用lna修飾寡核苷酸改進(jìn)的靶向核苷酸交換方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：：用lna修飾寡核苷酸改進(jìn)的靶向核苷酸交換方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種通過(guò)向靶細(xì)胞導(dǎo)入寡核苷酸引起在靶細(xì)胞內(nèi)DNA特異位點(diǎn)的核苷酸序列的特異性和選擇性改變的方法。結(jié)果是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的靶向交換導(dǎo)致了靶DNA的序列中與上述寡核苷酸的序列不同的地方變成與該寡核苷酸相同的序列。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及使用了修飾寡核苷酸的靶向核苷酸交換。本發(fā)明進(jìn)一步涉及寡核苷酸和試劑盒。本發(fā)明也涉及所述方法的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：遺傳修飾是為了達(dá)到修改活細(xì)胞的，或者由該細(xì)胞作為組成部分的生物體的或者該細(xì)胞再生的產(chǎn)生的生物體的一個(gè)或者多個(gè)基因編碼的生物學(xué)性質(zhì)的目的，在活細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中有意產(chǎn)生變化的過(guò)程。這些變化可以是下述形式，刪除部分遺傳物質(zhì)、加入外源性遺傳物質(zhì)或者改變遺傳物質(zhì)中現(xiàn)有的核苷酸序列。20多年來(lái)，真核生物遺傳修飾的方法已為人們所熟知，并且在植物、人類(lèi)和動(dòng)物細(xì)胞以及微生物中廣泛應(yīng)用以達(dá)到農(nóng)業(yè)領(lǐng)域、人類(lèi)健康、食品質(zhì)量和環(huán)境保護(hù)的改善。遺傳修飾的一般方法包括將外源DNA片段加入到細(xì)胞的基因組，這將給予該細(xì)胞或其生物體超過(guò)現(xiàn)有基因編碼性質(zhì)的新性質(zhì)(包括現(xiàn)有基因的表達(dá)將因此被抑制的應(yīng)用)。雖然許多這樣的例子在獲得所需性質(zhì)上是有效的，然而這些方法并不是十分精確的，因?yàn)樵谕庠碊NA插入的基因組位置是沒(méi)有控制的(因而對(duì)最終表達(dá)水平也沒(méi)有控制)，同時(shí)因?yàn)樗栊?yīng)必須要在原來(lái)良好平衡的基因組編碼的天然性質(zhì)的基礎(chǔ)上顯示。相反的，導(dǎo)致在預(yù)先確定的基因組位點(diǎn)的核苷酸的添加、刪除或者轉(zhuǎn)換的基因修飾的方法將會(huì)提供對(duì)現(xiàn)有基因的精確修飾。寡核苷酸指導(dǎo)的靶向核苷酸交換(Oligonucleotide-directedTargetedNucleotideExchange,TNE，有時(shí)稱(chēng)ODTNE)是一種基于將合成寡核苷酸傳入真核生物細(xì)胞核的方法(含有核苷酸類(lèi)似部分的短范圍的分子，這與DNA在它們的Watson-Crick堿基配對(duì)性質(zhì)方面相似，但是與DNA在化學(xué)性質(zhì)上是不同的)(Alexeev和Yoon，NatureBiotechnol.1343，1998;Rice，NatureBiotechnol.12:321，2001;Kmiec，J.Clin.Invest.112:632，2003)。通過(guò)有意地在寡核苷酸同源性序列中的設(shè)計(jì)錯(cuò)配核苷酸，該錯(cuò)配核苷酸可以被包含到基因組DNA序列中。這種方法提供了在現(xiàn)有基因座中單個(gè)或者至多一些核苷酸的轉(zhuǎn)換，但是可以用來(lái)在現(xiàn)有基因中產(chǎn)生終止密碼子，這導(dǎo)致它們功能的破壞，或者用來(lái)產(chǎn)生密碼子變化，產(chǎn)生編碼氨基酸組成發(fā)生改變的蛋白質(zhì)的基因(蛋白質(zhì)工程)。靶向核苷酸交換(TNE)已經(jīng)在植物、動(dòng)物和酵母細(xì)胞中描述。最先的TNE報(bào)道利用了由設(shè)計(jì)的嵌入到染色體耙位的自我互補(bǔ)的寡核苷酸組成的所謂嵌合體。該嵌合體含有錯(cuò)配核苷酸形成在耙染色體引入突變的模板。為了對(duì)TNE事件進(jìn)行選擇，大多數(shù)研究試圖在導(dǎo)致除草劑抗性的內(nèi)源性基因中引入一個(gè)單個(gè)核苷酸變化。最初使用嵌合體的例子來(lái)自人類(lèi)細(xì)胞(參見(jiàn)綜述Rice等，Nat.Biotech.J^:321-326)。嵌合體的使用同樣在植物種煙草、稻米、和玉米中已經(jīng)是成功的。(Beetham等，1999Proc.Natl.Acad.Sci.USA巡8774-8778;Kochevenko等，2003PlantPhys.巡174-184;Okuzaki等，2004PlantCellRep.509-512)。然而，嵌合體的活性被發(fā)現(xiàn)是很難復(fù)制的，因此單鏈(ss)寡核苷酸的TNE活性已經(jīng)被測(cè)定。已發(fā)現(xiàn)在小麥、酵母以及人類(lèi)細(xì)胞中結(jié)果更具有可重復(fù)性(Liu等，2002Nuc.AcidsRes.1^:2742-2750;綜述，Parekh-Olmedo等，2005GeneTherapy12:639-646;Dong等.2006PlantCellRep.21:457-65)。一些研究組已經(jīng)證明TNE也可以通過(guò)使用總細(xì)胞蛋白提取物檢領(lǐng)U。該TNE活性分析被稱(chēng)為無(wú)細(xì)胞分析(Cole-Strauss等，1999NucleicAcidsRes.27:1323-1330;Gamper等，2000NucleicAcidsRes.28，4332-4339;Kmiec等，2001PlantJ.;22:267-274;Rice等，2001處857-868)。該分析組織如下。使含有兩個(gè)細(xì)菌抗菌素抗性基因(卡那霉素和羧芐青霉素)的質(zhì)粒突變，以便由于單個(gè)核苷酸的變化(例如，從TAT到TAG)使其中一個(gè)抗菌素抗性基因(例如卡那霉素)含有一個(gè)框架內(nèi)終止密碼子。這個(gè)突變的質(zhì)粒然后與總細(xì)胞蛋白以及設(shè)計(jì)用來(lái)校正抗生素抗性基因中的終止密碼子的單鏈寡核苷酸進(jìn)行培養(yǎng)。TNE必需的蛋白質(zhì)存在于細(xì)胞提取物中，并且使用上述寡核苷酸來(lái)改變抗菌素抗性基因中的終止密碼子，恢復(fù)了抗性表型。質(zhì)粒DNA然后從反應(yīng)混合物中提取同時(shí)轉(zhuǎn)入大腸桿菌。該細(xì)菌隨后在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)細(xì)菌菌落的數(shù)量代表TNE修復(fù)事件的數(shù)量。電穿孔效率通過(guò)生長(zhǎng)在含有羧芐青霉素的培養(yǎng)基上的菌落數(shù)的計(jì)數(shù)來(lái)計(jì)算。TNE效率可以通過(guò)計(jì)算修復(fù)質(zhì)粒相對(duì)轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的總數(shù)的比例來(lái)定量。在所述的實(shí)驗(yàn)中，該寡核苷酸產(chǎn)生置換，將TAG改變?yōu)門(mén)AC。此外，無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)也可以用來(lái)研究使用寡核苷酸產(chǎn)生單核苷酸插入的可能性?？梢灾苽浜袕目股鼗騽h除單核苷酸、產(chǎn)生移碼突變的質(zhì)粒。在無(wú)細(xì)胞分析中，刪除部分通過(guò)由該寡核苷酸介導(dǎo)的單核苷酸的添加而被修復(fù)。