Dna模塊克隆載體質粒和其應用方法

文檔序號：432900閱讀：1346來源：國知局

專利名稱：Dna模塊克隆載體質粒和其應用方法
技術領域：
本發明涉及克隆載體質粒領域，并涉及使用克隆載體質粒構建DNA構建物或轉基因。
背景技術：
分子生物學的基礎是重組DNA技術，在本文中將其小結為出于研究核酸及其蛋白產物的結構和功能而修飾和擴增核酸。 -
單個基因、基因調控區、基因亞組和含有它們的整個染色體均由核苷酸的雙鏈反向平行序列組成，核苷酸包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤和胞嘧啶，習慣上分別用首字母A、 T、 G和C表示。這些DNA序列以及cDNA序列是衍生自mRNA(信使RNA)分子的雙鏈DNA拷貝，可切割成單獨片段，分離和插入載體如細菌質粒中來研究基因產物。質粒是染色體外的一段DNA，最初來源于細菌，可進行操作并再次引入宿主細菌中以便研究或產生基因產物。質粒的DNA與所有染色體DNA相似，即它同樣由A、 T、 G和C核苷酸組成，編碼基因和基因調控區，然而，質粒是相對較小的分子，它由少于約30,000個堿基對或30千堿基(kb)組成。此外，雙鏈質粒的核苷酸堿基對形成連續的環形分子，也使質粒DNA區別于染色體DNA。
質粒能促進細菌生物體之間快速交換遺傳物質，使得細菌能夠快速適應環境改變，如溫度、食物供給或其它刺激。獲得的任何質粒必須表達有助于宿主存活的基因，否則該生物體將破壞或丟棄該質粒，因為維持不必要的質粒會浪
費資源。克隆的細胞群含有相同遺傳物質，包括它可能攜帶的任何質粒。將含
有DNA插入物的克隆載體質粒用于這類克隆的宿主細胞群將擴增可得的感興趣DNA的量。然后分離并回收如此克隆的DNA，以便在建立DNA構建物所需的步驟中進行后續操作。因此，應理解，克隆的載體質粒是研究基因功能的有用工具，能夠快速產生大量感興趣的DNA插入物。
雖然質粒中發現的一些元件是天然產生的，但其它一些元件可以是經過工程改造提高該質粒作為DNA載體的有用性的元件。這些元件包括抗生素或化學物質抗性基因以及多克隆位點(MCS)等。這些元件各自在本發明、以及現有技術中起到某種作用。各元件所起作用的描述將突出說明現有技術的局限，并證明本發明的有用性。
可由宿主獲得的一類特別有用的質粒攜帶基因是能產生抗生素抗性的基因。在平常的重組DNA技術實踐中，抗生素抗性基因用作陽性或陰性選擇元件，以便與其它質粒相比，優先增強所述質粒的培養和擴增。
為了被宿主細菌保持，質粒一定也含有指導宿主復制該質粒的序列段。稱為復制起點(ORI)元件的序列能指導宿主利用其細胞酶產生質粒拷貝。這類細菌分裂時，子細胞各自保持了這類質粒的一個或多個拷貝。使某些大腸桿菌(五. co")菌株衍生化，以最大程度提高這種復制，使每個細菌產生高達300個拷貝。以此方式，可提高所需質粒的培育。
在任何克隆載體中另一種必需元件是插入感興趣遺傳物質的位置。這是經工程改造進入"野生型"質粒，從而使該質粒可用作克隆載體的合成元件。市售克隆載體質粒一般含有至少一個這種區域，稱為多克隆位點(MCS)。 MCS—般含有可被一種或一系列限制性核酸內切酶(下文稱為"限制性酶")切割的核苷酸序列，各酶具有不同的核酸內切酶限制性位點和切割模式。DNA分子中編碼的這些核酸內切酶位點或核酸內切酶限制性位點(下文稱為"限制性位點")一般含有雙鏈回文序列。就一些限制性酶而言，少至4-6個核苷酸足以提供限制性位點，而一些限制性酶需要8個或更多個核苷酸的限制性位點。例如，酶EcoRl 能識別六核苷酸序列5'G-A-A-T-T-C3'，其中5'表示通常稱作"上游"末端的分子末端，類似地，3'表示"下游"末端。該限制性位點的互補鏈是其反相平行鏈 3'G-A-A-T-T-C-5'。因此，雙鏈限制性位點可存在于較大的雙鏈分子中，其中它表示為
5' G-A-A-T-T誦C 3' 3' C-T-T-A-A-G 5'
如同許多其它限制性酶那樣，EcoRl不在雙鏈對稱軸上準確切割，而是在 7"所示核苷酸之間兩條DNA鏈上相距4個核苷酸的位置上切割 5' G/A-A-T-T-C 3' 3' C-T誦T-A-A/G 5'
以便切割該雙鏈DNA分子，在新形成的"末端"上得到的核苷酸構型為 5' G3' 5A-A-T-T-C 3。
3' C-T-T-A-A5' 3G5'
這種交錯切割產生5'末端突出的DNA片段。因為堿基互相接近時自發形成A-T和G-C對，所以突出末端如上述末端被稱為粘性末端。這些末端中任何一個均可與用同一限制性酶切割的其它互補末端形成氫鍵。由于含有特定限制性位點的任何DNA與含有相同序列的任何其它DNA的切割方式相同，所以這些切割末端互補。因此，用同一限制性酶切割的任何DNA分子的末端互相"匹配"，類似于拼圖相鄰部分的"匹配"，并可通過酶將它們連接在一起。正是這種特性能夠形成重組DNA分子，能夠將外來DNA片段引入細菌質粒，或引入任何其它DNA分子。
