專利名稱：：減少核酸雜交中C<sub>o</sub>t-1DNA畸變的發(fā)生的制作方法減少核酸雜交中Cot-lDNA畸變的發(fā)生相關(guān)申請的交叉參考本申請要求之前于2005年11月18日提交的待批臨時申請系列號60/737，986的權(quán)益，其內(nèi)容納入本文作參考。序列表本申請還附紙件形式的序列表，也納入本文作為參考，同時以計算機可讀的ASCII文件形式在U.S.P.T.O電子提交系統(tǒng)中遞交相同內(nèi)容。發(fā)明背景1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及抑制耙基因組或轉(zhuǎn)錄基因組中存在的重復(fù)元件與核酸探針中對應(yīng)的重復(fù)元件之間非特異性交叉雜交，同時避免探針中單拷貝序列與抑制性DNA中外來單拷貝序列之間偶然雜交的材料和方法。更具體說，本發(fā)明涉及開發(fā)和應(yīng)用基本上缺乏重復(fù)序列的探針，和開發(fā)和應(yīng)用合成的基本上沒有單拷貝元件的抑制性重復(fù)DNA。甚至更具體說，這類重復(fù)DNA包含的重復(fù)序列對應(yīng)于毗鄰一外或多個代表性基因組區(qū)域中的單拷貝元件的中至高拷貝重復(fù)元件。2.現(xiàn)有技術(shù)描述微陣列和陣列為基礎(chǔ)的比較基因組雜交研究已促進了對基因表達和基因座拷貝數(shù)的廣泛基因組研究。不同實驗室交互驗證研究提出了關(guān)于這些技術(shù)重復(fù)性的持續(xù)討論"5。減少復(fù)制研究所得結(jié)果差異的策略集中于關(guān)注如何使技術(shù)因素，如陣列產(chǎn)品、RNA合成、標(biāo)記、雜交、掃描、和數(shù)據(jù)分析的標(biāo)準(zhǔn)化6—8。Zakharkin等s提出樣品之間的生物學(xué)差異是這種差異的最大來源，其它因素的作用程度較弱。當(dāng)用雜交探針分析DNA時，必須先封閉耙DNA中的重復(fù)序列，然后才使探針與靶DNA雜交，以心避免探針中的重復(fù)元件與靶DNA中的同源重復(fù)元件之間雜交產(chǎn)生高背景噪音。單倍體基因組中常有多個拷貝的重復(fù)序列?？截悢?shù)范圍從二個到數(shù)十萬個，其中DNA的A1U家族是后者數(shù)目變化的典型例子。多個拷貝的重復(fù)序列可聚集成簇或間插在整個基因組中。重復(fù)序列可在基因組中一處或多處聚集成簇，例如重復(fù)序列可位于各染色體的著絲點處和有各種數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)Nakamura等，Science,235;1616(1987);或重復(fù)序列可分布在一個染色體上，如Bardoni等，Cytogenet.CellGenet，46:575(1987)報導(dǎo)只在X染色體裁上發(fā)現(xiàn)有重復(fù)序列；或重復(fù)序列可分布在所有的染色體上，如重復(fù)序列的Alu家族?；蛑锌砂l(fā)現(xiàn)復(fù)雜性低的簡單重復(fù)序列，但在基因組的非編碼序列中更常見。這種重復(fù)元件由一個、二個、三個、四個、或五個核苷酸核心序列元件組成，排列成串聯(lián)單元。不同個體基因組中相同位置處包含這些重復(fù)序列的串聯(lián)單元數(shù)目常不同。搜尋基因組序列中的核心序列元件的保守性連綴可發(fā)現(xiàn)這些重復(fù)元件。競爭雜交，也稱為抑制雜交提供了封閉可能的壓倒性DNA信號的方法。未標(biāo)記的競爭DNA或抑制DNA含有能結(jié)合耙DNA中同源重復(fù)元件的高數(shù)量重復(fù)元件，因此能阻止標(biāo)記探針的重復(fù)部分與靶核酸中這種重復(fù)元件結(jié)合，從而提高探針主要與非重復(fù)性靶序列雜交的幾率。大多數(shù)微陣列雜交研究共同需要利用富含重復(fù)序列(C。t-l)的DNA來抑制或封閉探針中的重復(fù)朝花夕拾與基因組(或轉(zhuǎn)錄基因組)中其它部位之間的非特異性交叉雜交?，F(xiàn)有技術(shù)通常在FISH之前山性DNA勸C。t-1與耙DNA的雜交以避免發(fā)生背景雜交，即非特異性雜交。在人類中，這種C。t-l組分高度集中于含有間插重復(fù)元件，如短和長間插重復(fù)元件SINE和LINE^'"的家族中。商品化產(chǎn)生C。t-1DNA制品的方法反復(fù)說明基因組DNA的變性和重連接，這可通過Alu元件(三重折疊大大超過正常基因組的相應(yīng)水平)和Ll元件(四重折疊大大超過正?；蚪M的相應(yīng)水平)的豐富程度來監(jiān)測。目前的質(zhì)控方法不能測定C。t-1DNA的精確組成或序列。雖然C。t-l組分看來能抑制探針的重復(fù)元件與耙DNA的對應(yīng)或同源重復(fù)元件之間的非特異性雜交，但也增加了實驗的嗓音12(圖1)。因此，研究了C。t-l組成中的差異是否可能是基因組雜交研究結(jié)果差異的主要來源。采用序列明確的基因組單拷貝(SC)探針"和由毗鄰的SC及重復(fù)性基因組序列構(gòu)成的探針，進行定量微球體雜交試驗(QMHf'"闡明了C。t-1在基因組雜交中的作用。確定C。t-1能促進包含毗鄰的共生同源重復(fù)序列(通常與該探針無關(guān))的穩(wěn)定雙鏈體(探針中的一拷貝序列與C。t-lDNA中的一拷貝序列雜交)的形成，從而阻止了對一拷貝序列雜交的精確量化。C。t-1中的一拷貝元件與探針中一拷貝的同源元件雜交扭曲了(假擴增)探針信號。圖1說明C。t-1105與基因組DNA靶100雜交抑制或阻斷了靶100中重復(fù)元件115不能被利用與探針110中的共生同源重復(fù)元件120雜交。顯示重復(fù)元件115與C。t-1DNA105中的抑制性重復(fù)元件117平行(進化)相關(guān)，從而表明元件115與117能雜交。作為現(xiàn)有技術(shù)的一種典型，探針110包含一個拷貝元件135及外來的重復(fù)元件120，選擇和合成一拷貝元件135使之與靶100中的一個同源拷貝元件140選擇性雜交。如上所述，將探針110偶聯(lián)于微球145用于探針的檢測和定量。如該研究所預(yù)計的那樣，顯示探針110能與靶110雜交。除與靶115中的重復(fù)元件雜交外，C。t-1105中的一拷貝元件130也與探針125中的同源單拷貝元件135雜交，從而提高了該探針的信號3倍。2006年8月16日提交的題為"微球懸液雜交的量化及其應(yīng)用(QuantificationofMicrosphereSuspensionHybridizationandUsesThereof)"的專禾U申請PCT/US2006/032693采用低或單個拷貝的基因組雜交探針的微球懸液雜交試驗，能用流式細胞計數(shù)法直接分析整個基因組DNA(或RNA)，此專利內(nèi)容納入本文作參考。因此，本領(lǐng)域需要抑制核酸探針與C。t-1DNA中元件雜交時產(chǎn)生信號畸變的方法；抑制探針與耙DNA非特異性雜交的方法；抑制抑制性或競爭性DNA與耙部分以及探針中單個拷貝序列雜交的方法；鑒定和合成抑制性DNA，合成的重復(fù)性DNA產(chǎn)物有效作為抑制性DNA的方法；和利用這種合成的抑制性DNA與基本上沒有重復(fù)元件的單個拷貝探針聯(lián)合的核酸雜交系統(tǒng)。發(fā)明概述本發(fā)明通過用合成的富含重復(fù)元件但基本上沒有單個拷貝元件或很低的9抑制性核酸替代C。t-l，克服了上述問題并提供了抑制C。t-1DNA所致畸變作用的新方法和產(chǎn)品。概括地說，本發(fā)明方法包括制備合成的抑制性DNA和使此抑制性DNA與耙基因組DNA雜交以封閉靶部分中重復(fù)序列，然后使探針與靶部分雜交的步驟。優(yōu)選，所述針沒有或基本上沒有重復(fù)元件，所述抑制性DNA沒有或基本上沒有單或低拷貝的DNA延伸段。在某些優(yōu)選形式中，所述方法包括的步驟為通過偶聯(lián)光譜編碼(spectrally-encoded)的聚苯乙烯微球與選擇的低拷貝合成的DNA序列制備雜交探針；使靶基因組DNA與本發(fā)明的合成的抑制性或封閉性DNA預(yù)雜交；再使所述探針與靶基因組DNA雜交；和用流式細胞計數(shù)法檢測雜交產(chǎn)物。雜交試驗中出現(xiàn)的C。t-1所導(dǎo)致的信號畸變通過靶部分與合成的重復(fù)元件預(yù)雜交抑制了交叉雜交而減少，所述的重復(fù)元件沒有或基本上沒有單個拷貝序列，優(yōu)選沒有或基本上沒有低拷貝序列。與目前的雜交試驗不同，本發(fā)明的雜交試驗用開發(fā)的包含選擇的重復(fù)元件但不包含競爭性單(或低)拷貝元件的DNA替代C。t-1抑制性DNA。所選的本發(fā)明的合成DNA優(yōu)選是由于其與側(cè)接有單(或低)拷貝感興趣序列的靶DNA的重復(fù)區(qū)域同源，所述感興趣序列對應(yīng)于所述單(或低)拷貝雜交探針的序列或與之同源，所述雜交探針設(shè)計用來與所述感興趣單(或低)拷貝序列雜交。本發(fā)明的方法和產(chǎn)物能有效減少(l)抑制性DNA與探針中同源元件之間，(2)探針中單或低拷貝元件與抑制性DNA中的同源單(或低)拷貝元件之間，和(3)探針中重復(fù)元件與靶基因組序列中同源元件之間的額外交叉雜交。本發(fā)明的單或低拷貝探針優(yōu)選基本上，甚至更優(yōu)選完全沒有重復(fù)元件，合成的抑制性DNA基本上，甚至更優(yōu)選完全沒有單或低拷貝元件。圖2說明合成的抑制性DNA205與基因組DNA靶200雜交能抑制或封閉此耙DNA中的重復(fù)元件215。如圖所示，合成的抑制性DNA205不提供額外的能與探針210中單或低拷貝元件235，或耙200中單或低拷貝元件240雜交的單或低拷貝元件，從而明顯減少了此試驗中單或低拷貝元件的交叉雜交。合成的探針210優(yōu)選包含一個或多個單拷貝或低拷貝元件，但沒有可能與抑制性DNA205或靶200中同源重復(fù)序列雜交的重復(fù)元件。圖2中，探針信號與靶200中所含的單拷貝或低拷貝元件240的直接(信號)對比為1:1。因此，本發(fā)明一方面提供抑制核酸探針中存在的重復(fù)序列與靶核酸基因組中同源重復(fù)序列之間非特異性交叉雜交的方法。一般來說，該方法包括鑒定代表性基因組區(qū)域中的重復(fù)序列，合成衍生自所鑒定的重復(fù)序列的抑制性核酸，和使所述抑制性核酸與靶核酸反應(yīng)。所述抑制性核酸宜含有一個或多個選自短散布元件、長散布元件、長末端重復(fù)序列、Alu元件、L1元件和DNA轉(zhuǎn)座子的序列明確的PCR產(chǎn)物。此反應(yīng)導(dǎo)致所述抑制性核酸中的重復(fù)序列與靶核酸中的同源重復(fù)序列雜交，從而基本上封閉了靶核酸中的重復(fù)序列使其不能與后續(xù)的反應(yīng)性核酸探針中的同源重復(fù)序列雜交，結(jié)果抑制了探針中重復(fù)序列與靶核酸中同源重復(fù)序列之間的非特異性交叉雜交。這種抑制作用因所述抑制性核酸基本上由所鑒定的重復(fù)序列組成又基本上沒有低拷貝序列而大大增強。合成的所述抑制性核酸優(yōu)選完全沒有低拷貝序列。