用丙炔基修飾的寡核苷酸的改進(jìn)的靶向核苷酸交換方法

專利名稱：：用丙炔基修飾的寡核苷酸的改進(jìn)的靶向核苷酸交換方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過將寡核苷酸引入細(xì)胞來特異性和選擇性改變?cè)诎屑?xì)胞中DNA的特異位點(diǎn)的核苷酸序列的方法。結(jié)果是靶向交換了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，使得耙DNA的序列被轉(zhuǎn)變成其中它們是不同的寡核苷酸的序列。更特別地，本發(fā)明涉及使用修飾的寡核苷酸的靶向核苷酸交換。本發(fā)明進(jìn)一步涉及寡核苷酸和試劑盒。本發(fā)明還涉及所述方法的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：遺傳修飾是在活細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中故意進(jìn)行改變的方法，目的是修飾所述細(xì)胞或其中所述細(xì)胞形成其部分或形成其可以再生的有機(jī)物的一個(gè)或多個(gè)遺傳編碼的生物學(xué)特性。這些變化可以采取遺傳物質(zhì)部分缺失、加入外源性遺傳物質(zhì)或改變遺傳物質(zhì)的現(xiàn)有核苷酸序列的形式。用于遺傳修飾真核生物的方法已知超過20年，并且其已廣泛用于植物、人類和動(dòng)物細(xì)胞及微生物中以改善農(nóng)業(yè)、人類健康、食品性質(zhì)和環(huán)境保護(hù)方面。遺傳修飾的常見方法包括加入遺傳修飾的常規(guī)方法，包括將外源性DNA片段加入細(xì)胞的基因組中，然后，其將賦予那些細(xì)胞或其有機(jī)體超過現(xiàn)有基因編碼的性質(zhì)的新性質(zhì)(包括其中現(xiàn)有基因的表達(dá)將因此被抑制的應(yīng)用)。盡管許多這樣的實(shí)例在獲得期望的性質(zhì)中是有效的，然而，這些方法不是非常精確，因?yàn)槠洳荒芸刂破渲型庠葱訢NA片段插入在基因組的位置(并從而高于表達(dá)的最終水平)，和因?yàn)轭A(yù)期效果將表明其本身高于由原始的和正常的基因組編碼的天然性質(zhì)。相反地，將引起在預(yù)先確定的基因組基因座中的核苷酸加入、缺失或轉(zhuǎn)化的遺傳修飾的方法允許精確地修飾現(xiàn)有基因。寡核苷酸定向靶向核苷酸交換CTNE，有時(shí)稱為ODTNE)是基于將合成的寡核苷酸(由核苷酸樣部分的短鏈(shortstretches)組成的分子，其類似于在其Watson-Crick堿基配對(duì)性質(zhì)中的DNA，但可能與DNA在化學(xué)上不同)遞送至真核生物細(xì)胞核的方法(AlexeevandYoon,NatureBiotechnol.1343,1998;Rice,NatureBiotechnol.i￡:321，2001;Kmiec,J.Clin.Invest,ill:632，2003)。通過故意地設(shè)計(jì)在寡核苷酸的同源性序列中的錯(cuò)配核苷酸，可以將錯(cuò)配核苷酸結(jié)合到基因組DNA序列中。該方法允許現(xiàn)有基因座的單個(gè)或至多幾個(gè)核苷酸轉(zhuǎn)化，但是可以應(yīng)用于在現(xiàn)有基因中建立終止密碼子從而引起其功能破壞，或建立密碼子變化從而引起具有改變的氨基酸組成的基因編碼蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)工程)。已經(jīng)在植物、動(dòng)物和酵母細(xì)胞中描述了靶向核苷酸交換(TNE)。第一個(gè)TNE報(bào)道使用了由自補(bǔ)性寡核苷酸組成的所謂嵌合體，設(shè)計(jì)該寡核苷酸是用于插入染色體耙向位點(diǎn)。所述嵌合體包含錯(cuò)配核苷酸，該錯(cuò)配核苷酸形成用于引入染色體耙點(diǎn)的突變的模板。為了選擇TNE事件，大部分研究嘗試在導(dǎo)致除草劑耐藥性的內(nèi)源基因中引入單核苷酸變化。使用嵌合體的第一個(gè)實(shí)例來自人類細(xì)胞(參見綜述Rice^"/.，Ato.歷0fec/7.i^:321-326)。嵌合體的使用也在植物種類煙草、米和玉米中獲得成功(Beethamda/.，1999/Voc.A^/.Jcad2^:8774-8778;Kochevenkoefa/.，2003P/awfP/j".m:174-184;Okuzaki2004戶/a^CW/iep.22:509-512)。然而，發(fā)現(xiàn)嵌合體的活性難于再生，因此，已經(jīng)測(cè)定了單鏈(ss)寡核苷酸的TNE活性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些在小麥、酵母菌和人類細(xì)胞中取得了更多重現(xiàn)性的結(jié)果(Liu""/.，2002TVwc.」L巡2742-2750;綜述，Parekh-Olmedo"a/.，2005G證T7zera"12:639-646;Dong&a/.，2006尸/朋fCe〃7e;.2i:457-65)。一些組顯示出也可以使用全部細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物來檢測(cè)TNE。對(duì)于TNE活性的這類測(cè)定被稱為無細(xì)胞測(cè)定(Cole-Strauss"a/.，1999池c/e/cJc油27:1323-1330;Gamper&a/.，20007Vwc/e/c爿c油ito.28,4332-4339;Kmieca/.，2001戶/a""22:267-274;Rice"a/.，2001巡857-868)。所述測(cè)定按如下設(shè)置。由于改變了單個(gè)核苷酸(例如TAT至TAG),包含兩種細(xì)菌抗生素抗性基因(卡那霉素和羧芐西林)的質(zhì)粒產(chǎn)生突變，使得所述抗生素抗性基因之一(例如卡那霉素)包含在框架中的終止密碼子。然后，用全部細(xì)胞蛋白質(zhì)孵育突變的質(zhì)粒，設(shè)計(jì)單鏈寡核苷酸以校正抗生素抗性基因中的終止密碼子。TNE所必需的蛋白質(zhì)存在于細(xì)胞提取物中，利用寡核苷酸改變抗生素抗性基因中的終止密碼子、恢復(fù)抗藥性表型。然后，從反應(yīng)混合物中純化質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。然后，在包含卡那霉素的培養(yǎng)基上析出細(xì)菌，菌落的數(shù)目表示TNE修復(fù)事件的數(shù)目。通過計(jì)數(shù)在包含羧芐西林的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)來計(jì)算電穿孔功效。