TNE在如植物這樣高等生物的細(xì)胞中的的應(yīng)用所面臨的最大問(wèn)題，到目前為止已有報(bào)道的是其效率低的問(wèn)題。在玉米中，Zhu等(2000NatureBiotech.il:555-558)報(bào)道的轉(zhuǎn)換率為1x10—4。后來(lái)在煙草(Kochevenko等2003PlantPhys.174-184)和稻米(Okuzaki等2004PlantCellRep.^2:509-512)上的研究分別報(bào)道了1><10-6和lxl(^的轉(zhuǎn)換率。這些轉(zhuǎn)換率對(duì)于TNE的實(shí)際應(yīng)用仍然是太低的?？煽康腄NA復(fù)制是傳遞基因組組穩(wěn)定性維持以及保證DNA含有的遺傳信息免于突變從一代傳到下一代的關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)之一。許多錯(cuò)誤起于親代DNA鏈中的損害或由與DNA堿基起反應(yīng)的試劑引發(fā)(UV光，環(huán)境毒素)。每個(gè)生物體必須含有一個(gè)防御機(jī)制以防止或者校正這些突變。錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(MMR)被認(rèn)為是在DNA損害監(jiān)視和防止非全同序列之間的重組中識(shí)別以及校正錯(cuò)配或在DNA復(fù)制中引起的不配對(duì)堿基(Fedier和Fink，2004Int.JOncol.2004;24(4):1039-47)，并且促成活細(xì)胞中DNA復(fù)制的精確度。TNE已經(jīng)在許多Kmiec專(zhuān)利申請(qǐng)中有描述，其中如WO0173002、WO03/027265、WOO1/87914、WO99/58702、W097/48714、WO02A0364。在WO01A73002中注意到使用未修飾DNA寡核苷酸得到的基因變化的低效率被認(rèn)為主要是由于反應(yīng)混合物或者靶細(xì)胞中的核酸酶引起的供體寡核苷酸降解的結(jié)果。為了補(bǔ)救這個(gè)問(wèn)題，提出結(jié)合修飾核苷酸以使得所得寡核苷酸對(duì)核酸酶有抗性。典型的例子包括帶有磷硫酰鍵、2'-氧-甲基-類(lèi)似物或者鎖核酸(LNA)的核苷酸。這些修飾優(yōu)選地位于寡核苷酸的末端，留下環(huán)繞靶堿基的中心DNA區(qū)域。此外，該出版物規(guī)定在轉(zhuǎn)化寡核苷酸和參與轉(zhuǎn)化過(guò)程的蛋白質(zhì)之間有特異的化學(xué)相互作用。因?yàn)閰⑴c改變過(guò)程的蛋白質(zhì)及其與寡核苷酸取代基的化學(xué)相互作用是未知的，通過(guò)在寡核苷酸內(nèi)使用除LNA、磷硫酰連接或者2'-氧-甲基類(lèi)似物以外的修飾以產(chǎn)生抗核酸酶末端的上述化學(xué)相互作用的作用是不可預(yù)測(cè)的，并且根據(jù)WO0173002,發(fā)明者認(rèn)為是不能預(yù)測(cè)的。因?yàn)镺DTNE現(xiàn)有方法的效率是相對(duì)低的(如前所述，在10—6和10—4之間，盡管報(bào)道有90%的寡核苷酸傳遞率)，在本領(lǐng)域中需要更有效率的TNE方法。相應(yīng)地，本發(fā)明者已經(jīng)開(kāi)始改進(jìn)現(xiàn)有TNE技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明者現(xiàn)在己經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)將與象A、C、T或G未修飾核苷酸相比與受體DNA結(jié)合能力更強(qiáng)的相應(yīng)核苷酸結(jié)合到TNE供體寡核苷酸中，TNE比率可以顯著提高。拋開(kāi)理論的束縛，本發(fā)明者相信通過(guò)將修飾核苷酸結(jié)合到供體寡核苷酸，該供體寡核苷酸更強(qiáng)的結(jié)合到受體DNA，因此提高了TNE比率。本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在接近但是不(直接)毗鄰錯(cuò)配的位置，即和錯(cuò)配位至少有一個(gè)核苷酸的距離，含有一個(gè)或者更多LNA的寡核苷酸可以顯著提高TNE的效率。為此，在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中按TNE轉(zhuǎn)換率使用在寡核苷酸內(nèi)不同位置結(jié)合了一個(gè)或更多LNA的寡核苷酸的效果已經(jīng)被研究。該寡核苷酸的TNE活性與由普通DNA構(gòu)成的寡核苷酸的TNE活性進(jìn)行比較。我們發(fā)現(xiàn)在錯(cuò)配位移除至少一個(gè)核苷酸的位置上含有一個(gè)或者多個(gè)LNA的寡核苷酸可以使無(wú)細(xì)胞分析中的置換和插入TNE效率都提高到迄今未觀察到的水平。含有LNA的寡核苷酸與由普通DNA構(gòu)成的寡核苷酸相比在無(wú)細(xì)胞分析中達(dá)到多IO倍的效率。我們發(fā)現(xiàn)TNE效率可以在寡核苷酸中LNA數(shù)量的增加時(shí)而改善，多個(gè)LNA被分別安置在至少相隔2個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少3個(gè)，更優(yōu)選至少4個(gè)的位置。此外，我們發(fā)現(xiàn)所觀察到的改善不依賴(lài)于基因座，這表明與錯(cuò)配相比帶有特定位置LNA的本發(fā)明的寡核苷酸能夠以不依賴(lài)于物種的方式提供提高的TNE轉(zhuǎn)換率，例如在植物和動(dòng)物細(xì)胞中。因此，本發(fā)明是基于合乎需要的耙向核苷酸交換可以通過(guò)使用部分(即至多為75%，優(yōu)選至多為50%)LNA修飾的核苷酸而完成的創(chuàng)造性設(shè)想。寡核苷酸修飾的位置、類(lèi)型和數(shù)量可以在如下公開(kāi)的限定內(nèi)不同。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了LNA修飾寡核苷酸。LNA修飾的，ss-寡核苷酸可以用來(lái)在植物和動(dòng)物或者人類(lèi)細(xì)胞引入特定的基因變化。本發(fā)明適用于生物醫(yī)學(xué)研究、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，并且適用于構(gòu)建特定的突變植物和動(dòng)物，包括人類(lèi)。本發(fā)明也適用于藥物和基因治療領(lǐng)域。本發(fā)明的寡核苷酸序列除了含有錯(cuò)配堿基的部分以外與靶鏈?zhǔn)且恢碌?，其中的錯(cuò)配堿基在靶鏈中引入了堿基變化。錯(cuò)配堿基被引入到靶序列中。通過(guò)處理核苷酸的修飾(與常規(guī)的A、C、T或G相比)，更特別地，通過(guò)處理引入錯(cuò)配的寡核苷酸的LNA修飾的位置和數(shù)量，效率(或者在DNA雙鏈中的所需位置上引入所需核苷酸的成功程度)可以得到改善。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種通過(guò)使親本DNA雙鏈接觸含有至少一個(gè)與親本鏈相比錯(cuò)配的核苷酸的寡核苷酸以實(shí)現(xiàn)親本DNA鏈(第一條鏈，第二條鏈)靶向改變的方法，其中供體寡核苷酸包含在能夠?qū)崿F(xiàn)靶向核苷酸交換的蛋白質(zhì)存在時(shí)，在特定位置用LNA修飾以獲得比親本(受體)鏈具有更高結(jié)合力的區(qū)段。因此，本發(fā)明的要點(diǎn)在于相對(duì)于未修飾的插入寡核苷酸，帶有LNA核苷酸的插入寡核苷酸(有時(shí)稱(chēng)為供體)的結(jié)合力的改善，LNA修飾位于不毗鄰所述錯(cuò)配的一個(gè)或者多個(gè)位置。