調(diào)控11β-羥類固醇脫氫酶1的表達用于治療眼科疾病的制作方法

專利名稱：調(diào)控11β-羥類固醇脫氫酶1的表達用于治療眼科疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防與lip-羥類固醇脫氫酶1 (11P-HSD1) 的高水平的表達或活性相關(guān)的眼睛疾病的方法和組合物；其特別地但是不 是專門治療青光眼。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及應(yīng)用RNAi技術(shù)下 調(diào)lip-HSDl的表達。
背景技術(shù)：
青光眼是失明的一個主要的誘因。世界上大約15%的失明病例是由青 光眼導(dǎo)致的。最常見的類型，原發(fā)性開角青光眼，在年齡超過40歲的普 通群體中具有1/200的流行率。青光眼已經(jīng)簡單地定義為由高于其正常生 理界限的眼內(nèi)壓(IOP)的持續(xù)穩(wěn)定地升高引起的眼組織損傷作用。盡管一些 病因可能參與青光眼并發(fā)癥，但是在治療選擇中的絕對的決定性因素是虹 膜角膜角內(nèi)的壓力中的原發(fā)性和/或誘導(dǎo)的變化的量。
盡管在青光眼中升高的IOP導(dǎo)致神經(jīng)損傷的病理生理機制尚是未知 的，但是，目前的治療包括目的在于降低這種壓力的藥物治療或手術(shù)?？?以使用四種類型的藥物，嘗試對升高的IOP的藥物抑制(1)水性體液形 成抑制劑(諸如碳水化酶抑制劑，(3-腎上腺素阻斷劑，和a2-腎上腺素受 體激動劑)；(2)縮瞳藥(諸如擬副交感神經(jīng)藥，包括擬膽堿藥和抗膽堿酯 酶抑制劑)；(3)眼色素層鞏膜流出增強劑；和(4)高滲劑(其在睫狀上皮 細胞內(nèi)產(chǎn)生穿過血液/水性屏障的滲透壓梯度)。出現(xiàn)第五類藥物，神經(jīng)保 護藥，作為藥物治療的重要的補充，其包括，例如，NOS抑制劑、興奮性 氨基酸拮抗劑、谷氨酸受體拮抗劑、程序性細胞死亡抑制劑和鈣通道阻斷 劑。
各種眼疾病以及它們的治療的綜述可以在下述參考文獻中找到 Bunce等，2005, Associations between the deletion polymorphism of the angiotensin 1-converting enzyme gene and ocular signs of primary open-angleglaucoma (血管緊張素1-轉(zhuǎn)化酶基因的缺失多態(tài)性和原發(fā)性開角青光眼的 眼睛體癥之間的相關(guān)性).Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol.(臨床實驗眼 科學(xué)檔案)；243(4):294; Costagliola等，2000, Effect of oral losartan potassium administration on intraocular pressure in normotensive and glaucomatous human subjects( 口服氯沙坦鉀對正常血壓和青光眼人受試者的眼內(nèi)壓的作 用).Exp Eye Res (實驗眼科研究)71(2): 167; Costagliola等，1995, Effect of oral captopril (SQ 14225) on intraocular pressure in man ( 口月艮卡托普禾U (SQ 14225)對人的眼內(nèi)壓的作用).Eur J Ophthalmol.(歐洲眼科學(xué)雜志)， 5(1 ):19; Cullinane 等,2002, Renin-angiotensin system expression and secretory function in cultured human ciliary body non-pigmented epithelium (腎素-血管緊張素系統(tǒng)在培養(yǎng)的人睫狀體無色素上皮細胞中的表達和分 泌功能).Br J Ophthalmol.(英國眼科學(xué)雜志)，86(6):676; Sakaguchi等，2002, Chymase and angiotensin converting enzyme activities in a hamster model of glaucoma filtering surgery (類胰凝乳蛋白酶和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶在青光眼 過濾手術(shù)的倉鼠模型中的活性).CurrEyeRes.(現(xiàn)代眼科研究)24(5):325; Shah等，2000, Oculohypotensive effect of angiotensin converting enzyme inhibitors in acute and chronic models of glaucoma (血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制 劑在急性和慢性青光眼模型中的眼低壓作用).J Cardiovasc Pharmacol (心 血管藥學(xué)雜志)，36(2):169,和Wang等，2005, Effect of CS-088, an angiotensin ATI receptor antagonist, on intraocular pressure in glaucomatous monkey eyes (CS-088, —種血管緊張素ATI受體拮抗劑，對青光眼樣猴 子眼的眼內(nèi)壓的作用).ExpEyeRes.(實驗眼科研究)，80(5):629。
RNA干擾是由短的干擾RNAs (siRNA)介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基 因沉默作用。在20世紀90年代早期，在植物中發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象后，Andy Fire 和Craig Mello證明雙鏈RNA (dsRNA)在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis degans)中以極度有效的方式特異性并且選擇性地抑制基因表達(Fire等, 1998， Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans (雙鏈RNA在秀麗隱桿線蟲中的有力的和特異性的 遺傳干擾).Nature (自然)，391:806)。第一鏈(有義RNA)的序列與靶 信使RNA (mRNA)相對應(yīng)的區(qū)域一致。第二鏈(反義RNA)與所述mRNA
互補。結(jié)果表明，獲得的dsRNA比相對應(yīng)的單鏈RNA分子(特別是反義 RNA)更加有效數(shù)個數(shù)量級。
當(dāng)酶，DICER，遇到dsRNA并且將其切成叫作小干擾RNAs(siRNA) 片段時，RNAi作用開始。這種蛋白屬于RNA酶III核酸酶家族。蛋白質(zhì) 復(fù)合物將這些RNA殘余物聚集起來，并且將它們的密碼用作尋找并且破 壞細胞中具有匹配的序列的任何RNAs如靶mRNA的指導(dǎo)(參見，Bosher 禾口 Labouesse, 2000， RNA interference: genetic wand and genetic watchdog (RNA干擾遺傳指揮棒和遺傳的監(jiān)察者).Nat Cell Biol (自然細胞生物 學(xué))，2000, 2(2):E31,禾口 Akashi等，2001， Suppression of gene expression by RNA interference in cultured plant cells (在培養(yǎng)的植物細胞中通過RNA干 擾抑制基因表達).Antisense Nucleic Acid Drug Dev (反義核酸藥物研發(fā))， 11(6):359)。