在優(yōu)選形式中，靶核酸包含低拷貝序列。合成的所述抑制性核酸優(yōu)選包含選出的與一個或多個代表性基因組區(qū)域中的毗鄰低拷貝序列的重復(fù)序列相對應(yīng)的多個重復(fù)序列。在某些優(yōu)選形式中，本發(fā)明方法還包括使靶核酸與含有與所述靶核酸中的低拷貝序列同源的低拷貝序列的一外或多個探針雜交的步驟。在優(yōu)選形式中，所述探針基本上，甚至更優(yōu)選完全沒有重復(fù)序列。在其它優(yōu)選形式，本發(fā)明方法包括使所述探針與光譜編碼的聚苯乙烯微球偶聯(lián)。此種探針優(yōu)選用可檢測部分標(biāo)記以提高其可利用性。一些優(yōu)選的可檢測部分包括熒光團、酶偶聯(lián)物、熒光團標(biāo)簽核苷酸、與攜帶抗原的核苷酸結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體、生物素-dUTP、地高辛(digoxygenin)-dUTP和它們的組合。此法以及本文中其它地方所述的方法可用于任何程序，這些程序中Cot-lDNA已用于或可能用于選自微陣列雜交試驗、熒光原位雜交試驗和微球體雜交試驗等試驗。另一方面提供合成抑制性核酸的方法。此方法一般包括鑒定代表性基因組區(qū)域中的重復(fù)序列；和通過合成能與所鑒定的重復(fù)序列雜交但不與所述代表性基因組區(qū)域附近或其中的低拷貝序列雜交的核酸序列來合成所述抑制性核酸的步驟。此合成的抑制性核酸優(yōu)選基本上沒有低拷貝序列。在某些優(yōu)選形式中，本發(fā)明方法也包括根據(jù)它們與感興趣低拷貝序列的相鄰性(proximity)選擇某些經(jīng)鑒定的重復(fù)序列來合成所述抑制核酸。這些經(jīng)鑒定的重復(fù)序列是最靠近感興趣低拷貝序列的那些序列。此種合成的抑制核酸優(yōu)選不含有能與該感興趣低拷貝序列雜交的序列。當(dāng)然，本發(fā)明的合成的抑制性核酸可用于雜交試驗，特別是可用于Cot-l或封閉DNA的雜交試驗。一些優(yōu)選的雜交試驗包括熒光原位雜交試驗，微陣列試驗和微球體雜交試驗。本發(fā)明另一方面提供提高低拷貝數(shù)核酸探針與靶核酸中同源區(qū)域之間雜交特異性的新型方法。此方法通常包括使靶核酸中的重復(fù)元件與抑制性核酸中的同源重復(fù)元件雜交的步驟，其中，合成或選擇的抑制性核酸包含多個重復(fù)元件，且基本上，更優(yōu)選，完全不含有低拷貝數(shù)元件，和使靶核酸中的低拷貝數(shù)元件與一個或多個核酸探針中的同源低拷貝數(shù)元件雜交。在優(yōu)選形式中，選出的所述抑制性核酸中的重復(fù)元件與一個或多個代表性基因組區(qū)域中低拷貝元件側(cè)翼的重復(fù)元件基本同源。甚至更優(yōu)選，此側(cè)翼重復(fù)元件是中到高拷貝數(shù)，而所述低拷貝元件包括單拷貝元件。還要更優(yōu)選，所述探針基本上沒有重復(fù)元件。本發(fā)明另一方面提供精確量化核酸序列拷貝數(shù)的方法。這種方法通常包括的步驟有制備具有第一光譜地址的第一光譜編碼熒光微球，和具有第二光譜地址的第二光譜編碼熒光微球，通過確認懷疑含有感興趣序列的靶核酸序列的核苷酸-核苷酸序列鑒定靶基因組核酸探針的序列，合成由鑒定的耙基因組核酸探針序列衍生的低拷貝靶探針，此靶探針含有至少一個低拷貝元件且基本上沒有重復(fù)元件，將此耙探針與第一微球偶聯(lián)，合成所選的與該耙核酸序列的參比核酸序列雜交的參比探針，將所述參比探針與具有第二光譜地址的微球偶聯(lián)，鑒定代表性基因組區(qū)域中的重復(fù)序列，合成抑制性核酸，所述抑制性核酸包含與所述鑒定的重復(fù)序列雜交的充分同源性序列，所述抑制性核酸基本上含有重復(fù)元件且基本上沒有低拷貝元件，使抑制性核酸與染色體靶核酸反應(yīng)，從而導(dǎo)致抑制性核酸中的重復(fù)元件與染色體靶序列中的同源重復(fù)元件雜交，使靶探針與染色體靶序列反應(yīng)從而導(dǎo)致靶探針中低拷貝元件與染色體靶序列中的同源低拷貝元件雜交，使抑制性核酸與含有染色體靶序列染色體參比序列反應(yīng)從而導(dǎo)致抑制性核酸中的重復(fù)元件與染色體參比序列中的同源重復(fù)元件雜交，使參比探針與染色體參比序列反應(yīng)從而導(dǎo)致參比探針與參比染色體雜交，通過第一光譜地址檢測雜交的靶探針，通過第二光譜地址檢測雜交的參比探針，和比較檢測到的雜交耙探針的反應(yīng)與檢測到的雜交參比探針的反應(yīng)來量化檢測到的靶探針。在優(yōu)選形式中，所述抑制性DNA包含的重復(fù)元件與耙中低拷貝元件相毗鄰的基因組重復(fù)元件相對應(yīng)的重復(fù)元件。本發(fā)明另一方面，提供抑制核酸探針中存在的重復(fù)元件與靶核酸中的同源重復(fù)元件之間非特異性交叉雜交的方法。此方法通常包括使抑制性核酸與含有一個或多個低拷貝元件的靶核酸中同源重復(fù)元件雜交的步驟。優(yōu)選地，合成或選擇的抑制性核酸含有選出的與含有毗鄰中至高拷貝數(shù)重復(fù)元件的單拷貝區(qū)域的一個或多個代表性基因組區(qū)域相對應(yīng)的多個重復(fù)元件且基本上不含低拷貝元件。然后，再使所述靶核酸與含有與所述靶中的低拷貝元件同源的低拷貝元件的一個或多個探針雜交，所述探針基本上不含重復(fù)序列。本發(fā)明另一方面，提供抑制抑制性核酸中存在的低拷貝元件與靶核酸中的同源低拷貝元件之間的非特異性交叉雜交的方法。該方法通常包括鑒定靶核酸中和附近的重復(fù)性和低拷貝元件，通過從所述靶核酸中選擇重復(fù)序列將其包含在所述制性核酸中同時在所述合成中基本上避免包含低拷貝序列來合成抑制性核酸序列，和使合成的抑制性核酸與耙核酸反應(yīng)，而使各同源性抑制核酸與靶核酸元件互相雜交。本發(fā)明也提供利用抑制或封閉DNA(如Cot-lDNA)來提高試驗精確度和重復(fù)性的方法，包括選擇或合成含有多個重復(fù)元件但基本上沒有低拷貝序列的抑制性核酸，和釆用所選擇的或合成的抑制性核酸替代Cot-lDNA的步驟。本發(fā)明另一方面，提供抑制基因組靶核酸與核酸探針額外雜交的方法。此方法通常包括選擇基因組中對應(yīng)于感興趣序列的一條或多條序列來制備用于雜交的基因組靶核酸；鑒定感興趣靶序列中的低拷貝序列；合成與所鑒定到的低拷貝耙序列同源的低拷貝探針，所述低拷貝探針基本上沒有重復(fù)序列；鑒定毗鄰于靶低拷貝序列的重復(fù)序列；合成與靶重復(fù)序列同源的抑制性DNA，該抑制性DNA基本上含有重復(fù)元件；使耙核酸與該抑制性DNA反應(yīng)從而該抑制性DNA中的重復(fù)元件與靶核酸中的同源重復(fù)元件雜交；使靶核酸與所述低拷貝探針反應(yīng)而使所述探針中的低拷貝元件與所述耙核酸中的同源低拷貝元件雜交；和檢測該低拷貝探針以量化探針與靶的雜交，從而確定靶核酸中替代的低拷貝元件。定義除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員共同理解的相同含意。所有專利申請、公開的專利申請和其它公開的專利及本文參考的GenBank與其它數(shù)據(jù)庫的序列它們的內(nèi)容都納入本文作參考。如果此節(jié)所述的定義與所述專利申請、公開的專利申請和其它公開的專利及納入本文作參考的GenBank與其它數(shù)據(jù)庫的序列內(nèi)容相反或不一致，將取此節(jié)中所述及的定義而不取納入本文的參考文獻中的定義。如本文所用，"一個"或"一種"指"至少一個"或"一個或多個"。如本文所用，"核酸"指任何形式的脫氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)，包括單鏈、雙鏈體、三鏈體、線性和環(huán)形。如本文所用，"序列"指核酸序列。如本文所用，術(shù)語"參比探針"指對基因組中某基因座的特異性探針，所述基因座優(yōu)選常染色體序列中可造成嚴重損傷和優(yōu)選致死性的具有拷貝數(shù)除2以外的基因座。參比探針可衍生自任何低拷貝或單拷貝染色體基因座，只要它在病人樣品中具有正常的染色體組分。在為診斷體質(zhì)疾病而測定基因組拷貝數(shù)時，參比探針通常是常染色體來源的正常發(fā)育中需要由二個等位基因表達的一個或多個基因(的探針)。對診斷癌癥疾病而測定基因組拷貝數(shù)，從含有少量致癌基因的染色體區(qū)域選擇參比探針，其應(yīng)含有染色體的正常成分。如本文所用，"標(biāo)記物"批號具有可檢測物理性能的化學(xué)基團或部分，或任何能導(dǎo)致化學(xué)基團或部分顯示楞檢測性能的化合物，如能催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓹z測產(chǎn)物的酶。術(shù)語"標(biāo)記物"也包括能抑制特定物理性能表達的化合物。"標(biāo)記物"可以是結(jié)合對的一成員化合物，另一成員具有可檢測的物理性能。示范性標(biāo)記物包括質(zhì)量基團、熒光基團、冷光基團、化學(xué)發(fā)光基團、光學(xué)基團、帶電基團、極性基團、色素、半抗原、蛋白質(zhì)結(jié)合配體、核苷酸序列、放射基團、酶、特定顆粒和它們的組合。如本文所用，"樣品"指可能含有待分析靶核酸的材料。樣品可以是生物樣品，如生物體液或生物組織。生物體液的例子包括尿液、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰液、腦脊液、眼淚、粘液、羊水等。生物組織是聚集的細胞，常由特定類型細胞與它們的胞間成分一起形成人的結(jié)構(gòu)，動物、植物、細菌、真菌或病毒的結(jié)構(gòu)，包括結(jié)締、上皮、皮膚、肌肉和神經(jīng)組織。生物組織的例子還包括器官、腫瘤、淋巴結(jié)、動脈和單細胞集合，例如，分離自血漿、血液或尿液或用膠原酶處理的固體組織。如本文所用，"擴增"指線性倍增樣品中的靶核酸分析物以提高試驗的靈敏度。如本文所述，本領(lǐng)域已知有許多不同方法可擴增核酸。如本文所用，"微球組"指含有相同的光譜地址與一個lc探針或一組lc探針偶聯(lián)的微球組。如本文所用，"低拷貝"或"lc"指能與基因組中靶核酸或區(qū)域的10個或較少個間隔序列雜交的序列。優(yōu)選拷貝數(shù)為IO或更少，更優(yōu)選7個或更少，還要優(yōu)選5個或更少，最優(yōu)選3個或更少。如本文所用，"單拷貝"或"sc"指能與基因組中靶核酸或區(qū)域的3個或較少個間隔序列雜交的核酸序列。因此，此術(shù)語包括極嚴格獨特性的序列(即與相應(yīng)基因組中的一個而且只有一個序列相互補的序列)，及其二鏈體和三鏈體。術(shù)語"單拷貝元件"和"單拷貝序列"也可用于指這類核酸序列。如本文所用，"高重復(fù)性的"指存在1000個以上的拷貝。如本文所用，"序列相同性"指二條或多條多核苷酸序列，即參比序列和與該參比序列作比較的某給定序列之間的關(guān)系?？赏ㄟ^將給定序列和參比序列作最佳排列后產(chǎn)生最高程度序列相似性，測定序列串之間的匹配進行序列的比較來測定二序列的相同性。比對時，根據(jù)堿基的位置對位置確定序列相同性，如具體位置的核苷酸相同則序列相同。