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于雙鏈DNA序列靶向改變的寡核苷酸，該雙鏈DNA序列含有第一DNA序列和與第一DNA序列互補(bǔ)的第二DNA序列，該寡核苷酸包含能夠雜交到第一DNA序列的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)與第一DNA序列有關(guān)的錯(cuò)配，其中該寡核苷酸包含至少一個(gè)區(qū)段，所述的區(qū)段含有至少一個(gè)與天然存在的A、C、T或G相比具有更高的結(jié)合親和力的修飾核苷酸，其中，優(yōu)選地，所述的至少一個(gè)修飾核苷酸與天然存在的第一DNA序列中相對(duì)位置上的核苷酸的互補(bǔ)核苷酸相比，對(duì)第一DNA序列中相對(duì)位置上的該核苷酸的結(jié)合更強(qiáng)，其中所述的至少一個(gè)修飾核苷酸是一個(gè)置于距離所述的至少一個(gè)錯(cuò)配至少一個(gè)核苷酸的LNA，并且優(yōu)選的，其中該寡核苷酸含有至多約75%的修飾核苷酸。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于雙鏈DNA序列耙向改變的LNA修飾寡核苷酸。該雙鏈DNA序列包含第一DNA序列和第二DNA序列。該第二DNA序列與第一DNA序列互補(bǔ)，并且與第一DNA序列配對(duì)形成雙鏈。該寡核苷酸包含含有至少一個(gè)與將被改變的雙鏈DNA序列有關(guān)的錯(cuò)配的結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，該結(jié)構(gòu)域是與第一鏈的互補(bǔ)的，包括至少一個(gè)錯(cuò)配的寡核苷酸的一部分。優(yōu)選地，該結(jié)構(gòu)域內(nèi)的錯(cuò)配與第一DNA序列有關(guān)。該寡核苷酸包含由至少一個(gè)LNA修飾的區(qū)段以具有比第二DNA序列(的相應(yīng)部分)更高的結(jié)合親合力。優(yōu)選地，所述的至少一個(gè)修飾核苷酸是一個(gè)置于距離所述的至少一個(gè)錯(cuò)配至少一個(gè)核苷酸的LNA，更優(yōu)選的，該寡核苷酸含有至多約75%的LNA修飾核苷酸。含有錯(cuò)配的結(jié)構(gòu)域和含有修飾核苷酸的區(qū)段可以是重疊的。因此，在某些實(shí)施方案中，含有錯(cuò)配的結(jié)構(gòu)域在寡核苷酸上位于與修飾區(qū)段不同的位置。在某些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)域包括所述的區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，該區(qū)段包括所述的結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)域和該區(qū)段位于寡核苷酸上相同位置并且具有相同的長(zhǎng)度，即它們的長(zhǎng)度和位置重疊。在某些實(shí)施方案中，在該結(jié)構(gòu)域中可以有多于一個(gè)的所述的區(qū)段。對(duì)于本發(fā)明，這意味著含有結(jié)合到DNA雙鏈中的錯(cuò)配的寡核苷酸的部分可以位于與寡核苷酸被修飾部分不同或者移位的位置。特別地，在某些實(shí)施方案中，其中細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)(或者至少是與該系統(tǒng)有關(guān)的蛋白質(zhì)，或者至少是涉及TNE的蛋白質(zhì))決定了哪條鏈含有所述的錯(cuò)配以及哪條鏈用作錯(cuò)配校正的模板。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸包含含有至少一個(gè)，優(yōu)選為至少2個(gè)，更優(yōu)選為至少3個(gè)LNA修飾核苷酸的區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，在寡核苷酸上的所述的區(qū)段可以包含多于4、5、6、7、8、9或者10個(gè)LNA修飾核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述的至少一個(gè)LNA被置于距錯(cuò)配至多10個(gè)核苷酸，優(yōu)選為至多8個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為至多6個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選為至多4、3或者2個(gè)核苷酸的距離。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的至少一個(gè)LNA被置于距錯(cuò)配1個(gè)核苷酸的距離，即一個(gè)核苷酸被置于錯(cuò)配和LNA之間。在某些涉及含有多于一個(gè)LNA寡核苷酸的實(shí)施方案中，每個(gè)LNA位于距錯(cuò)配至少一個(gè)核苷酸的距離。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，LNA不是彼此毗鄰的而是至少由一個(gè)核苷酸分開(kāi)，優(yōu)選地兩個(gè)或者三個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施方案中，在有兩個(gè)或者更多(偶數(shù))個(gè)寡核苷酸的LNA修飾時(shí)，修飾從錯(cuò)配以(大約)相等的距離被間隔。換句話(huà)說(shuō)，優(yōu)選地，LNA修飾被對(duì)稱(chēng)地置于錯(cuò)配的周?chē)?。例如，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩個(gè)LNA以距錯(cuò)配1個(gè)核苷酸的距離對(duì)稱(chēng)地置于錯(cuò)配的周?chē)?同時(shí)彼此之間是3個(gè)核苷酸)。在某些實(shí)施方案中，至多50%的寡核苷酸的修飾核苷酸是LNA衍生物，例如，常規(guī)的A、C或G被它的LNA相應(yīng)物代替，優(yōu)選為至多40%,更優(yōu)選為至多30%，甚至更優(yōu)選為至多20%，最優(yōu)選為至多10%。在某些實(shí)施方案中，多于一個(gè)的錯(cuò)配可以同時(shí)或者接連被引入。寡核苷酸可以接納多于一個(gè)的寡核苷酸上毗鄰或者間隔位置上的錯(cuò)配。為此，寡核苷酸可以適合接納一個(gè)第二套遵守這里描述的原則的LNA，只要它們不會(huì)由于在寡核苷酸中LNA的特殊構(gòu)象而干擾彼此的改善的結(jié)合能力，即優(yōu)選地距錯(cuò)配1個(gè)核苷酸的距離相互間隔地圍繞在錯(cuò)配周?chē)?。在某些?shí)施方案中，寡核苷酸可以包含2、3、4或者更多個(gè)錯(cuò)配核苷酸，它們可以是毗鄰的或者遠(yuǎn)離的(即非毗鄰的)。寡核苷酸含可以包含結(jié)構(gòu)域和區(qū)段以接納上述內(nèi)容，特別地可以包含若干區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，該寡核苷酸可以包括一個(gè)潛在的插入，該插入將被插入到受體鏈中。所述的插入在長(zhǎng)度上可以是不同的，從多于5個(gè)核苷酸直至達(dá)到100個(gè)核苷酸。同理，在某些實(shí)施方案中，類(lèi)似的不同長(zhǎng)度的核苷酸片段可以被刪除(1-100個(gè)核苷酸)。本發(fā)明的還有一個(gè)方面，寡核苷酸的設(shè)計(jì)可以通過(guò)以下步驟完成——確定所要交換的受體鏈序列，或至少是圍繞將要發(fā)生交換的核苷酸的序列區(qū)段。典型地，這可以是至少10個(gè)，優(yōu)選為15、20、25或30個(gè)核苷酸毗鄰錯(cuò)配，優(yōu)選在錯(cuò)配的兩側(cè)(例如GGGGGGXGGGGGG，其中X是錯(cuò)配)；——設(shè)計(jì)一個(gè)供體寡核苷酸，該寡核苷酸與毗鄰錯(cuò)配的一個(gè)或者兩個(gè)區(qū)段互補(bǔ)，并且包含所需的將被交換的核苷酸(例如CCCCCCYCCCCCC);——提供(例如，通過(guò)合成)在所需的位置帶有LNA修飾得供體寡核苷酸。