在嘗試將RNAi用于基因敲除中，應(yīng)該意識到，哺乳動物細胞已經(jīng)發(fā) 展了許多針對病毒感染的保護機制，其可能妨礙這種方法的應(yīng)用。事實上， 極低水平的病毒dsRNA的存在引發(fā)干擾反應(yīng)，導(dǎo)致對翻譯的普遍的非特異 性的抑制，其又引發(fā)程序性細胞死亡(Williams, 1997, Role of the double-stranded RNA-activated protein kinase (PKR) in cell regulation (雙鏈 RNA-激活的蛋白激酶(PKR)在細胞調(diào)控中的作用).Biochem Soc Trans, 25(2):509; Gil禾口 Esteban， 2000， Induction of apoptosis by the dsRNA-dependent protein kinase (PKR): mechanism of action (通過dsRNA-依賴性蛋白激酶(PKR)誘導(dǎo)程序性細胞死亡作用機制).Apoptosis (程序 性細胞死亡)，5(2): 107-14)。
在2000年，據(jù)報道，在小鼠卵母細胞和早期胚胎中，dsRNA特異性抑 制3種基因。翻譯停滯，并且因此隨著胚胎繼續(xù)發(fā)育，沒有觀察到PKR反 應(yīng)(Wianny禾口Zernicka-Goetz， 2000, Specific interference with gene ftmction by double-stranded RNA in early mouse development (雙鏈RAN在早期小鼠 發(fā)育中對基因功能的特異性干擾).Nat Cell Biol (自然細胞生物學(xué))， 2(2):70)。在Ribophama AG (Kulmbach,德國)的研究表明RNAi在哺乳動 物細胞中功能性，其使用短(20-24個堿基對)的dsRNA關(guān)閉人細胞中的基 因，而不起始急性階段反應(yīng)。其它研究組進行的類似的實驗證實了這些結(jié)
果。 (Elbashir等,2001, RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide認As (認A干擾是由21-和22-個核苷酸的RNAs介導(dǎo)的). Genes Dev (基因發(fā)育),15(2): 188; Caplen等，2001, Specific Inhibition of gene expression by small double stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems(在無脊椎和脊椎系統(tǒng)中小的雙鏈RNAs對基因表達的特異性抑制). Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報)，98:9742)。在各種正 常的和癌癥人和小鼠細胞系中檢測，確定短的發(fā)夾RNAs (shRNA)可以如 它們的siRNA負體一樣有效地使基因沉默(Paddison等，2002, Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells (矢豆的 發(fā)夾RNAs (shRNAs)在哺乳動物細胞中誘導(dǎo)序歹l」-特異性沉默).Genes Dev
(基因發(fā)育)，16(8):948)。最近，另一組小RNAs (21-25個堿基對)表現(xiàn)出 介導(dǎo)基因表達的下調(diào)。這些RNAs，小時序調(diào)控的RNAs (stRNA)，在秀麗 隱桿線蟲的發(fā)育過程中調(diào)控基因表達的時間(關(guān)于綜述，參見Banerjee和 Slack, Control of developmental timing by small temporal RNAs: a paradigm for RNA-mediated regulation of gene expression (通過小時序RNAs對發(fā)育時 間的控制基因表達的RNA-介導(dǎo)的調(diào)控的范例).Bioessays (生物論文)， 2002， 24(2): 119-29，和Grosshans與Slack， 2002, Micro-RNAs : small is plentifbl(微小RNAs:小而豐富).JCell Biol(細胞生物學(xué)雜志)，156(1):17)。 科學(xué)家已經(jīng)在一些系統(tǒng)中使用RNAi，包括秀麗隱桿線蟲、果蠅
(Drosophila)、錐蟲(trypanosomes)以及其它的無脊椎動物。最近一些 組已經(jīng)表明在不同的哺乳動物細胞系(特別在HeLa細胞)中對蛋白質(zhì)生物 合成的特異性抑制，這表明，RNAi是一種用于在體外使基因沉默的廣泛 適用的方法?；谶@些結(jié)果，RNAi已經(jīng)迅速成為確認(鑒定和指定)基 因功能的公認的工具。使用短dsRNA寡核苷酸的RNAi將產(chǎn)生對只是部分 測序的基因的功能的理解。
正如己經(jīng)闡述的那樣，IOP通過水性體液(AH)的產(chǎn)生(取決于通過睫 狀上皮雙層的鈉轉(zhuǎn)運)和排出(主要通過小梁網(wǎng))之間的平衡而維持。AH 被分泌到眼睛的后室中，從虹膜和晶狀體之間的睫狀上皮細胞流過，通過 瞳孔，進入前室，并且最后放射樣流入外周，在那里它主要通過在小梁網(wǎng) (TM)中的鞏膜靜脈竇而流出，并且在更少程度上通過眼色素層鞏膜流出途
徑流出 (Davson H. The aqueous humour and intraocular pressure (水性體液 和眼內(nèi)壓),在Davson，s Physiology of the Eye (Davson眼生理學(xué)),第5 版.倫敦，Macmillan出版社，1990:3-95; Hart WM. Intraocular pressure (眼內(nèi) 壓).在HartWM,編，Adler，s Physiology of the Eye (Adler眼生理學(xué)).St Louis, Mosby-Year書籍公司(Mosby-Year Book Inc) ，1992:248-267)。
在外周上皮組織中，鈉和水轉(zhuǎn)運受皮質(zhì)類固醇和lip-羥類固醇脫氫酶 (1113-HSD)同工酶(lip-羥類固醇脫氫酶l(lip-HSDl),從可的松激活皮質(zhì) 醇；和11P-羥類固醇脫氫酶2(11(3-HSD2),將皮質(zhì)醇滅活成可的松)的調(diào)控。 ll卩-HSDl廣泛表達，在許多糖皮質(zhì)類固醇靶點組織中最顯著，所述糖皮質(zhì) 類固醇耙點組織包括肝、脂肪組織、骨骼、以及肺、血管系統(tǒng)、卵巢和中 樞神經(jīng)系統(tǒng)。
在人的眼睛中已經(jīng)描述了 11 P-HSD的表達。11 (3-HSD2在角膜內(nèi)皮細胞 中表達，而11P-HSD1更廣泛地表達在小梁網(wǎng)、晶狀體上皮細胞和角膜上皮 細胞中表達(Tomlinson JW. 11Beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 in human disease: a novel therapeutic target (人疾病中的1型11P-羥類固醇脫氫 酶新的治療靶點).MinervaEndocrinol. 2005年3月；30(1):37-46)。
11(3-HSDl，而不是lip-HSD2，位于人的無色素神經(jīng)上皮細胞或NPE 中(Rauz S， Walker EA, Shackleton CHL, Hewison M, Murray PI, Stewart PM. Expression and putative role of 11卩匿hydroxysteroid dehydrogenase isozymes within the human eye (1 ip-羥類固醇脫氫酶同工酶在人眼睛內(nèi)的表達和推 定的作用).Invest Ophthalmol Vis Sci (研究眼科學(xué)和視覺科學(xué))2001; 42:2037-42; Suzuki T, Sasano H, Kaneko C, Ogawa S, Darnel AD, Krozowski ZS. Immunohistochemical distribution of 11卩-hydroxysteroid dehydrogenase in human eye (1 ip-羥類固醇脫氫酶在人眼睛中的免疫組織化學(xué)分布).Mol Cell Endocrinol(分子細胞內(nèi)分泌學(xué))2001; 173:121-5; Mirshahi M, Nicolas C, Mirshahi A， Hecquet C， d，Hermies F, Faure JP，等，The mineralocorticoid hormone receptor and action in the eye (眼睛中的鹽皮質(zhì)激素激素受體和作 用).Biochem Biophys Res Commun (生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊)1996; 219:150-6; Stokes J, Noble J, Brett L, Philips C, Seckl JR, O'Brien C，等， Distribution of glucocorticoid and mineralocorticoid receptors and