然后將位置相同的總數(shù)除以參比序列的核苷酸或殘基總數(shù)產(chǎn)生序列相同性百分比。用已知方法，包括但不限于《計算機分子生物學(xué)》(ComputationalMolecularBiology),Lesk，AN主編，牛津大學(xué)出版社，紐約(1988);《生物計算信息學(xué)和基因組計劃》(Biocomputing:informaticsandGenomeProjects),Smith,DW，主編，學(xué)術(shù)出版社，紐約(1993);《序歹ll數(shù)據(jù)的計算機分析》(Computeranaysisofsequencedata),Griffm，AM禾口Griffm，HG主編，人類出版社(HumanaPress),新澤西(1994);《分子生物學(xué)中的序歹ll分析》(SequenceAnalysisinMolecularBiology),vonHeinge，G，學(xué)術(shù)出版社(1987);《序列分析引物》(S叫uenceAnalysisPrimer),geibskov，M和Devereux，J主編，M,斯圖克頓出版社(StocktonPress),紐約(1991);Carillo，H和Lipman，D，SIAMJAppliedMath，48:1073(1988)。設(shè)計了測定序列相同性的優(yōu)選方法給出了所測試序列之間的最大匹配?？衫霉娍色@得的計算機15程序編輯測定序列相同性的方法確定給定序列之間的相同性。這類程序的例子包括但不限于GCG程序包(Devereux，J等，NucleicAcidResearch,12(1):387(1984)、BLASTP、BLASTN禾tlFASTA(Altschul，SF等，JMolBiol，215:403410(1990)。這些程序采用缺口對序列作最佳比對可產(chǎn)生給定序列與參比序列之間最高水平的序列相同性。例如說，某多核苷酸的核苷酸序列與參比核苷酸序列具有至少例如95%的"序列相同性"，這意味該給定的多核苷酸的核苷酸序列與參比序列相同，除了該多核苷酸序列每IOO個核苷酸可包含最多5個與參比核苷酸不同。換言之，在含有與參比核苷酸序列至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸中，該參比序列中最多5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代，或參比序列中總核苷酸的最多5%可插入到參比序列中。二序列之一中的轉(zhuǎn)化可用這些計算機程序根據(jù)參比序列與同源性測試序列的反義鏈相似性檢測。參比序列的這些變異可發(fā)生在參比核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之間單個散布在參比序列核苷酸中的任何處，或參比序列中一個或多個毗鄰基團中。如本文所用，"重復(fù)序列"是在基因組中作為靶DNA—部分的反復(fù)出現(xiàn)的序列，此重復(fù)序列之間的序列相同性至少約60%，更優(yōu)選至少約80%，這是可能導(dǎo)致干擾探針與靶DNA所需特異性雜交的足夠長度，即此時探針可能與多個拷貝重復(fù)序列雜交。一般而言，基因組中出現(xiàn)的重復(fù)序列至少為10倍，重復(fù)序列的大小范圍從1個核苷酸至數(shù)百個核苷酸，重復(fù)單元的長度至少為10個核苷酸到數(shù)千個核苷酸。重復(fù)序列可以是任何形式，如串聯(lián)、散布、回文或尖角重復(fù)序列(在靶區(qū)域中有一些拷貝，在基因組中那處有一些拷貝)，可出現(xiàn)在染色體的著絲點附近，分布在一條染色體全長上，或某些或所有的染色體上。正常時但有少數(shù)例外，重復(fù)序列不表達物理學(xué)上有用的蛋白南。"重復(fù)序列"也可稱為"重復(fù)性序列"或"重復(fù)性元件"。如本文所用，"短散布元件"本文也稱為SINE，指由RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的含75bp-500bp長度重復(fù)單元的高度重復(fù)性散布性可轉(zhuǎn)座元件。SIME元件中最豐富的一類是Alu家族。Alu序列度約300bp在人基因組中存在約500,000個拷貝。如本文所用，"長散布元件"本文也稱為LIME，指由RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的含高達7000bp重復(fù)單元的高度重復(fù)性散布性可轉(zhuǎn)座元件。如本文所用，"長末端重復(fù)序列"本文也稱為LTR，指含有通常長200-500bp的末端直接重復(fù)序列的一大類可轉(zhuǎn)座元件。如本文所用，"MIR"重復(fù)序列指哺乳動物的含有長至少260bp重復(fù)單元在人基因組中有約105個拷貝的散布性重復(fù)元件。如本文所用，"MER"重復(fù)序列指起源未知在人基因組中拷貝數(shù)為100-1000個的中等散布性重復(fù)元件。如本文所用，中等(散布性)DNA指均勻分布在人基因組中存在10-1000個拷貝長度150-300bp的重復(fù)序列。一個例子是Alu家族。如本文所用，高度重復(fù)性DNA指在人基因組中存在1()S拷貝的長5-300bp的短重復(fù)序列。一個衛(wèi)星DNA。如本文所用，術(shù)語"DNA轉(zhuǎn)座子"或"轉(zhuǎn)座子"指基因組中可從一處位置移動到另一處的DNA序列。這些序列也稱為"可移動基因元件"。轉(zhuǎn)座子移動通常稱為轉(zhuǎn)座。附圖簡述圖1是說明探針與C。t-1DNA中單拷貝元件雜交的示意圖。圖2是說明抑制DNA與耙核酸中重復(fù)序列雜交的示意圖。圖3是說明在C。t-1DNA中的QMH雜交產(chǎn)生潛在結(jié)構(gòu)的示意圖。圖4是說明所用的合成重復(fù)產(chǎn)品和探針抑制與基因組模板交叉雜交的示意圖。優(yōu)選實施方式的詳細描述以下實施例提供了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。這些實施方式顯示了，單(或低)拷貝探針能與先前已與含有重復(fù)元件但無單拷貝或低拷貝元件的合成的DNA雜交的基因組靶核酸雜交。然而這些實施例目的只說明和公開本文的內(nèi)容，不應(yīng)構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。實施例材料和方法定微絲飾,微扁泉合成將,微可檢測到以標(biāo)記的核酸片段形式或標(biāo)記的核酸片段集合形式與靶序列雜交的探針。標(biāo)記的探針可用于含有與該探針中序列同源的序列的任何靶核酸。這些靶核酸可包括但不限于含有單拷貝序列作為轉(zhuǎn)錄物整合組分的染色體或純化的核酸DNA、異核RNA或mRNA。為確保詳細解譯，上述DNA靶序列和DNA探針為常用例子，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員知道以上所述可等同(所知差異全歸于靶序列和探針的性質(zhì))應(yīng)用于其它種類的核酸。本發(fā)明優(yōu)選探針的一個重要特征是它們由"低拷貝"或"單拷貝"或"獨特"的DNA序列構(gòu)成，此種序列均與靶DNA區(qū)域的至少感興趣部分互補而且基本上沒有與構(gòu)成基因組靶區(qū)域一部分的重復(fù)序列互補的序列。因此，優(yōu)選由單拷貝或獨特序列構(gòu)成的探針與相應(yīng)基因組中的三個或多個序列互補，優(yōu)選只與一個序列互補。低拷貝或混合的低拷貝和重復(fù)序列探針的設(shè)計或參見以前的報導(dǎo)"'15'16'2G。在優(yōu)選形式中，本發(fā)明采用專門設(shè)計的能與單倍體基因組序列中獨特基因座高特異性雜交的低拷貝或單拷貝雜交探針。探針選擇和合成的方法可參見美國專利6，828,097和7,014，997，它們的內(nèi)容納入本文作參考。這些最初的步驟要求了解靶核酸和基因組重復(fù)序列二者的序列，其逐漸增多的可利用信息可向人類基因組計劃(HumanGenomeProject)和相關(guān)生物信息研究(單位)査詢。為了開發(fā)本發(fā)明的探針，必須知道靶DNA區(qū)域的序列。靶區(qū)域可以是重排已經(jīng)過鑒定的整個染色體或只是其一部分。知道了這種序列，目標(biāo)是確定靶區(qū)域中單拷貝或獨特序列的邊界。優(yōu)選通過參比耙區(qū)域中重復(fù)序列位置而實現(xiàn)這點。通常將耙區(qū)域的序列與相應(yīng)基因組的已知重復(fù)序列作比較，可利用已有的計算機軟件。一旦鑒定好耙區(qū)域中的重復(fù)序列，推導(dǎo)的該間插序列即是低或單拷貝序列(即舭鄰重復(fù)序列之間的序列)?？衫肧mith等，Adv.Appl.Math.，2:482(1981)的局部同源性算法，或Needleman等，J.Mol.Biol.，48:443(1970)的同源性比對算法，最佳排列對比靶序列與重復(fù)序列進行比較。宜選擇和合成至少二種不同的探針。應(yīng)選擇和合成至少一組能識別特定核酸序列中異常變化(如果存在)的探針(測試探針)，和選擇和合成另一組識別參18比序列的探針(參比探針)。探針宜長60-1000堿基對，更優(yōu)選80-500堿基對，最優(yōu)選90-110堿基對。發(fā)現(xiàn)微球與約100堿基對的低拷貝探針偶聯(lián)后能產(chǎn)生特性明確的平均熒光分布值和一致的較高次級平均熒光強度值，因而更精確地反映了真正的拷貝數(shù)。較短的偶聯(lián)探針也更穩(wěn)定，偶聯(lián)后適當(dāng)保存，優(yōu)選在黑暗處4"C保存在雜交反應(yīng)中可用二個月以上。這可減少標(biāo)記的貯存微球的批間差異，從而減少偶聯(lián)、定性和定量偶聯(lián)探針的微球所需的工作量。其使用期長于偶聯(lián)后二周內(nèi)即顯示雜交效率降低的偶聯(lián)探針。此實施例中使用的探針包括含有sc間插物的探針(i)ABLla(2004-5，chr9:130623551-130625854)，其含有多樣性的AluJo/Sx/L2重復(fù)序列，(ii)ABLlb(chr9:130627353-130628735)，其含有先前設(shè)計和經(jīng)驗證的ABL1中的多樣性AluJo重復(fù)序列13'14,(iii)1823bp染色體9探針，其含有Alu/MER1重復(fù)序列，ABLlAluMERl(chr9:130621702-130623525)，(iv)TEKT3內(nèi)含子的98bpsc區(qū)段(chrl7:15149108-15149206)和(v)PMP22內(nèi)含子的101bpSC區(qū)段(chrl7:15073475-15073576)，(vi)H0XB1內(nèi)含子的93bpsc區(qū)段(chrl7:43964237-43964330)?；蚪M重建實驗的探針包括(vii)HOXBlb(chrl7:43963396國43965681)和(viii)C1QTNF7(chr4:15141452-15141500)。