修飾可以是很大程度上不同的，這依賴(lài)于環(huán)境。例如，CCCmCCmCYCCmCCCmC、CCCmCCCYCCCmCCC、CCCCCCYCCCmCmCmCm、CmCmCmCmCmCYCCCCCC、CCCCCmCYCCCmCCCCC等等，其中C"M戈表一個(gè)LNA修飾核苷酸殘基。對(duì)于不同的受體序列，例如ATGCGTACXGTCCATGAT,可以設(shè)計(jì)相應(yīng)的供體寡核苷酸，例如，TACGCALGYCLGGTACTA(L=LNA)，其修飾可以進(jìn)行如前所述的變化?！谀軌虬邢蚝塑账峤粨Q的蛋白質(zhì)存在時(shí)，用供體寡核苷酸對(duì)DNA進(jìn)行修飾，例如，特別地，所述蛋白質(zhì)在細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制中發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)。拋開(kāi)理論的束縛，改善的結(jié)合親合力被認(rèn)為是提高寡核苷酸的發(fā)現(xiàn)并且保持結(jié)合到它的靶標(biāo)的可能性，從而改善TNE效率。許多不同的糖主鏈或者堿基的化學(xué)修飾提供了改善的結(jié)合親合力。然而，本發(fā)明人致力于研究LNA修飾寡核苷酸，發(fā)現(xiàn)它們?cè)赥NE中的活性取決于在寡核苷酸中的位置。封閉核苷酸(LNA)是一種具有非常有趣性質(zhì)的用于反義基因療法的DNA類(lèi)似物。LNA是二環(huán)核苷酸和三環(huán)核苷酸和核苷酸類(lèi)似物和含有這樣核苷酸類(lèi)似物的寡核苷酸。LNA和相關(guān)類(lèi)似物的堿基結(jié)構(gòu)和功能特性在許多公開(kāi)物和專(zhuān)利中公開(kāi)了，包括WO99/14226、WO00/56748、WO00/66604、WO98/39352，美國(guó)專(zhuān)利No.6,043,060，以及美國(guó)專(zhuān)利No.6,268,490，所有的這些通過(guò)引用完整的合并于此。特別地，它結(jié)合了辨別正確和不正確的靶標(biāo)(高專(zhuān)一性)，非常高的生物穩(wěn)定性(低周轉(zhuǎn)，lowturnover)和空前的親和力(對(duì)耙非常高的結(jié)合力)的多種能力。事實(shí)上，LNA帶來(lái)的親和力的增加使得先前報(bào)道的類(lèi)似物的親和力處于低到中度的范圍。LNA是一種RNA類(lèi)似物，其中的核酸糖在結(jié)構(gòu)上受到2，-氧原子和4，-碳原子之間的亞甲基橋的抑制。該橋接限制了呋喃核糖的適應(yīng)性并且將結(jié)構(gòu)封閉到剛性二環(huán)結(jié)構(gòu)中。這樣所謂的N型(或3，-內(nèi))構(gòu)象導(dǎo)致含有雙鏈LNA的Tm的增加，以及因此獲得的更高的結(jié)合親合力和更高的特異性。NMR光譜研究現(xiàn)在已經(jīng)實(shí)際上證實(shí)了LNA糖封閉的N型構(gòu)象，但是也顯示LNA單體可以扭曲它們的未修飾的相鄰核苷酸成為一個(gè)N型構(gòu)象。重要地，所述的LNA的有利特性并不像其它核苷酸類(lèi)似物經(jīng)常觀察到的那樣以犧牲其他重要性質(zhì)為代價(jià)。LNA可以與所有其它構(gòu)成DNA類(lèi)似物集合的化學(xué)化學(xué)物自由混合。LNA堿基可以作為短全LNA序列或作為較長(zhǎng)的LNA/DNA嵌合體結(jié)合到寡核苷酸中。LNA可以被置于內(nèi)部，3'或5'-位置。然而，由于它們的剛性二環(huán)構(gòu)象，LNA殘基有時(shí)會(huì)擾亂核苷酸鏈的螺旋狀扭曲。因此通常很少設(shè)計(jì)帶有兩個(gè)或者更多毗鄰LNA殘基的寡核苷酸。優(yōu)選地，LNA殘基被至少一個(gè)不干擾螺旋狀扭曲的(修飾)核苷酸如常規(guī)的核苷酸(A、C、T或G)分開(kāi)。最初發(fā)展的以及優(yōu)選的LNA單體(β-D-氧-LNA單體)已經(jīng)被修飾成新的LNA單體。新的a-L-氧-LNA顯示出對(duì)于3'核酸外切酶活性的高穩(wěn)定性，并且比3-D-氧-LNA在設(shè)計(jì)有效反義寡核苷酸方面更有效率且具有更多用途。同時(shí)，可以使用xylo-LNA和L-riboLNA，如W09914226、WO00/56748、WO00/66604所公開(kāi)的。在本發(fā)明中，任何上述類(lèi)型的LNA在達(dá)到本發(fā)明的目的(即改善TNE效率)上都是有效的，優(yōu)選為3-D-LNA類(lèi)似物。在TNE領(lǐng)域，LNA修飾已經(jīng)被列舉在用于作為T(mén)NE的嵌合分子的可選擇的可能寡核苷酸的列表中。然而，該領(lǐng)域迄今沒(méi)有給出LNA修飾單鏈DNA寡核苷酸將TNE效率顯著提高到現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的當(dāng)LNA置于距錯(cuò)配至少一個(gè)核苷酸和/或寡核苷酸不含有超過(guò)約75%(大概是核苷酸的最接近整數(shù))LNA時(shí)的水平。寡核苷酸的遞送可以經(jīng)電穿孔法或者其它能夠遞送到細(xì)胞核或者細(xì)胞質(zhì)的常規(guī)技術(shù)來(lái)完成。在活體外，本發(fā)明的方法的試驗(yàn)可以通過(guò)使用例如WO01/87914、WO03/027265、WO99/58702、WO01/92512中所述的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)來(lái)完成。如這里所用的，供體寡核苷酸影響TNE的能力依賴(lài)于合并到供體核苷酸中的修飾核苷酸的類(lèi)型、位置和數(shù)量或相對(duì)量。這種能力可以通過(guò)例如將常規(guī)核苷酸之間的結(jié)合親合力(或結(jié)合能(吉布斯自由能))以1為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的方法定量，即對(duì)于AT和GC的結(jié)合，該親合力被標(biāo)準(zhǔn)化為l。對(duì)于本發(fā)明的寡核苷酸，各修飾核苷酸的相對(duì)結(jié)合親和力(RelativeBindingAffnity，RBA)是大于1。這體現(xiàn)在下面的公式中<formula>seeoriginaldocumentpage15</formula>其中，RBA是總相對(duì)結(jié)合親和力，RBA(修飾的)是具有n個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的修飾寡核苷酸的相對(duì)結(jié)合親和力的和，RBA(非修飾的)是具有m個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的修飾寡核苷酸的相對(duì)結(jié)合親和力的和。例如，一個(gè)100bp的寡核苷酸含有10個(gè)修飾，每個(gè)修飾具有1.1的相對(duì)結(jié)合親和力。那么總RBA等于RBA=[(10*1.1)+(90*1.0)]-(100*1.0)=1。要注意的是，RBA的定義原則上不依賴(lài)于與之相比的核苷酸鏈的長(zhǎng)度。然而，當(dāng)不同鏈的RBA相比較時(shí)，優(yōu)選地是鏈具有大約相同的長(zhǎng)度或者長(zhǎng)度相當(dāng)?shù)膮^(qū)段被采用。要注意的是，RBA在修飾可被集合在一條鏈上未予考慮。因此，相比鏈B，某鏈A更高的修飾度表示RBA(A)>RBA(B)。對(duì)于上游和下游區(qū)段，相應(yīng)的(局部的)RBA值是可以被確定和使用的。為了調(diào)節(jié)修飾核苷酸的位置的作用，加權(quán)因子被引入RBA值。