1 ip勿droxysteroid dehydrogenases in human and rat ocular tissues (糖皮質(zhì)激 素和鹽皮質(zhì)激素受體以及l(fā)iP-羥類固醇脫氫酶在人和大鼠眼組織中的分 布).Invest Ophthalmol Vis ScK研究眼科學(xué)和視覺科學(xué))2000; 41:1629-38)。 原位雜交將11(3-HSD1的表達限定在睫狀上皮細胞中，而睫狀體組織的 RT-PCR分析證實11(3-HSD1，以及另外的糖皮質(zhì)激素受體和鹽皮質(zhì)激素受 體的表達(Rauz S, Cheung CM, Wood PJ, Coca-Prados M， Walker EA, Murray PI， Stewart PM. Inhibition of 11 beta勿droxysteroid dehydrogenase type 1 lowers intraocular pressure in patients with ocular hypertension (在,患有 眼高壓的患者中，抑制1型11(3-羥類固醇脫氫酶降低了眼內(nèi)壓).QJM.,2003 年7月；96(7);481-90)。酶llp-HSDl在決定細胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素濃度中起著 關(guān)鍵的作用，其通過在可逆的反應(yīng)中從無活性的可的松和l l-脫氫皮質(zhì)酮再 生活性糖皮質(zhì)激素(在人類中為皮質(zhì)醇，在大鼠和小鼠中為皮質(zhì)酮)。在 水性體液中己經(jīng)記錄了14: l的高的皮質(zhì)醇/皮質(zhì)酮比例，這與局部皮質(zhì)醇-產(chǎn)生系統(tǒng)一致(Rauz S， Walker EA, Shackleton CHL, Hewison M, Murray PI, Stewart PM. Expression and putative role of 11 p勿droxysteroid dehydrogenase isozymes within the human eye ( 1 l卩-f圣類固醇脫氫酶同工酶 在人眼睛中的表達和推定的作用).Invest Ophthalmol Vis Sci.(研究眼科 學(xué)和視覺科學(xué))2001;42:2037-42)。
在實驗性無對照(uncontrolled)的研究中，給志愿者口服施用甘珀酸 (CBX)， ll卩-HSDl的一種抑制劑，導(dǎo)致17.5。/。的IOP減少，表明ll卩-HSDl 活性可以部分調(diào)控鈉通過NPE-色素雙層的轉(zhuǎn)運，并且因此導(dǎo)致水性體液的 分泌(Rauz S， Walker EA, Shackleton CHL, Hewison M， Murray PI, Stewart PM. Expression and putative role of 11卩勿droxysteroid dehydrogenase isozymes within the human eye (11(3-羥類固醇脫氫酶同工酶在人眼睛中的 表達和推定的作用).Invest Ophthalmol Vis Sd.(研究眼科學(xué)和視覺科學(xué)) 2001; 42:2037-42)。此外，健康志愿者和患有眼高壓的患者(IOP升高， 但是沒有視神經(jīng)病)的隨機的、安慰劑對照的研究評估了CBX對IOP的作 用(Rauz S, Cheung CM, Wood PJ， CocaPrados M, Walker EA, Murray PI, Stewart PM. Inhibition of 11卩勿droxysteroid dehydrogenase type 1 lowers intraocular pressure in patients with ocular hypertension (在患有目艮高壓的患
者中，抑制l型lip-羥類固醇脫氫酶降低眼內(nèi)壓).QJM., 2003年7月； 96(7):481 -90)。
前文是與RNAi相關(guān)的相關(guān)技術(shù)的討論。所述討論只是為了理解其所 隨后的發(fā)明而提供，并不是承認任何所述的工作是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
發(fā)明概述
在本發(fā)明中，我們提供了通過使用siNA調(diào)控lip-羥類固醇脫氫酶l (11(3-HSDO的表達和/或活性而用于治療眼科疾病的方法和組合物。在 優(yōu)選的實施方案中，所述眼科疾病特征在于，在動物，包括人中的改變的 IOP。特別地，所述眼科疾病是青光眼。
本發(fā)明的另一個方面涉及一種分離的siNA化合物，其包括與選自SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 61的核苷酸序列互補的序列，或者包括選自SEQ ID NO 62-SEQ ID NO 122組的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個方面涉及包括靶向liP-HSDl的siNA化合物的藥物組 合物。
除了治療青光眼之外，所述方法還適用于治療眼的前室的其它疾病。 特別地，所述方法可以用于治療特征在于在眼睛中的改變的水性形成或流 出的疾病。可以按照本發(fā)明進行治療的疾病的實例包括局部疾病，如感染 或炎癥，和全身疾病，如眼色素層炎或系統(tǒng)疾病的表現(xiàn)。此外，本發(fā)明的 某些實施方案提供用于糖尿病視網(wǎng)膜病的治療。
下調(diào)作用可以通過使用雙鏈核酸部分而實現(xiàn)，所述雙鏈核酸部分叫作 siNA或小的干擾NA，其針對ll(3-HSDl的mRNA表達進行干擾。盡管修飾
的核酸或相似的化學(xué)合成的實體也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，但是所述 siNA優(yōu)選地是siRNA。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案涉及siNA的局部應(yīng)用。本發(fā)明的實施方案還提 供用于治療眼科疾病的藥物組合物。本發(fā)明可以用于局部眼科治療、參與 青光眼發(fā)病機理的靶基因的領(lǐng)域，以及應(yīng)用化學(xué)合成的實體治療動物(包 括人)的領(lǐng)域。
附圖
描述
圖l顯示與lip-HSD的兩種備選的轉(zhuǎn)錄物相對應(yīng)的GenBank登記號。
圖2顯示選作本發(fā)明的siNA的耙序列的耙基因序列的短片段。
圖3顯示本發(fā)明的siNA分子。
圖4顯示在正常血壓的新西蘭兔中，兩種siRNAs對IOP減少的最大作 用。值表示相比于對照(只使用賦形劑的對側(cè)眼睛)的IOP減少的百分數(shù) 的平均值和它們的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)。所用的siRNAs是llHSD/01: CCACAUCACCAACGCUUCUdTdT (SEQ ID 133;與人SEQ ID N。 IOO同 源的兔序歹J)和UHSD/02: CGUCAAUGUAUCAAUCACUdTdT (SEQ ID 134;具有最佳得分并且無相應(yīng)的公開的人序列的兔序列)。
圖5顯示在正常血壓的新西蘭兔中，隨著時間，siRNA 11HSD/02對IOP 減少的體內(nèi)作用。相比于對照，四次連續(xù)使用265嗎的siRNA對IOP產(chǎn)生 20.34的減少。相反，合成的siRNA對IOP水平?jīng)]有任何作用。
每個值代表在4只不同的動物中，相比于對照(只用賦形劑的對側(cè)眼 睛)的IOP減少的百分數(shù)的平均值。
發(fā)明詳述