建立重組DNA分子時考慮的另一普遍原理是用特定限制性酶切割分子中出現的所有限制性位點，而不只是感興趣位點。DNA分子越大，任意限制性位點重復出現的可能性越高。假定任何限制性位點沿某DNA分子隨機分布，平均每44(即256)個核苷酸出現一個四核苷酸位點，而每46(即4096)個核苷酸出現一個六核苷酸位點，每48(即114，688)個核苷酸出現一個八核苷酸位點。因此，不難理解，較短的限制性位點出現頻率較高，而較長的限制性位點較少出現。準備構建轉基因或其它重組DNA分子時，這是一個重要問題，因為這種計劃常常需要將大小不同的幾段DNA組裝在一起。這些片段越大，希望使用的位點在幾段DNA組件中出現的可能性越高，最樂觀的情況也會使得操作困難。
在本文中將頻繁出現的限制性位點稱為常見限制性位點，切割這些位點的
核酸內切酶稱為常見限制性酶。關聯序列大于6個核苷酸的限制性酶稱為罕見限制性酶，其關聯位點是罕見限制性位點。然而，有一些6bp的限制性位點的出現頻率高于統計學預測值，這些位點和切割它們的核酸內切酶也被稱作罕見。因此，稱謂"罕見"和"常見"并不指任何具體限制性酶的相對豐度或可及性，而是指在任何DNA分子或DNA分子的分離片段、或者任何基因或其DNA序列中構成其關聯限制性位點的核苷酸序列的出現頻率。
最近分離到第二類限制性酶，稱為尋靶(homing)核酸內切酶(HE)酶。 HE酶具有大的、不對稱限制性位點(12-40個堿基對)。HE限制性位點極罕見。例如，稱為 I-Scel 的 HE 具有 18 bp 限制性位點 (5'…TAGGGATAACAGGGTAAT…3')，預計在每7xl0"個堿基對的隨機序列中僅出現一次。這種出現頻率等于在20個哺乳動物大小的基因組中僅出現一個位點。如果克隆載體質粒的合適位置上含有HE位點，HE位點的罕見特性將大大提高遺傳工程技術人員切割最終轉基因產物而不破壞轉基因的完整性的可能性。
由于任何來源生物體的DNA分子均被其關聯限制性酶以相同方式切割，所以可用限制性酶切割來自任何物種的外來DNA片段，插入用同一限制性酶切割的細菌質粒載體中，在合適的宿主細胞中擴增。例如，可用稱為EcoRl 的限制性酶切割人基因中的兩個位置，可分離具有EcoRl末端的所需片段，在通常稱為連接反應物或連接混合物的體系中與也用EcoRl切割的質粒混合。在連接混合物中適當條件下，一些分離的人基因片段將與質粒分子的末端匹配起來。這些新連接的末端可連接在一起，并用酶使該質粒再環化，現在該質粒就含有新的DNA插入物。然后將連接混合物引入大腸桿菌或另一種合適的宿主中，新工程改造的質粒將隨著細菌分裂而擴增。以此方式，可從細菌獲得并收獲相對大量的人基因拷貝。然后，可根據研究、分析或產生基因產物蛋白的需要進一步操作這些基因拷貝。
重組DNA技術常常體現在產生所謂的"轉基因"。轉基因常包含衍生自一種或多種供體生物并引入宿主生物的各種遺傳物質。一般地，用克隆載體作為項目的起點或"主鏈"(backbone)來構建轉基因，設計一系列復雜的克隆步驟在該載體內組裝最終產物。轉基因元件(含有核苷酸序列)包括但不限于l)調
節性啟動子和/或增強子元件，2)表達成mRNA分子的基因，3)使mRNA信使穩定化的DNA元件，4)模擬哺乳動物內含子基因區域的核苷酸序列和5)mRNA 加工信號，如加到天然產生的mRNA末端的聚A尾。在某些情況下，實驗設計可能需要加入定位信號，以便將基因產物運輸到特定的亞細胞位置。這些元件各自是由供體基因組切下的較大DNA分子的片段，或者在某些情況下，是在實驗室中合成的。各片段與其它片段以精確順序和5'-3'取向組裝到克隆載體質粒中。
可以DNA片段的形式分離到任何基因的啟動子，將其放入合成分子如質粒中，以便指導所需基因的表達，假定可提供刺激感興趣啟動子所需的必要條件。例如，可分離胰島素基因的啟動子序列，與報道基因一起放入克隆載體質粒中，用于研究在合適細胞類型中表達胰島素基因所需的條件。或者，在克隆載體質粒中胰島素基因啟動子可與任何感興趣基因的蛋白質編碼序列連接在一起，用于驅動感興趣基因在表達胰島素的細胞中表達，假定如此構建的DNA 轉基因中存在所有必要元件。
在某些類型的轉基因中，報道基因是特別有用的組件。報道基因中包含的編碼某蛋白的核苷酸序列在轉基因中與其連接的感興趣特定啟動子的指導下表達，提供可測定到啟動子活性的生化反應。一般相對于內源性細胞蛋白質的背景，易于檢測或測定報道基因。常用的報道基因包括但不限于LacZ、綠色熒光蛋白和熒光素酶以及其它報道基因，許多都是本領域技術人員所熟知的。
