介質(zhì)的導(dǎo)電性和介電常數(shù)，其依次依賴于例如溫度、鹽的濃度或者其他分子等等。因此，它們的變化能引起被檢測的阻抗等級的變化，而它們與信號(微粒的存在和/或位置)沒有關(guān)系。盡管這一般不是問題，但這些方法的性能(較高的精度、較快的速度)，可以通過使用參考像素(無疑與空籠框相對應(yīng)的像素，其阻抗僅受懸浮介質(zhì)的導(dǎo)電性和介電常數(shù)的影響)的平均檢測值的歸一化值補(bǔ)償上述變化，而得到改善。 *** 在到止為止所描述的檢測和表征的所有方法中，可以引入進(jìn)一步的步驟，這就是使用與所考慮的力場(F)當(dāng)前配置下肯定不能被微粒占據(jù)的空間區(qū)域有關(guān)的參考傳感器(PIXEL_REF)的平均檢測值的歸一化值，補(bǔ)償所述傳感器(PIXEL_IJ)所檢測的灰度級。
關(guān)于應(yīng)用的注釋 到這里為止，所述方法和裝置是一般使用的，但還有多種應(yīng)用，作為例子但不限制本發(fā)明，我們敘述一些最重要的應(yīng)用 ·分析血液樣本；在芯片(使用例如封閉電介質(zhì)電泳籠框)上引入樣本，對紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，作為第一級近似，對所有被占據(jù)的籠框計(jì)數(shù)(事實(shí)上，別的細(xì)胞也可能存在，但其濃度對通常所要求的精度來說低到可以忽略)。
·Emochroma表征血液中的細(xì)胞數(shù)目和類型；在這種情況下，采用對每一單個(gè)存在的細(xì)胞進(jìn)行精確表征的上述方法，將它分類為紅細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞等等。
·對存在于樣本中的細(xì)菌計(jì)數(shù)；通過在芯片上(具有DEP封閉籠框)注入已知體積的樣本，檢測所有存在的細(xì)菌，如有必要也可檢測類型，假如采用光學(xué)傳感器所檢測的它們的特征標(biāo)記是可辨別的話。
·從混合群體中分離/計(jì)數(shù)具有熒光標(biāo)記的細(xì)胞。這類問題在研究和診斷學(xué)兩方面廣泛受到關(guān)注。
例如，可以檢測乳制品樣本例如牛奶、酸奶、冰淇淋制品等等中的細(xì)菌。
作為一個(gè)例子，可以檢測鮮葡萄汁的發(fā)酵細(xì)菌(例如釀酒的應(yīng)用)。
作為又一個(gè)例子，可以檢測存在于飲用水體中的細(xì)菌。
權(quán)利要求
1.一種檢測微粒(BEAD)存在的方法，所述微?？赡艽嬖谟谟呻姌O(EL)的陣列產(chǎn)生的作用在所述微粒上的力場(F)的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)上，其特征在于所述方法包括以下步驟
i.使力場(F)無效；
ii.測量在無效以后并被選擇作為無效場中的微粒所經(jīng)歷的穩(wěn)定和/或布朗運(yùn)動(dòng)的動(dòng)態(tài)函數(shù)的至少一個(gè)時(shí)間間隔中，測量由與所述穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)有關(guān)的第一傳感器(PIXEL_IJ)和由與所述力場(F)的當(dāng)前配置下肯定不能被微粒占據(jù)的空間區(qū)域有關(guān)的第二傳感器(PIXEL_REF)產(chǎn)生的灰度級；
iii.重新激活力場(F)；
iv.重復(fù)若干次步驟i)至iii)，實(shí)質(zhì)上與假定作為參考的所述第二傳感器(PIXEL_REF)所檢測灰度級值的方差向其漸近值的收斂速度相當(dāng)；
v.將如下穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)分類為被微粒占據(jù)的點(diǎn)在所考察的暫態(tài)系列測量中，與該穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)有關(guān)的第一傳感器上所檢測灰度級值的標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果大于預(yù)定閾值(THR)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述閾值(THR)對應(yīng)于與不能被微粒占據(jù)的所述空間區(qū)域有關(guān)的所述第二傳感器(PIXEL_REF)上所檢測灰度級值的平均值，提高與所述第二傳感器(PIXEL_REF)上所檢測灰度級的標(biāo)準(zhǔn)偏差值成比例的一個(gè)系數(shù)。
3.一種檢測微粒(BEAD)存在的方法，所述微粒可能存在于由電極(EL)的陣列產(chǎn)生的作用在所述微粒上的力場(F)的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)上，其特征在于所述方法包括以下步驟