探針中所見重復(fù)序列定義為多樣性，根據(jù)(在因特網(wǎng)girinst.org)與家族成員共有序列的差異百分比(>12%)，缺失百分(>4°/。)，和/或插入百分比(>4%)。微與錄,錄凝如前所述合成探針并與微球偶聯(lián)13'2Q。合成期間根據(jù)具體的偶聯(lián)反應(yīng)，給探針加上氨基尾以便與不同的微球偶聯(lián)。優(yōu)選通過改進的碳二亞胺反應(yīng)使探針與微球偶聯(lián)。將各有特定的光譜地址(命名為Ll-L9;加州派羅阿托杜克科技公司(DukeScientific,PaloAlto，CA))和約2000,000個碳大小包衣的熒光微球分別與不同的lc探針偶聯(lián)。將純化的氨基修飾的lc探針通過改進的碳二亞胺交連程序與羧基化微球產(chǎn)(Dunbar等，2003;Fulton等，1997)。先加熱變性各探針，然后在冰上快速冷卻。將具有相同光譜特性的約3.125x105個微球滴入1.5ml微離心管(佛羅里達州奧卡拉的美國科技公司(USAScientific,Ocala，F(xiàn)lorida))中，10000g離心2分鐘，吸棄上清液。將150微升0.1MMES緩沖液(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)pH4.5加入各管簡單旋渦振蕩微球然后lO,OOOg離心2分鐘。除去上清液用80微升0.1MMES振蕩重懸微球。各管加入單一lc探針(0.5nM)振蕩混合。加入1.25微升體積10mg/ml的新制l-乙基-3-3-二甲氨基丙基碳二亞胺鹽酸(EDC)，簡單振蕩反應(yīng)液，避光培育30分鐘偶而攪拌。重復(fù)攪拌和培育EDC二次，每次用新配制的1.25微升EDC溶液。加入500微升0.02%吐溫(Tween)20停止反應(yīng)，振蕩和10，000g離心2分鐘。除去上清液后每管加入250微升0.1%SDS，振蕩，然后10，000g離心2分鐘。小心除去上清液，加入25微升0.1MMESpH4.5，振蕩試管后4"C避光保存。將1微升各微球加入到100微升1xPBS中，在FACSCalibur流式細胞計數(shù)儀(加州桑澤斯的BD公司(BectonDickinson,SanJose，Califomia))上采用以下給出的條件進行分析，量化微球濃度。已開發(fā)了與上述方法等同的核酸與微球偶聯(lián)的其它方法。DNA與微球偶聯(lián)的另一常用方法是使鏈霉親和素包被珠與含有5'-末端用生物素修飾的核苷酸的探針結(jié)合。美國專利6,361,944已將金米顆粒與巰基修飾的核酸偶聯(lián)。美國專利6，468，546;6,838，243;6,833,246;6，828,146和6,828,142已將蛋白-核酸與珠偶聯(lián)。已通過親電子連接試劑，即N-氯乙酰氨二已基氨基磷酸酯試劑(Guzaev等，BioorgMedChemLett1988-1215;8(24):3671-6)實現(xiàn)了寡核苷酸與微球的偶聯(lián)。也已將DNA與半導(dǎo)體納米晶體顆粒偶聯(lián)(Taylor，J.R.，F(xiàn)ang，M.M.和Nie，S.M."用生物學(xué)方法偶聯(lián)的熒光納米顆粒檢測DNA單部分上的特異性序歹ll"(ProbingspecificsequencesonsingleDNAmoleculeswithbioconjugatedfluorescentnanoparticle)Anal.Chem.，72，1979-1986;2000;W，Z，Guo.，J.J.Li，Y.A.Wang,X.G.Peng."通過樹枝狀橋制備半導(dǎo)體盒式納米晶體的偶聯(lián)化學(xué)方法及生物應(yīng)用"(Conjugationchemistryandbioapplicationsofsemiconductorboxnanocrystalspreparedviadendrimerbridging)Chem.Mater.15，3125-3133(2003)，和美國專利6，630，307)。在一優(yōu)選的實施方式中，微球本身被染色，將具有不同光譜地址的熒光聚苯乙烯微球與低拷貝探針偶聯(lián)，得到低拷貝探針-偶聯(lián)珠的各種組合，其中參比探針按不同的光譜地址命名。流式細胞計數(shù)儀能識別不同的光譜地址，允許與結(jié)合在不同組微球上的各種低拷貝探針發(fā)生多重反應(yīng)。20麟鄉(xiāng)微吝如前所述13'2G，利用甲醇-乙酸固定的來源于骨髓樣品的細胞遺傳學(xué)制品中的沉淀細胞，制備了基因組模板(靶核酸序列)。不同于其它方法，此靶序列不作預(yù)先選擇或擴增。因此，在本發(fā)明中可雜交基因組(或轉(zhuǎn)錄基因組)的整個拷貝作分析。根據(jù)樣品的來源和狀況，抽提細胞DNA(或RNA)，如需要可用常規(guī)方法體外復(fù)制。宜用GenomiPhi試劑盒(加州巴倫西亞恰根公司(Qiagen，Valencia,CA))體外復(fù)制所述核酸，此試劑盒只需用不到1納克的樣品核酸，需要的操作時間不到20分鐘。然后用常規(guī)方法標(biāo)記此DNA，優(yōu)選在體外復(fù)制中直接標(biāo)記，或采用由標(biāo)記物與對此標(biāo)記物具有親和性的報告分子組成的間接標(biāo)記系統(tǒng)。用可鑒定的標(biāo)記物如熒光團、酶偶聯(lián)物、或選自親和素、鏈霉親和素或特異性抗體可識別的生物素或部分來標(biāo)記靶核酸。有幾種類型的可鑒定的非同位素標(biāo)記物。一類是能化學(xué)結(jié)合靶核酸可作為直接鑒定工具的標(biāo)記物。此類的一個例子是熒光染料部分，當(dāng)用適當(dāng)波長的射線照射時，此部分被激發(fā)至高能態(tài)而發(fā)射熒光。本領(lǐng)域已知有直接標(biāo)記熒光的核苷酸如Cy3-dUTP是標(biāo)記用于本發(fā)明耙DNA的合適形式。直接DNA的其它方法可能也適合(例如用于Ulysses方法的市售氨基-烯丙基標(biāo)記物(荷蘭克里太克(Kreatech，Netherlands)),然而此法必須使基因組DNA片段(通過超聲、DNA酶、剪切或用其它酶消化)化為適合雜交的大小，然后將標(biāo)記的靶DNA加入到偶聯(lián)探針的微球中。在一優(yōu)選的實施方式中，核酸在體外復(fù)制期間用生物素-dUTP或地高辛-dUTP直接標(biāo)記，超聲處理得到的標(biāo)記樣品產(chǎn)生長約300bp-lkbp的片段。也可用切口平移法，利用修飾的、或直接標(biāo)記的核苷酸來標(biāo)記靶核酸(Rigby等，J.Mol.Biol.，113:237-251，1977),在常規(guī)方法中利用含有可鑒定的選擇性標(biāo)記物的反應(yīng)試劑(但不限于此)使其偶聯(lián)于核苷酸如dUTP或dATP?；蛴煤瑹晒鈭F標(biāo)簽的核苷酸直接標(biāo)記這些片段，或通過使標(biāo)記的雙鏈體與能識別如下所述己摻入到這種片段中的核苷酸的熒光標(biāo)記抗體結(jié)合而間接標(biāo)記這些片段。切口平移(100微升)要用無內(nèi)切核酸酶的DNA聚合酶I(羅氏分子生物化學(xué)公司(RocheMolecularBiochemicals))和DNA酶I(沃生頓化學(xué)品公司(WorthingtonChemical))。將各片段與DNA聚合酶1(4單位/mgDNA)、DNA酶(0.01-3mg/100n1反應(yīng)液)、標(biāo)記的核苷酸(0.05mM終濃度)和切口平移緩沖液混合。15。C反應(yīng)60分鐘，產(chǎn)生不同量的標(biāo)記的探針片段，其核苷酸含量不同在約300-1000bp范圍。或者，可在體外復(fù)制期間摻入生物素-dUTP或地高辛-dUTP，再用DNA酶I處理或用其它一些方法剪切得到的標(biāo)記樣品，產(chǎn)生長約300bp-lkbp的片段。常用的標(biāo)記和檢測核酸的其它方法可應(yīng)用于檢測本發(fā)明方法(制備的)低拷貝DNA偶聯(lián)微球。這些物質(zhì)包括熒光染料標(biāo)記物和熒光組合物，如能量轉(zhuǎn)移基團、偶聯(lián)蛋白質(zhì)、抗體或抗原。更具體說，切口平移時將1微克基因組DNA和pUC19DNA用生物素-16dUTP標(biāo)記分別獲得長100bp-350bp和50bp-300bp的產(chǎn)物17。將1微克各C。t-1DNA(得自制造商I和R)經(jīng)切口平移用地高辛-lldUTP標(biāo)記獲得50bp-300bp產(chǎn)物。雜效座,敘潘冊箭用含10,000探針偶聯(lián)微球的40微升1.5xTMAC雜交緩沖液(3-mol/L氯化四甲銨、50mmol/LTris-HCI，pH8.0lg/L肌氨酰(Sarkosyl))稀釋標(biāo)記的DNA(50ng)。反應(yīng)配制的組分列于表1中。表1微球雜交的量化(平均熒光強度)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>*每次反應(yīng)用生物素-16dUTP進行切口平移并用50ngFL2進行SPE檢測。按前人描述進行雜交反應(yīng)和檢測13'，雜交反應(yīng)的條件取決于具體的核苷酸組成和每條低拷貝探針的長度，這些本領(lǐng)域技術(shù)人員不難確定。對于雜交，用含有低拷貝探針偶聯(lián)微球的雜交緩沖液稀釋樣品序列。探針偶聯(lián)微球的用量取決于測試樣品的量。每次雜交反應(yīng)分析優(yōu)選約5pg對1tig樣品，更優(yōu)選對約25-100ng樣品，還要優(yōu)選對約30-70ng樣品，還更優(yōu)選對約40-60ng樣品，最優(yōu)選對約50ng樣品。因此，要雜交的每組緩沖液宜含有約2,000-10,000個探針偶聯(lián)微球，更優(yōu)選2,000-6，000個探針偶聯(lián)微球，還要優(yōu)選約4,500-5,500個探針偶聯(lián)微球，最優(yōu)選約5,000個探針偶聯(lián)微球。稀釋后宜在約95'C加熱變性雜交反應(yīng)物，然后在合適的雜交溫度下雜交過夜，溫度宜約45-51°C，取決于探針核酸的組成和長度。然后洗滌雜交的微球，離心去除未雜交的靶序列。除去上清液，染色雜交樣品，或用一定量的修飾的報告分子或其它合適的標(biāo)記物，優(yōu)選可作為次級熒光染料的標(biāo)記物標(biāo)記，以檢測標(biāo)記的樣品與低拷貝探針偶聯(lián)微球的雜交。優(yōu)選的報告分子是藻紅素標(biāo)記的鏈霉親和素，或抗-地高辛熒光抗體，分別檢測和結(jié)合優(yōu)選的靶序列標(biāo)記、生物素和地高辛。在雜交反應(yīng)所用的相同溫度下培育雜交的和標(biāo)記的/染色的樣品足夠時間使報告分子檢測和結(jié)合標(biāo)記的靶序列。然后洗滌樣品除去殘余染料。離心樣品除去上清液，用一定量的雜交緩沖液重懸著色的雜交微球。流式細胞計數(shù)分析前，可按流式細胞計數(shù)儀操作說明書稀釋雜交樣品。每次反應(yīng)每組優(yōu)選分析約2，000-6，000個微球，更優(yōu)選約4,500-5,500個微球，最優(yōu)選每次反應(yīng)每組分析約5,000個微球。