TNE功效可以通過計(jì)算修復(fù)的質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的總數(shù)之比來定量。在這樣的試驗(yàn)中，寡核苷酸影響取代，將TAG改變成TAC。而且，也可以使用無細(xì)胞系統(tǒng)研究使用寡核苷酸來生產(chǎn)單核苷酸插入物的可能性。也可以產(chǎn)生具有從抗生素抗性基因上刪除單核苷酸，產(chǎn)生移碼突變的質(zhì)粒。在無細(xì)胞測(cè)定中，通過加入所述寡核苷酸介導(dǎo)的核苷酸來修復(fù)缺失。在較高級(jí)有機(jī)體比如植物的細(xì)胞中應(yīng)用TNE面臨的最大問題是迄今為止已經(jīng)報(bào)道的低效率。在玉米中，Zhu等人，(2000AtowreJl:555-558)報(bào)道的基因轉(zhuǎn)變率是1x104。隨后，在煙草(Kochevenko&，2003戶/a"f巡174-184)和米(Okuzakida/.，2004尸/朋fCe〃g:509-512)的研究中報(bào)道的基因轉(zhuǎn)變率分別是1x10—6和1x10-4。這些頻率對(duì)于實(shí)際應(yīng)用TNE仍然太低。DNA的可靠復(fù)制是介導(dǎo)保持基因組基因組穩(wěn)定性和保證包含在DNA中的遺傳信息不產(chǎn)生突變地從一代傳到下一代的主要標(biāo)準(zhǔn)之一。許多錯(cuò)誤是由親代DNA鏈中的損壞引起或由與DNA堿基反應(yīng)的試劑(紫外線、環(huán)境毒素)引起。每種有機(jī)體必須保持防止或校正這些突變的防護(hù)措施。認(rèn)為錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(MMR)在DNA破壞監(jiān)控(damagesurveillance)和預(yù)防非相同序列間重組中識(shí)別和校正在DNA復(fù)制期間引起的錯(cuò)配或不成對(duì)的堿基(FedierandFink,2004Int.JOncol.2004;24(4):1039-47)，和有助于活細(xì)胞中DNA復(fù)制的精確度。已經(jīng)在多個(gè)Kmiec的專利申請(qǐng)中描述了TNE，特別地在WO0173002、WO03/027265、WOO1/87914、WO99/58702、W097/48714、WO02/10364中。在WO01〃3002中，仔細(xì)考慮的是使用未修飾的DNA寡核苷酸獲得低效率的基因改變主要被認(rèn)為是在反應(yīng)混合物或耙細(xì)胞中存在的核酸酶降解供體寡核苷酸的結(jié)果。為了糾正該問題，提議加入修飾的核苷酸，其導(dǎo)致得到的寡核苷酸對(duì)核酸酶有耐受性。典型的實(shí)例包括具有磷硫酰鍵的核苷酸、2'-0-甲基類似物或鎖核酸(LNAs)。這些修飾優(yōu)選地位于寡核苷酸的末端，留下靶向堿基周圍的中心DNA域。而且，所述出版物規(guī)定在轉(zhuǎn)化寡核苷酸和參與轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)之間涉及特殊的化學(xué)相互作用。這種化學(xué)相互作用對(duì)使用不是LNA、磷硫酰鍵或2'-0-甲基類似物的修飾生產(chǎn)寡核苷酸的核酸酶抗性端的影響是不可能預(yù)測(cè)的，因?yàn)樯婕霸摳淖冞^程的蛋白質(zhì)及其與所述寡核苷酸取代基的化學(xué)相互作用仍然不是已知的，并且根據(jù)WO0173002的本發(fā)明人，也不能預(yù)測(cè)。由于目前的ODTNE方法的功效相對(duì)低(如前所述，在10—6至10—4之間，盡管報(bào)道寡核苷酸的高遞送速率為90%)，本領(lǐng)域存在獲得更有效的用于TNE的方法的需要。因此，本發(fā)明人已經(jīng)開始改進(jìn)現(xiàn)有的TNE技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容現(xiàn)在，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過將核苷酸結(jié)合到用于TNE的供體寡核苷酸中，其能夠比相應(yīng)未修飾的核苷酸如A、C、T或G更強(qiáng)地結(jié)合受體DNA，TNE的速率可以顯著地增加。不受理論的束縛，本發(fā)明人相信，通過將修飾的核苷酸結(jié)合到供體寡核苷酸中，供體寡核苷酸更強(qiáng)地結(jié)合受體DNA，從而增加了TNE的速率。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)包括C5-丙炔修飾的嘧啶和/或C7-丙炔基修飾的嘌呤的寡核苷酸顯著地改善了TNE的功效。為此目的，研究了使用加入丙炔化的核苷酸的寡核苷酸對(duì)在無細(xì)胞系統(tǒng)中的TNE頻率的影響。將這種寡核苷酸的TNE活性與由標(biāo)準(zhǔn)DNA組成的寡核苷酸的TNE活性比較。人們發(fā)現(xiàn)包含C5-丙炔化嘧啶和/或C7丙炔化嘌呤的寡核苷酸增加在無細(xì)胞試驗(yàn)中取代和插入的TNE功效至迄今未觀察到的水平。所述包含丙炔化的核苷酸的寡核苷酸在無細(xì)胞測(cè)定中比由標(biāo)準(zhǔn)DNA組成的寡核苷酸更有效多達(dá)10倍。還發(fā)現(xiàn)，TNE功效可以通過增加寡核苷酸中丙炔化的核苷酸的數(shù)目來進(jìn)一步改善，而且觀察到的改善與基因座無關(guān)，表明包含C5-丙炔化嘧啶和/或C7丙炔化的嘌呤的寡核苷酸能夠以與種類無關(guān)的方式，比如在植物和動(dòng)物細(xì)胞中提供增加頻率的TNE。因此，本發(fā)明是基于創(chuàng)造性考慮期望的靶向核苷酸交換可以通過利用(部分)C5丙炔修飾的嘧啶和/或C7丙炔修飾的嘌呤寡核苷酸獲得。所述寡核苷酸修飾(即狀態(tài))的位置、類型和數(shù)量可隨本文下述公開而改變。因此，本發(fā)明在一個(gè)方面提供((完全)C5丙炔修飾的嘧啶和/或C7丙炔修飾的嘌呤)寡核苷酸。修飾的ss-寡核苷酸可用于將特定的遺傳改變引入植物和動(dòng)物或人類細(xì)胞。本發(fā)明適用于生物醫(yī)學(xué)研究、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，和構(gòu)建特別突變的植物和動(dòng)物，包括人類。本發(fā)明還適用于醫(yī)學(xué)和基因治療領(lǐng)域。本發(fā)明的寡核苷酸序列與靶向鏈同源，不同在于包含引入靶向鏈中堿基改變的錯(cuò)配堿基。將所述錯(cuò)配堿基引入靶向序列。