內含子是哺乳動物基因中的非編碼區，細菌基因組中未發現內含子，但它是哺乳動物細胞中適當形成mRNA所必需的區域。因此，用于哺乳動物系統的任何DNA構建物都必須含有至少一個內含子，可由任何哺乳動物基因分離內含子，將它與合適的剪接信號一起插入DNA構建物，所述剪接信號使哺乳動物細胞能夠切掉該內含子并將其余的mRNA末端剪接在一起。
mRNA穩定化元件是保護一些mRNA不降解的結合蛋白所識別的DNA 序列。包含mRNA穩定化元件常常能提高該mRNA在一些哺乳動物細胞類型中的基因表達水平，因此可用于一些DNA構建物或轉基因。可以從天然產生的DNA或RNA分離mRNA穩定化元件，或者通過合成方法產生包含在DNA 構建物中的穩定化元件。
定位信號是編碼感興趣蛋白質的亞細胞路徑的蛋白信號的DNA序列。例如，核定位信號能將蛋白質導向細胞核；質膜定位信號將其導向質膜等。因此，可將定位信號摻入DNA構建物中，以其蛋白質產物轉移到所需的亞細胞位置中。
DNA構建物中可編碼標簽序列，以便使蛋白質產物具有獨特的附連區域。這種獨特區域用作可將其與內源性對應物區別開來的蛋白質標簽。或者，它可用作可通過本領域熟知的各種技術檢測的標志物，這些技術包括但不限于 RT-PCR、免疫組化或原位雜交。
用復雜的轉基因，或者用含有特別大的DNA區域的轉基因，會使這些 DNA片段中存在多個限制性位點的概率增加。回想起每4096 bp (46)出現一個編碼任何一個六核苷酸位點的限制性位點。如果啟動子序列是3000 bp，準備將1500 bp的感興趣基因組裝到3000 bp的克隆載體中，那么6個或更少核苷酸的許多位點將無法使用的可能性相當大，因為任何可用的位點必須僅出現在這些片段的兩個片段中。而且，該位點必須出現在待組裝的合適分子的合適區域中。此外，大多數克隆計劃需要加入其它DNA元件，從而增加了生長分子的復雜性和不合適地重復任何具體位點的概率。由于任何限制性酶將切割DNA 分子中所有它的限制性位點，因此，如果某限制性酶位點重復出現，所有不合適的位點將與所需位點一起被切割，這會破壞該分子的完整性。因此，必須仔細設計各個克隆步驟，以便不會因為已用于摻入前一元件的限制性酶的切割而破壞生長分子。最后，當研究人員希望將完整的轉基因引入哺乳動物生物體時，常常必須在轉基因至少一端的獨特限制性位點將完全組裝的轉基因構建物線性化，因此需要不存在于此構建物其它地方的另一種獨特位點。由于大多數 DNA構建物是根據單個目的設計的，所以對將來可能需要作出的修改考慮很少，進一步增加了將來實驗改變的難度。
傳統上，由于幾種原因，轉基因設計和構建消耗了大量時間和精力，這些原因包括
1.可獲得產生各種末端的多種限制性酶和HE酶；但大多數這些酶互不相容。許多限制性酶如EcoRl能產生具有突出的5'粘性末端或"尾"的DNA片段；其它限制性斷如Pstl)能產生具有3'突出尾的片段，另外一些酶(如Ball)
在對稱軸上切割，產生鈍端片段。一些酶與用其它限制性酶和/或HE酶切割形成的末端兼容，但大多數有用的酶不兼容。在設計DNA構建物的過程中，必須仔細考慮采用各種DNA片段分離方法產生的末端。
2. 必須首先從其來源基因組分離組裝DNA構建物或轉基因所需的DNA 片段，將其放入質粒克隆載體，擴增獲得有用量。可采用許多市售或單獨改變的克隆載體進行該步驟。大多數不同的市售克隆載體質粒是各自獨立開發的，因此含有不同序列和感興趣的基因DNA片段或遺傳元件的限制性位點。因此，必須單獨修飾基因，以使其適應各種載體，滿足給定實驗類型的需要。常常需要根據后續實驗改變進一步同一 DNA片段，或將其克隆到其它組合中形成新的DNA構建物或轉基因。由于各DNA構建物或轉基因是根據具體應用定制的，沒有考慮或了解它下一步將如何使用，所以常常必須根據后續應用進行" 回復改動(retro-fitted)"。
3. 此外，任何給定的基因或遺傳元件的DNA序列不同，可含有使其與目前可用載體不相容、從而使操作復雜化的內部限制性位點。將幾種DNA片段組裝成單個DNA構建物或轉基因時，尤其如此。
雖然可使用限制性酶操作遺傳物質，但已知可通過從頭合成、重組工程和 /或PCR終止子突出端克隆來產生MCS或其它轉基因組件。合成轉基因組件的一種這類方法包括Jarrell等在美國專利6,358,712中所述的方法。雖然Jarrell 公開了將轉基因元件"焊接(welding)"在一起的方法，但現有技術沒有說明一旦組裝后，"脫焊"和再組裝這些元件的方法或工具。
因此，提供以準確順序和5'-3'取向將轉基因各組件與其它組件一起克隆到克隆載體質粒中的方法是有利的。還需要使得使用者能夠將許多DNA片段快速組裝到一個分子中的系統，盡管在這些DNA片段的末端及其各自的內部發現限制性位點的冗余。提供快速改變所選DNA片段的末端，以向其中添加限制性位點的簡單方式也是有用的。包含單對或相反對的HE限制性位點會提高具有獨特克隆位點的可能性。也易于取代或去除一個或多個片段的系統會增加目前使用者無法獲得的多樣性水平。因此，能夠將DNA片段插入或移出側接于克隆載體中固定的罕見限制性位點的"盒"區的"模塊"系統特別有用，受到重組DNA技術領域的歡迎。