然而，分析的樣品量取決于用于的具體流式細胞計數(shù)儀。該領(lǐng)域技術(shù)人員無須過多實驗即可修改確定最佳的流式細胞計數(shù)儀校正和操作設(shè)置范圍，從而測定具體的雜交試驗。熒光珠標(biāo)準(zhǔn)品已廣泛使用，可用其校正流式細胞計數(shù)儀不同熒光檢測通道的強度。也可用參比熒光標(biāo)準(zhǔn)品依據(jù)分子的等價可溶性熒光染料(MESF)單位校正的表面標(biāo)記校正此儀器。優(yōu)選優(yōu)化光電倍增管(PMT)的電壓設(shè)置和前向掃描、側(cè)向掃描、流速、和各檢測通道的域值以最大程度減少二種不同探針與一份基因型正常病人樣品雜交所產(chǎn)生的熒光強度差異。易出現(xiàn)非優(yōu)化的電壓參數(shù)導(dǎo)致寬大的熒光峰或非線性數(shù)據(jù)，而優(yōu)化的參數(shù)當(dāng)以側(cè)向掃描圖觀察時偏向?qū)е戮哂胁煌庾V地址的微球緊密聚集。這些設(shè)置優(yōu)選依據(jù)熒光測定的數(shù)學(xué)平均值、幾何平均值、中位數(shù)和峰頻道而確定。反應(yīng)物經(jīng)5(TC變性3分鐘和雜交過夜。洗滌雜交微球用報告分子鏈霉親和素藻紅素(SPE;分子探針公司(MolecularProbes))和/或抗-地高辛-抗體異硫氰酸熒光黃(FITC，分子探針公司)染色。用流式細胞儀(FACSCalibur，加州桑澤斯的BD公司)分析雜交樣品，采用雙激光檢測，用細胞計數(shù)儀共同測定微球的光譜地址和與樣品序列結(jié)合產(chǎn)生的次級熒光染料以鑒定和定量雜交的探針。通過量化結(jié)合樣品產(chǎn)生的次級熒光染料的熒光強度，測定每種樣品序列與其互補的探針偶聯(lián)微球雜交產(chǎn)生的信號。選擇相容的微球光譜地址以最大程度減少與未結(jié)合的次級熒光染料(報告分子)的發(fā)射波長相重疊。這可通過與用相同的未偶聯(lián)和未雜交的微球獲得的結(jié)果作比較而得到證實。也可采用保留在含有除樣品核酸外所有成分的反應(yīng)管中的陰性對照，測定檢測通道次級熒光染料的背景熒光。優(yōu)選在運作之間用蒸餾水沖洗此系統(tǒng)去除殘留的微球。每次反應(yīng)分析約5,000個微球。用SPE和/或FITC平均熒光強度(分別在通道FL2和/或FL1中檢測)定量雜交，此強度對應(yīng)于探針?biāo)Y(jié)合的基因組靶DNA(FL2)和C。t-1DNA(FL1)的量。用偶聯(lián)探針和含有相同序列的標(biāo)記靶DNA進行的校正研究證明，平均熒光強度的變化與雜交的靶DNA量呈線性相關(guān)。每次雜交實驗用含有除耙DNA以外的所有反應(yīng)組分的陰性對照分別測定FL1和FL2通道的背景熒光。如前所述設(shè)置優(yōu)化的PMT電壓；用廠商提供的CellQuest軟件13'2()收集數(shù)據(jù)進行分析。通過選擇能最大程度減少二種不同探針與一份基因型正常病人樣品雜交所產(chǎn)生的熒光強度差異的光電倍增管電壓設(shè)置，確定最優(yōu)的光電倍增管電壓設(shè)置。這些設(shè)置依據(jù)說明書(CellQuest;BD公司)的熒光測定的數(shù)學(xué)平均值、幾何平均值、中位數(shù)和峰頻道而確定。FACSCalibur儀的典型光電倍增管電壓設(shè)置是FSC(前向掃描)二EOO(無信號放大)、SSC(側(cè)向掃描"344V、FL1=727V、FL2=640V和FL4=500V。設(shè)置的FSC、FL1、FL2和FL3的域值是默認值52V。選擇此FSC域值作為主要參數(shù)的52V值，設(shè)置的SSC次級參數(shù)為125V值。對所用的下部護套管液體設(shè)置的流速是FACsFlow(BD公司)。在運作之間用2-5ml蒸餾水沖洗此系統(tǒng)去除殘留的微球。用CellQuest軟件收集數(shù)據(jù)和分析。也用WinMDI2.8流式細胞儀軟件包(WinMDI;J.Trotter.加州索克儀器公司(SalkInstitute,LaJolla，California》進行數(shù)據(jù)分析。^微伊效游"A^#虔用250ul0.1XSSC1%SDS洗滌等份(35ul)與ABLla(表1:反應(yīng)9和20)雜交的基因組DNA，離心(13,000xg)沉淀，重復(fù)二次。95°。加熱變性雜交的基因組序列5分鐘，然后4"C離心3分鐘快速冷卻?；厥盏男蛄杏米鱍PCR和與微球偶聯(lián)的ABLlAluMERl(表1:反應(yīng)21和22)雜交的靶序列。全慮復(fù)絲"A^從根據(jù)重復(fù)性序列家族選擇的基因組區(qū)域合成制備了重復(fù)性DNA，因為這些重復(fù)序列各自在C。t-1制備過程中均富含。然而，可采用包含毗鄰中拷貝至高拷貝數(shù)重復(fù)元件的sc區(qū)的代表性基因組區(qū)。為了證明基因組探針中的這種重復(fù)元件可能在超過所需目標(biāo)區(qū)段的部位受到抑制，制備了包含位于染色體4p中ClQTNF7基因上游二個400bpsc區(qū)(chr4:15139704-15141581)之間中央的l.lkbLTR元件的探針(圖4A)。然后合成了用于封閉此重復(fù)元件的位于ABLla探針中的重復(fù)序列；染色體9的ABLla含有280bp的AluJo重復(fù)序列、300bp的AluSx重復(fù)序列和830bp的L2元件區(qū)段(圖4C)。也采用染色體17q上位于HOXB15'端含有306bpAluSx重復(fù)序列和154bpLl截短序列(chrl7:43963396-3965681)的2286bp區(qū)段作為探針9圖4B)。開發(fā)了PCR擴增各重復(fù)序列和靶產(chǎn)物(表2:HOXBlb和ClQTNF7)的引物，擴增了直接側(cè)接這些重復(fù)元件(表2:HOXBlAluLl和C1QTNF7LTR)的獨特序列。用Pfx(因維曲根公司(Invitrogen》擴增基因組DNA(帕瑪咖公司(Promega))。然后電泳擴增產(chǎn)物用微離心柱離心抽提。如前人所述通過改進的碳二亞胺反應(yīng)使探針偶聯(lián)于微球13'2()。在存在和缺乏C。t-lDNA時，此雜交反應(yīng)(表l:反應(yīng)23-33)均提高了合成的重復(fù)性PCR產(chǎn)物與同源性PCE產(chǎn)物和/或基因組DNA雜交的效力。使反應(yīng)物雜交，洗滌，用SPE染色，然后用流式細胞計數(shù)分析。用Chromo4定量PCR系統(tǒng)(加州赫爾克里斯的BR實驗室公司(Bio-RadLaboratories,Hercules,California))進行QPCR和數(shù)據(jù)分析。引物和擴增區(qū)段用BLAT"(見英特網(wǎng)genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlast)和BLAST(表2)驗證獨特的基因組表示。BLAT是一種計算機軟件工具，包含序列比對算法，和鑒定人26基因組中可能與査詢序列同源的區(qū)域的脊椎動物序列索引。BLAT是與BLAST類似的比對工具，只是結(jié)構(gòu)上有所不同，因為BLAT工作時能將整個基因組的索引保存在存貯器中，而BLAST的靶數(shù)據(jù)庫包括GenBank收集的序歹ij。每50微升反應(yīng)液含有各引物0.5PM、50ngC。t-1模板或陽性對照人基因組DNA(帕瑪咖公司)、25n12xQTSybrG主混合物(恰根公司)。用DNA酶在基因組DNA上形成缺口以產(chǎn)生50bp-300bp的片段，陰性對照含有除DNA以外的所有反應(yīng)組分。熱循環(huán)條件是95°C15分鐘后，45輪擴增(94'C15秒、61°C30秒(獲取數(shù)據(jù))、72°C30秒)然后72r5秒，溫度遞降每秒20'C產(chǎn)生解鏈曲線。利用校正曲線測定采用不同量的正?；蚪M模板(lng、2ng、4ng、lOng和20ng)回收的基因組模板中輸入的靶序列量，和測定各反應(yīng)的Ct値。用QPCR測定從ABLla雜交產(chǎn)物(lul;表1:反應(yīng)21和22)回收的序列組成。引物組采用幾個從ABL1區(qū)擴增的不一定與此探針同源的序列，包括ABLla和ABLlc(chr9:130709665-130711469)、ABLld(chr9:130699324-130700596)以及其它未連接的基因組區(qū)如DNJA3Alu(chrl6:4421138-4421200)的特異性引物，它含有位于DA^/基因5'端的Alu重復(fù)序列、7^《73和T/OiB7(表2)。如上所述進行反應(yīng)。每組引物運作陽性對照(人基因組DNA)以提供原先加入QMH反應(yīng)中的基因組DNA的初始量(50ng)。在存在和缺乏C。t-1DNA時從測試樣品中初始模板量確定從QMH回收的靶序列摩爾比(從針對標(biāo)準(zhǔn)校正曲線的交互參考Ct信內(nèi)推)。表2.此項研究所用的探針和引物<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>原位熒光雜交(FISH)本發(fā)明方法也可用于原位熒光雜交(FISH)實驗。FISH探針的靶區(qū)域可以是整條染色體或其一部分。探針合成后進行標(biāo)記15'16，F(xiàn)ISH雜交探針可與合成的重復(fù)性DNA—起培育代替Cot-lDNA進行重復(fù)抑制，然后與固定在載玻片上的染色體雜交。采用Cot-lDNA的比較性實驗用或不用探針預(yù)雜交常呈現(xiàn)不同的探針雜交信號14。與不用Cot-lDNA預(yù)雜交的FISH實驗相比，不用Cot-lDNA探針的FISH預(yù)雜交顯示染色體上探針信號微弱14。此微弱信號來源于探針中的單拷貝序列與Cot-lDNA中的單拷貝序列雜交。這樣就減少了與染色體中靶序列雜交所需的探針用量因此信號較弱。然而作為結(jié)果，不用Cot-lDNA預(yù)雜交的實驗雖然探針信號強度明亮，但通常呈現(xiàn)更多的假陽性探針雜交，而導(dǎo)致背景熒光水平較高使分析更加費力。通過探針與不包含店拷貝序列的合成的純重復(fù)性DNA組分預(yù)雜交，能有效抑制探針中的任何重復(fù)序列，留下的單拷貝序列可用于與染色體雜交。因此不會損傷染色體上的探針信號強度并且有效地最大程度地減少了背景(假陽性雜交信號)。結(jié)果與C。"ZW4游定量徵承效使FISH-驗證的混合的sc和重復(fù)序列的探針、包含多樣性AluJo/Sx/L2重復(fù)序列(chr9:130623551-130625854)的ABLl基因IVSlb5，端的ABLla與生物素標(biāo)記的基因組DNA雜交13'2、雖然在復(fù)制ABLla與生物素標(biāo)記的基因組DNA雜交中，預(yù)計購得的C。t-1DNA能抑制重復(fù)序列的雜交，但當(dāng)C。t-1用復(fù)制ABLla與切口平移的基因組DNA雜交時，標(biāo)記的基因組耙部分的平均熒光強度一致地和顯著地增強了2.2倍(表1:反應(yīng)1和2)。