通過處理核苷酸的修飾(與常規(guī)A、C、T或G相比)，更特別地，通過處理引入所述錯(cuò)配的丙炔修飾寡核苷酸的位置和數(shù)量，可以改善功效(或期望的核苷酸在DNA雙鏈體中期望的位置的成功結(jié)合度)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是通過使母體DNA雙鏈體同與母鏈相比包含至少一個(gè)錯(cuò)配核苷酸的寡核苷酸接觸來靶向改變母DNA鏈(第一鏈，第二鏈)的方法，其中供體寡核苷酸包含在能夠靶向核苷酸交換的蛋白質(zhì)存在下，用C5丙炔取代的嘧啶和/或C7取代的嘌呤修飾以具有比母(受體)鏈更高結(jié)合力的區(qū)段。因此，本發(fā)明的發(fā)明點(diǎn)在于相對(duì)于未修飾的插入寡核苷酸，改善了具有丙炔修飾的ss-寡核苷酸的插入寡核苷酸(有時(shí)稱為供體)的結(jié)合力。具體實(shí)施例方式在一個(gè)方面，本發(fā)明屬于用于靶向改變雙鏈DNA序列的丙炔修飾的寡核苷酸。雙鏈DNA序列包含第一DNA序列和第二DNA序列。第二DNA序列為第一DNA序列的互補(bǔ)鏈，并與其配對(duì)形成雙鏈。寡核苷酸包括一個(gè)域，該域包括至少一個(gè)關(guān)于要改變的雙鏈DNA序列的錯(cuò)配。優(yōu)選地，該域是與第一個(gè)鏈互補(bǔ)的寡核苷酸的部分，包括至少一個(gè)錯(cuò)配。優(yōu)選地，在域中的錯(cuò)配與第一DNA序列相關(guān)。寡核苷酸包括被修飾(包含C5-丙炔修飾的嘧啶和/或C7丙炔修飾的嘌呤)以具有比(相對(duì)應(yīng)的部分)第二DNA序列更高結(jié)合親合力的區(qū)段。包含錯(cuò)配的域和包含修飾的核苷酸的區(qū)段可以重疊。因此，在某些實(shí)施方案中，包含錯(cuò)配的域位于寡核苷酸中與要考慮修飾的區(qū)段不同的位置。在某些實(shí)施方案中，域結(jié)合區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，區(qū)段可以結(jié)合域。在某些實(shí)施方案中，域和區(qū)段位于寡核苷酸的相同位置，并且具有相同的長(zhǎng)度，即，它們的長(zhǎng)度和位置一致。在某些實(shí)施方案中，在一個(gè)域內(nèi)存在可能多于一個(gè)的區(qū)段。對(duì)于本發(fā)明，這意味著包含要結(jié)合到DNA雙鏈體的錯(cuò)配的寡核苷酸的部分可以位于不同于要修飾的寡核苷酸部分的位置。特別地，在某些實(shí)施方案中，其中細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)(或至少與該系統(tǒng)相關(guān)的蛋白質(zhì)，或至少涉及到TNE中的蛋白質(zhì))確定哪些鏈包含錯(cuò)配和哪些鏈要被用作用于校正錯(cuò)配的模板。—在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸包括其包含至少一個(gè)，優(yōu)選至少2個(gè)，更優(yōu)選至少3個(gè)丙炔修飾的核苷酸的區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸上的區(qū)段可以包含多于4、5、6、7、8、9或10個(gè)丙炔修飾的核苷酸。在某些實(shí)施方案中，區(qū)段是完全修飾的，即，寡核苷酸中所有的嘧啶載有C5-丙炔取代，和/或所有的嘌呤載有C7-丙炔取代。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸中至少10%的核苷酸被其丙炔化的相似物代替。在某些實(shí)施方案中，至少25，更優(yōu)選至少50%，甚至更優(yōu)選至少75%，且在某些情況下優(yōu)選至少90%的核苷酸被其丙炔化的相似物代替。在某些實(shí)施方案中，可以同時(shí)或連續(xù)引入多于一個(gè)錯(cuò)配。寡核苷酸可在寡核苷酸相鄰的或間隔的位點(diǎn)容納多于一個(gè)錯(cuò)配。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸可以包含2、3、4或多個(gè)錯(cuò)配的核苷酸，所述錯(cuò)配的核苷酸可以是相鄰的或遠(yuǎn)距離的(即，非相鄰的)。寡核苷酸可以包括進(jìn)一步的用于調(diào)節(jié)這點(diǎn)的域和區(qū)段，特別地可以包括幾個(gè)區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸可包括要插入受體鏈的可能的插入物。這樣的插入物的長(zhǎng)度可在從多于五個(gè)直至100個(gè)核苷酸間變動(dòng)。按類似的方式，在某些實(shí)施方案中，可以引入類似長(zhǎng)度變動(dòng)(從1至100個(gè)核苷酸)的缺失。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，寡核苷酸的設(shè)計(jì)可以如下獲得-確定受體鏈的序列，或者至少要交換的核苷酸周圍的序列的區(qū)段。這可以典型地約為鄰近于錯(cuò)配的至少10個(gè)、優(yōu)選15、20、25或30個(gè)核苷酸，優(yōu)選地在錯(cuò)配的每一邊(例如GGGGGGXGGGGGG，其中X為錯(cuò)配)；-設(shè)計(jì)供體寡核苷酸，其與鄰近于錯(cuò)配的一個(gè)或兩個(gè)區(qū)段互補(bǔ)，并且包含要交換的期望的核苷酸(例如CCCCCCYCCCCCC);-提供(例如通過合成)具有在期望位置的丙炔修飾物的供體寡核苷酸。修飾物可在在很大程度上不同，取決于環(huán)境。實(shí)例為CmCmCmCmCmCmYCmCmCmCmCmCm、CmCCm(XmCYCmCCmCCmC、CCCCCCYCmCmCmCmCmCm、CmCmCmCmCmCmYCCCCCC、CCCCCCmYCmCCCCC、CmCCCCCYCmCCCCC、CmCCCCCYCCCCCCm、CmCCCCCYCCCCCC等，其中c"M戈表丙炔修飾的核苷酸殘基。對(duì)于不同的受體序列，例如ATGCGTACXGTCCATGAT,可以設(shè)計(jì)相應(yīng)的供體寡核苷酸，例如具有與上文列出的可變修飾的TACGCATGYCAGGTACTA。-在能耙向核苷酸交換的蛋白質(zhì)存在下，使要修飾的DNA接受所述供體寡核苷酸，所述蛋白質(zhì)例如，且特別是在所述細(xì)胞的錯(cuò)配修復(fù)機(jī)理中有功能的蛋白質(zhì)。不受理論的束縛，認(rèn)為改進(jìn)的結(jié)合親合力增加寡核苷酸發(fā)現(xiàn)和保持結(jié)合到其靶點(diǎn)的可能性，從而改善TNE功效。糖主鏈或堿基的許多不同的化學(xué)修飾賦予和改善結(jié)合親合力。然而，本發(fā)明人選擇集中于丙炔修飾的寡核苷酸。包含具有在C5位置丙炔基的嘧啶核苷酸的寡核苷酸形成比其相應(yīng)的嘧啶衍生物更穩(wěn)定的雙鏈和三級(jí)結(jié)構(gòu)。具有在7-位的相同丙炔取代基的嘌呤形成更穩(wěn)定的雙鏈，因此，其是優(yōu)選的。