專利名稱：：用于在具有補體因子h的風險變體的患者中預防和治療年齡相關性黃斑變性的c3-轉化酶...的制作方法
技術領域：
：本發明涉及預防和治療眼部疾病的領域。更具體而言，本發明涉及通過施用抑制C3轉化和活化的物質，在具有補體因子H(CFH)的Y402H或其它風險變體的患者中預防和治療AMD。2.相關現有技術描述年齡相關性黃斑變性(AMD)是影響負責高清晰度視覺的視網膜黃斑或中央區的致衰弱、致盲疾病，并且是老年人中不可逆視覺喪失的主導原因。已知遺傳和環境因素均在AMD的發生中起作用。例如，吸煙、脂質攝入和年齡已知是AMD發生的風險因素。兩種形式的AMD(干性AMD和濕性AMD)在美國影響了超過1100萬個個體。千性AMD發生于80%的AMD患者中，并且其特征是視網膜色素上皮(RPE)下的布魯赫膜(Bruch'smembrane)中存在細胞碎片(玻璃疣(drusen))、RPE色素不規則或地圖狀萎縮。發生在剩余20%AMD患者中的濕性AMD的特征在于脈絡膜新血管生成和/或RPE的脫離。也涉及AMD患者眼中細胞外基質異常。干性年齡相關性黃斑變性的診斷由RPE下玻璃疣的存在定義，并出現在疾病的早期階段。玻璃疣是由蛋白質、脂質和細胞碎片組成的小型淺黃色細胞外沉著物。玻璃疣的主要成分是補體蛋白。玻璃疣通常伴有顯著的色素改變和后極中的色素蓄積。RPE通常顯示是萎縮性的，下面的脈絡膜叢更容易看得見。在干性AMD的晚期，這些萎縮的病灶島融合并形成大的萎縮區，伴有嚴重受影響的視覺。濕性AMD由脈絡膜新血管生成的存在定義，并可包括RPE隆起、滲出物或視網膜下積液。目前沒有治療能夠反轉AMD的作用，然而，年齡相關性眼病研究(AREDS)顯示飲食性抗氧化劑供給可降低AMD的發展。[AREDS報告(AREDSReport)第8期(加01)1激光光凝術、光動力學療法、Macugen和Lucentis⑧4皮證明可用于濕性AMD的治療。每六周通過玻璃體內注射施用Macugen,而一月一次通過玻璃體內注射施用Lucentis。Macugen中的活性成分，哌加他尼鈉，是寡核苷酸的共價軛合物，其為血管內皮生長因子(VEGF)的拮抗劑。Lucentis⑧中的活性成分，ranibizumab，是結合VEGF的抗體片段。VEGF已經顯示是與眼內病癥相關的新血管生成的關鍵調節劑(Ferrara等人，1997)。在患有糖尿病和其它缺血相關的視網膜病變的患者中，眼流體中VEGF的濃度與血管活性增生的存在高度相關(Aiello等人，1994)。其它研究已經證明在受AMD影響的患者中VEGF在脈絡膜新血管膜中的定位(Lopez等人，1996)。大量的研究小組一直致力于尋找與AMD發生相關并對其發生負責的基因。單核苷酸多態性(SNP)基因分型為快速鑒定疾病相關基因提供了巨大的希望(Hirschhorn&Daly，2005;Hinds等人，2005)。科學出版物(ScienceExpress)和PNAS(3月-5月，2005)中出版的報導描述了使用SNP基因分型鑒定補體因子H基因(CFH)中的單個多態性，其導致提高的發生AMD的風險。據報導，CFH中單個氨基酸改變(Y402H)占AMD的40-50%。Edwards的研究(Edwards等人，2005)涉及UTSouthwestern波士頓大學(BostonUniversity)和Sequenom的科學家。他們在兩個病例控制(controlled)群體(第一個群體224個AMD患者和134個對照；第二個群體中176個病例和68個對照)中，最初使用24個SNP通過ARMD1基因座進行了SNP基因分型，然后再用額外的SNP精修該區域。他們報導了補體因子H中具有一個拷貝Y402HSNP的個體發生AMD的風險提高了2.7倍。該單個SNP似乎占該群體中AMD的50%。Haines的研究(Haines等人，2005)是在范德比特大學(VanderbiltUniversity)和杜克大學(DukeUniversity)完成的合作研究。與Edwards研究相似，Haines和同事們對他們的兩個AMD群體通過ARMDl基因座進行了SNP基因分型。他們的群體由182個AMD家族和495個AMD患者的病例對照群體和185個對照組成。他們最初4吏用44個SNP通過ARMDl基因座進行篩選，然后使用額外的SNP精修他們的搜索。在他們所有的AMD群體中，他們發現CFH中Y402HSNP是雜合(帶有一拷貝的Y402HSNP)的患者具有提高了2.45倍的發生AMD的風險，而純合個體(帶有兩個拷貝的該SNP)具有3.33倍的風險。對于患有新血管生成性(濕性)AMD的患者而言，風險甚至更高(雜合中為3.45，純合中為5.57)。他們評價該SNP應對他們的群體中43%的AMD負責。