在第一個方面中，本發(fā)明涉及siNA在制備用于治療眼科疾病的藥物中 的應(yīng)用，其中所述siNA能夠抑制ll(3-羥類固醇脫氫酶l (lip-HSDl)的表達。
當(dāng)按照本發(fā)明應(yīng)用時，術(shù)語抑制包括11P-HSD1的下調(diào)。在一個實施方 案中，按照本發(fā)明的眼科疾病特征在于，在患者中改變的眼內(nèi)壓(IOP)。在 另一個實施方案中，所述眼科疾病選自包括下列各項的組青光眼、感染、 炎癥、眼色素層炎、和系統(tǒng)疾病的表現(xiàn)。所述眼科疾病可以選自青光眼或 糖尿病視網(wǎng)膜病。按照本發(fā)明，可以在患者的眼中抑制耙基因的表達。
在一個實施方案中，按照本發(fā)明的siNA是siRNA。優(yōu)選地，所述siRNA 是dsRNA。
盡管關(guān)于RNAi的機制還是未知的，但是產(chǎn)生特異性dsRNA寡核苷酸 所需要的步驟是清楚的。已經(jīng)表明，長度為21-26個核苷酸的dsRNA雙鏈體 鏈在產(chǎn)生RNA干擾中最有效。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的siNA 長度為21-26個核苷酸。然而，按照本發(fā)明的siNA化合物的長度是沒有限 制的。選擇基因內(nèi)的正確的同源區(qū)也是重要的。當(dāng)考慮產(chǎn)生用于RNAi的 dsRNA時，諸如距離起始密碼子的距離、G/C含量和腺苷二聚體的位置的 因素是重要的。然而，所述因素的一個后果是，人們可能需要檢測一些不 同的序列用于最有效的RNAi，并且這可能是成本高的。
在1999年，Tuschl等(Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro (在體外通過雙鏈RNA的耙點mRNA降解).Genes Dev.(基 因發(fā)育)，1999; 13(24):3191-7)解釋了siRNAs的沉默作用，表明它們的效率 是雙鏈體長度、3'-突出端的長度和在這些突出端中的序列的函數(shù)。基于這 一奠基性工作，Eurogentec推薦應(yīng)該應(yīng)用下述指南選擇耙mRNA區(qū)域，以 及因此siRNA雙鏈體的序列
由于RNAi取決于復(fù)合蛋白質(zhì)相互作用的建立，所以，顯而易見地， mRNA靶應(yīng)該沒有不相關(guān)的結(jié)合因子。在這種情形中，由于它們可能更富 含調(diào)控蛋白結(jié)合位點，所以，應(yīng)該避免5，和3，不翻譯區(qū)(UTRs)和接近起始 密碼子的區(qū)域。因此，siRNA的序列選擇如下
在mRNA序列中，選擇位于AUG起始密碼子下游或終止密碼子上游 50-100 nt的區(qū)域。
在這一區(qū)域中，尋找下述序列AA(N19),CA(N19)。計算每一條鑒定 的序列的G/C百分比。理想地，G/C含量是50。/。，但是它必須低于70%，并 且大于30%。
優(yōu)選地，避免含有下述重復(fù)的序列AAA， CCC, GGG， TTT， AAAA, CCCC, GGGG, TTTT。
還進行按照mRNA的二級結(jié)構(gòu)的可及性預(yù)測。還使用最適合前述標(biāo)準(zhǔn) 的核苷酸序列進行了BLAST (即，NCBIESTs數(shù)據(jù)庫)，以確保只有一種 基因?qū)⒈皇Щ睢?br> 為了將結(jié)果的闡釋最大化，當(dāng)使用siRNAs時，應(yīng)該采取下述預(yù)防措施
在分開的實驗中，總是檢測有義和反義的單鏈。
嘗試合成的siRNA雙鏈體。這應(yīng)該具有與你的siRNA相同的核苷酸
組成但是缺少與任何其它基因(包括你的基因)的顯著的序列同源性。
如果可能，使用兩種獨立的siRNA雙鏈體敲除相同的基因，以控制 沉默過程的特異性。 實際上，將每種選擇的基因作為核苷酸序列引入到預(yù)測程序中，所述 預(yù)測程序考慮上述所有的變量，用于設(shè)計最適的寡核苷酸。這種程序掃描
任何mRNA核苷酸序列尋找易于被siRNAs耙向的區(qū)域。這種分析的輸出是 可能的siRNA寡核苷酸的得分。最高得分用于設(shè)計雙鏈的RNA寡核苷酸 (典型地21bp長，但是其它的長度也是可能的)，其典型地通過化學(xué)合成 制備。
按照本發(fā)明的核苷酸可以包括一個或多個修飾的寡核苷酸。所述一個 或多個修飾目的在于增加siNA的穩(wěn)定性或可用性。在下文引用的公布中描 述了適當(dāng)?shù)男揎椀膶嵗?，每一公布通過引用結(jié)合于此。按照本發(fā)明的這樣 修飾的實例包括，但不限于，硫代磷酸酯核苷酸間連接，2'-0-甲基核糖核 苷酸，2'-脫氧-氟核糖核苷酸，2'-脫氧核糖核苷酸，"通用堿基"核苷酸， 5-C-甲基核苷酸，以及反向脫氧非堿基(deoxyabasic)殘基的結(jié)合，在 siRNA的兩個互補鏈之間的化學(xué)交聯(lián)，和siRNA的一條鏈的3，末端的化學(xué) 修飾，中間修飾，例如，糖修飾，核酸堿基修飾和/或主鏈修飾。描述了2，-氟修飾的核糖核苷酸和2'-脫氧核糖核苷酸。
研究表明，用脫氧核糖核苷酸取代具有兩個核苷酸的3'-突出端的 21-mer siRNA雙鏈體的3'-端核苷酸突出片段對RNAi活性沒有不利影響。 已經(jīng)報道了，在所述siRNA的每一端，用脫氧核糖核苷酸取代多達4個核苷 酸是很好耐受的，而用脫氧核糖核苷酸完全取代導(dǎo)致沒有RNAi活性 (Elbashir 2001)。另外，Elbashir等還報道了用2，-0-甲基核苷酸取代siRNA 完全消除了RNAi活性。
可以使用在WO2005/044976中所述的親和性修飾的核苷。這一公布描 述了包括修飾的核苷的寡核苷酸，以具有對于它們在靶mRNA和/或互補 siNA鏈中的互補核苷酸的增加的或減少的親和力。
GB2406568描述了化學(xué)修飾的備選的修飾的寡核苷酸，以提供對降解 的提高的抗性或增加的吸收。這樣的修飾的實例包括硫代磷酸酯核苷酸間 連接，2'-0-甲基核糖核苷酸，2'-脫氧-氟核糖核苷酸，2'-脫氧核糖核苷酸， "通用堿基"核苷酸，5-C-甲基核苷酸，以及反向脫氧非堿基殘基結(jié)合。
WO2004/029212描述了修飾的寡核苷酸，以增強所述siRNA的穩(wěn)定性或提高靶向效率。修飾包括在siRNA的兩個互補鏈之間的化學(xué)交聯(lián)，和 siRNA的鏈的3'端的化學(xué)修飾。優(yōu)選的修飾是內(nèi)部修飾，例如，糖修飾， 核酸堿基修飾和/或主鏈修飾。描述了2'-氟修飾的核糖核苷酸和2'-脫氧核
糖核苷酸。
WO2005/040537還描述了可以用于本發(fā)明的修飾的寡核苷酸。 如利用dsNA和修飾的dsNA —樣，本發(fā)明可以使用短的發(fā)夾NA
(shNA); siNA分子的兩條鏈可以通過接頭區(qū)連接，其可以是核苷酸接頭或
非-核苷酸接頭。
除了按照本發(fā)明的與mRNA靶區(qū)域中的序列互補的siNA之外，可以使 用簡并siNA序列，來耙向按照本發(fā)明的同源區(qū)域。簡并siNA序列可以按照 技術(shù)人員己知的方法設(shè)計。例如，WO2005/045037描述了設(shè)計靶向這樣的 同源序列的siNA分子，例如，通過結(jié)合不規(guī)范的堿基對，例如，錯配和/ 或擺動堿基對，其可以提供其它的靶序列。在鑒定錯配的情形中，不規(guī)范 的堿基對(例如，錯配和/或擺動堿基)可以用來產(chǎn)生靶向多于一種基因序 列的siNA分子。在一個非限制性實例中，不規(guī)范的堿基對如UU和CC堿基 對用來產(chǎn)生能夠耙向具有序列同源性的不同的靶的序列的siNA分子。因 此，使用本發(fā)明的siNAs的一個優(yōu)點在于，可以設(shè)計單一的siNA，以包括 與在同源基因之間保守的核苷酸序列互補的核酸序列。在這種方法中，單 一的siNA可以用來抑制多于一種基因的表達，而不是使用多于一種siNA 分子來耙向不同的基因。
本發(fā)明的優(yōu)選的siNA分子是雙鏈的。本發(fā)明的一種siNA分子可以包括 平端，即，不包括任何突出的核苷酸的末端。在一個實施方案中，本發(fā)明 的siNA分子可以包括一個或多個平端。在優(yōu)選的實施方案中，所述siNA 分子具有3'突出端。本發(fā)明的siNA分子可以包括具有n個核苷酸(5^n》1) 的3'突出端的雙鏈體核酸分子。Elbashir(2001)表明，當(dāng)包含3'-端二核苷酸 突出端時，21個核苷酸的siRNA雙鏈體最有活性。