因此，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過使用7-丙炔基嘌呤核苷酸(8-氮雜-7-脫氮雜-2'-脫氧鳥苷和8-氮雜-7-脫氮雜-2'-脫氧腺嘌呤的7-丙炔基衍生物)進(jìn)一步增加了該功效，其增加結(jié)合親合力至比C5-丙炔嘧啶核苷酸甚至更大的程度。這樣的核苷酸特別地公開在He&Seela，2002，7Vwc/e/ci仏，5485-5496中。丙炔基是具有三鍵的三碳鏈。所述三鍵共價(jià)結(jié)合核苷酸的基本結(jié)構(gòu)，其位于嘧啶的CM立置和嘌呤核苷酸的7-位置(圖2)。胞嘧啶和胸苷可以同時(shí)具有(35-丙炔基，分別形成C、丙炔基-胞嘧啶和(35-丙炔基-胸苷。單一C、丙炔基-胞嘧啶殘基使Tm增加了2.8°C，單一C、丙炔基-胸苷增加了1.7°C。(Froehler&a/.，19937fefr(3/ze<in9丄e/teraM:1003-6;Lacroixa/.，1999S/oc/zewh^71893-1901;AhmadianWa/.，1998A^c/e/cJc/<*i^.》3127-3135;ColocciWa/.，1994J力m.C7^w.5bc116:785-786)。這是由在C5位的1-丙炔基的疏水性引起，并且其還允許堿基的較好堆積，因?yàn)楸不鄬?duì)于所述雜環(huán)堿基是二維的。已經(jīng)利用包含CS-丙炔取代嘧啶基的寡核苷酸的改善的結(jié)合性質(zhì)來改變細(xì)胞過程。包含CS-丙炔基的反義寡核苷酸與其靶向mRNA形成更穩(wěn)定的雙鏈，導(dǎo)致基因表達(dá)的抑制作用增加(Wagner"a/.，19935We"ce260:1510-1513;Flanagan&a/.，19967V她reS/otec/z.1139-1145;Meuniera/.，2001勘toeraec&7Vwc/e/cJc/dDev.jj_:117-123)。而且，這些試驗(yàn)證實(shí)這樣的寡核苷酸為具有生物活性的，而且它們可以是細(xì)胞容許的。在TNE領(lǐng)域中，已經(jīng)在一系列可能的寡核苷酸修飾物中列出了(35-丙炔嘧啶修飾物，所述寡核苷酸修飾物作為用于TNE中的嵌合體分子的替換物。然而，迄今為止，本領(lǐng)域沒有表明CS丙炔修飾的單鏈DNA寡核苷酸顯著地增加TNE功效至目前發(fā)現(xiàn)的這種程度的指示。寡核苷酸的遞送可以經(jīng)由電穿孔或其它能夠遞送至胞核或細(xì)胞質(zhì)的常規(guī)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的方法的體外試驗(yàn)中，使用無細(xì)胞系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)該方法，如例如在WO01/87914、WO03/027265、WO99/58702、WOO1/92512中描述的。如本文使用的，供體寡核苷酸影響TNE的能力取決于結(jié)合到供體寡核苷酸中的修飾核苷酸的類型、位點(diǎn)和數(shù)量。該能力可例如通過如下方式定量化標(biāo)準(zhǔn)化常規(guī)核苷酸之間在1的結(jié)合親合力(或結(jié)合能(吉布斯自由能))，即，對(duì)于AT和GC結(jié)合，將結(jié)合親合力標(biāo)準(zhǔn)化為l。對(duì)于本發(fā)明的寡核苷酸，各個(gè)修飾的核苷酸的相對(duì)結(jié)合親合力(RBA)為>1。這在下式中例證11RBA二i:RBA(修飾的)-S:RBA(未修飾的)〉0nm其中RBA為總的相對(duì)結(jié)合親合力，RBA(修飾的)為具有長(zhǎng)度為n個(gè)核苷酸的修飾的寡核苷酸的相對(duì)結(jié)合親合力的總和，RBA(未修飾的)為具有長(zhǎng)度為m個(gè)核苷酸的未修飾的寡核苷酸的相對(duì)結(jié)合親合力的總和。例如，100bp寡核苷酸包含IO個(gè)修飾，每個(gè)具有的相對(duì)結(jié)合親合力為1.1。那么，總的RBA等于RBA二[(l0*1.1)+(90*1.0)]-(100*1.0)=應(yīng)當(dāng)注意RBA的定義基本上與相比較的核苷酸鏈的長(zhǎng)度無關(guān)。然而，當(dāng)比較不同鏈的RBA時(shí)，優(yōu)選地所述鏈具有約相同的長(zhǎng)度或采用可比較長(zhǎng)度的區(qū)段。應(yīng)當(dāng)注意RBA不考慮所述修飾可以集中在一個(gè)鏈上。因此，某鏈A比鏈B的較高程度的修飾是指RBA(A片RBA(B)。對(duì)于上游和下游區(qū)段，相應(yīng)RBA值可以是定義和使用的。為了調(diào)節(jié)修飾的核苷酸位點(diǎn)的影響，可以將加權(quán)系數(shù)引入RBA值。例如，修飾的核苷酸對(duì)鄰近錯(cuò)配的供體寡核苷酸的作用可能比其對(duì)遠(yuǎn)離錯(cuò)配五個(gè)核苷酸間隔的修飾核苷酸的作用大。在本發(fā)明的上下文中，RBA(供體戶RBA(受體)。在某些實(shí)施方案中，供體的RBA值可以比受體的RBA值大至少0.1。在某些實(shí)施方案中，供體的RBA值可以比受體的RBA值大至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5。RBA值可以來源于對(duì)核苷酸的修飾的結(jié)合親合力的常規(guī)分析，比如通過分子模型、熱力學(xué)測(cè)量等?？蛇x地,它們可以通過測(cè)量修飾的和未修飾的鏈之間的Tm差異確定?？蛇x地，RBA可以表示為未修飾的和修飾的鏈之間的Tm差異，通過測(cè)量或通過使用用于計(jì)算一組核苷酸的Tm的常規(guī)公式計(jì)算，或者通過計(jì)算和測(cè)量的聯(lián)合。根據(jù)本發(fā)明的供體寡核苷酸可進(jìn)一步包含改善雜交特征的修飾，以便所述供體顯示出對(duì)靶DNA鏈增加的親合力，使得供體的插入較容易。還可以進(jìn)一步修飾所述供體寡核苷酸以使其變得更耐受核酸酶，以穩(wěn)定三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)。C5丙炔取代的嘧啶供體寡核苷酸的修飾可以包括磷硫酰修飾、2-OMe取代、使用LNAs(鎖核酸)、PNAs(肽核酸)、核糖核苷酸及其它修飾、優(yōu)選增加寡核苷酸和受體鏈之間的雜種的穩(wěn)定性的堿基。在這樣的修飾中特別有用的是PNAs，其為其中寡核苷酸的脫氧核糖主鏈被肽主鏈代替的寡核苷酸類似物。一個(gè)這樣的肽主鏈?zhǔn)怯赏ㄟ^酰胺鍵連接的N-(2-氨乙基)甘氨酸的重復(fù)單元構(gòu)建的。所述肽主鏈的各個(gè)亞基連接核堿基(也稱為"堿基")，其可以是天然存在的、非天然存在的或修飾的堿基。