Klein研究(Klein等人，2005)涉及洛克變勒大學(RockefellerUniversity)、耶魯大學、國家眼科研究所(TheNationalEyeInstitute)(NEI)和EMMESCorporation的科學家。與前2個研究不同，Klein小組使用>116，000個SNP對96個AMD患者和50個對照進行了全基因組SNP基因型篩選。該研究中所有的個體臨床上定義明確地來自AREDS研究群體。Klein小組獨立地繪制AMD易感性基因座對染色體lq(與ARMDl相同的區域)的作圖并鑒定了CFH中的Y402HSNP為風險等位基因。對于AMD而言，帶有一拷貝該等位基因(雜合的)的個體具有提高了4.6倍的風險，而兩個染色體上均帶有該SNP(純合的)的個體具有提高了7.4倍的風險。Hageman研究(Hageman等人，2005)包括來自愛荷華大學(UniversityofIowa)和哥倫比亞大學(ColumbiaUniversity)的患者。他們的CFH分析以他們的先前研究(在玻璃疣形成中鑒定的補體的研究)和先前的連鎖分析研究(鑒定染色體基因座lq25-32的連鎖分析研究)為基礎。Hageman小組分析了卯0個AMD患者和400個對CFH基因中的SNP而言匹配的對照。除了在先前的群體中鑒定的Y402H變體外，Hageman等人鑒定了其它AMD風險變體，例如I62V，間插序列1、2、6和10,A307A和A473A。Edwards、Haines、Klein和Hageman發現的證實可見于Conley等人，(2005)、Zareparsi等人，(2005)和Souied等人，(2005)的至少三個后繼研究中。Conley等人，(2005)鑒定了Y402H變體與AMD患者的顯著關聯，這是在796個家族性和196個lt^性AMD病例相對于120個未受影響的、不相關的對照中進行的。Zar印arsi等人，(2005)在他們的單中心研究群體中發現外顯子9(Y402H)中的T>C替代與AMD相關聯。Souied等人，(2005)將北美種群中與AMD相關聯的Y402H多態的最初發現擴展至歐洲(法國)AMD種群。Souied等人檢查了60個散發的和81個家族性的AMD病例，并發現了相對于91個健康對照而言，Y402H多態與AMD的顯著關聯。因此，看起來與AMD相關聯的Y402H多態是可再現的和普遍的發現。前述研究中沒有一個提出對這些患者的治療方案，所述患者被鑒定為由于存在Y402H多態而處于發生AMD的風險下或正在從干性AMD向濕性AMD發展。需要的是用于鑒定處于發生AMD風險下的患者并對這些患者提供預防性治療方案的方法。在那些患者中抑制視覺損失或改善視敏度的治療方案也是所需的，所述患者已經被診斷為患有AMD并祐l現在補體家族基因中具有Y402H多態或其它風險變體。
發明內容本發明通過提供用于治療下述人的方法克服了現有技術的這些缺點和其它缺點，所述人由于補體因子H基因中具有Y402H多態或其它風險變體而患有AMD或處于發生AMD的風險下。根據本發明的方法，患者以在補體因子H基因中具有Y402H多態或其它風險變體進行鑒定。Y402H多態或其它風險變體的鑒定可以通過(例如通過頰拭子(cheekswab)或血樣)獲得來自患者的組織來完成。補體因子H基因借助于技術人員的常規手段從組織中分離得到。從患者中分離的基因的序列與不含有Y402H多態的補體因子H基因(也稱作"正常補體因子H基因"或"野生型補體因子H基因")的序列比較，以確定Y402H多態是否存在于取自患者的組織樣品中。如果患者被鑒定為具有Y402H多態，則對患者施用含有C3轉化酶抑制劑的組合物，以在患者中抑制與年齡相關性黃斑變性(AMD)相關的視敏度損失，或預防AMD的發生。因此，本發明的方法包括以下步驟a)通過i)和ii)所述在患者中鑒定Y402H多態i)從患者獲得組織樣品；和ii)分析所述組織樣品是否存在Y402H多態，其中Y402H多態的存在表明發生AMD或從干性AMD發展到濕性AMD的風險提高；b)對在上文步驟(a)中被鑒定為具有Y402H多態的患者施用治療有效量的組合物，所述組合物包含C3轉化酶抑制劑。按重量計，本發明組合物中存在的C3轉化酶抑制劑的量通常為0.01%-10%。在本發明方法的優選的方面，C3轉化酶抑制劑是康普塔汀(compstatin)。盡管本發明的組合物可以通過任何已知的局部眼部遞送手段進行遞送，但是施用組合物的優選方法應通過局部眼部遞送、后鞏膜旁(posteriorjuxtascleral)施用、玻璃體內注射、目艮球筋膜下(subTenons)施用，或通過玻璃體內或經鞏膜植入。本發明的組合物優選通過后鞏膜旁施用或通過玻璃體內植入的持續遞送裝置施用。下圖形成本說明書的部分，并被包括在內以進一步闡明本發明的某些方面。通過參考該圖以及本文提出的具體實施方案的詳細描述，可以更好地理解本發明。圖l提供了補體系統的概述，其闡述了經典途徑、MB-凝集素途徑和旁路途徑。