例如，在毗鄰錯(cuò)配的供體核苷酸上的修飾核苷酸的作用可以比位于錯(cuò)配5個(gè)核苷酸距離的修飾核苷酸的作用更大。在本發(fā)明的上下文中，RBA(供體)>RBA(受體)。在某些實(shí)施方案中，供體的RBA值至少比受體的RBA值大0.1。在某些實(shí)施方案中，供體的RBA值至少比受體的RBA值大0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5。RBA值可以通過(guò)核苷酸修飾結(jié)合親合力的常規(guī)分析獲得，例如通過(guò)分子模型、熱力學(xué)測(cè)量等等。可選擇地，它們可以通過(guò)修飾和未修飾鏈之間的Tm差值的測(cè)定來(lái)決定?？蛇x擇地，RBA可以表達(dá)為未修飾和修飾鏈之間在Tm的差值，該差值或者通過(guò)測(cè)量或者通過(guò)用于計(jì)算一套核苷酸的Tm的常規(guī)公式計(jì)算，或者結(jié)合計(jì)算和測(cè)量來(lái)獲得。根據(jù)本發(fā)明的供體寡核苷酸可以包含進(jìn)一步的修飾以改善雜交性質(zhì)，使得供體顯示出對(duì)靶DNA鏈提高的親和力，以便供體的插入更容易。供體寡核苷酸可以進(jìn)一步被修飾以對(duì)核酸酶更具抗性、以穩(wěn)定三倍體或四倍結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的LNA修飾供體寡核苷酸的修飾可以包含磷硫酰修飾、2-OMe置換、在寡核苷酸的3'和/或5'末端的進(jìn)一步使用LNA、PNA(肽核苷酸)、核糖核苷酸和其他修飾，優(yōu)選增強(qiáng)寡核苷酸和受體鏈之間的雜交穩(wěn)定性的堿基。這些修飾中特別有用的是PNA，它們是寡核苷酸類(lèi)似物，其中的脫氧核糖主鏈被肽主鏈替代。一種所述的肽主鏈由酰胺鍵連接的N-(2-氨乙基)(N-(2-aminoethy1))甘氨酸的重復(fù)單位構(gòu)成。每個(gè)肽主鏈的亞單位附加到一個(gè)核堿基(nucleobase，也命名為"堿基")，該核堿基可以是天然存在的、非天然存在的或修飾的堿基。PNA寡聚物特異性結(jié)合到比DNA或RNA具有更高親和力的互補(bǔ)DNA或RNA序列。相應(yīng)地，所得的PNA/DNA或PNA/RNA雙鏈具有更高的解鏈溫度(Tm)。另外，PNA/DNA或PNA/RNA雙鏈的Tm比DNA/DNA或DNA/RNA雙鏈對(duì)于鹽濃度較不敏感。PNA的聚酰胺主鏈也對(duì)酶解作用更具抵抗力。PNA的合成在例如WO92/20702和WO92/20703中有描述，它們的內(nèi)容通過(guò)引用完整的合并于此。其它的PNA在例如W093/12129和1996年7月23日頒發(fā)的美國(guó)專(zhuān)利No.5,539,082中有說(shuō)明，它們的內(nèi)容全部引入以作為參考。另外，許多科學(xué)出版物敘述了PNA的合成以及它們的性質(zhì)和用途。參見(jiàn)，例如Patel，Nature,1993，365，490;Nielsen等，Science,1991，254，1497;Egholm，J.Am.Chem.Soc，1992，114，1895;Knudson等，NucleicAcidsResearch,1996，24，494;Nielsen等，J.Am.Chem.Soc，1996，118，2287;Egholm等，Science,1991，254，1497;Egholm等，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，1895;以及Egholm等，JAm.Chem.Soc.，1992，114，9677。更多有用的本發(fā)明的LNA寡核苷酸以SuperA和SuperT被熟知，這從EpochBiosciencesGermany可獲得。這些修飾核苷酸含有插入到DNA大溝中的附加取代基，被認(rèn)為可以改善DNA雙鏈中堿基堆積。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，有利結(jié)果可以在根據(jù)本發(fā)明的LNA修飾寡核苷酸之外，進(jìn)一步修飾引入到寡核苷酸提高受體鏈寡核苷酸的親和力時(shí)獲得。因此，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的LNA修飾寡核苷酸進(jìn)一步含有C5-丙炔修飾嘧啶和/或C7丙炔基修飾嘌呤顯著改善了TNE的效率。本發(fā)明的供體寡核苷酸也可以用來(lái)制備嵌合體，即含有DNA、RNA、LNA、PNA或其結(jié)合的區(qū)段。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸還包含其它可選的非甲基化的修飾核苷酸。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸對(duì)核酸酶是抗性的。這有利于防止寡核苷酸被核酸酶降解以及增加供體找到它的耙標(biāo)(受體分子)的可能性。在某些實(shí)施方案中，位于錯(cuò)配位置上的寡核苷酸中的核苷酸是可以被修飾的。錯(cuò)配是否可以修飾很大程度上依賴(lài)于使用供體和受體鏈之間親和力上的差異的靶向核苷酸交換的精確機(jī)制或者細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī)制。對(duì)于錯(cuò)配的臨近或者接近位置上的其它修飾的位置的精確定位來(lái)講也是一樣的。然而，基于此處的公開(kāi)，所述的寡核苷酸是容易設(shè)計(jì)和試驗(yàn)的，參考本說(shuō)明書(shū)中其它地方所描述的對(duì)合適的寡核苷酸的試驗(yàn)操作。在某些實(shí)施方案中，在錯(cuò)配位上的核苷酸是不被修飾的。在某些實(shí)施方案中，修飾位于距錯(cuò)配l個(gè)核苷酸距離的位置，優(yōu)選為距錯(cuò)配2、3、4、5、6或7個(gè)核苷酸的位置。在某些實(shí)施方案中，修飾位于距錯(cuò)配下游區(qū)的位置。在某些實(shí)施方案中，修飾位于距錯(cuò)配上游區(qū)的位置。在某些實(shí)施方案中，修飾位于距錯(cuò)配10bp到10kB的位置，優(yōu)選為距錯(cuò)配50到5000bp，更優(yōu)選為距錯(cuò)配100-500。用作供體的寡核苷酸在長(zhǎng)度上可以是不同的，但一般的長(zhǎng)度上的變化在10到500個(gè)核苷酸之間，優(yōu)選為11到100個(gè)核苷酸，優(yōu)選為15到90個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為20到70個(gè)核苷酸，最優(yōu)選為30到60個(gè)核苷酸。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列靶向改變的方法，包括使該雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列結(jié)合一條供體寡核苷酸，其中該雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列含有一條第一DNA序列和一條與第一DNA序列互補(bǔ)的第二DNA序列，以及其中該供體寡核苷酸含有包含至少一個(gè)與將被改變的雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列有關(guān)的錯(cuò)配的結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地與第一DNA序列有關(guān)，以及在有靶向核苷酸交換能力的蛋白質(zhì)存在時(shí)，其中供體寡核苷酸的區(qū)段被LNA修飾以表現(xiàn)出與寡核苷酸中位于該位置上的未修飾核苷酸相比，對(duì)于第一DNA序列更高的親和力，其中LNA位于距離至少相對(duì)該錯(cuò)配一個(gè)核苷酸的位置。廣義地來(lái)講，本發(fā)明一般適用于所有種類(lèi)的生物體，例如人類(lèi)、動(dòng)物、植物、魚(yú)類(lèi)、爬行類(lèi)動(dòng)物、昆蟲(chóng)、真菌、細(xì)菌等等。