還關(guān)于物種之間的序列保守性而篩選了候選寡核苷酸，以促進從動物 到人類臨床研究的轉(zhuǎn)換。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，使用了保守的寡 核苷酸；這允許單一的寡核苷酸序列用于動物模型和人類臨床試驗二者 中。
本發(fā)明可以包括同時施用一種或多種種類的siNA分子?？梢赃x擇這些 一種或多種種類，以靶向相同的或不同的mRNA種類。優(yōu)選地，所述siNA 靶向選自SEQID l-SEQID61的序列，或者靶向包括SEQID 1-SEQ ID 61
的序列。
與lip-HSD的兩種備選的轉(zhuǎn)錄物相對應(yīng)的GenBank登記號顯示在表l 中。本發(fā)明允許每種轉(zhuǎn)錄物形式的單一靶向。因此，在一個實施方案中， 所述siNA靶向在表l中所示的llp-HSD的一種剪接形式。
RNAi針對的所選的寡核苷酸序列顯示在表2中。顯示的序列是siNA耙 向的DNA序列。因此，本發(fā)明使用具有與指定的DNA序列互補的序列的 NA雙鏈體。
表2中所示的序列不是限制性的。靶DNA不必要在AA或CA之后。此 外，耙DNA可以由側(cè)連任何鄰近的序列的表2中所包括的序列而組成。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及治療眼科疾病的方法，其包括施用siNA， 其中所述siNA能夠抑制11 (3-HSD1的表達。所述siNA按照本發(fā)明定義。
在另一個方面中，本發(fā)明還涉及抑制11P-HSD1的表達的方法，其包括 施用能夠抑制ll卩-HSDl的表達的siNA化合物。所述siNA按照本發(fā)明定義。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種靶向ll(3-HSDl的分離的siNA化合 物，其中所述siNA化合物包括與選自SEQ ID 1- SEQ ID 61的核苷酸序列互 補的序列。在一個實施方案中，所述siNA化合物可以包括選自SEQIDNO 62-SEQIDN0 122的組的核苷酸序列。特別地，本發(fā)明涉及一種用作藥物 的分離的siNA分子，其包括與選自SEQID l-SEQID61的核苷酸序列互補 的序列或SEQ ID No 62-122的序列。
在最后一方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包括本文所述的一種 分離的siNA化合物。在一個實施方案中，所述藥物組合物包括靶向 ll卩-HSDl的分離的siNA化合物，其中所述siNA化合物包括與選自SEQ ID 1-SEQ ID 61的核苷酸序列互補的序列，或者包括選自SEQ ID NO 62-SEQ IDN0 122組的核苷酸序列。
本發(fā)明的siNA分子及其制劑或組合物可以按照本領(lǐng)域通常所知的那 樣直接或局部(例如，局限性地)施用到眼睛。例如，siNA分子可以包括 遞送賦形劑，其包括脂質(zhì)體，用于施用給受試者。載體和稀釋劑以及它們
的鹽可以存在于藥用制劑中。核酸分子可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的 各種方法施用到細胞，所述方法包括但不限于，包封在脂質(zhì)體中，通過離 子電滲，或者通過結(jié)合到其它賦形劑中，諸如可生物降解的聚合物、水凝
膠、環(huán)糊精聚(乳酸-共-羥基乙酸)(PLGA)和PLCA微球體，可生物降解
的納米膠囊，和生物黏附的微球體，或者通過蛋白質(zhì)載體。在另一個實施 方案中，本發(fā)明的核酸分子還可以用聚吖丙啶及其衍生物，諸如聚吖丙啶
-聚乙二醇-N-乙?；肴樘前?PEI-PEG-GAL)或聚吖丙啶-聚乙二醇-三-N-乙酰基半乳糖胺(PEI-PEG-三GAL)衍生物。
本發(fā)明的siNA分子可以與破膜劑(membrane disruptive agent)禾口/或陽 離子脂質(zhì)或輔助脂質(zhì)分子復(fù)合。
可以用于本發(fā)明的遞送系統(tǒng)包括，例如，水性和非水性凝膠，乳膏， 多乳液，微乳液，脂質(zhì)體，油膏，水性和非水性溶液，洗液，氣霧劑，碳 氫化合物基質(zhì)和散劑，并且可以包含賦形劑，諸如增溶劑，滲透增強劑(例 如，脂肪酸，脂肪酸酯，脂肪醇和氨基酸)，以及親水聚合物(例如，聚 卡波非和聚乙烯吡咯垸酮)。在一個實施方案中，所述藥用載體是脂質(zhì)體 或透皮增強劑。
本發(fā)明的藥物制劑是以適合施用如系統(tǒng)或局部施用到細胞或受試者 中的形式存在，所述受試者包括，例如人。適當(dāng)?shù)男问讲糠秩Q于用途或 進入的途徑，例如，口服、透皮或通過注射。其它因素是本領(lǐng)域內(nèi)已知的， 并且包括這樣的考慮，諸如防止所述組合物或制劑行使其作用的毒性和形 式。
本發(fā)明還包括為儲存或施用而制備的組合物，其包括在藥用載體或稀 釋劑中的藥物有效量的需要的化合物。治療應(yīng)用可接受的載體或賦形劑是 制藥領(lǐng)域公知的。例如，可以提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和調(diào)味劑、這些 包括苯甲酸鈉、山梨酸、和對-羥基苯甲酸的酯。另外，可以使用抗氧化劑 和懸浮劑。
藥物有效劑量是預(yù)防、抑制發(fā)作或治療(將癥狀減輕到某種程度，優(yōu) 選地是減輕全部癥狀)疾病狀態(tài)所需要的劑量。所述藥物有效劑量取決于 疾病的類型，所用的組合物，施用途徑，被治療的哺乳動物的類型，在考 慮中的具體哺乳動物的身體特征，同時用的藥物，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人
員應(yīng)該意識到的其它因素。
一般地，施用活性成分的量在0.1mg/kg和100 mg/kg體重/天之間。 本發(fā)明的制劑可以以劑量單位制劑施用，所述劑量單位制劑包含常規(guī) 無毒的藥用載體、佐劑和/或賦形劑。制劑可以以適于口服使用的形式，例 如，作為片劑、藥片、錠劑、水性或油性混懸液、分散的散劑或粒劑、乳 劑、硬或軟膠囊、或糖漿或酏劑。口服應(yīng)用需要的組合物可以按照本領(lǐng)域 己知用于制備藥物組合物的任何方法制備，并且這樣的組合物可以包含一 種或多種這樣的甜味劑、調(diào)味劑、著色劑或防腐劑，以提供制藥學(xué)上別致 而可口的制劑。片劑包含與適用于制備片劑的無毒藥用賦形劑混合的活性 成分。
例如，這些賦形劑可以是惰性稀釋劑；諸如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、 磷酸鈣或磷酸鈉；粒化和崩解劑，例如，玉米淀粉或海藻酸；粘合劑，例 如淀粉、明膠或阿拉伯樹膠；以及潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石 粉。所述片劑可以是不包被的，或者它們可以通過已知的技術(shù)進行包被。 在一些情形中，這樣的涂層可以通過已知的技術(shù)制備，以延緩在胃腸道中 的崩解和吸收，并且由此在更長的時間周期提供緩慢恒定的作用。例如， 可以使用時間延遲物質(zhì)，諸如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
口服應(yīng)用的制劑還可以作為硬明膠膠囊存在，其中活性成分與惰性固 體稀釋劑如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合，或者作為軟明膠膠囊存在，其 中所述活性成分與水或油介質(zhì)如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。
水性混懸液包含與適用于制備水性混懸液的賦形劑混合的活性物質(zhì)。 這樣的賦形劑是混懸劑，例如，羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基-甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠和阿拉伯樹膠；分散或濕 潤劑可以是天然存在的磷脂，例如，磷脂酰膽堿，或烯化氧與脂肪酸的縮 合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或環(huán)氧乙垸與長鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物， 例如，十七烷乙烯氧基十六垸醇，或烯化氧與衍生于脂肪酸和己糖醇的偏 酯(partial ester)的縮合產(chǎn)物，如聚氧依稀山梨糖醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烷 與來脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物，例如聚乙烯脫水山梨糖醇單油 酸酯。所述水性混懸液還可以包含一種或多種防腐劑，例如乙基、或正丙 基對-羥基苯甲酸酯， 一種或多種著色劑， 一種或多種調(diào)味劑，和一種或多種甜味劑，如蔗糖或糖精。