PNA寡聚體特別地將序列結(jié)合到具有比DNA或RNA具有更高親合力的互補(bǔ)DNA或RNA。因此，得到的PNA/DNA或PNA/RNA雙鏈具有較高的熔解溫度(Tm)。而且，PNA/DNA或PNA//RNA雙鏈的Tm比DNA/DNA或DNA/RNA雙鏈對(duì)鹽濃度更不敏感。PNAs的聚酰胺主鏈也對(duì)酶降解更有耐受性。PNAs的合成描述在，例如WO92/20702和WO92/20703中，將其內(nèi)容以其全部引入本文作為參考。其它的PNAs闡述在例如W093/12129和1996年7月23日申請(qǐng)的美國專利No.5,539,082中，將其內(nèi)容以其全部引入本文作為參考。而且，許多科技出版物描述了PNAs的合成及其性質(zhì)和用途。參見，例如，Patel，Nature,1993,365,490;Nielsenetal.，Science,1991,254,1497;Egholm,J.Am.Chem.Soc"1992,114,1895;Knudsonetal.，NucleicAcidsResearch,1996，24，494;Nielsenetal"J.Am.Chem.Soc.,1996，118,2287;Egholmetal.，Science,1991，254，1497;Egholmetal.,J.Am.Chem.Soc.，1992,114,1895;禾口Egholmetal"JAm.Chem.Soc,1992,114，9677。本發(fā)明的C5-丙炔取代的嘧啶寡核苷酸的有用的進(jìn)一步修飾物也稱為SuperA和SuperT，得自EpochBiosciencesGermany。這些修飾的核苷酸包含插入(sticksinto)DNA的大溝的另外的取代基，其中其被認(rèn)為改善了DNA雙鏈中的堿基堆積。也參見圖4。有用的進(jìn)一步修飾也包括一個(gè)或多個(gè)來自被稱為鎖核酸(LNAs)的合成分子類型的單體。LNAs為二環(huán)和三環(huán)核苷和核苷酸類似物和包含這樣的類似物的寡核苷酸。LNAs和相關(guān)類似物的堿基結(jié)構(gòu)和功能特征公開在多個(gè)出版物和專利中，包括WO99/14226、WO00/56748、WO00/66604、WO98/39352、美國專利No.6,043,060和美國專利No.6，268，4卯，所有的都以其全部引入本文作為參考。也可以將本發(fā)明的供體寡核苷酸制備成嵌合體，即包含DNA、RNA、LNA、PNA區(qū)段或其組合。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸進(jìn)一步包含其它的、任選非甲基化的、修飾的核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸是對(duì)核酸酶有耐受性的。這點(diǎn)有利地預(yù)防了寡核苷酸被核酸酶降解和擴(kuò)大了供體寡核苷酸可以發(fā)現(xiàn)其靶點(diǎn)(受體分子)的幾率。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在寡核苷酸中錯(cuò)配位點(diǎn)的核苷酸可以是修飾的。無論錯(cuò)配是否可以修飾，都將在很大程度上取決于使用供體和受體鏈之間的親合力差異進(jìn)行的靶向核苷酸交換或細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī)理的精確機(jī)理。這同樣適用于在錯(cuò)配的鄰近或附近的其它修飾位置的精確位置。然而，根據(jù)本文公開的內(nèi)容，考慮到如本文在別處描述的用于適當(dāng)?shù)墓押塑账岬脑囼?yàn)方法，可以容易地設(shè)計(jì)和試驗(yàn)這樣的寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，在錯(cuò)配位置的核苷酸是未修飾的。在某些實(shí)施方案中，修飾鄰近錯(cuò)配，優(yōu)選在錯(cuò)配的2、3、4、5、6或7個(gè)核苷酸之內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，修飾位于錯(cuò)配的下游位置。在某些實(shí)施方案中，修飾位于錯(cuò)配的上游位置。在某些實(shí)施方案中，修飾位于距離錯(cuò)配的10bp至10kB，優(yōu)選50至5000bp，更優(yōu)選距離100至500。用作供體的寡核苷酸可以在長(zhǎng)度方面不同，但通常在10至500個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度中變動(dòng)，優(yōu)選11至100個(gè)核苷酸，優(yōu)選15至90個(gè)，更優(yōu)選20至70個(gè)，最優(yōu)選30至60個(gè)核苷酸。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于靶向改變雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列的方法，其包括在能靶向核苷酸交換的蛋白質(zhì)存在下，結(jié)合雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列與供體寡核苷酸，其中雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列包含第一DNA序列和作為第一DNA序列的互補(bǔ)鏈的第二DNA序列，和其中所述供體寡核苷酸包括一個(gè)域，該域包括至少一個(gè)關(guān)于要改變的雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列，優(yōu)選關(guān)于第一DNA序列的錯(cuò)配，和其中供體寡核苷酸的區(qū)段被C5-丙炔基取代的嘧啶修飾成比在所述寡核苷酸的那個(gè)位置的未修飾的核苷酸相比對(duì)第一DNA序列有更高程度的親合力，和/或其中第二DNA被甲基化成比供體寡核苷酸的相應(yīng)區(qū)段更低程度的甲基化。本發(fā)明以其最寬的形式屬類地適于各種有機(jī)體，比如人類、動(dòng)物、植物、魚、爬行動(dòng)物、昆蟲、真菌、細(xì)菌等。本發(fā)明適于修飾所有類型的DNA，比如來源于基因組DNA的DNA、線性DNA、人工染色體、核染色體DNA、細(xì)胞器染色體DNA、BACs、YACs。本發(fā)明可以在體內(nèi)及體外進(jìn)行。