本發(fā)明適用于任何類(lèi)型DNA的修飾，例如得自基因組DNA、線性DNA、人工染色體、核染色體DNA、細(xì)胞器染色體DNA、BAC、YAC的DNA。本發(fā)明可以在活體內(nèi)(invivo)以及取自體內(nèi)在活體外(exvivo)完成。廣義地來(lái)講，本發(fā)明適用于改變細(xì)胞、通過(guò)回復(fù)校正突變到野生型、誘導(dǎo)突變、通過(guò)破壞編碼區(qū)的滅活酶、通過(guò)改變編碼區(qū)對(duì)酶的生物活性進(jìn)行修飾、通過(guò)破壞編碼區(qū)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾。本發(fā)明實(shí)質(zhì)上也涉及如上所述寡核苷酸的用途，用于改變細(xì)胞、通過(guò)回復(fù)校正突變到野生型、誘導(dǎo)突變、通過(guò)破壞編碼區(qū)的滅活酶、通過(guò)改變編碼區(qū)對(duì)酶的生物活性進(jìn)行修飾、通過(guò)破壞編碼區(qū)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾、錯(cuò)配修復(fù)、靶向改變(植物)遺傳物質(zhì)，包括基因突變、靶向基因修復(fù)和基因敲除。本發(fā)明進(jìn)一步涉及試劑盒，其包含一個(gè)或者更多如本說(shuō)明書(shū)在別處所定義的寡核苷酸，可選的聯(lián)合能誘導(dǎo)MRM、特別是有TNE能力的蛋白質(zhì)。本發(fā)進(jìn)一步涉及通過(guò)本發(fā)明的方法得到的修飾遺傳物質(zhì)、涉及含有該修飾遺傳物質(zhì)的細(xì)胞和生物體，以及涉及如此得到的植物或植物部分。本發(fā)明特別涉及使用本發(fā)明的LNA修飾寡核苷酸以提供植物中的抗除草劑的TNE方法的用途。特別地，本發(fā)明涉及被提供了抗除草劑的植物，尤其是草甘磷和/或磺酰脲類(lèi)除草劑，例如氯磺隆。附圖1:靶向核苷酸交換圖示。含有將被交換核苷酸(X)的受體雙鏈DNA鏈被帶入與含有將被插入的核苷酸(Y)的LNA修飾供體寡核苷酸(以NWTNNNmYNNmNNm的圖式給出)接觸。三環(huán)構(gòu)造受到或被帶入接觸有TNE能力的環(huán)境或者與有執(zhí)行TNE能力的蛋白質(zhì)接觸，例如所知的無(wú)細(xì)胞的酶混合物或者無(wú)細(xì)胞提取物(參見(jiàn)i.a.WO99/58702、WO01/73002)。附圖2:不同LNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)。附圖3:使用無(wú)細(xì)胞分析測(cè)量的含有LNA修飾核苷酸的寡核苷酸的TNE修復(fù)效率。每個(gè)使用普通DNA寡核苷酸的實(shí)驗(yàn)的修復(fù)效率被確定，并且被定義為1的值。成倍的增加表明通過(guò)使用含有3-D-LNA的寡核苷酸與使用普通DNA寡核苷酸相比得到的修復(fù)效率的觀察到的修復(fù)的增加。實(shí)施例材料和方法含有LNA核苷酸的寡核苷酸從Eurogentec購(gòu)買(mǎi)。所用的寡核苷酸的序列如下所示。實(shí)驗(yàn)中所用的質(zhì)粒是含有能給予卡那霉素和羧芐青霉素抗性的基因的pCR2.1(Invitrogen)的衍生物。在結(jié)構(gòu)中，終止密碼子和缺失基因組被引入卡那霉素ORF和羧芐青霉素，如前人所述(Sawano等，2000NucleicAcidsRes.e78)。質(zhì)粒KmY22stop在卡那霉素ORF中密碼子Y22處具有TAT到TAG的突變。在質(zhì)粒KmY22中，Y22密碼子(TA工)的第三核苷酸被刪除給出一個(gè)移碼。有缺陷的卡那霉素基因和用在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中的寡核苷酸<formula>seeoriginaldocumentpage20</formula><table><row><column>寡核苷酸</column><column>序列</column><column>LNA/DNA</column><column>SEQID</column></row><row><column>L1</column><column>tgtgcccagtCgTagccgaatagc</column><column>2/24(8-3%)</column><column>1</column></row><table><table><row><column>L2</column></row><row><column>tgtgcccagTcgtAgccgaatagc</column></row><row><column>2/24(8-3%)</column></row><row><column>2</column></row><row><column>13V</column></row><row><column>TgTgCcCaGtCg;TaGcCgAaTaGc</column></row><row><column>12/24(50%)</column></row><row><column>3</column></row><row><column>L4</column></row><row><column>GtGcCcAgTcGtAgCcGaAtAgC</column></row><row><column>12/24(50%)</column></row><row><column>4</column></row><row><column>L5</column></row><row><column>GtgcCcagTcgtAgccGeta/tAgc</column></row><row><column>6/24(25%)</column></row><row><column>5</column></row><row><column>L6</column></row><row><column>tgtgCccagTcgtaGccgaAtagc</column></row><row><column>4/24(16-6%)</column></row><row><column></column></row><table>相關(guān)的卡那霉素開(kāi)放讀碼框和編碼的氨基酸的序列被展示。產(chǎn)生終止密碼子(TAG，勺的單個(gè)核苷酸突變?nèi)缜八霰灰?Sawano等，2000NucleicAcidsRes.2§:e78)。實(shí)驗(yàn)中使用的LNA寡核苷酸的序列以大寫(xiě)字母顯示。寡核苷酸Ll-L6被用來(lái)使KmY22stop和KmY22A突變轉(zhuǎn)化為交變的酪氨酸編碼密碼子(TAC)。在每個(gè)寡核苷酸中的錯(cuò)配核苷酸是用下劃線強(qiáng)調(diào)的。在卡那霉素ORF上的寡核苷酸結(jié)合區(qū)域是用下劃線強(qiáng)調(diào)的。寡核苷酸Ll-L6是卡那霉素編碼序列的互補(bǔ)。無(wú)細(xì)胞分析按照如下完成擬南芥(Arabidopsisthaliana)(Col-0生態(tài)型)的花芽被收集并且在氮下粉碎。200^tl蛋白質(zhì)分離緩沖液(20mMHEPESpH7.5、5mMKC1、1.5mMMgCl2、10mMDTT、10%(v/v)甘油、1%(w/v)PVP)被加入。植物碎屑通過(guò)離心分離在14kRPM下30分出沉淀，并且上清液在-80。C儲(chǔ)藏。蛋白質(zhì)濃縮物通過(guò)使用NanoOrange試劑盒(MolecularProbes,Inc)被測(cè)量。一種典型的分離物導(dǎo)致約3-4pg4il的蛋白質(zhì)濃度。無(wú)細(xì)胞反應(yīng)包括以下組分，lpg質(zhì)粒DNA(KmY22stop或KmY22△)，100ng寡核苷酸，30ng總植物蛋白，4^1切斷的鮭精DNAG(ig/W)，2^蛋白酶抑制劑混合物(50x濃度完全無(wú)EDTA蛋白酶抑制劑雞尾酒片劑，RocheDiagnostics),50(xl2x無(wú)細(xì)胞反應(yīng)緩沖液(400mMTrispH7.5、200mMMgC12、2mMDTT、0.4mM精脒、50mMATP、2mM每種CTP、GTP、UTP，O.lmM每種dNTP和10mMNAD)，加水至總體積lOO(il?