因此，本發明一方面提供了采用克隆載體質粒快速組裝DNA構建物或轉基因的方法。另一方面是依次將DNA片段，也稱為"插入物"或"模塊"如啟動子、表達(Expression)和3'調控核苷酸序列，摻入克隆載體質粒中。
發明概述
本發明提供了一種通過提供在含有稱為基因樞(genepivot)的專用停靠點的模塊克隆載體內提供主鏈，產生用于合成遺傳結構域模塊、PE3轉基因和其它復雜DNA構建物的模塊克隆載體的結構和方法。
本發明涉及一種由DNA克隆載體組成的結構域模塊停靠載體，所述載體包含將感興趣遺傳物質亞克隆到多克隆(MC)模塊中的MC模塊，該MC模塊包含a)第一基因樞(GP)，其含有可通過操作限定MC模塊5'部分的至少兩個恒定的罕見限制性位點；b)含有包括多個限制性位點的多克隆位點(MCS)的核酸序列，以便為將感興趣遺傳物質克隆到MC模塊中提供克隆位點，所述限制性位點選自常見的、在結構域模塊停靠載體中獨特的(unique)限制性位點；和c)第二基因樞，其含有可通過操作限定MC模塊3'部分的至少兩個恒定的罕見限制性位點。
本發明也涉及一種由DNA克隆載體組成的結構域模塊載體，其包含的結構域模塊包括a)第一基因樞，其含有可通過操作限定結構域模塊5'部分的至少兩個恒定的罕見限制性位點；b)感興趣遺傳模塊，它由含有感興趣遺傳物質的核酸序列組成；和c)第二基因樞，其含有可通過操作限定結構域模塊3'部分的至少兩個恒定的罕見限制性位點。
本發明也涉及一種由DNA克隆載體組成的PE3停靠載體，其包含含有至少一個克隆模塊的PE3克隆模塊，經構建該模塊可用于將至少第一結構域模塊克隆到PE3克隆模塊中，所述PE3克隆模塊包含a)第一基因樞，其含有克隆后可通過操作限定至少第一結構域模塊5'部分的至少兩個恒定的罕見限制性位點；b)由含有填充片段的第一核酸序列組成的填充模塊，克隆后被第一結構域模塊取代；和c)第二基因樞，其含有克隆后可通過操作限定至少第一結構域模塊3'部分的至少兩個恒定的罕見限制性位點。
本發明也涉及由DNA克隆載體組成的PE3停靠載體，其包含含有多個克隆模塊的PE3克隆模塊，經構建該模塊可用于將多個結構域模塊克隆到PE3 克隆模塊中，所述PE3克隆模塊包含a)第一基因樞，其含有克隆后可通過操作限定第一結構域模塊5'部分的至少兩個恒定的罕見限制性位點；b)由含有填充片段的第一核酸序列組成的第一填充模塊，克隆后被第一結構域模塊取代； c)第二基因樞，其含有克隆后可通過操作限定第一結構域模塊3'部分和第二結構域模塊5'部分之間的共有連接的至少兩個恒定的罕見限制性位點；d)由含有填充片段的第二核酸序列組成的第二填充模塊，克隆后被第二結構域模塊取代；e)第三基因樞，其含有克隆后可通過操作限定第二結構域模塊3，部分和第三結構域模塊5'部分之間的共有連接的至少兩個恒定的罕見限制性位點；f)由含有填充片段的第三核酸序列組成的第三填充模塊，克隆后被第三結構域模塊取代；和g)第四基因樞，其含有克隆后可通過操作限定第三結構域模塊3'部分的至少兩個恒定的罕見限制性位點。
本發明還涉及由DNA克隆載體組成的PE3多克隆(MC)停靠載體，其包含經構建能將至少三結構域模塊克隆到PE3克隆模塊中的PE3克隆模塊，所述 PE3克隆模塊包含a)第一基因樞，其含有克隆后可通過操作限定第一結構域
模塊5'部分的至少兩個恒定的罕見限制性位點；b)第一核酸序列；C)第二基因
樞，其含有克隆后可通過操作限定第一結構域模塊3'部分和第二結構域模塊5' 部分之間的共有連接的至少兩個恒定的罕見限制性位點；d)第二核酸序列；e) 第三基因樞，其含有克隆后可通過操作限定第二結構域模塊3'部分和第三結構
域模塊5'部分之間的共有連接的至少兩個恒定的罕見限制性位點；f)第三核酸
序列；和g)第四基因樞，其含有克隆后可通過操作限定第三結構域模塊3'部分的共有連接的至少兩個恒定的罕見限制性位點；其中所述第一、第二和第三核酸序列中至少一種是含有多克隆位點(MCS)的多克隆模塊，以便為將感興趣遺傳物質克隆到多克隆模塊中提供克隆位點，其余核酸序列是填充片段序列，所述多克隆位點含有多個限制性位點，這些限制性位點選自常見的、在PE3停靠載體中獨特的限制性位點。
本發明還涉及由DNA克隆載體組成的PE3載體，其包含含有啟動子模塊、表達模塊和3'調控模塊的PE3模塊，所述PE3模塊包含a)第一基因樞，其含有可通過操作限定啟動子模塊5'部分的至少兩個恒定的罕見限制性位點；b)啟