本發(fā)明以其最寬的形式適于許多目的用于改變細(xì)胞、通過恢復(fù)成野生型校正突變、誘導(dǎo)突變、通過破壞編碼區(qū)使酶失活、通過改變編碼區(qū)修飾酶的生物活性、通過破壞編碼區(qū)修飾蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及基本上如上文描述的寡核苷酸用于改變細(xì)胞、通過恢復(fù)成野生型校正突變、誘導(dǎo)突變、通過破壞編碼區(qū)使酶失活、通過改變編碼區(qū)修飾酶的生物活性、通過破壞編碼區(qū)修飾蛋白質(zhì)、錯(cuò)配修復(fù)、靶向改變(植物)遺傳物質(zhì)包括基因突變、靶向基因修復(fù)和基因替換的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及試劑盒，其包括一種或多種如本文在別處定義的寡核苷酸，任選地與能誘導(dǎo)MRM和特別地能夠TNE的蛋白質(zhì)的組合。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過本發(fā)明的方法獲得的修飾遺傳物質(zhì)、包括所述修飾遺傳物質(zhì)的細(xì)胞和有機(jī)體、如此獲得的植物或植物部分。本發(fā)明特別涉及使用本發(fā)明的丙炔-修飾的寡核苷酸的TNE方法提供植物中除草劑耐藥性的用途。特別地，本發(fā)明涉及已具有抗除草劑耐藥性的植物，所述除草劑特別是卡那霉素、草甘膦和/或羧芐西林。圖i:顯示了靶向核苷酸交換的圖示。使包含要交換的核苷酸(x)的受體雙鏈DNA鏈與包含要插入的核苷酸CO的C5-丙炔嘧啶修飾的供體寡核苷酸(給出的圖示如NNN"NNNmYNNmNN，接觸。使三級(jí)結(jié)構(gòu)加到或接觸能TNE的環(huán)境或至少接觸能進(jìn)行TNE的蛋白質(zhì)，比如被稱為無細(xì)胞酶混合物或無細(xì)胞提取物(參見，例如WO99/58702、WOO1/73002)。圖2:顯示了5-丙炔基-脫氧胸苷、5-丙炔基-脫氧胞嘧啶、2'-脫氧-7-丙炔基-7-脫氮雜(^化3)-腺苷和2'-脫氧-7-丙炔基-脫氮雜-鳥苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖3:顯示了包含C5-丙炔嘧啶核苷酸的寡核苷酸的TNE修復(fù)功效，如使用無細(xì)胞測(cè)定測(cè)量的。對(duì)于每個(gè)試驗(yàn)，使用標(biāo)準(zhǔn)DNA寡核苷酸測(cè)定修復(fù)功效，并將值設(shè)定為1。增加的倍數(shù)表明看到的使用包含C5-丙炔嘧啶的寡核苷酸比使用標(biāo)準(zhǔn)DNA寡核苷酸獲得的修復(fù)功效增加。使用丙炔化的嘌呤獲得了類似的結(jié)果。實(shí)施例材料和方法包含C5-丙炔嘧啶的寡核苷酸購自TrilinkBiotech或GeneLink。所用的寡聚物的序列顯示如下。在該試驗(yàn)中所用的質(zhì)粒為pCR2.1(Invitrogen)的衍生物，其包含同時(shí)賦予卡那霉素和羧芐西林耐藥性的基因。在框架中，將終止密碼子和缺失引入如前所述的卡那霉素和羧芐西林中(SawanoWa/.，20007W/c/e/cJc/A2^:e78)。在質(zhì)粒KmY22stop的卡那霉素ORF中具有在密碼子Y22的TAT至TAG突變，而在質(zhì)粒CbY44stop的羧節(jié)西林ORF中具有在密碼子Y44的TAC至TAG轉(zhuǎn)變。在質(zhì)粒KmY22中，刪除第三核苷酸的Y22密碼子(TAI)得到移碼。在無細(xì)胞系統(tǒng)中使用的缺陷卡那霉素和羧芐西林基因及寡核苷酸KmWTGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGERFGYDWKmY22stopGAGAGGCTATTCGGCTAGGACTGGGCACAACAGERFGKmY22AGAGAGGCTATTCGGCTA一GACTGGGCACAACAGER.Ij.FGCbWTGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCGARVGYIEDCbY44stopGGTGCACGAGTGGGTTAGATCGAACTAGATCTCGARVG<table>complextableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>顯示了卡那霉素和羧芐西林開放讀碼框及編碼的氨基酸的相關(guān)序列。如前所述，引入產(chǎn)生終止密碼子(TAG,"的單核苷酸突變(Sawano"a/.，2000TVwc/e/cJc/A28:e78)。顯示了在試驗(yàn)中所用的寡核苷酸的序列。使用寡核苷酸Kl-K4將KmY22stop和KrnY22A突變修復(fù)成可選的酪氨酸編碼密碼子(TAC)。類似地，使用寡核苷酸CI將CbY44突變(TAG)改變成可選的酪氨酸密碼子(TAT)。在每個(gè)寡核苷酸中的錯(cuò)配核苷酸下加下劃線。標(biāo)明丙炔衍生物核苷酸(￥=5-丙炔基-脫氧胞苷，Z=5-丙炔基-脫氧尿苷)。在卡那霉素和羧芐西林ORF的寡核苷酸結(jié)合區(qū)域下加下劃線。寡核苷酸K1-K4為卡那霉素編碼序列的互補(bǔ)鏈，而CI為羧芐西林非編碼鏈的互補(bǔ)鏈。如下進(jìn)行脫細(xì)胞測(cè)定。收集來自擬南芥(生態(tài)型Col-0)的花芽，并在氮?dú)庀履ニ椤＜尤?00W的蛋白質(zhì)分離緩沖劑(20mMHEPESpH7.5、5mMKCl、1.5mMMgCl2、10mMDTT、10。/。(v/v)甘油、l%(w/v)PVP)。通過以14kRPM離心30分鐘沉淀植物碎屑，并將上清液貯藏在-8(TC。使用NanoOrange試劑盒(MolecularProbes,lnc)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。典型的分離導(dǎo)致約3-4pg的蛋白質(zhì)濃度。進(jìn)行包含下述組分的脫細(xì)胞反應(yīng)1i!g的質(zhì)粒DNA(KmY^stop或CbY"stop)、100ng的寡核苷酸、30嗎的總植物蛋白質(zhì)、411l剪切的鮭魚精液DNA(3昭/pl)、2^1的蛋白酶抑制劑混合物(50x濃度完全無EDTA蛋白酶抑制劑合劑片劑,RocheDiagnostics)、50(il2x脫細(xì)胞反應(yīng)緩沖劑(400mM的TrispH7.5、200mM的MgCl2、2mM的DTT、0.4mM的亞精胺、50mM的ATP、2mM的各種CTP、GTP、UTP、O.lmM的各種dNTPs禾B10mM的NAD)，用水將總體積加至10(^1。在37'C下培養(yǎng)該混合物1小時(shí)。然后，如下分離質(zhì)粒DNA。將100^d的H2O加入各個(gè)反應(yīng)中以增加體積，然后加入200^1的堿緩沖的苯酚(pH8-10)。將其簡(jiǎn)短地渦旋，然后以13krpm離心3分鐘。將上層水相轉(zhuǎn)移到新的管中，然后加入200^1的氯仿。將其簡(jiǎn)短地渦旋，以13krpm旋轉(zhuǎn)3分鐘，并將水相轉(zhuǎn)移到新管中。通過加入0.7體積的2-丙醇沉淀DNA，并將沉淀物再懸浮在TE中。