衍生自染色體17基因的sc探針PMP22(Chrl7:15073475-15073576)和TEKT3(Chr17:15149108-15149206)在存在C。t-lDNA時顯示較小但可重復(fù)的1.08禾P1.14倍增長(表l:反應(yīng)l-6)。這些實驗提示C。t-l的效力與圍繞這些sc間區(qū)的重復(fù)序列組成相關(guān)。來自HOXB1的sc探針(Chrl7:43964237-43964330)—致性顯示了加入C。t-lDNA導(dǎo)致雜交強度的小降低(表1:反應(yīng)7-12)，測試的基因組樣品雜交強度降低了0.84-0.92倍。HOXB1間區(qū)特點是無重復(fù)序列(UCSC基因組瀏覽器(UCSCGenomeBrowser),2004-5)。環(huán)繞ABLla的區(qū)域含有豐富的高密度保守和散布的SINE(AluJo，AluSx)和LINE(L2)元件。TEKT3和PMP22間區(qū)含有較短較不豐富和更多樣性種類的重復(fù)元件(MIR、MER和L2)。通過比較生物素標(biāo)記的耙DNA(在FL2通道中用鏈霉親和素藻紅素[SPE]檢測)、生物素標(biāo)記的陰性靶對照(Puc19質(zhì)粒)各與地高辛標(biāo)記的C。t-1DNA(在FL1通道中用FITC-偶聯(lián)的抗-地高辛抗體)雜交來測定加入C。t-1DNA改變靶DNA與ABLla探針雜交的程度。存在C。t-1導(dǎo)致ABLla與生物素標(biāo)記的同源基因組耙序列雜交產(chǎn)生的熒光平均強度提高了2倍，然而，結(jié)合的標(biāo)記C。t-1序列量大大超過抑制ABLla中重復(fù)序列所需，與其中刪除了C。t-1序列的反應(yīng)相比，強度提高了50倍(表1:反應(yīng)13和14)。C。t-1結(jié)合看來有特異性，因為不論C。t-1是否存在ABLla與pUC19雜交顯示有背景信號水平(〈101)(表1:反應(yīng)15)。這些發(fā)現(xiàn)提示C。t-l中的同源序列直接與ABLla探針結(jié)合。因為推測ABLla序列只代表了C。t-1靶部分的一小部分，它單獨不能解釋所見的雜交強度提高。為確定信號提高是否與C。t-1DNA的量有關(guān)，在固定量(50ng)的生物素標(biāo)記的基因組耙DNA中加入不同量的地高辛標(biāo)記的C。t-1DNA與ABLlb雜交，ABLlb是混合的sc和重復(fù)性探針，含有二種多樣性的AluJo重復(fù)序列(chr9:130627353-130628735)。將反應(yīng)中的C。t-1量從50ng倍增到100ng探針與C。t-1的雜交提高了1.8倍，與同源序列的雜交提高了1.3(表1:反應(yīng)16和17)。類似地，150ng標(biāo)記的C。t-1DNA與ABLla雜交比50ngC。t-l提高了3倍，與靶DNA雜交提高了1.5倍(表1:反應(yīng)17和18)。雖然加入C。t-1DNA稀釋了同源的生物素化靶DNA,但仍提高了2-4倍，對應(yīng)的雜交強度出乎意料地提高了1.5倍。C。t-1濃度與雜交強度的相關(guān)性提示此反應(yīng)成分促進了含有除探針和所需的基因組耙DNA以外的其它序列的雙鏈體形成。為測定結(jié)合探針的C。t-1衍生序列的組成，變性這些產(chǎn)物，與ABLla偶聯(lián)微球雜交后回收(表l:反應(yīng)19和20)。將這些產(chǎn)物用作耙序列，隨后與非重疊sc和重復(fù)性微球偶聯(lián)探針ABLlAluMERl雜交，ABLlAluMERl含Alu元件(AluJb、AluSq、Charlie1禾口AluSx)和位于距ABLla2.3kb著絲點的MER1序列。鑒于ABLlAluMERl在基因組中的此位置，預(yù)計它不存在于切口平移回收的基因組產(chǎn)物中。然而，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的C。t-1組分是回收ABLlAluMERl序列的來源，依據(jù)是FL1通道中平均熒光強度提高了11倍(表1:反應(yīng)21和22).C。t-1中毗鄰雜交的ABLla的重復(fù)序列看來通過形成重復(fù)和單拷貝序列元件的網(wǎng)絡(luò)而聚集在一起與基因組序列雜交(圖3:分圖1和2)。通過定量PCR(QPCR)分析回收的雜交產(chǎn)物中存在的序列評價了這種可能性。微量尸C及藩效柳用QPCR測定了C。t-1中與我們探針同源的sc序列成分。表2鑒定了此項研究所用的探針和引物。表3顯示了此項分析的結(jié)果。表3.回收的雜交耙DNA量化<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>擴增C。t-1DNA和對照基因組DNA的500ng樣品中ABLla的100bpsc區(qū)段(表2)。根據(jù)它們各自的Ct信，廠商I和R的C。t-1組分顯示與正常基因組成相比，雜交的ABLla量分別提高了14和2倍(或提高了2.5和1.7摩爾)(表1:反應(yīng)l-3)。雜交后回收ABLla序列測定與此探針雜交的基因組和C。t-1衍生序列的組成(表1:反應(yīng)21和22)。在含耙和C。t-1DNA二者的雜交樣品中ABLla序列提高了128倍(表3:反應(yīng)13和14)。從雜交液回收的與ABLlAluMERl相同序列包含的C。t-1比缺乏C。t-1的一式二份反應(yīng)中的高139倍(表3:反應(yīng)15和16)。在回收的雜交產(chǎn)物中還檢測到與ABLlAluMERl密切相關(guān)的重復(fù)序列。在雜交反應(yīng)物中測到的具有92%相似性的Alu元件DNJA3Alu(5，連接于DNJA3基因；chrl6:4421138-4421200)含有C。t-1，但在缺乏C。t-1的反應(yīng)物中沒有，表明C。t-1是此污染序列的來源(表3:反應(yīng)17和18)。與ABLla探針雜交的回收產(chǎn)物中沒檢測到其它sc基因組區(qū)段(即來自CMTlA、H0XB1和其它ABL1區(qū)域(ABLlc和ABLld))。與連接ABL1的RRP4-1.6a序列雜交的C。t-1衍生序列(表2)含有同源sc和重復(fù)序列，盡管此單拷貝探針已經(jīng)FISH驗證14?；蚪M中中等和高度豐富的MIR、L2和Ll重復(fù)元件圍繞此序列。QPCR證明相對于從sc間區(qū)內(nèi)衍生的短RRP4-1.6a產(chǎn)物，從上游(5，)和下游(3，)擴增子回收的重復(fù)序列濃度較高(表3:反應(yīng)4-12)。Cr值的比較表明，拓寬基因組重復(fù)序列(RRP4-1.6a5'和RRP4-1.6a3，)的廠商R的sc序列是基因組DNA中唯一比C。t-1組分豐富6.8倍的序列(廠商I的也類似)。如預(yù)計的那樣，基因組中內(nèi)部scRRP4-1.6a序列比C。t-1豐富得多(24倍)，但在C。t-l中仍可檢測到(表3:反應(yīng)7-9)。C。t-1制品中SINE和LINE豐富導(dǎo)致雜交時連接lc或sc序列加速，有可能與標(biāo)記的基因組DNA中的偶聯(lián)探針或真正的sc耙序列退火相連。微始成艦復(fù)腦在基因組的三個不同基因座通過替代專門從與sc序列毗鄰的重復(fù)元件制備的過量純化的DNA，逆轉(zhuǎn)了C。t-lDNA的雜交效果(圖4)。合成的1.9kb擴增產(chǎn)物含有LTR-樣重復(fù)元件和染色體4中C1QTNF7上游的單拷貝序列。除純化的合成的LTR-樣元件外，C1QTNF7LTR對此產(chǎn)品自身與偶聯(lián)微球的雜交沒有作用，而加入C。t-lDNA提高了平均熒光強度1.2倍(表l:反應(yīng)23-25)。在存在和缺乏C。t-1DNA時用C1QTNF7LTR阻斷重復(fù)序列與切口平移的基因組DNA雜交獲得了類似結(jié)果(表1:反應(yīng)26-28)。用含有這些序列的合成的PCR產(chǎn)物HOXBlAluLl抑制了AluSx與染色體17的H0XB1基因座(HOXBlb)上游約2.3kb區(qū)域中的Ll重復(fù)序列雜交。在存在HOXBlAluLl時HOXBlb的PCR產(chǎn)物與對應(yīng)的微球偶聯(lián)探針雜交有效封閉了擴增靶DNA中的重復(fù)序列，降低了雜交產(chǎn)生的熒光強度0.3倍，推測是由于靶DNA長度減少(表1:反應(yīng)32和33)。在比較基因組與偶聯(lián)ABLla探針的微球雜交中，在此靶區(qū)域中加入合成的Alu和L2元件，也有效地抑制了重復(fù)序列的雜交(表l:反應(yīng)29-31)。C。"微厚麟妙游縛在已發(fā)表的雜交研究中對于抑制重復(fù)序列的雜交幾乎都包括c。t-i，提出的問題是此試劑如何影響表達和/或基因組拷貝數(shù)的定量測定？在采用C。t-l的研究中，評價了一組復(fù)制的靶樣品與克隆探針陣列的雜交的雙標(biāo)記雜交熒光強度的變異(數(shù)據(jù)來源于GEO數(shù)據(jù)庫http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo)。分析用于微球雜交試驗的基因的cDNA探針試驗結(jié)果(包括ABLla、HOXB1和TEKT3)，然后通過它們的重復(fù)序列組成，鑒別位于基因組環(huán)境中的幾個基因序列的雜交模式，即重復(fù)序列群集的密度(表4下部)或稀疏度(表4上部)。表4不同基因復(fù)制微陣列研究中的變異<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>與衍生自含有較少但多態(tài)性更大重復(fù)序列的因組區(qū)域的探針相比，重復(fù)序列致密的基因組間區(qū)中的序列復(fù)制Cy3/Cy5的強度比率變異更顯著。例如，發(fā)現(xiàn)采用相同的測試樣品在不同的復(fù)制實驗中ABL1顯示了提高和降低的表達(如數(shù)據(jù)庫記錄GDS751/20213顯示樣品方差為0.3，p=0.18;表4)，與我們用偶聯(lián)-ABLla的微球在雜交中觀察到的扭曲相似。相反，采用相同的測試樣品在復(fù)制表達陣列研究中H0XB1的熒光強度對數(shù)比率顯示幾乎沒有差異(GDS223/31555，樣品方差=0.001，pO.OOOl)，與此基因座我們的結(jié)果相符。這提示，C。t-1中的單拷貝序列與探針雜交，使形成的混合sc與重復(fù)序列網(wǎng)絡(luò)聚集而捕獲靶cDNA中的標(biāo)記的重復(fù)序列。在微陣列研究中，C。t-1就如此以類似于QMH中所見方式通過形成復(fù)雜的雜交網(wǎng)絡(luò)而扭曲了富集的克隆探針與散布的重復(fù)序列的雜交。討論上述分析證明，C。t-1DNA中存在的非重復(fù)序列能顯著改變用同源探針檢測雜交反應(yīng)時標(biāo)記的基因組靶DNA的量。C。t-1并非抑制交叉雜交，而是使與含重復(fù)序列探針的雜交提高了3倍多。此結(jié)果提示，未標(biāo)記的C。t-1DNA序列能橋連序列特異性探針中的lc和重復(fù)序列與互補的耙序列。