優選的實施方案的詳述最近已經報導，補體因子H(CFH)中的單核苷酸多態性(SNP)對接近50%的AMD的歸因危險度負責(Edwards等人，2005;Haines等人，2005;Klein等人，2005;Hageman等人，2005)。CFH的正常功能看來是防止過量的補體激活。補體系統補充并放大身體對外來病原體的抗體應答，并由三種途徑組成經典途徑、MB-凝集素途徑和旁路途徑(圖1)。任何補體級聯的激活導致C3轉化酶復合體形成。因此，C3轉化酶是補體激活的中心調節體。C3轉化酶將C3轉化為其活性的C3b形式。經典/凝集素途徑產生C3轉化酶C4b2b，而旁路途徑產生C3轉化酶C3bBb。CFH是多功能的，并能結合C3b、加速C3b降解，并作為因子I(其能滅活C3b)的輔因子。三種最近研究中鑒定的Y402HSNP位于CFH蛋白的S7結構域中，所述結構域是負責與C-反應性蛋白(CRP)和肝素結合的區域。結合至CRP和肝素的CFH提高CFH對補體蛋白C3b的親和力。該相互作用的改變可伴隨Y402H多態而發生，導致降低的對C3b的親和力和補體級聯的未受抑制的激活。治療AMD。C3轉化酶抑制劑療法的靶標患者種群可以通過遺傳篩選(例如使用頰拭子或血液分析)和對Y402HSNP或其它風險變體的基因分型來鑒定。可以使用QIAampDNABloodMaxi試劑盒(快而精公司(Qiagen)，巴Valencia,CA)從外周血液白細胞中分離基因組DNA。可以使用單鏈構象多態性(SSCP)分析、使用AppliedBiosystemsSNPAssays-On-Demand定量PCR、或通過對擴增的DNA直接測序來檢測DNA多態性。檢測CFH基因中多態性的其它手段對技術人員而言是常規的。本發明的C3轉化酶抑制劑可以全身或局部地施用。全身施用包括口服、經皮、皮下(subdermal)、腹膜內、皮下(subcutaneous)、經鼻、舌下或直腸施用。最優選的全身性施用途徑是口服。用于眼部施用的局部施用包括表面(topical)、玻璃體內、眼周、經鞏膜、眼球后、鞏膜旁(juxtascleral)、眼球筋膜下(sub-tenon)施用，或通過眼球內裝置施用。用于局部遞送的優選的方法包括通過后鞏膜旁施用、通過玻璃體內注射或通過插管(例如U.S.專利號6，413，245bl所述)經鞏膜遞送至黃斑。或者可以通過玻璃體內植入或經鞏膜植入的持續遞送裝置或通過局部部眼遞送的其它已知手段來遞送抑制劑。根據本發明的方法，將包含一種或多種本發明的化合物和用于全身或局部施用的可藥用載體的組合物施用至有其需要的哺乳動物。用于本發明方法中的優選的組合物含有C3轉化酶抑制劑，例如康普塔汀、迷迭香酸或MLN2222(也稱作CAB-2)。根據本領域已知的用于所期的具體施用途徑的方法配制組合物。根據本發明的方法，將組合物施用至有其需要的哺乳動物，所述組合物包含一種或多種C3轉化酶抑制劑和用于全身或局部施用的可藥用載體。根據本發明施用的組合物包含藥學有效量的一種或多種C3轉化酶抑制劑。如本文使用的"藥學有效量"是指足夠降低或預防AMD和/或與AMD相關的浮見敏度損失的量。一般而言，對旨在全身施用用于治療AMD的組合物而言，C3轉化酶抑制劑的總量應為約0.01-100mg/kg。對于局部施用而言，組合物中C3轉化酶抑制劑的優選濃度應為0.0001%-30%w/v。將以下的實施例包括在內，以例證本發明的優選實施方案。本領域技術人員應當明白，下文實施例中公開的技術代表了本發明人發現的在本發明實施中非常有效的技術，因此可以認為其構成了實施本發明的優選方式。然而，本領域技術人員在本公開內容的啟發下應當理解，在不偏離本發明的主旨和范圍的情況下，可對公開的具體實施方案進行許多改變而仍然獲得類似或相似的結果。實施例1康普塔汀的結構康普塔汀的線性氨基酸序列ILE-CYSC(2-12)-VAL-VAL-GLN-ASP-TRP-GLY訓HIS-HIS-ARG-CYS(2-12)THR(Furlong等人，2000;Morikis等人，1998)實施例2迷迭香酸的結構:(Sahu等人，1999)實施例3來自千碎喜制藥(Milleniumpharmaceuticals)的MLN2222(先前為CAB-2)結構未知。實施例4該實施例闡述了用于玻璃體內目艮部施用的含有本發明的C3轉化酶抑制劑的代表性藥物制劑的組成。<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例5該實施例闡述了含有本發明的C3轉化酶抑制劑的代表性藥物制劑的組成，所述藥物制劑用于后鞏膜旁和眼周施用。<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>基于本文的公開內容，可以在不進行過度實驗的情況下制備和實施本文所公開的和要求保護的所有組合物和/或方法。