為了除去任何共純化的寡核苷酸，使該DNA經(jīng)QiagenPCR純化柱，并以30^1的最終體積洗脫質(zhì)粒DNA。將2^1的質(zhì)粒DNA電穿孔至18^il的DH10B(Invitrogen)電感受態(tài)(electrocompetent)細(xì)胞。在電穿孔后，使該細(xì)胞在37'C的SOC培養(yǎng)基中恢復(fù)1小時(shí)。在該時(shí)期后，對(duì)于使用kmY22stop禾QKmY22的試驗(yàn)，加入卡那霉素至100嗎/ml的濃度，并再培養(yǎng)所述細(xì)胞3小時(shí)。對(duì)于使用CbY44stop的試驗(yàn)，在恢復(fù)期后，將細(xì)胞直接析出在固體培養(yǎng)基上。固體培養(yǎng)基包含100嗎/ml的卡那霉素或羧節(jié)西林。對(duì)于KmY22stop和KmY22.試驗(yàn)，檢測(cè)在卡那霉素培養(yǎng)基上的TNE事件數(shù)量，并通過計(jì)數(shù)在羧芐西林培養(yǎng)基上析出的電穿孔的10—4和10—5稀釋度的菌落數(shù)量來計(jì)算電穿孔功效。對(duì)于使用CbY44stop進(jìn)行的試驗(yàn)，可逆化這些選擇條件。通過TNE事件的數(shù)量除以轉(zhuǎn)化細(xì)胞的總數(shù)計(jì)算TNE功效。結(jié)果設(shè)計(jì)寡核苷酸用于在引入KmY22stop和CbY44stop的卡那霉素或羧芐西林ORF中的終止密碼子(TAG)產(chǎn)生單核苷酸取代，以便密碼子再次編碼正確氨基酸。在質(zhì)粒KmY22.中，設(shè)計(jì)寡核苷酸用于加入單核苷酸，從而修復(fù)ORF。為了建立最佳數(shù)量的C5-丙炔嘧啶，制備一批寡核苷酸。寡聚Kl含兩個(gè)位于錯(cuò)配核苷酸兩側(cè)的C5-丙炔嘧啶。在寡聚K2中，所有的胞嘧啶核苷酸被5-丙炔基-脫氧胞苷代替。在寡聚K3中，所有的胸苷核苷酸被5-丙炔基-脫氧尿苷代替。在寡聚K4和C4中，所有的嘧啶被C5-丙炔嘧啶代替。在各個(gè)試驗(yàn)中，平行進(jìn)行未修飾的DNA寡核苷酸和C5-丙炔修飾的寡核苷酸。在各個(gè)試驗(yàn)中，將使用標(biāo)準(zhǔn)DNA寡核苷酸獲得的TNE功效任意設(shè)定為1，接著，將C5-丙炔修飾的寡核苷酸的TNE功效表示為比標(biāo)準(zhǔn)DNA寡核苷酸增加的倍數(shù)。如圖3所示，在我們的測(cè)定中，C5-丙炔修飾的寡核苷酸比標(biāo)準(zhǔn)DNA的作用更有效。取代和插入的功效都增強(qiáng)了。取代的全面修復(fù)功效比插入的要高。觀察到的增強(qiáng)取決于存在的C5-丙炔核苷酸的百分比。寡核苷酸(24聚)包含2(K1)、7(K2)或5(K3)C5-丙炔嘧啶，所有的都顯示出比DNA寡核苷酸增強(qiáng)2-3倍。然而，使用其中所有的12個(gè)嘧啶核苷酸都被C5-丙炔嘧啶(K4&C4)代替的寡核苷酸觀察到修復(fù)功效的最大增加(6-10倍)。重要的是請(qǐng)注意，當(dāng)使用C5-丙炔修飾的寡核苷酸時(shí)，該功效不僅僅限于在KmY22的修復(fù)，同時(shí)也增加了在CbY44的終止密碼子的修復(fù)。從其中我們假定終止密碼子的轉(zhuǎn)化已發(fā)生的菌落純化質(zhì)粒，接著，測(cè)序抗生素抗性基因以證實(shí)終止密碼子確實(shí)被改變。因此，人們發(fā)現(xiàn)包含C5-丙炔嘧啶核苷酸的寡核苷酸具有改進(jìn)的反義性質(zhì)。據(jù)證實(shí)，通過使用體外TNE測(cè)定，無細(xì)胞系統(tǒng)，與使用標(biāo)準(zhǔn)DNA寡核苷酸獲得的TNE功效相比，包含C5-丙炔嘧啶核苷酸的寡核苷酸的確顯示出顯著更高的TNE水平。該增強(qiáng)可以高達(dá)10倍，其與要改變的寡核苷酸序列或基因座無關(guān)。通過靶向富含嘧啶的序列以便最大化C5-丙炔嘧啶核苷酸的百分?jǐn)?shù)可進(jìn)一步改善這一增強(qiáng)功效。該功效也可通過使用7-丙炔基嘌吟核苷酸進(jìn)一步增加，其比C5-丙炔嘧啶核苷酸增加結(jié)合親合力至甚至更大的程度(He&Seela，2002Wwc/e/cJc/A7仏巡5485-5496)。組合丙炔嘌呤和嘧啶能產(chǎn)生其中所有的核苷酸在堿基上載有丙炔基的寡核苷酸。權(quán)利要求1、用于靶向改變雙鏈DNA序列的寡核苷酸，其中雙鏈DNA序列包含第一DNA序列和作為第一DNA序列互補(bǔ)鏈的第二DNA序列，該寡核苷酸包括能雜交到第一DNA序列的域，其中域包括至少一個(gè)關(guān)于第一DNA序列的錯(cuò)配，和其中寡核苷酸包括至少一個(gè)區(qū)段，該區(qū)段包含至少一個(gè)具有比天然存在的A、C、T或G更高結(jié)合親合力的修飾核苷酸，和其中至少一個(gè)修飾核苷酸以與互補(bǔ)于第一DNA序列的相對(duì)位置的核苷酸的天然存在的核苷酸相比更強(qiáng)地結(jié)合在第一DNA序列的相對(duì)位置的核苷酸上，其中修飾核苷酸為C7-丙炔嘌呤或C5-丙炔嘧啶。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其中嘌呤為腺苷或鳥苷和/或嘧啶為胞嘧啶、尿嘧啶或胸苷。3、根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中至少10%的嘧啶和/或嘌呤被其相應(yīng)丙炔化的衍生物代替，優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少75%，且最優(yōu)選至少90%。4、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中修飾核苷酸為嘧啶。5、根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中修飾核苷酸為嘌呤。6、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸包括至少2個(gè)區(qū)段，優(yōu)選至少3個(gè)區(qū)段，該區(qū)段獨(dú)立地包含至少一個(gè)、優(yōu)選至少2個(gè)、更優(yōu)選至少3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)修飾核苷酸。7、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中區(qū)段位于接近或在3'-末端、5'末端和/或包圍或位于錯(cuò)配兩側(cè)的位置。8、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中在錯(cuò)配位置的核苷酸是未修飾的。