重復(fù)序列與C。t-1組分中的同源lc序列連接可能使基因組靶DNA中標(biāo)記的重復(fù)序列隨后雜交而聚集。將C。t-1DNA加入到與標(biāo)記的基因組模板雜交的探針中可催化形成與該探針和基因組某處同源的異質(zhì)雙鏈體網(wǎng)絡(luò)(圖3，實施例2)。將C。t-lDNA通過標(biāo)記的lc基因組靶DNA加到連接的重復(fù)元件上(圖3,實施例4)促進了含有l(wèi)c和重復(fù)序列(圖3，實施例3)的"偏愛(partial)"雙鏈體的形成。標(biāo)記的重復(fù)序列與lc基因組靶DNA連接也可能改變雜交強度，但程度與C。t-1不同，這是由于C。t-l同時富含lc和散布的重復(fù)序列。隨著微陣列技術(shù)的進展，許多研究人員關(guān)注上述實驗的可重復(fù)性4—5。也許，交叉雜交有關(guān)差異的最大來源來自重復(fù)序列7。然而，許多學(xué)者認為解決此差異的方法是用C。t-lDNA封閉重復(fù)元件，然后使cDNA與陣列雜交6—7。Dong等人19發(fā)現(xiàn)"某些無重復(fù)序列的區(qū)域與能與人C。t-1DNA組分雜交的重復(fù)序列充分同源"，提出是它們歪曲了微陣列結(jié)果的雜交信號強度。C。t-1通過促進探針與無關(guān)的標(biāo)記基因組耙DNA之間重復(fù)性序列橋連的形成，影響了雜交試驗的重復(fù)性，C。t-1所含的1C和SC序列能與標(biāo)記的靶DNA競爭探針(結(jié)合)位點。有理由進行更廣泛的大基因組分析以鑒定更可能對此種系統(tǒng)誤差來源敏感的其它基因組區(qū)域。C。t-1DNA中的重復(fù)組分根據(jù)合理的動力學(xué)而非序列的組成制備。由于lc序列中不含重復(fù)序列，這種序列明確的合成的DNA能更有效阻斷探針中重復(fù)序列與共生同源基因組耙重復(fù)DNA的雜交。合成的基因座特異性試劑的另一優(yōu)點是在C。t-lDNA中不能充分提呈重復(fù)(序列)家族，或由于重復(fù)序列的多態(tài)性而不能提呈，可合成這些序列提供更精確更綜合性的無sc序列的基因組重復(fù)序列庫。然而，基于此產(chǎn)品本身的成本和邏輯挑戰(zhàn)，應(yīng)防止C。t-1被合成的廣泛代表了整個基因組中所有已知重復(fù)元件的重復(fù)性DNA試劑取代?？蛇M一步加工C。t-1以限制其所含的sc序列的量。將含有C。t-l中大部分雙鏈DNA的重復(fù)序列重新退火連接于本身含單拷貝無重疊重復(fù)組分的單鏈序列。用專性持續(xù)推進的核酸外切酶如綠豆核酸酶，或A核酸內(nèi)切酶處理這些混合的雙鏈體和單鏈結(jié)構(gòu)，將修剪從雙鏈體DNA上凸出的單鏈序列。這些酶應(yīng)不會在錯配核苷酸處切割，錯配核苷酸常見于同一重復(fù)序列家族的相關(guān)成員，其中單鏈缺口間隔序列被配對的堿基序列間隔開或位于雙鏈體的切口處。此方法將消化單鏈重復(fù)序列和單拷貝間區(qū)。這將特別影響到通常顯示基因組5'(或3')端截斷的例如在Ll逆轉(zhuǎn)座子[11]中所見的重復(fù)元件的提呈?？杉尤胂鄳?yīng)的合成的DNA試劑來緩解這些序列的丟失。應(yīng)注意C。t-1DNA的這種處理不能完全消除所有的sc序列，因為sc序列可能重退火連接，然而形成這類雙鏈體是反應(yīng)動力學(xué)不喜愛的。鑒于以上所述，用部分或完全合成的由明確的重復(fù)序列組成的阻斷試劑替代C。t-1DNA應(yīng)能改善微陣列和基因組雜交比較陣列表達的可重復(fù)性。這應(yīng)最終導(dǎo)致這些應(yīng)用廣泛的方法實驗條件的標(biāo)準(zhǔn)化。參考文獻l.Oostlander.A.，Mcijer.G.和Ylstra，B{2004)"基于微陣列的比較性基因組雜交及其在人類遺傳學(xué)中的應(yīng)用，，(Microarray-basedcomparativegenomichybridizationanditsapplicationsinhumangenetics)Clin.Genet.，66:488-95.2.Hijum，SV.等(2005)"評價涉及DNA微陣列數(shù)據(jù)重復(fù)性和質(zhì)量的因素的通用驗證方法"(AgeneralapplicablevalidationschemefortheassessmentoffactorsmrolvedinreproducibilityandqualityofDNA-microarraydata)BMCGenomics.6:77。3Bamrler.T,等(2005)"各實驗室與交叉平臺之間基因表達分析的全球標(biāo)準(zhǔn)化"(Standardizingglobalgeneexpressionanalysisbetweenlaboratoriesandacrossplatforms)NatureMethods.2:351-6。4.Sherlock.G.(2005)"關(guān)于FISH和芯片"(OfFISHandChips)NatureMethods,2:329-330.5Dobbin,K等(2005)"利用寡核苷酸微陣列進行癌基因表達分析的實驗室之間比較研究"(InterlaboratoryComparabilityStudyofCancerGeneExpressionAnalysisUsingOligonucleotideMicroarrays)，ClinicalCancerResearch,11:565-72.6.Li.X.，Weikuan.G.，Mohan，S.和BaylinkD.(2002)"DNA微陣歹U:它們的用途禾口濫用"(DNAMicroarrays:Theiruseandmisuse)Microcirculation，9;13-22.7.Wren.J，Kulkami.A.，Joslin.J.，Butow，R.和Gamer.H.(2002)"PCR-斑點微陣列上的交叉雜交"(Cross-hybridizationonPCR-spottedmicroarrays)《IEEE工程在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中》(IEEEEngineeringinMedicineandBiology),71-758.Marshall.B，(2004)，，排除基因陣列的嗓音"(Gettingthenoiseoutofgenearrays),Science,306:630-1.9.Zakharkin，S.，Kim，K.，Mehta.T.，Chen，L.，Barnes,S.，Schsirer.K.，ParrishR.，Allison,D.和Page,G(2005)"Affymetrix微陣列實驗中的差異來源"(Affymetrixmicroarrayexperiments).BMCBioinformatics，6:214-225.10.Britten.R.和Kohne."DNA中的重復(fù)序列"(RepeatedsequencesinDNA)，Science,161:529-540.11.Rogan，RK.，Pan,J.和Weissman，S.M.(.1987)"人e-GY球蛋白基因整合區(qū)中的重復(fù)序列此家族中的序列分析和相關(guān)進化"(LIrepeatelementsinthehumanepsilon-Ggammaglobingeneintergenicregion:sequenceanalysisandconcertedevolutionwithinthisfamily),MolBiolEvol4(4);327-42.12.Carter,N.，F(xiàn)iegler.H.和Piper，J.(2002)"比較性基因組雜交微陣列技術(shù)的比較分析Wellcome依托公司負責(zé)的工作報告"(Comparativeanalysisofcomparativegenomichybridizationmicroarraytechnologies:reportofaworkshopsponsoredbytheWellcomeTrust)Cytometry,49:43-8.13.Newkirk.H.，Miralles，M，Rogan，P和Knoll，J.(2006)"用定量微球雜交測定基因組拷貝數(shù)"(Determinationofgenomiccopynumberwithquantitativemicrospherehybridization).HumanMutation27:376-386.14.Rogan，P.，Cazcarro，P.和Knoll，J.(2001.)"熒光原位雜交單拷貝基因組DNA探針的序歹iJ設(shè)計"(Sequence隱baseddesignofsingle-copygenomicDNAprobesforfluorescenceinsituhybridization),GenomeResearch,11:1086-94.15.Rogan，P.和Knoll，J.(2003)"高分辨率原位檢測染色體異常的序列設(shè)計"(Sequence-basedinsitudetectionofchromosomalabnormalitiesathighresolution)AmericanJournalofMedicalGenetics,121:245-57.16.Knoll，J.，Rogan.P.(2004)"單拷貝基因組雜交探針及其制備方法"(SingleCopyGenomicHybridizationProbesandMethodofGeneratingSame)美國專利6，828，097。17.Knoll，J.和Lichter，P."分裂中期染色體和分裂間期細胞核的原位雜交"(Insituhybridizationtometaphasechromosomesandinterphasenuclei)(2005)千l(登在DracopoliN.，HainesJ，KorfB.，MoirD.，MortonC，SeidmanC.，SeidmanJ.，SmithD，(主編)《人類遺傳學(xué)現(xiàn)有方法》(CurrentprotocolsinHumanGenetics)第一巻第4.3單元中，格林威利出版社(Green-Wiley)，紐約18.Kent,W.(2002)"BLAT--BLAST-樣比對工具"(BLAT—theBLAST-likealignmenttool)GenomeResearch,12:656-64.19.Dong，S.等，(2001)"靈活運用發(fā)現(xiàn)和驗證單個核苷酸多態(tài)性的高密度寡*亥苷酸陣歹U"(FlexibleUseofHigh-DensityOligonucleotideArraysforSingle-NucleotidePolymorphismDiscoveryandValidation),GenomeResearch,11:1418-1424.20.NewkirkH.，KnollJ.，RoganP."懸浮微球雜交的定量及其應(yīng)用，，(QuanlificationofMicrosphereSuspensionHybridizationandUsesThereof),專利申請?zhí)朠CT/US2006/032693,2006-8-16提交。