動子模塊；c)第二基因樞，其含有可通過操作限定啟動子模塊3'部分和表達模塊5'部分之間的共有連接的至少兩個恒定的罕見限制性位點；d)表達模塊；e) 第三基因樞，其含有可通過操作限定表達模塊3'部分和3'調控模塊5'部分之間的共有連接的至少兩個恒定的罕見限制性位點；f)3'調控模塊；和g)第四基因樞，其含有可通過操作限定3'調控模塊3'部分的至少兩個恒定的罕見限制性位點。
本發明也提供，PE3停靠載體、PE3載體和PE3多克隆(MC)停靠載體中任一種可包含由PE3載體釋放PE3模塊以插入多基因停靠載體的部件 (means)，一般包含啟動子結構域、表達結構域和側接于基因樞的3'調控結構域模塊。釋放和插入所述PE3克隆模塊的一種部件包括位于PE3停靠載體或PE3 MC停靠載體中的一對尋耙核酸內切酶(HE)，其側接含有PE3克隆模塊的核酸序列。將啟動子結構域、表達結構域和3'調控結構域插入或克隆入PE3 克隆模塊后，該對HE提供了剪切PE3載體上的PE3模塊、以插入多基因載體內相容性停靠位置中的一種部件，所述相容性停靠位置一般由同一對HE確定。雖然任何尋靶核酸內切酶均可用于所述第一位置(剪切的PE3模塊的5'端)或第二位置(剪切的PE3模塊的3'端)，但優選的HE對由所述第一位置上的I-Ceu I 和所述第二位置上反向的ISce-I組成。在PE3停靠載體或PE3 MC停靠載體的其它實施方式中，可采用不同的剪切和插入部件代替HE。這類不同的剪切和插入部件可包含一對一種或多種恒定的罕見限制性位點，包含不同于基因樞中罕見限制性位點的一對罕見限制性位點，或側接的基因樞(GP1和GP4)本身。插入部件采用了重組工程方法，下面進行討論。
本發明提供了構建PE3模塊載體的方法，所述方法包括以下步驟a)提供含有PE3克隆模塊的PE3克隆載體，所述PE3克隆模塊依次含有含有至少兩個恒定的罕見限制性位點的第一基因樞、由含有填充片段的核酸序列組成的至少第一填充模塊、和第二基因樞；b)提供至少第一結構域模塊載體，其依次含有第一基因樞，由含有感興趣遺傳物質的核酸序列組成的感興趣遺傳模塊; 和第二基因樞；c)提供所述第一基因樞的罕見限制性位點之一的第一關聯限制性酶和所述第二基因樞的罕見限制性位點之一的第二關聯限制性酶；d)采用所述第一和第二關聯限制性酶從所述第一結構域模塊載體切下和分離感興趣
遺傳模塊；e)采用所述第一和第二關聯限制性酶從PE3克隆載體的PE3克隆模塊上切下第一填充模塊；和f)將感興趣的遺傳模塊連接到PE3克隆模塊中。該方法也可采用第三基因樞和關聯限制性酶將感興趣的第二遺傳模塊剪切和連接到PE3克隆模塊中，從而將感興趣的第二遺傳模塊插入PE3中。相似地，可采用第三基因樞和關聯限制性酶將感興趣的第二遺傳模塊剪切和連接到PE3 克隆模塊中，從而將感興趣的第三遺傳模塊插入PE3中。該方法能夠將感興趣的遺傳模塊依次安置到PE3克隆載體中。一般地，所述感興趣的第一、第二和第三遺傳模塊分別對應于啟動子模塊、表達模塊和3'調控模塊。
本發明的另一實施方式是制備轉基因的方法，其包括以下步驟提供包含主鏈的克隆載體質粒，該主鏈至少含有第一、第二、第三和第四停靠點，所述停靠點以5'-3'方向依次安置，各自具有可通過操作被限制性酶切割的至少一個恒定的罕見限制性位點；用對應于第一停靠點的至少一個恒定的罕見限制性位點的第一限制性酶切割第一停靠點，產生3，端露出的切割的第一停靠點；用對應于第二停靠點的至少一個恒定的罕見限制性位點的第二限制性酶切割第二停靠點，產生5'端露出的切割的第二停靠點；提供含有5'端、感興趣核苷酸序列和3'端的第一插入物，其中所述第一插入物的5'端與切割的第一停靠點露出的3'端相容，所述第一插入物的3'端與切割的第二停靠點露出的5'端相容，將所述第一插入物和切割的克隆載體質粒放入合適的反應混合物中，以便使所述第一插入物連接和自身定向到第一停靠點和第二停靠點之間的主鏈內，重新組裝所述主鏈。
在此實施方式中，然后，可用第二限制性酶切割第二停靠點，產生3'端露出的切割的第二停靠點，可采用對應于第三停靠點的至少一個恒定的罕見限制性位點的第三限制性酶切割第三停靠點，產生5'端露出的切割的第三停靠點，然后是以下步驟提供含有5'端、感興趣核苷酸序列和3'端的第二插入物，其中所述第二插入物的5'端與切割的第二停靠點露出的3'端相容，所述第二種插入物的3'端與切割的第三停靠點露出的5'端相容，將所述第二插入物和切割的克隆載體質粒放入合適的反應混合物中，以便使所述第二插入物連接和自身定向到第二停靠點和第三停靠點之間的主鏈內，重新組裝所述主鏈。
另外，這種實施方式可包括以下后續步驟用第三限制性酶切割第三停靠
點上的主鏈，產生3，端露出的切割的第三停靠點，用對應于第四停靠點的至少
一個恒定的罕見限制性位點的第四限制性酶切割第四停靠點，產生5，端露出的切割的第四停靠點，提供含有5，端、感興趣核苷酸序列和3'端的第三插入物，其中所述第三插入物的5'端與切割的第三停靠點露出的3'端相容，所述第三插入物的3'端與切割的第四停靠點露出的5'端相容，將第三插入物和切割的克隆載體質粒放入合適的反應混合物中，以便使所述第三插入物連接和自身定向到第四停靠點和第二停靠點之間的主鏈內，重新組裝所述主鏈。