9、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中至少一個(gè)修飾核苷酸位于鄰近于錯(cuò)配，優(yōu)選在錯(cuò)配的2、3、4、6、7、8、9或10個(gè)核苷酸內(nèi)的位置。10、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其具有10至500個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。11、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中(修飾的)區(qū)段為域。12、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸。13、用于靶向改變雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列的方法，其包括在存在能靶向核苷酸交換的蛋白質(zhì)的情況下，組合雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列和供體寡核苷酸，其中雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列包含第一DNA序列和作為第一DNA序列的互補(bǔ)鏈的第二DNA序列，和其中供體寡核苷酸包括域，該域包括至少一個(gè)關(guān)于要改變的雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列，優(yōu)選關(guān)于第一DNA序列的錯(cuò)配，和其中寡核苷酸包括區(qū)段，該區(qū)段包含至少一個(gè)具有比天然存在的A、C、T或G更高結(jié)合親合力的修飾核苷酸，和其中修飾核苷酸以與互補(bǔ)于第一DNA序列的相對(duì)位置的核苷酸的天然存在的核苷酸相比更強(qiáng)地結(jié)合在第一DNA序列的相對(duì)位置的核苷酸，和其中修飾的寡核苷酸在權(quán)利要求1-12中進(jìn)行定義。14、根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中改變優(yōu)選地在選自植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、嚙齒類細(xì)胞、靈長(zhǎng)類細(xì)胞、人類細(xì)胞或酵母細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)。15、根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中蛋白質(zhì)源自細(xì)胞提取物。16、根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中細(xì)胞提取物選自植物細(xì)胞提取物、真菌細(xì)胞提取物、嚙齒類細(xì)胞提取物、靈長(zhǎng)類細(xì)胞提取物、人類細(xì)胞提取物或酵母細(xì)胞提取物。17、根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中改變?yōu)橹辽僖粋€(gè)核苷酸的缺失、取代或插入。18、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞為真核細(xì)胞、植物細(xì)胞、非人類哺乳動(dòng)物細(xì)胞或人類細(xì)胞。19、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中靶DNA來自真菌、細(xì)菌、植物、哺乳動(dòng)物或人類。20、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中雙鏈DNA來自基因組DNA、線性DNA、哺乳動(dòng)物人工染色體、細(xì)菌人工染色體、酵母菌人工染色體、植物人工染色體、核染色體DNA、細(xì)胞器染色體DNA、附加體DNA。21、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其用于改變細(xì)胞、通過恢復(fù)成野生型校正突變、誘導(dǎo)突變、通過破壞編碼區(qū)使酶失活、通過改變編碼區(qū)修飾酶的生物活性、通過破壞編碼區(qū)修飾蛋白質(zhì)。22、如權(quán)利要求1-12中定義的寡核苷酸在改變細(xì)胞、通過恢復(fù)成野生型校正突變、誘導(dǎo)突變、通過破壞編碼區(qū)使酶失活、通過改變編碼區(qū)修飾酶的生物活性、通過破壞編碼區(qū)修飾蛋白質(zhì)、錯(cuò)配修復(fù)、靶向改變(植物)遺傳物質(zhì)包括基因突變、靶向基因修復(fù)和基因替換中的用途。23、如權(quán)利要求1-12中定義的寡核苷酸在增強(qiáng)雙鏈DNA序列的靶向改變中的用途，該雙鏈DNA序列包含第一DNA序列和作為第一DNA序列互補(bǔ)鏈的第二DNA序列，該寡核苷酸包括能雜交到第一DNA序列的域，其中域包括至少一個(gè)關(guān)于第一DNA序列的錯(cuò)配，和其中寡核苷酸包括包含修飾核苷酸的區(qū)段，其中修飾核苷酸具有比天然存在的A、C、T或G更高的結(jié)合親合力，和其中修飾核苷酸以與互補(bǔ)于第一DNA序列的相對(duì)位置的核苷酸的天然存在的核苷酸相比更強(qiáng)地結(jié)合在第一DNA序列的相對(duì)位置的核苷酸，其中修飾核苷酸為C7-丙炔嘌呤或C5-丙炔嘧啶。24、如權(quán)利要求1-12中定義的寡核苷酸在用于為植物提供除草劑耐藥性的方法中的用途。25、試劑盒，其包括如權(quán)利要求1-12中定義的寡核苷酸。26、通過權(quán)利要求13-21所述的方法制備的修飾遺傳物質(zhì)。27、包含權(quán)利要求26所述的修飾遺傳物質(zhì)的細(xì)胞。28、通過權(quán)利要求13-21所述的方法制備的或包含權(quán)利要求26所述的遺傳物質(zhì)的植物或植物部分。全文摘要用于雙鏈DNA序列的靶向核苷酸交換的方法和寡核苷酸，其中供體寡核苷酸包含至少一個(gè)修飾核苷酸和/或以比在第一DNA序列的相對(duì)位置的核苷酸互補(bǔ)的天然存在的核苷酸相比更強(qiáng)地結(jié)合在第一DNA序列的相對(duì)位置的核苷酸，所述修飾的核苷酸為具有比天然存在的A、C、T或G更高結(jié)合親合力的丙炔化的嘌呤和/或嘧啶。文檔編號(hào)C12N15/10GK101346465SQ200680048972公開日2009年1月14日申請(qǐng)日期2006年12月20日優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日發(fā)明者M(jìn)·T·J·德博特,P·本多克,R·C·J·霍格斯申請(qǐng)人:凱津公司