油性混懸液可以通過將所述活性成分混懸在植物油如花生油、橄欖 油、芝麻油或椰子油中，或者混懸在礦物油如液體石蠟中而配制。所述油 性混懸液可以包含增稠劑，例如蜂蠟，硬石蠟或十六烷醇。可以加入甜味 劑和調(diào)味劑，以提供可口的口服制劑。這些組合物可以通過加入抗氧化劑 如抗壞血酸而保存。
適合通過加入水而制備水性混懸液的分散的散劑和粒劑提供與分散 劑或濕潤劑、混懸劑以及一種或多種防腐劑混合的活性成分。適當(dāng)?shù)姆稚?或濕潤劑或混懸劑由上文已經(jīng)提及的那些舉例。還可以存在其它的賦形 劑，例如，甜味劑、調(diào)味劑和著色劑。
本發(fā)明的藥物制劑還可以以水包油的乳劑形式存在。油相可以是植物 油或礦物油或這些的混合物。適當(dāng)?shù)娜榛瘎┛梢允翘烊淮嬖诘臉淠z，例如 阿拉伯樹膠或黃蓍膠，天然存在的磷脂，例如大豆、磷脂酰膽堿，以及衍 生于脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯，例如失水山梨糖醇單油酸酯，和所 述偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯。所 述乳劑還可以包含甜味劑和調(diào)味劑。
糖漿和酏劑可以用甜味劑如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖 配制。這樣的制劑還可以包含緩和劑、防腐劑和調(diào)味劑與著色劑。所述藥 物組合物可以以無菌注射水性或油質(zhì)混懸液的形式存在。
這種混懸液可以按照已知的技術(shù)使用上文已經(jīng)提及的那些適當(dāng)?shù)姆?散劑或濕潤劑和混懸劑配制。
無菌注射制劑還可以是在無毒的腸胃外(parentally)接受的稀釋劑或 溶劑中的無菌注射溶液或混懸液，例如，作為在l，3-丁二醇中的溶液存在。 其中可以使用的可接受的賦形劑和溶劑是水，Ringer's溶液和等滲氯化鈉 溶液。另外，無菌的、不揮發(fā)的油常規(guī)用作溶劑或混懸介質(zhì)。出于這一目 的，可以使用任何少刺激的不揮發(fā)的油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。 另外，脂肪酸如油酸用于制備注射劑。
本發(fā)明的核酸分子還可以以栓劑的形式施用，例如，用于所述藥物的 直腸施用。這些組合物可以通過將藥物與適當(dāng)?shù)臒o刺激性的賦形劑混合而 制備，所述適當(dāng)?shù)臒o刺激性賦形劑在常溫下是固體而在直腸溫度下是液體，并且因此將在直腸中融解，而將藥物釋放。這樣的物質(zhì)包括可可脂和 聚乙二醇。
本發(fā)明的核酸分子可以在無菌介質(zhì)中腸胃外施用。所述藥物，取決于 所用的賦形劑和濃度，可以懸浮在或溶解在賦形劑中。有利地，佐劑，如 局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑，可以溶解在所述賦形劑中。
應(yīng)該理解，對于任何具體的受試者，特定的劑量水平取決于許多因素， 包括所用的具體化合物的活性、年齡、體重、綜合健康、性別、日常飲食、 施用時間、施用途徑、和排泄速率、藥物組合以及進行治療的具體疾病的 嚴重性。
為了施用給非人動物，所述組合物還可以加入到動物飼料或飲用水 中。可以便利地配制動物飼料和飲用水組合物，以致動物在其日常飲食中 采用治療適量的組合物。還可以便利地將所述組合物作為預(yù)混合物存在， 以添加到飼料或飲用水中。
本發(fā)明的核酸分子還可以與其它治療化合物組合施用給受試者，以提 高整體治療效果。使用多種化合物治療適應(yīng)證可以增加有益作用，同時減 少副作用的存在。
備選地，本發(fā)明的某些siNA分子可以在細胞內(nèi)從真核啟動子表達?？?以遞送能夠表達所述siNA分子的重組載體并且其存在于耙細胞中。備選
地，可以使用提供核酸分子的瞬時表達的載體。必要時，這樣的載體可以
重復(fù)施用。 一旦表達，所述siNA分子與靶mRNA相互作用，并且產(chǎn)生RNAi 反應(yīng)。siNA分子表達載體的遞送可以是系統(tǒng)的，諸如通過靜脈內(nèi)或肌內(nèi)施 用，通過施用給從受試者移植的靶細胞，然后將其重新引入到受試者中， 或者通過允許引入到需要的靶細胞的任何其它方式。
獲得siRNA雙鏈體
RNAs優(yōu)選地使用適當(dāng)保護的核糖核苷亞磷酰胺和常規(guī)DNA/RNA合 成儀化學(xué)合成。將siRNA雙鏈體的一條或兩條鏈用2'-脫氧或2'-0-甲基寡核 糖核苷酸取代消除了在蒼蠅提取物中的沉默(Elbashir等.2001)。然而，在 哺乳動物細胞中，似乎可能地用2'-0-甲基寡核糖核苷酸取代有義siRNA(Ge等.RNA interference of influenza virus production by directly targeting mRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription (通 過直接靶向mRNA進行降解而RNA干擾流感病毒的產(chǎn)生并且間接地抑制 所有的病毒RNA轉(zhuǎn)錄).ProcNatlAcadSciUS A (美國國家科學(xué)院學(xué)報)， 2003; 100(5):2718-23)。
最便利地，siRNAs從商業(yè)RNA寡聚物合成供應(yīng)商獲得，它們出售不同 質(zhì)量和價位的RNA-合成產(chǎn)物。通常，21-nt的RNAs不是太難合成，并且容 易地以適用于RNAi的質(zhì)量提供。
RNA合成試劑的供應(yīng)商包括普洛里格(Proligo)(漢堡，德國)， Dharmacon研究(Dharmacon Research)(拉斐牛寺(Lafayette), CO,美國)， Glen研究(Glen Research)(斯特林(Sterling), VA，美國)，ChemGenes (阿 什蘭(Ashland) , MA,美國)，禾口Cruachem (Glasgow,英國)，Qiagen (德國)， Ambion (美國)和Invitrogen (蘇格蘭)。前述常規(guī)的RNA合成公司有資格提 供siRNAs，其具有用于耙點確定的許可。特別地，我們的siRNA供應(yīng)商是 Ambion， Dharmacon和Invitrogen，它們是提供關(guān)于siRNA的傳統(tǒng)的常規(guī)化 學(xué)合成服務(wù)，并且提供用HPLC純化并以干燥形式與無RNA酶的水一起遞 送的siRNA的公司。關(guān)于RNAi和siRNA方法的基于中樞網(wǎng)路的資源，以及 與其它siRNA相關(guān)的產(chǎn)品和服務(wù)的鏈接，可以在上文提及的供應(yīng)商的網(wǎng)頁 上找到。
當(dāng)使用單鏈RNA分子時，退火步驟是必需的。重要的是，所有處理步 驟應(yīng)該在無菌的、無RNA酶的條件下進行。為了使RNAs退火，首先，必 須通過在260納米(nm)的UV吸收而將寡聚物定量。然后使用下述基于 Elbashir等(2001)的方法進行退火
分別等分，并且將每種RNA寡聚物稀釋到50pM的濃度。
將30 pl的每種RNA寡聚物溶液和15 |nl 5X退火緩沖液組合。最終緩 沖液濃度是100 mM醋酸鉀，30 mM HEPES-KOH pH 7.4， 2 mM醋 酸鎂。終體積是75pl。
將所述溶液在90。C溫育1分鐘，將管子離心15秒，在37。C靜置1小 時，然后在室溫下使用。所述溶液可以在-2(TC冷凍保存，并且冷 凍-解凍多達5次。siRNA雙鏈體的終濃度通常是20 nM。備選地，已經(jīng)退火的dsRNA可以從供應(yīng)商處購買。
還可以使用化學(xué)修飾的核酸。例如，關(guān)于可以使用的修飾的類型的綜
述在WO03/070744中提供，其內(nèi)容通過引用結(jié)合于此。特別要注意這一公 布的第11-21頁。其它可能的修飾如上文所述。技術(shù)人員應(yīng)該意識到可以結(jié) 合到RNA分子中的其它類型的化學(xué)修飾。