；旌衔镌?7°C下培養(yǎng)1小時(shí)。然后質(zhì)粒DNA按以下方法分離。100U1H2021加入到每個(gè)反應(yīng)中以增加體積隨后加入20(V1的堿性緩沖苯酚(pH8-10)。簡(jiǎn)要地旋轉(zhuǎn)然后在13krpm下離心3分鐘。上層的水相被轉(zhuǎn)到一個(gè)新的試管中同時(shí)然后加入200pl氯仿，簡(jiǎn)要地旋轉(zhuǎn)，然后在13krpm旋轉(zhuǎn)3分鐘，上層水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的試管中。DNA通過(guò)加入0.7體積的2-丙醇沉淀出來(lái)，同時(shí)片狀沉淀物在TE中再懸浮。為了清除任何共純化寡核苷酸，DNA通過(guò)QiagenPCR純化柱，同時(shí)質(zhì)粒DNA在30pl的終體積中洗脫。2jil的質(zhì)粒DNA電穿孔到18(ilDH10B(Invitrogen)電穿孔感受態(tài)細(xì)胞。在電穿孔后，細(xì)胞在37°C下在SOC培養(yǎng)基中恢復(fù)1小時(shí)。這段時(shí)間以后，卡那霉素加入到100昭/ml的濃縮物中，同時(shí)細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)3小時(shí)。固體培養(yǎng)基含有100i!g/ml卡那霉素或者羧節(jié)青霉素。對(duì)于KmY22stop禾nKmY22實(shí)驗(yàn)，TNE事件的數(shù)量在卡那霉素培養(yǎng)基上被檢測(cè)，同時(shí)電穿孔術(shù)的效率通過(guò)計(jì)數(shù)得自羧芐青霉素培養(yǎng)基析出的電穿孔的10—4和10—5稀釋的菌落的數(shù)量而計(jì)算。TNE效率通過(guò)按轉(zhuǎn)化細(xì)胞的總數(shù)除以TNE事件的數(shù)量而計(jì)算。結(jié)果寡核苷酸被設(shè)計(jì)在引入到卡那霉素ORF中的終止密碼子(TAG)產(chǎn)生單個(gè)核苷酸置換(KmY22stop)或插入(KmY22A)，因此密碼子再次編碼正確的氨基酸。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，未修飾DNA寡核苷酸和LNA修飾寡核苷酸是平行進(jìn)行的。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用普通DNA寡核苷酸得到的TNE效率被設(shè)定為1，同時(shí)LNA寡核苷酸的TNE效率隨后以與普通DNA寡核苷酸相比成倍增長(zhǎng)的形式表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)修復(fù)效率的增加依賴(lài)于LNA在寡核苷酸中的位置。寡核苷酸Ll含有在錯(cuò)配核苷酸兩側(cè)的LNA核苷酸，同時(shí)這表明與DNA寡核苷酸相比沒(méi)有改善。然而，帶有與錯(cuò)配間隔一個(gè)核苷酸的LNA核苷酸的寡核苷酸L2表現(xiàn)出5倍的平均增加。額外的LNA核苷酸(L3&L4)的加入減少修復(fù)效率低于普通DNA寡核苷酸的修復(fù)效率到背景水平，這些寡核苷酸是無(wú)生物學(xué)活性的。這被使用L5和L6的數(shù)據(jù)所證實(shí)。在L5中，除了如L2中的LNA側(cè)鄰錯(cuò)配核苷酸，它還包含附加的LNA核苷酸。在這個(gè)例子中，使用L2得到的在修復(fù)中的增加是觀察不到的，推測(cè)這可能是附加LNA核苷酸的抑制作用。L6也表明當(dāng)使用KmY22stop時(shí)修復(fù)中的改善。同樣的趨勢(shì)當(dāng)實(shí)驗(yàn)使用KmY22A完成時(shí)也被觀察到。已知經(jīng)由單個(gè)核苷酸插入的修復(fù)比經(jīng)由置換的修復(fù)的效率低，這與此處觀察到的相同。L2表明在修復(fù)率的增加，這表明圍繞錯(cuò)配的LNA核苷酸位置的插入是增加修復(fù)率的一個(gè)重要特征。在本發(fā)明中，實(shí)驗(yàn)表明使用無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)活體外TNE分析，含有LNA核苷酸的寡核苷酸表現(xiàn)出相比使用普通DNA寡核苷酸得到的TNE效率更高水平的TNE。所述的增加可以是高達(dá)5倍。該作用很大程度上依賴(lài)于相對(duì)錯(cuò)配核苷酸LNA核苷酸的位置。此外，修復(fù)過(guò)程對(duì)寡核苷酸上LNA核苷酸的數(shù)量非常敏感，當(dāng)該數(shù)量達(dá)到50%時(shí)，寡核苷酸表現(xiàn)出在分析中減少的生物學(xué)活性。LNA核苷酸的另一種形式，2'-氨基-LNA類(lèi)似物(Rosenbohm等，(2003)OrgBiomolChem.丄，655-663)可以通過(guò)在核苷酸中附加其他化學(xué)基團(tuán)而進(jìn)一步功能化。除增加的結(jié)合親合力以外，所述的具有附加化學(xué)基團(tuán)的LNA核苷酸可以在許多方面與DNA相互作用，進(jìn)一歩增強(qiáng)結(jié)合親合力(Sorensen等，(2003)ChemCommun(Camb)i2，2130-2131)。該2'-氨基隱LNA可超過(guò)已顯示的5倍增加而進(jìn)一步增加修復(fù)。權(quán)利要求1、一種用于雙鏈DNA序列靶向改變的寡核苷酸，該雙鏈DNA序列含有第一DNA序列和與第一DNA序列互補(bǔ)的第二DNA序列，該寡核苷酸包含能夠雜交到第一DNA序列的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)與第一DNA序列有關(guān)的錯(cuò)配，其中該寡核苷酸包含至少一個(gè)區(qū)段，所述的區(qū)段含有至少一個(gè)與天然存在的A、C、T或G相比具有更高的結(jié)合親和力的修飾核苷酸，其中所述的至少一個(gè)修飾核苷酸是一個(gè)置于距離所述的至少一個(gè)錯(cuò)配至少一個(gè)核苷酸的LNA，其中，可選的是，該寡核苷酸含有至多約75％的LNA修飾核苷酸。2、根據(jù)權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中至少2個(gè)，優(yōu)選為至少3個(gè)，更優(yōu)選為至少4個(gè)，甚至更優(yōu)選為至少5個(gè)以及最優(yōu)選至少6個(gè)核苷酸是LNA。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2的寡核苷酸，其中所述的LNA不受限制地分布在距離所述的錯(cuò)配兩側(cè)至多10個(gè)核苷酸上，優(yōu)選為至多8個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為至多6個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選為至多4、3或2個(gè)核苷酸的。4、根據(jù)權(quán)利要求1-3的寡核苷酸，其中2個(gè)，優(yōu)選為3個(gè)，更優(yōu)選為4個(gè)，甚至更優(yōu)選為5個(gè)以及最優(yōu)選為6個(gè)核苷酸是LNA。5、根據(jù)前述任一權(quán)利要求的寡核苷酸，其中至多50%的該寡核苷酸的所述的修飾核苷酸是LNA衍生物，優(yōu)選為至多40%，更優(yōu)選為至多30%，甚至更優(yōu)選為至多20%，以及最優(yōu)選為至多10%。6、根據(jù)前述任一權(quán)利要求的寡核苷酸，其中所述的至少一個(gè)修飾核苷酸不受限制地置于該錯(cuò)配的5'側(cè)和/或3'側(cè)。