雖然已經根據優選實施方案對本發明的組合物和方法進行了描述，但是對于本領域技術人員顯而易見的是，可以在不脫離本發明的概念、主旨和范圍的情況下對本文所述的組合物和/或方法以及該方法的步驟或步驟順序進行變化。更具體而言，顯然可以用某些在化學上和結構上相關的物質代替本文所述的物質以獲得類似的結果。對于本領域技術人員顯而易見的所有該類替代和修改都在所附權利要求所定義的本發明的主旨、范圍和概念內。參考文獻它細節而言)被明確地并入本文作為參考。美國專利6,413，245blUS專利申請20030207309書籍其它出版物(Edwards等人，2005;Hageman等人，2005;Haines等人，2005;Klein等人，2005)Edwards,A.O.，Ritter，R.，3rd,Abel，K.J.，Manning,A.,Panhuysen,C,Fairer,L.A.,Haines,J.L.，Hauser，M.A.，Schmidt,S.，Scott,W.K.等人，(2005).補體因子H多態性和年齡相關性黃斑變性(CompkmentfactorHpolymorphismandage-relatedmaculardegeneration)補體因子H變體增加年齡相關性黃斑變性的風險(ComplementfactorHvariantincreasestheriskofage-relatedmaculardegeneration)在Iq32的補體因子H中的Y402H變體與年齡相關性黃斑變性易感性的強關聯(StrongassociationoftheY402HvariantincomplementfactorHatIq32withsusceptibilitytoage-relatedmaculardegeneration).科學(Science)308，421-424.Furlong,S.T"Dutta，A.S.，Coath，M.M.，Gormley，J.J.，Hubbs,S.J.，Lloyd,D.，Mauger，R.C,Strimpler,A.M.，Sylvester,M.A.，Scott，C.W"和Edwards,P.D.(2000).C3活化被康普塔汀類似物而不是絲氨酸蛋白酶抑制劑或肽基a-酮雜環所抑制(C3activationisinhibitedbyanalogsofcompstatinbutnotbyserineproteaseinhibitorsorpeptidylalpha-ketoheterocycles).免疫藥理學(Immunopharmacology)48，199-212.Hageman，G.S.，Anderson,D.H.，Johnson,L.V"Hancox,L,S.，Taiber，A.J.，Hardisty，L.I，Hageman，J.L，Stockman,H.A.，Borchardt,J.D.，Gehrs，K.M.，等人(2005).在補體調節基因因子H(HF1/CFH)中的常見單元型4吏個體易患年齡相關性黃斑變性(AcommonhaplotypeinthecomplementregulatorygenefactorH(HF1/CFH)predisposesindividualstoage-relatedmaculardegeneration).美國國家科學P完學才艮(ProcNatlAcadSciUSA)102，7227-7232.Haines,J.L.，Hauser，M.A.，Schmidt,S.,Scott,W.K.，Olson,L.M.，Gallins，P"Spencer,K.L.，Kwan，S.Y"Noureddine，M.，Gilbert,J.R.等人(2005).補體因子H變體增加年齡相關性黃斑變性的風險(ComplementfactorHvariantincreasestheriskofage-relatedmaculardegeneration).科學308,419-421.Klein,R.J.，Zeiss,C,Chew,E.Y"Tsai，J.Y"Sackler，R.S.，Haynes，C，Heiming，A.K.，SanGiovanni,J.P"Mane,S.M.，Mayne，S.T"等人，(2005).年齡相關性黃斑變性中的補體因子H多態性(ComplementfactorHpolymorphisminage-relatedmaculardegeneration).科學308，385-389.Morikis，D.，Assa-Mimt，N"Sahu，A.,和Lambris,J.D.(1998).—種有效的補體抑制劑——康普塔汀的溶液結構(Solutionstructureofcompstatin，apotentcomplementi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