i.在所述力場(F)的第一當(dāng)前配置下，測量由與所述穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)有關(guān)的第一傳感器(PIXEL_STA)和由與肯定不能被微粒占據(jù)的空間區(qū)域有關(guān)的參考傳感器(PIXEL_REF)產(chǎn)生的灰度級；
ii.改變力場(F)，以便向其應(yīng)用第二當(dāng)前配置，其中所述穩(wěn)定平衡點(diǎn)與第二傳感器(PIXEL_TGT)相對應(yīng)地位移，第二傳感器不同于第一傳感器。
iii.在所述力場(F)的所述第二當(dāng)前配置下，測量由第二傳感器(PIXEL_TGT)和由與肯定不能被微粒占據(jù)的空間區(qū)域有關(guān)的參考傳感器(PIXEL_REF)產(chǎn)生的灰度級；
iv.確定前面各點(diǎn)i)和iii)所檢測灰度級值之間的差值(DIFF_IMG)；
v.重復(fù)步驟i)至iv)；
vi.處理差分灰度級值，以區(qū)分被微粒占據(jù)的和未被微粒占據(jù)的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述處理包括以下步驟確定灰度級差值的絕對值；以及將與如下傳感器有關(guān)的平衡點(diǎn)分類為被占據(jù)的平衡點(diǎn)，所述傳感器所檢測變化實(shí)質(zhì)上大于在力場(F)的所述第一和第二配置下不能被微粒占據(jù)的所述參考傳感器的灰度級平均變化。
5.一種檢測微粒(BEAD)存在的方法，所述微?？赡艽嬖谟谟呻姌O(EL)的陣列產(chǎn)生的作用在所述微粒上的力場(F)的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)上，其特征在于所述方法包括以下步驟
i.改變力場(F)，以使所述穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)位移而使得所述微粒(BEAD)的通過與有關(guān)的傳感器(PIXEL_IJ)相對應(yīng)；
ii.以實(shí)質(zhì)上高于所述微粒在新平衡位置上的穩(wěn)定時(shí)間的頻率，測量與所述不同穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)的通過有關(guān)的傳感器(PIXEL_IJ)所產(chǎn)生的灰度級；
iii.通過由所述傳感器(PIXEL_IJ)所檢測灰度級的暫態(tài)演變的至少一個(gè)特征參數(shù)的測量結(jié)果，區(qū)分微粒的存在或不存在。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于所述傳感器(PIXEL_IJ)上灰度級量度的暫態(tài)演變的特征參數(shù)包括峰間幅度。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于通過與閾值比較進(jìn)行分類，所述閾值的確定是從在所考慮的力場(F)配置下不能被微粒占據(jù)的參考傳感器上的灰度級峰間量度出發(fā)，提高與所述參考傳感器的所述峰間值標(biāo)準(zhǔn)偏差成比例的一個(gè)系數(shù)。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括對已檢測到存在的微?？倲?shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的步驟，其特征在于所述計(jì)數(shù)步驟以基于統(tǒng)計(jì)的估算的方法進(jìn)行如下
i.用傳感器測量存在于由電極(EL)的陣列產(chǎn)生的力場(F)中的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)的數(shù)目(ECmeasure)，所述穩(wěn)定平等點(diǎn)不包含任何微粒(BEAD)；
ii.微粒(BEAD)的計(jì)數(shù)(NCELLS)由穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)數(shù)(NCAGES)的對數(shù)和不包含任何微粒的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)的測量數(shù)(ECmeasure)的對數(shù)的差，與穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)數(shù)(NCAGES)的對數(shù)和穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)數(shù)減1(NCAGES-1)的對數(shù)的差兩者之比來確定。