本發明另一實施方式是制備用于合成轉基因或其它復雜DNA構建物的模塊克隆載體質粒的方法，所述方法包括以下步驟提供含有主鏈的克隆載體質粒，所述主鏈至少含有第一和第二停靠點，所述停靠點各自具有可通過操作被限制性酶切割的至少一個恒定的罕見限制性位點；采用對應于第一停靠點的至少一個恒定的罕見限制性位點的第一限制性酶切割第一停靠點，產生3'端露出的切割的第一停靠點和5'端露出的切割的主鏈；提供含有5'端、感興趣核苷酸序列和3'端的第一插入物，其中所述第一插入物的5'端與切割的第一停靠點露出的3'端相容，所述第一插入物的3'端可通過操作(與切割主鏈露出的5'端結合時)形成具有可通過操作被第三限制性酶切割的至少一個恒定的罕見限制性位點的第三停靠點，將所述第一插入物和切割的克隆載體質粒放入合適的反應混合物中，以便使所述第一插入物連接和自身定向到第一停靠點和第三停靠點之間、第二停靠點上游的主鏈內，重新組裝所述主鏈，然后用第三限制性酶切割第三停靠點，產生3，端露出的切割的第三停靠點和5，端露出的切割的主鏈；提供含有5，端、感興趣核苷酸序列和3，端的第二插入物，其中所述第二插入物的5，端與切割的第三停靠點露出的3，端相容，第二插入物的3，端可通過操作(與切割主鏈露出的5'端結合時)形成包含可通過操作被第四限制性酶切割的至少一個恒定的罕見限制性位點的第四停靠點，將所述第二插入物和切割的克隆載體質粒放入合適的反應混合物中，以便使所述第二插入物連接和自身定向到第三停靠點和第四停靠點之間、第二停靠點上游的主鏈內，重新組裝所述主鏈，然后用第四限制性酶切割第四停靠點，產生3'端露出的切割的第四停靠點，用對應于第二停靠點的至少一個恒定的罕見限制性位點的第二限制性酶切割第二停靠點，產生5'端露出的切割的第二停靠點，提供含有5'端、感興趣核苷酸
序列和3'端的第三插入物，其中所述第三插入物的5'端與切割的第四停靠點露出的3'端相容，所述第三插入物的3'端與切割的第二停靠點露出的5'端相容，將第三插入物和切割的克隆載體質粒放入合適的反應混合物中，以便使所述第三插入物連接和自身定向到第四停靠點和第二停靠點之間的主鏈內，重新組裝所述主鏈。
可以參照以下附圖和詳述更全面地了解本發明的其它特性和優點。
附圖簡要說明
納入本說明書并構成本說明書一部分的

了本發明的實施方式，附圖與上面給出的發明概述和下面給出的詳述一起解釋了本發明的原理。
圖1是含有在遺傳模塊中克隆的多克隆位點的結構域模塊停靠載體的示意圖。
圖2是含有在結構域模塊中克隆的結構域克隆模塊的PE3停靠載體的示意圖。
圖3是含有在遺傳模塊中克隆的多克隆位點的PE3多克隆停靠載體的另一種實施方式的示意圖。
圖4是含有在PE3載體中克隆的部件的多基因載體的示意圖。圖5是本發明模塊構思的另一種示意圖。圖6是停靠質粒圖。
圖7是說明可包含在停靠質粒MCS中的限制性酶位點的例子的直線限制性位點圖。
圖8是多基因(或原始)停靠質粒圖。
圖9是說明可包含在多基因停靠質粒MCS中的限制性酶位點的例子的直線限制性位點圖。
圖IO是穿梭載體P("SVP")質粒圖。
圖11是說明可包含在穿梭載體PMCS中的限制性酶位點的例子的直線限制性位點圖。
圖12是穿梭載體E("SVE")質粒圖。
圖13是說明可包含在穿梭載體EMCS中的限制性酶位點的例子的直線限
制性位點圖。
圖14是穿梭載體3'("SV3")圖。
圖15是說明可包含在穿梭載體3'MCS中的限制性酶位點的例子的直線限制性位點圖。
圖16是按照本發明制備并與PE3模塊一起使用的多基因停靠載體的示意圖。
圖17是采用基因樞提供含有PE3模塊的多基因載體以將PE3模塊插入多基因停靠載體中的示意圖。
圖18是采用多基因載體中的多克隆位點將PE3模塊插入多基因停靠載體的示意圖。
圖19是采用多基因載體中的BstX-l限制性位點將PE3模塊插入多基因停靠載體的示意圖。
圖20是采用多基因載體中的尋靶核酸內切酶將PE3模塊插入多基因停靠載體的示意圖。
圖21是采用PE3載體和多基因載體之間的重組工程化將PE3模塊插入多基因停靠載體中的示意圖。
序列表簡述
納入本說明書并構成本說明書一部分的所附序列表說明了本發明的實施方式，該序列表與上面給出的發明概述和下面給出的詳述一起解釋了本發明的原理。
SEQ:ID 01是PE3停靠質粒MCS的核苷酸序列的例子。 SEQ:ID 02是PE3停靠質粒的核苷酸序列的例子。 SEQ:ID 03是原始停靠質粒MCS的核苷酸序列的例子。 SEQ:ID 04是原始停靠質粒的核苷酸序列的例子。 SEQ:ID 05是穿梭載體P質粒MCS的核苷酸序列的例子。 SEQ:ID 06是穿梭載體P質粒的核苷酸序列的例子。 SEQ:ID 07是穿梭載體E質粒MCS的核苷酸序列的例子。 SEQ:ID 08是穿梭載體E質粒的核苷酸序列的例子。