權(quán)利要求1.一種抑制核酸探針中存在的重復(fù)序列與靶基因組核酸中同源重復(fù)序列之間非特異性交叉雜交的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟鑒定代表性基因組區(qū)域中的重復(fù)序列；合成衍生自所鑒定的重復(fù)序列的抑制性核酸，所述抑制性核酸基本上含有所鑒定的重復(fù)序列且基本上沒有低拷貝序列；和使所述抑制性核酸與靶核酸反應(yīng)，從而導(dǎo)致所述抑制性核酸中的重復(fù)序列與所述靶核酸中的同源重復(fù)序列雜交，由此所述靶核酸中的所述重復(fù)序列基本上不與后續(xù)的反應(yīng)性核酸探針中的同源重復(fù)序列雜交，從而抑制了所述探針中的所述重復(fù)序列與所述靶核酸中的同源重復(fù)序列之間的非特異性交叉雜交。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶核酸含有低拷貝序列。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述合成的抑制性核酸含有選出的與一個或多個代表性基因組區(qū)域中的毗鄰低拷貝序列的重復(fù)序列相對應(yīng)的多個重復(fù)序列。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述合成的抑制性核酸完全沒有低拷貝序列。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括使所述靶核酸與一個或多個探針雜交的步驟，此種探針含有與所述耙核酸中的低拷貝序列同源的低拷貝序列。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述探針基本上沒有重復(fù)序列。7.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述探針完全沒有重復(fù)序列。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括將所述探針與光譜編碼的聚苯乙烯微球偶聯(lián)的步驟。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括用可檢測部分標(biāo)記所述探針的步驟。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述部分選自熒光團、酶偶聯(lián)物、熒光團標(biāo)簽核苷酸、與攜帶抗原的核苷酸結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體、生物素-dUTP、地高辛-dUTP和它們的組合。11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在試驗中利用所述抑制性核酸來封閉所述重復(fù)序列，所述試驗選自微陣列雜交試驗、熒光原位雜交試驗和微球體雜交試驗。12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制性核酸包含一種或多種序列明確的PCR產(chǎn)物，它們選自短散布元件、長散布元件、長末端重復(fù)序列、Alu元件、L1元件和DNA轉(zhuǎn)座子。13.—種合成抑制性核酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟鑒定代表性基因組區(qū)域中的重復(fù)序列；和通過合成能與所鑒定的重復(fù)序列雜交但不與所述代表性基因組區(qū)域附近或其中的低拷貝序列雜交的核酸序列來合成所述抑制性核酸。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述合成的抑制性核酸基本上沒有低拷貝序列。15.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，還包括根據(jù)它們與感興趣低拷貝序列的相鄰性選擇某些經(jīng)鑒定的重復(fù)序列來合成所述抑制性核酸。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述某些經(jīng)鑒定的重復(fù)序列是最靠近所述感興趣低拷貝序列的那些序列。17.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述合成的抑制核酸不含能與所述感興趣低拷貝序列雜交的序列。18.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，還包括在雜交試驗中采用所述合成的抑制性核酸的步驟。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述雜交試驗選自熒光原位雜交試驗，微陣列試驗和微球體雜交試驗。20.—種提高低拷貝數(shù)核酸探針與靶核酸中同源區(qū)域之間雜交特異性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟使所述靶核酸中的重復(fù)元件與抑制性核酸中的同源重復(fù)元件雜交，所述抑制性核酸包含多個重復(fù)元件且基本上不含低拷貝數(shù)元件；和使所述靶核酸中的低拷貝數(shù)元件與一個或多個所述核酸探針中的同源低拷貝數(shù)元件雜交。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，選出的所述抑制性核酸中的重復(fù)元件與一個或多個代表性基因組區(qū)域中低拷貝元件側(cè)翼的重復(fù)元件基本同源。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述側(cè)翼重復(fù)元件是中到高拷貝數(shù)。23.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述低拷貝元件包括單拷貝元件。24.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述探針基本上不含重復(fù)元件。25.—種精確量化核酸序列拷貝數(shù)的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟制備具有第一光譜地址的第一光譜編碼熒光微球，和具有第二光譜地址的第二光譜編碼熒光微球；通過確認懷疑含有感興趣序列的靶核酸序列的核苷酸-核苷酸序列鑒定靶基因組核酸探針序列；合成由所述鑒定的靶基因組核酸探針序列衍生的低拷貝靶探針，所述靶探針含有至少一個低拷貝元件且基本上沒有重復(fù)元件；將所述耙探針與所述第一微球偶聯(lián)；合成所選的與所述靶核酸序列的參比核酸序列雜交的參比探針；將所述參比探針與具有第二光譜地址的微球偶聯(lián)；鑒定代表性基因組區(qū)域中的重復(fù)序列；合成抑制性核酸，所述抑制性核酸包含與所述鑒定的重復(fù)序列雜交的充分同源性序列，所述抑制性核酸基本上含有重復(fù)元件且基本上沒有低拷貝元件；使所述抑制性核酸與染色體靶核酸反應(yīng)，從而導(dǎo)致所述抑制性核酸中的重復(fù)元件與所述染色體靶序列中的同源重復(fù)元件雜交；使所述耙探針與所述染色體靶序列反應(yīng)從而導(dǎo)致所述靶探針中的低拷貝元件與所述染色體靶序列中的同源低拷貝元件雜交；使所述抑制性核酸與含有所述染色體靶序列的染色體參比序列反應(yīng)從而導(dǎo)致所述抑制性核酸中的重復(fù)元件與所述染色體參比序列中的同源重復(fù)元件雜交；使所述參比探針與所述染色體參比序列反應(yīng)從而導(dǎo)致所述參比探針與所述染色體參比序列雜交；通過所述第一光譜地址檢測雜交的靶探針；通過所述第二光譜地址檢測雜交的參比探針；和比較檢測到的雜交靶探針的反應(yīng)與檢測到的雜交參比探針的反應(yīng)來量化檢測到的耙探針。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述抑制性DNA包含重復(fù)元件，所述重復(fù)元件與所述靶中低拷貝元件相毗鄰的基因組重復(fù)元件相對應(yīng)。27.—種抑制核酸探針中存在的重復(fù)元件與靶核酸中的同源重復(fù)元件之間的非特異性交叉雜交的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟使抑制性核酸與含有一個或多個低拷貝元件的靶核酸中的同源重復(fù)元件雜交，合成的所述抑制性核酸含有選出的與含有毗鄰中至高拷貝數(shù)重復(fù)元件的單拷貝區(qū)域的一個或多個代表性基因組區(qū)域相對應(yīng)的多個重復(fù)元件且基本上不含低拷貝元件，再使所述靶核酸與含有與所述靶中的低拷貝元件同源的低拷貝元件的一個或多個探針雜交，所述探針基本上不含重復(fù)序列。28.—種抑制抑制性核酸中存在的低拷貝元件與核酸探針中或靶核酸中的同源低拷貝元件之間的非特異性交叉雜交的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟鑒定所述靶核酸中和附近的重復(fù)性和低拷貝元件，通過從所述靶核酸中選擇重復(fù)序列將其包含在所述制性核酸中同時在所述合成中基本上避免包含低拷貝序列來合成抑制性核酸序列，和使所述合成的抑制性核酸與所述靶核酸反應(yīng)，而使各同源性抑制核酸與耙核酸元件互相雜交。29.—種利用Cot-lDNA來提高試驗精確度和重復(fù)性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟選擇或合成含有多個重復(fù)元件但基本上沒有低拷貝序列的抑制性核酸，和用所述選擇的或合成的抑制性核酸替代Cot-lDNA。30.—種抑制基因組靶核酸與核酸探針額外雜交的方法，其^P征在于，所述方法包括以下步驟選擇基因組中對應(yīng)于感興趣序列的一條或多條序列來制備用于雜交的基因組靶核酸；鑒定所述感興趣靶序列中的低拷貝序列；合成與所述鑒定到的低拷貝靶序列同源的低拷貝探針，所述低拷貝探針基本上沒有重復(fù)序列；鑒定毗鄰于所述靶低拷貝序列的重復(fù)序列；合成與所述耙重復(fù)序列同源的抑制性DNA，該抑制性DNA基本上含有重復(fù)元件；使所述靶核酸與所述抑制性DNA反應(yīng)從而該抑制性DNA中的所述重復(fù)元件與靶核酸中的同源重復(fù)元件雜交；使靶核酸與所述低拷貝探針反應(yīng)而使所述探針中的低拷貝元件與所述靶核酸中的同源低拷貝元件雜交；和檢測所述低拷貝探針以量化探針與靶的雜交，從而確定所述靶核酸中替代的低拷貝元件。全文摘要本發(fā)明提供了抑制核酸探針中存在的重復(fù)元件與靶核酸中對應(yīng)的重復(fù)元件之間非特異性交叉雜交的新型方法，該方法所用合成的DNA含有多個重復(fù)元件，同時能避免產(chǎn)生低拷貝的單拷貝序列。文檔編號C12Q1/68GK101405407SQ200680049039公開日2009年4月8日申請日期2006年11月17日優(yōu)先權(quán)日2005年11月18日發(fā)明者H·L·紐科克申請人:兒童慈善醫(yī)院