9.一種表征存在于由電極(EL)的陣列產(chǎn)生的作用在所述微粒上的力場(F)的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)上的微粒(BEAD)的方法，其特征在于包括以下步驟
i.改變力場(F)，以使所述穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)位移而使得所述微粒(BEAD)的通過與有關(guān)的傳感器(PIXEL_IJ)相對應(yīng)；
ii.以實(shí)質(zhì)上高于所述微粒在新平衡位置上的穩(wěn)定時(shí)間的頻率，測量與包含微粒的不同穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)的通過有關(guān)的傳感器(PIXEL_IJ)所產(chǎn)生的灰度級；
iii.處理灰度級量度的暫態(tài)演變的特征參數(shù)，以估計(jì)所述微粒的性質(zhì)。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于灰度級暫態(tài)演變的所述參數(shù)包括從下列參數(shù)組中選擇的至少一個(gè)參數(shù)
i.力場(F)的變化與灰度級的初始變化之間的延時(shí)(td)；
ii.灰度級的暫態(tài)變化的長度(tw)；
iii.灰度級的正峰寬度(Gpp)；
iv.灰度級的負(fù)峰寬度(Gnp)。
11.一種對多種類型(NTP)的微粒(BEAD)進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法，所述微粒存在于由電極(EL)的陣列產(chǎn)生的作用在所述微粒上的力場(F)的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)上，其特征在于所述方法執(zhí)行如下步驟
i.改變力場(F)，以使所述穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)位移而使得所述微粒(BEAD)的通過與有關(guān)的傳感器(PIXEL_IJ)相對應(yīng)；
ii.以實(shí)質(zhì)上高于微粒在新平衡位置上的穩(wěn)定時(shí)間的頻率，測量與包含微粒的不同穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)的通過有關(guān)的傳感器(PIXEL_IJ)可檢測的灰度級；
iii.處理與每一穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)有關(guān)的灰度級暫態(tài)演變測量的特征參數(shù)，用以檢測有關(guān)的籠框是否空的，是否包含某類的一個(gè)微粒，或者是否包含更多個(gè)微粒；
iv.用數(shù)值方法確定每一類型微粒計(jì)數(shù)(NCELLSt)的組合，所述組合較好地近似具有每一類型單個(gè)微粒(Pt_1_MEAS)的籠框和空籠框(EC_MEAS)的測量值。
12.根據(jù)權(quán)利要求5或9或11所述的方法，其特征在于使所述穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)位移，使得所述微粒(BEAD)的通過與多個(gè)有關(guān)的傳感器(PIXEL_IJ)相對應(yīng)；以及所述傳感器(PIXEL_IJ)是光學(xué)傳感器并且被遮蔽，以便檢測實(shí)質(zhì)上小于微粒尺寸的空間部分上的入射光功率。
13.根據(jù)權(quán)利要求5、9或12所述的方法，其特征在于對與包含微粒的所述穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)的通過有關(guān)的傳感器(PIXEL_IJ)可檢測的灰度級變化過程進(jìn)行控制，以便確定所述微粒在新平衡位置上的穩(wěn)定暫態(tài)的結(jié)束，并從這一測量返回所述穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)的位移速度。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于在所述穩(wěn)定暫態(tài)結(jié)束時(shí)，產(chǎn)生所述力場(F)的變化以引起所述穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)的新位移。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述傳感器是光學(xué)傳感器，并且所述灰度級對應(yīng)于照射在傳感器上的光功率。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述傳感器是阻抗計(jì)傳感器。