SEQ:ID 09是穿梭載體3質粒MCS的核苷酸序列的例子。 SEQ:ID 10是穿梭載體3質粒的核苷酸序列的例子。
用于描述本發明的術語定義
出于本發明目的，以下術語定義如下
"染色質修飾結構域"(CMD)指與維持和/或改變染色質結構有關的各種蛋
白質相互作用的核苷酸序列。
"克隆"指將DNA分子連接到質粒中和將其轉移到合適宿主細胞中以便在宿主增殖過程中復制的過程。
術語"克隆載體"指至少含有復制起點、陽性選擇攜帶該載體的宿主細胞的部件如抗生素抗性基因、和多克隆位點的環形DNA分子。克隆載體可由質粒、粘粒、人工染色體(BAC、 PAC、 YAC和其它)或病毒載體主鏈組成。
"關聯序列"指限制性酶結合和切割DNA分子或基因所需的最小核苷酸鏈。
"常見"指在基因組內出現頻率相對較高的任何限制性位點。 "相容"指可與用相同限制性酶切割或通過其它方法產生的其它互補性末
端形成氫鍵的DNA鏈的5'或3'末端或端。由于含有限制性酶的特異性限制性位點的DNA與含有相同序列的任何其它DNA的切割方式相同，所以這些切割末端互補，從而相容。因此，用同一限制性酶切割的任何DNA分子的末端互相"匹配"，類似于拼圖相鄰部分的"匹配"，并可通過酶將它們連接在一起。結合在一起時，相容性末端將形成特定限制性酶的限制性位點。
"從頭合成"指通過連接代表全部所需DNA分子的亞序列的互補單鏈DNA 分子相容性突出端，合成任何長度的雙鏈DNA分子的過程。
"DNA構建物"指在克隆載體質粒內連續進行克隆步驟合成的DNA分子，它常常用于在任何合適細胞宿主如培養細胞中體外指導基因表達，或在轉基因小鼠體內指導基因表達。用于制備這類小鼠的轉基因也可稱為DNA構建物，尤其是在設計和合成轉基因的階段。
"DNA片段"指任何分離的DNA分子，包括但不限于蛋白質編碼序列、報道基因、啟動子、增強子、內含子、外顯子、聚A尾、多克隆位點、核定位信號或mRNA穩定化信號、或者任何其它天然產生或合成的DNA分子。或者， DNA片段可以完全是由合成來源在體外產生的。而且，DNA片段可包含天然產生和/或合成的分離片段的任何組合。
"停靠質粒"指專門用于本發明，將DNA片段組裝到DNA構建物中的克隆載體質粒。
"核酸內切酶"，在本文中也常常稱為"限制性酶"，指能結合DNA分子編碼的限制性位點并且在該序列內部或附近的準確位置上切割該DNA分子的一類催化分子的成員。
術語"核酸內切酶限制性位點"或"限制性位點"(以及"關聯序列"，見上)指限制性酶結合和切割DNA分子或基因所需的最小核苷酸鏈。
"增強子區"指對于靶基因的表達不是必需的，但在合適條件下能提高基因表達水平的核苷酸序列。
"基因表達宿主選擇基因"(GEH-S)指可賦予宿主生物體某特征的遺傳元件，該特征可通過光學感受器、PCR擴增、生化實驗或細胞/生物體存活實驗(用合適的抗生素或化學物質處理時使細胞或生物體有抗性或受毒害)進行選擇、跟蹤或檢測。
術語"基因啟動子"或"啟動子"(P)可互換使用，指表達基因所需的核苷酸序列。
術語"插入物"和"模塊"基本上可互換，僅有的微細差別是將"插入物"插入載體中，一旦插入后，常常稱為"模塊"。然后，可去除載體中的模塊。另外，術語"插入物"常常用于分離的模塊，用作插入模塊受體載體的插入物。
"內含子"指兩個蛋白質編碼區或外顯子之間存在的基因的非蛋白質編碼區核苷酸序列。
"定位信號"(LOC)指編碼感興趣蛋白質的亞細胞途徑的信號的核苷酸序列。
"多克隆位點"(MCS)指含有將DNA片段克隆到克隆載體質粒中的至少一個獨特的限制性位點，更一般地含有一組獨特的限制性位點的核苷酸序列。
術語"mRNA穩定化元件"指通過結合認為能保護一些mRNA不降解的蛋白質而識別的DNA序列。
提到一組限制性位點時，術語"通過操作限定"指用一種關聯限制性酶切割該組中任何一種限制性位點時，突出端殘基代表該組限制性位點下游核苷酸序列的5'部分。
術語"復制起點"(ORI)指指導質粒在宿主細胞內復制或倍增的核苷酸序列。
"PCR終止子突出端克隆技術"指用聚合酶鏈反應與單鏈DNA引物擴增遺傳模塊的方法，所述單鏈DNA引物含有受保護的5'突出端核苷酸，可用作與互補DNA突出端的連接位點。
"聚A尾"指通常存在于信使RNA(mRNA)分子末端的腺嘌呤(A)核苷酸序列。將聚A尾信號摻入DNA構建物或轉基因的3'端能促進感興趣基因的表達。
"引物位點"指為了啟動DNA測序、PCR擴增和/或RNA轉錄，單鏈DNA 寡核苷酸可與其退火連接的用作DNA模板的核苷酸序列。
術語"pUC19"是本領域技術人員熟知的質粒克隆載體，可參見NCBI Genbank數據庫的登錄號弁L09137。