"體外"系統(tǒng)
為了檢驗siRNA干擾的特異性，使用表達耙基因的不同的細胞培養(yǎng)物， 諸如無色素的睫狀上皮細胞NPE，睫狀上皮細胞OMDC，或胚胎腎細胞 HEK293。備選地，使用細胞膀胱癌細胞系T-24、肺癌細胞系A(chǔ)549或人胚 胎角化細胞HEK。
將所述細胞用相應(yīng)的siRNA雙鏈體溫育，并且進行關(guān)于靶基因表達的 下調(diào)作用的分析。為了將siRNA敲除與培養(yǎng)細胞中的特異性表型聯(lián)系在一 起，需要證明靶蛋白質(zhì)的減少或者至少證明靶mRNA的減少。
靶基因的mRNA水平通過實時定量PCR(RT-PCR)定量。此夕卜，可以以 本領(lǐng)域公知的各種方法確定蛋白水平，諸如使用針對不同的靶的特異性抗 體的蛋白質(zhì)印跡分析允許直接監(jiān)測靶蛋白的減少。
siRNA雙鏈體的轉(zhuǎn)染
本領(lǐng)域公知技術(shù)的一些實例如下我們可以是使用陽離子脂質(zhì)，諸如 RNAiFect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen)禾卩脂轉(zhuǎn)染胺2000試齊U(Invitrogen)，實施siRNA 雙鏈體的單一轉(zhuǎn)染，并且在轉(zhuǎn)染后24、 48和72小時測定沉默。
典型的轉(zhuǎn)染方法可以實施如下對于6孔平板的一個孔，我們使用終 濃度100nM的siRNA進行轉(zhuǎn)染。按照RNAiFect方法，在轉(zhuǎn)染前的那天，我 們在3 ml含有DMEM、 10%血清、抗生素和谷氨酰胺的適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基 中接種2-4X 105個細胞/ 匕并且在正常生長條件下(37'C和5。/。 C02)培養(yǎng)細 胞。在轉(zhuǎn)染那天，細胞必須達到30-50%匯合。我們將15 pl20iaM的siRNA 雙鏈體(對應(yīng)100nM的終濃度)稀釋在85pl的緩沖液EC-R中，以提供100 ial的終體積，并且通過渦旋混合。對于復(fù)合物形成，我們將19(ilRNAiFect 轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的siRNA中，并且通過吹吸或渦旋混合。在將樣品在
室溫下溫育10-15分鐘以允許形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物后，我們將所述復(fù)合物用具有
低抗生素的2.9 ml新鮮生長培養(yǎng)基逐滴加入到細胞中。在渦旋振蕩所述板
以確保轉(zhuǎn)染復(fù)合物的均勻分布后，我們將所述細胞在它們正常的生長條件 下培養(yǎng)。第二天，將所述復(fù)合物去除，并且加入新鮮和完全的生長培養(yǎng)基。
為了監(jiān)測基因沉默，在轉(zhuǎn)染后24、 48和72小時收集細胞。脂轉(zhuǎn)染胺2000 試劑方法非常相似。在轉(zhuǎn)染前的那天，我們在3 ml含有DMEM、 10%血清、 抗生素和谷氨酰胺的適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中接種2-4X 105個細胞/孔，并且在 正常生長條件下(37'C和5。/。 C02)培養(yǎng)細胞。在轉(zhuǎn)染那天，細胞必須達到 30-50%匯合。我們將12.5 pl 20 一的siRNA雙鏈體(對應(yīng)100 nM的終濃度) 稀釋在250 pl的DMEM中，以提供262.5 pl的終體積，并且混合。此外，將 6^1脂轉(zhuǎn)染胺2000稀釋在250 plDMEM中，并且混合。在室溫下溫育5分 鐘后，將稀釋的寡聚體和稀釋的脂轉(zhuǎn)染胺組合，以允許在室溫下溫育20分 鐘的過程中形成復(fù)合物。而后，我們將所述復(fù)合物用具有低抗生素的2ml 新鮮生長培養(yǎng)基逐滴加入到細胞中，并且通過前后旋轉(zhuǎn)平板而輕輕混合， 以確保轉(zhuǎn)染復(fù)合物的均勻分布。我們將所述細胞在它們正常的生長條件下 培養(yǎng)，并且在第二天，將所述復(fù)合物去除，并且加入新鮮和完全的生長培 養(yǎng)基。為了監(jiān)測基因沉默，在轉(zhuǎn)染后24、 48和72小時收集細胞。
轉(zhuǎn)染效率可以取決于細胞類型，而且取決于傳代次數(shù)和細胞的匯合。 形成siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的時間和方式(例如，顛倒相對于渦旋)也是關(guān) 鍵的。低的轉(zhuǎn)染效率是失敗的沉默的最常見的原因。良好的轉(zhuǎn)染是重要的 問題，并且需要對要用的每種新細胞系進行仔細地檢查?？梢詸z測轉(zhuǎn)染報 道基因的轉(zhuǎn)染效率，例如，CMV-推動的EGFP表達質(zhì)粒(例如，來自克隆 泰克(Clontech))或B-Gal表達質(zhì)粒，并且然后在第二天通過相差和/或熒 光顯微鏡評估。
siRNA雙鏈體的檢測
取決于耙蛋白的豐度和壽命(或周轉(zhuǎn))，敲除表型可以在1-3天后或者 甚至更久以后變得明顯。如果沒有觀察到表型，蛋白的耗盡可以通過免疫 熒光或蛋白質(zhì)印跡觀察到。
在轉(zhuǎn)染后，將從細胞提取的總RNA級分用DNA酶I預(yù)處理，并且使
用隨機引物用于反轉(zhuǎn)錄。使用覆蓋至少一個外顯子-外顯子連接的特異性引
物對進行PCR擴增，以控制前-mRNAs的擴增。非耙mRNA的RT/PCR 也需要作為對照。不可檢測的耙蛋白的減少的mRNA的有效耗盡可以表 明，在細胞中可能存在穩(wěn)定的蛋白質(zhì)的大的儲備。備選地，實時PCR擴 增可以用來以更精確的方式檢測mRNA的減少或消失。實時反轉(zhuǎn)錄酶(RT) PCR最特異性、靈敏性和可再現(xiàn)性地定量模板的初始量。實時PCR監(jiān)測 在反應(yīng)過程中出現(xiàn)的熒光，作為在每個PCR循環(huán)中的擴增子產(chǎn)量的指征。 在反應(yīng)中，這種信號以對PCR產(chǎn)物的量的正比例增加。通過記錄在每個 循環(huán)中的熒光發(fā)射的量，可以在指數(shù)階段過程中監(jiān)測PCR反應(yīng)，在所述 指數(shù)階段中，PCR產(chǎn)物的量的最初的顯著增加與靶模板的初始量相關(guān)。
為了驗證在細胞培養(yǎng)物中鑒定的差異表達的基因的干擾模式，按照供 應(yīng)商的方法實施qRT-PCR。對于定量RT-PCR(qRT-PCR)，大約250 ng總 RNA用于反轉(zhuǎn)錄，然后在含有Master SYBR Green I的反應(yīng)混合物中使用 對每種基因特異的引物進行PCR擴增?；镜腜CR條件包括在91°C30 分鐘的初始步驟，然后是40個循環(huán)95°C 5秒，62°C 10秒，和72°C 15 秒。使用與每種靶基因相對應(yīng)的特異性的引物序列。b-激動蛋白mRNA的 定量用作數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的對照。當(dāng)所選的內(nèi)源/內(nèi)部對照的基因表達更豐富， 并且保持恒定，在樣品中，與總RNA成比例時，相關(guān)基因表達的比較進 行得最好。通過使用不變的內(nèi)源對照作為活性參照，mRNA靶的定量可以 關(guān)于加入每一反應(yīng)中的總RNA的量的差異進行標(biāo)準(zhǔn)化。
動物研究
新西蘭兔是設(shè)計研究IOP的實驗平臺的黃金標(biāo)準(zhǔn)。它容易處理，并且 它具有大眼睛，大小與人的器官相似。另外，測量IOP的現(xiàn)有裝置不適合 用于具有小眼睛的動物，諸如小鼠或大鼠。最后，兔具有可以在局部使用 商購降血壓藥物而下降至其值的多達40。/。的IOP (約23mmHg)。因此， 盡管可能產(chǎn)生兔青光眼模型(例如，手術(shù)阻斷鞏膜外層靜脈或者人工封閉 小梁網(wǎng))，由于在我們的掌握中，IOP的藥理學(xué)下降可以容易地并且可再 現(xiàn)地測量，所以，我們已經(jīng)使用了正常血壓的兔。
實驗方法