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于使用與所述力場(F)的所述當(dāng)前配置下肯定不能被微粒占據(jù)的空間區(qū)域有關(guān)的參考傳感器(PIXEL_REF)的平均值檢測歸一化的值，對所述傳感器(PIXEL_IJ)所檢測灰度級值進(jìn)行補(bǔ)償。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述灰度級的測量在暫時(shí)使所述力場(F)無效的期間內(nèi)進(jìn)行。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述力場(F)通常從正電介質(zhì)電泳、負(fù)電介質(zhì)電泳、電介質(zhì)上電潤濕、電流體動(dòng)力學(xué)流動(dòng)、電泳中選擇。
20.一種用于檢測和/或表征微粒(BEAD)的裝置，包括用于產(chǎn)生作用在所述微粒上的、由電極(EL)的陣列產(chǎn)生的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)的裝置；和與所述電極關(guān)聯(lián)的光學(xué)傳感器(PIXELS)；其特征在于所述光學(xué)傳感器設(shè)置成檢測實(shí)質(zhì)上小于微粒尺寸的傳感器部分上的入射光功率。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的裝置，其特征在于包括所述傳感器的遮蔽裝置；和開口，所述開口的數(shù)目為每一傳感器至少一個(gè)，所述開口貫穿所述遮蔽裝置而獲得，并具有小于被檢測/表征的微粒的預(yù)定尺寸。
22.一種用于檢測和/或表征微粒(BEAD)的裝置，包括用于產(chǎn)生作用在所述微粒上的、由電極(EL)的陣列產(chǎn)生的力場(F)的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(PEQ)裝置；和與所述電極關(guān)聯(lián)的傳感器(PIXEL)，其特征在于對于每一電極(EL)，第一傳感器(PIXEL_V)用來檢測垂直方向上所述微粒的移動(dòng)，第二傳感器(PIXEL_H)用來檢測水平方向上所述微粒的移動(dòng)。
23.根據(jù)權(quán)利要求20至22中任何一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于包括至少一個(gè)具有預(yù)定通帶的分色濾光器，以便至少部分地遮蔽作為光學(xué)傳感器的所述傳感器(PIXEL)。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的裝置，其特征在于包括多個(gè)分色濾光器，各具有從一組不同通帶中選擇的通帶，所述分色濾光器之間以非重疊方式安排，以便在任何情況下至少部分地遮蔽所述傳感器(PIXEL)。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的裝置，其特征在于所述至少一個(gè)分色濾光器被安排用來覆蓋所述電極(EL)，并裝備有與每一所述電極至少一部分相對應(yīng)地設(shè)置的阻斷開口。
26.根據(jù)權(quán)利要求23至25中任何一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于包括與覆蓋物(LID)相對應(yīng)地安排至少一個(gè)具有預(yù)定通帶的分色濾光器，所述覆蓋物(LID)和所述電極(EL)的陣列一起限定小室或微室，適用于接收和容納包含所述微粒的液體樣本
全文摘要
本發(fā)明涉及利用非均勻時(shí)變力場和集成光學(xué)或阻抗計(jì)傳感器對微粒進(jìn)行表征和/或計(jì)數(shù)的方法和裝置。力場可以是正的或負(fù)的電介質(zhì)電泳、電泳或電流體力學(xué)運(yùn)動(dòng)，其特征在于有關(guān)微粒(固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài))的一組穩(wěn)定平衡點(diǎn)；通過利用國際科學(xué)界稱為電介質(zhì)上電潤濕的效應(yīng)，同樣的方法可適用于操縱小滴(液態(tài)微粒)。本發(fā)明的目的是對存在于樣本中的每一微粒的位置起控制作用，以便以確定性和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使這些微粒位移，以集成光學(xué)或阻抗計(jì)傳感器檢測它們的存在和/或表征它們的類型；以及以有效的方法對它們進(jìn)行計(jì)數(shù)和操縱。
文檔編號C12M1/42GK101389747SQ200680049247
公開日2009年3月18日 申請日期2006年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月26日
發(fā)明者尼科洛·馬納雷西, 羅伯托·圭列拉, 詹內(nèi)伊·梅多羅 申請人:硅生物系統(tǒng)股份公司