7、根據(jù)前述任一權(quán)利要求的寡核苷酸，其中位于所述的錯(cuò)配的5'側(cè)或3'側(cè)同一側(cè)的兩個(gè)LNA修飾核苷酸彼此間隔至少一個(gè)，優(yōu)選為兩個(gè)堿基對(duì)。8、根據(jù)前述任一權(quán)利要求的寡核苷酸，其中在該錯(cuò)配位置的核苷酸是未修飾的。9、根據(jù)前述任一權(quán)利要求的寡核苷酸，其中所述的至少一個(gè)修飾核苷酸不位于該錯(cuò)配毗鄰的位置，同時(shí)優(yōu)選地位于該錯(cuò)配2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)核苷酸以?xún)?nèi)。10、根據(jù)前述任一權(quán)利要求的寡核苷酸，其具有10至500個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。11、根據(jù)前述任一權(quán)利要求的寡核苷酸，其中所述的(修飾)區(qū)段即是所述的結(jié)構(gòu)域。12、雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列耙向改變的方法，包括使該雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列結(jié)合一條供體寡核苷酸，其中該雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列含有一條第一DNA序列和一條與第一DNA序列互補(bǔ)的第二DNA序列，以及其中該供體寡核苷酸含有包含至少一個(gè)與將被改變的雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列有關(guān)的錯(cuò)配的結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地與第一DNA序列有關(guān)，以及其中該寡核苷酸含有包含至少一個(gè)與天然存在的A、C、T或G相比具有更高親合力的修飾核苷酸的區(qū)段，以及在存在能夠耙向核苷酸交換的蛋白質(zhì)時(shí)，該修飾核苷酸與天然存在的第一DNA序列中相對(duì)位置上的核苷酸的互補(bǔ)核苷酸相比，對(duì)第一DNA序列中相對(duì)位置上的該核苷酸的結(jié)合更強(qiáng)，以及其中該修飾寡核苷酸是如權(quán)利要求1-11所述的寡核苷酸。13、根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的改變是在細(xì)胞中的，該細(xì)胞優(yōu)選自由植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞、人類(lèi)細(xì)胞或酵母細(xì)胞組成的群組。14、根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中該蛋白質(zhì)得自細(xì)胞提取物。15、根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中該細(xì)胞提取物選自由植物細(xì)胞提取物、真菌細(xì)胞提取物、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞提取物、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞提取物、人類(lèi)細(xì)胞提取物或酵母細(xì)胞提取物的組成的群組。16、根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中該改變是至少一個(gè)核苷酸的刪除、置換或插入。17、根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中該細(xì)胞是真核細(xì)胞、植物細(xì)胞、非人類(lèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或人類(lèi)細(xì)胞。18、根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中靶標(biāo)DNA來(lái)自于真菌、細(xì)菌、植物、哺乳動(dòng)物或人類(lèi)。19、根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中雙鏈DNA來(lái)自于基因組DNA、線性DNA、哺乳動(dòng)物人工基因組、細(xì)菌人工基因組、酵母人工基因組、植物人工基因組、核基因組DNA、細(xì)胞器基因組DNA、附加體DNA。20、根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，用于改變細(xì)胞、通過(guò)回復(fù)校正突變到野生型、誘導(dǎo)突變、通過(guò)破壞編碼區(qū)的滅活酶、通過(guò)改變編碼區(qū)對(duì)酶的生物活性進(jìn)行修飾、通過(guò)破壞編碼區(qū)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾。21、如權(quán)利要求1-12所述的寡核苷酸的用途，用于改變細(xì)胞、通過(guò)回復(fù)校正突變到野生型、誘導(dǎo)突變、通過(guò)破壞編碼區(qū)的滅活酶、通過(guò)改變編碼區(qū)對(duì)酶的生物活性進(jìn)行修飾、通過(guò)破壞編碼區(qū)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾、錯(cuò)配修復(fù)、靶向改變(植物)遺傳物質(zhì)，包括基因突變、靶向基因修復(fù)和基因敲除。22、如權(quán)利要求1-12所述的寡核苷酸的用途，用于增強(qiáng)的雙鏈DNA序列的耙向改變，該雙鏈DNA序列含有一條第一DNA序列和一條與第一DNA序列互補(bǔ)的第二DNA序列，該寡核苷酸包含能夠雜交到第一DNA序列的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)與第一DNA序列有關(guān)的錯(cuò)配，同時(shí)其中該寡核苷酸包含一個(gè)含有修飾核苷酸的區(qū)段，其中所述的修飾核苷酸與天然存在的A、C、T或G相比具有更高的結(jié)合親和力，以及其中所述的修飾核苷酸與天然存在的第一DNA序列中相對(duì)位置上的核苷酸的互補(bǔ)核苷酸相比，對(duì)第一DNA序列中相對(duì)位置上的該核苷酸的結(jié)合更強(qiáng)，其中所述的修飾核苷酸是LNA。23、如權(quán)利要求1-11所述的寡核苷酸在提供植物抗除草劑的方法中的用途。24、含有如權(quán)利要求1-11所述寡核苷酸的試劑盒。25、通過(guò)如權(quán)利要求12-20所述的方法產(chǎn)生的修飾遺傳物質(zhì)。26、包含如權(quán)利要求25所述的修飾遺傳物質(zhì)的細(xì)胞。27、如權(quán)利要求11-20的所述的方法制備的或者包含如權(quán)利要求25所述的修飾遺傳物質(zhì)的植物或植物部分。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于雙鏈DNA序列的靶向核苷酸交換的方法和寡核苷酸，其中供體寡核苷酸含有至少一個(gè)修飾核苷酸，該修飾核苷酸是與天然存在的A、C、T或G相比具有更高結(jié)合親合力的LNA，和/或是與天然存在的第一DNA序列中相對(duì)位置上的核苷酸的互補(bǔ)核苷酸相比，對(duì)第一DNA序列中相對(duì)位置上的該核苷酸的結(jié)合更強(qiáng)的修飾核苷酸。文檔編號(hào)C12N15/10GK101346466SQ200680048992公開(kāi)日2009年1月14日申請(qǐng)日期2006年12月21日優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日發(fā)明者L·K·瓦霍夫斯基,M·T·J·德博特,P·本多克,R·C·J·霍格斯申請(qǐng)人:凱津公司