使用正常血壓的新西蘭白兔(雄性，2-3 kg)。將動物詞養(yǎng)在具有食物 和水的自由通道的獨立的籠子中。將它們置于人工的12小時光照/12小時 黑暗的循環(huán)中，以避免不可控制的IOP的晝夜擺動。動物處理和治療按照 歐洲國會指示(European Communities Council Directive) (86/609/EEC)和視 覺禾口目艮禾斗學(xué)研究協(xié)會 (Association for Research in Vision and Ophthalmology)關(guān)于在眼科學(xué)和視覺研究中使用的動物的闡述進行。
藥物典型地通過在角膜表面上緩慢輸注小體積(典型地40 pl)而施用。 對側(cè)的眼睛只用賦形劑處理，并且可以在每次實驗中用作對照，以免存在 與另一只眼睛相同的現(xiàn)象?？梢员苊庠谕恢粍游镏羞M行多次實驗。
使用接觸式壓力計(TONOPEN XL, Mentor, Norwell, Massachusetts)進 行IOP測量。由于其可靠性和小的大小，TonoPen壓力計是非常方便的。 對角膜表面使用壓力計傳感器，巧妙地使用這種儀器進行測量。這種裝置 已經(jīng)證明是在兔中測量3-30 mm Hg范圍內(nèi)的眼內(nèi)壓的選擇的壓力計 (Abrams等.Comparison of three tonometers for measuring intraocular pressure in rabbits (在兔中測量眼內(nèi)壓的三種壓力計的比較).Invest Ophthalmol Vis Sci (研究眼科學(xué)和視覺科學(xué)).1996年4月；37(5):940-4)。 所有的測量都落入這一區(qū)間內(nèi)眼內(nèi)壓的平均基線值是17.0±0.39mmHg Cn-lOO)。由于IOP從晚上到白天有變化，所以，所有的實驗在同一時間 進行，以允許IOP更穩(wěn)定，并且允許與賦形劑治療的客觀比較。為了避免 動物的痛苦，將兔局部麻醉(丁氧普魯卡因/丁卡因，0.4%/l%，在鹽水溶 液中(l/4v:v))。在進行每次眼內(nèi)壓測量之前，將溶液應(yīng)用(lOpl)到角膜 上。將siRNA或鹽水以40pl的體積局部應(yīng)用到角膜上。
在兔中應(yīng)用siRNA的標(biāo)準(zhǔn)方法如下在連續(xù)4天內(nèi)，每天將在鹽水溶 液(0.9% w/v)中的終體積40 |il的siRNA的劑量應(yīng)用到一只眼睛中。對側(cè)的 眼睛作為對照，并且在同一時間點，將40 pi的無菌鹽水(0.9% w/v)緩慢輸 注于其上。在10天的過程中，在每次應(yīng)用前，和在輸注后2小時、4小時 和6小時，測量IOP。在第二和第三天之間觀察到最大反應(yīng)。為了比較 siRNA與其它降壓化合物的作用，檢測了適利達(拉坦前列素0.005%)和 Trustop(多佐胺2%)，并且在相同條件下測量IOP。 基于上文所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，處理兔。這些實驗表明兩種siRNAs對正 常血壓的新西蘭兔的IOP的減少的最大作用。在圖4中的值代表相對于對 照(只用賦形劑的對側(cè)眼睛)的IOP減少的百分數(shù)的平均值和它們的標(biāo)準(zhǔn) 誤差(SD)。 所用的 siRNAs 為 11HSD/01: CCACAUCACCAA CGCUUCUdTdT (SEQ ID 133;與人SEQ ID N。 100同源的兔序列)和 11HSD/02: CGUCAAUGUAUCAAUCACUdTdT (SEQ ID 134;具有最佳得 分并且無相應(yīng)的公開的人序列的兔序列)。
結(jié)果還表示了隨著時間，siRNA 11HSD/02對正常血壓的新西蘭兔的 IOP減少的體內(nèi)作用(圖5)。相比于對照，四次連續(xù)使用265嗎的siRNA 對IOP產(chǎn)生20.34的減少。相反，合成的siRNA對IOP水平?jīng)]有任何作用。 每個值代表在4只不同的動物中，相比于對照(只用賦形劑的對側(cè)眼睛) 的IOP減少的百分數(shù)的平均值。
權(quán)利要求
1.siNA在制備用于治療眼睛疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述siNA能夠抑制11β-羥類固醇脫氫酶1(11β-HSD1)的表達。
2. 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中所述眼睛疾病特征在于在患者中改變的眼 內(nèi)壓(IOP)。
3. 權(quán)利要求l或2的應(yīng)用，其中所述眼睛疾病選自包含青光眼、感染、 炎癥、眼色素層炎和系統(tǒng)疾病的表現(xiàn)的組。
4. 前述權(quán)利要求任一項的應(yīng)用，其中所述眼睛疾病是青光眼。
5. 前述權(quán)利要求任一項的應(yīng)用，其中所述眼睛疾病是糖尿病視網(wǎng)膜病。
6. 前述權(quán)利要求任一項的應(yīng)用，其中在患者的眼睛中，所述靶基因表 達被抑制。
7. 前述權(quán)利要求任一項的應(yīng)用，其中所述siNA是siRNA。
8. 權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中所述siRNA是dsRNA。
9. 權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中所述siRNA是shRNA。
10. 前述權(quán)利要求任一項的應(yīng)用，其中所述siNA包括一種或多種修 飾的寡核苷酸。
11. 前述權(quán)利要求任一項的應(yīng)用，其中將所述siNA局部施用到患者的 眼睛中。
12. 權(quán)利要求ll的應(yīng)用，其中將所述siNA施用到患者的角膜中。
13. 前述權(quán)利要求任一項的應(yīng)用，其中使用多種種類的siNA。
14. 權(quán)利要求13的應(yīng)用，其中所述多種種類靶向同一mRNA種類。
15. 前述權(quán)利要求任一項的應(yīng)用，其中所述siNA靶向選自SEQIDNO 1-SEQIDN061的序列，或者耙向包括SEQ ID NO 1-SEQIDNO 61的序 列。
16. 前述權(quán)利要求任一項的應(yīng)用，其中所述靶基因是11(3-HSD1，并且 所述siNA耙向選自SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 61的序列，或者靶向包括 SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 61的序列。
17. 前述權(quán)利要求任一項的應(yīng)用，其中本發(fā)明的siNA分子包括選自 SEQ IDN0 62-SEQ ID NO 122的組的核苷酸序列。
18. 權(quán)利要求17的應(yīng)用，其中所述siNA分子包含3'突出端。
19. 一種治療眼睛疾病的方法，其包括施用siNA，其中所述siNA能 夠抑制llp-HSDl的表達。
20. —種靶向11P-HSD1的分離的siNA化合物，其中所述siNA化合 物包括與選自SEQIDNO 1-SEQIDN0 61的核苷酸序列互補的序列。
21. —種靶向llp-HSDl的分離的siNA化合物，其中所述siNA化合 物包括選自SEQIDN0 62-SEQIDNO 122的組的核苷酸序列。
22. 權(quán)利要求20和21的分離的siNA化合物，其中所述siNA是 siRNA。
23. 權(quán)利要求22的分離的siNA化合物，其中所述siRNA是dsRNA。
24. 權(quán)利要求22的分離的siNA化合物，其中所述siRNA是shRNA。
25. 按照權(quán)利要求20-24中任一項所述的分離的siNA化合物，其中所 述siNA包括修飾的寡核苷酸。 '
26. 權(quán)利要求20-25的分離的siNA化合物，其還包括3'突出端。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療眼睛疾病的siNA組合物和方法，其中所述siNA化合物能夠抑制11β-羥類固醇脫氫酶(11β-HSD1)的表達。
文檔編號C12N15/113GK101346467SQ200680049061
公開日2009年1月14日 申請日期2006年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月25日
發(fā)明者M#+[a]·康塞普希翁·希門尼斯戈麥斯, 安娜·伊薩貝爾·希門尼斯安東, 安赫拉·塞斯托·亞格 申請人:西倫蒂斯公司