"隨機核苷酸序列"指不與編碼指定為同一分子組件的其它元件的序列相重復的核苷酸序列的任意組合。隨機序列所需的核苷酸數目取決于側接該隨機序列的限制性酶的要求。大多數核酸內切酶至少需要2-4個額外的隨機序列，以便使DNA結合穩定化。隨機序列的數量優選為3(對應于組成密碼子的核苷酸數目)的倍數。因此，隨機序列的最小數目優選為6，然而，可采用更少或更多的核苷酸。
"罕見"指在基因組內出現頻率相對較低的限制性位點。
"重組臂"指能促進轉基因DNA和基因組DNA之間同源重組的核苷酸序列。成功的重組需要存在能夠通過同源重組摻入宿主基因組中的、側接于轉基因DNA某區域的左重組臂(LRA)和右重組臂(RRA)。
"重組工程"指聯合采用隨機或位點選擇性重組酶和DNA序列的過程，重組酶可作用于所述DNA序列將一部分遺傳物質由一個DNA分子運輸到另一個不同DNA分子。
"報道基因"指編碼可用于監測感興趣具體啟動子的活性的蛋白質的核苷酸序列。
"限制性核酸內切酶"或"限制性酶"指能結合DNA關聯序列并且在該序列內部的準確位置上切割該DNA分子的一類催化分子的成員。
"穿梭載體"指本發明所用的一種專門的克隆載體質粒，用于制備能夠修飾 DNA片段末端的中間體分子。
"標簽序列"(TAG)指編碼能夠檢測、或者在一些情況下能與任何內源性對應物區別開的獨特蛋白質區域的核苷酸序列。
"非翻譯區"(UTR)指包含mRNA分子的非蛋白質編碼區的核苷酸序列。這些非翻譯區可位于mRNA分子的5'端(5' UTR)或3'端(3' UTR)。
"獨特"指不存在于特定DNA分子內任何其它位置的任何限制性核酸內切酶或HE位點。
發明詳述
本發明提供了通過提供其中含有模塊克隆或停靠點的主鏈，產生用于合成 PE3轉基因或其它復雜DNA構建物的多基因停靠載體的結構和方法，所述多基因停靠載體一般是質粒載體，也稱為模塊克隆載體。可通過本發明，采用經優化減少頻繁需要的操作量的克隆載體將各種DNA片段組裝到從頭DNA構建物或轉基因中。PE3轉基因載體在本文中稱為PE3停靠載體或停靠質粒，一般含有以直線方式排列的至少一個多克隆位點(MCS)和多組罕見限制性位點和 /或獨特的尋靶核酸內切酶("HE")位點。這種排列確定了模塊結構，使得使用者能夠將結構域模塊作為插入物置入PE3轉基因構建物中，而不破壞已經在以前的克隆步驟中摻入停靠質粒的DNA元件的完整性。
雖然本發明公開并列舉了用于將遺傳結構域模塊構建到PE3轉基因模塊中的模塊載體和方法以及用于插入多基因載體，即質粒克隆載體的PE3轉基因模塊，但也可采用相似方法在較大的染色體外DNA分子如粘粒或人工染色體，包括細菌人工染色體(BAC)中構建遺傳結構域模塊和PE3轉基因模塊。由于可摻入質粒克隆載體的遺傳元件的種類很多，所以只需很少操作或者無需進一步操作就可將最終PE3轉基因產物轉移到各種宿主生物體中。
本發明提供了各停靠點(基因樞)和各結構域模塊或插入物的5'和3'端均與另一停靠點或插入物的相應端相容(的實施方式)。例如，如果第一停靠點含有
恒定的罕見限制性酶如SgrAl的限制性位點，隨后切割該停靠點，那么準備插入切割的第一停靠點3'端的第一插入物將含有相容性5，端，以當插入物與第一停靠點組合時產生SgrAl的限制性位點。質粒內的第二停靠點可以(例如)含有恒定的限制性酶如Swal的限制性位點。任何第二插入物的3'端都將具有相容性核苷酸序列，以便與切割的第二停靠點切割的5'端組合，產生SwaI的限制性位點。另外，為了適當地插入模塊克隆載體質粒和隨后在同一點上去除，第一插入物的3，端和第二插入物的5'端必須含有相容性末端，以產生第三種恒定的罕見限制性酶，如Pacl或Sail的第三限制性位點。
本發明結構域模塊停靠載體在本文中也稱為"穿梭載體"，它能在結構域模塊中穿梭到PE3停靠載體中，其包含具有常見限制性位點的多克隆位點，該位點側接于至少一個罕見限制性位點，任選地側接于HE位點。設計穿梭載體，以便將DNA片段克隆到罕見限制性位點之間的常見限制性位點中。隨后可通過在罕見限制性(或HE)位點上切割而釋放該克隆的片段，用同樣的罕見限制性位點和/或HE位點或穿梭載體中存在的位點將其摻入PE3停靠載體中。
因此，與常規克隆載體不同的是，MCS的設計允許采用含有一組罕見限制性位點的確定的基因樞將結構域模塊("盒"或DNA片段模塊)插入PE3停靠載體(停靠質粒)的模塊區。同樣，可采用相同的罕見限制性酶和/或HE酶容易地去除各模塊，并用任何其它感興趣的DNA片段取代。這種特征使得使用者能夠迅速而容易地改變實驗計劃的方向，而不必重建整個DNA構建物。因此，本發明的結構域模塊和PE3克隆載體使得使用者能夠將DNA片段克隆到中間性結構域模塊載體中(利用常規的限制性位點，產生盒-接受模塊)，然后通過罕見限制性位點將模塊片段轉移到最終構建物中所需的模塊部位。而且，將來能用其它盒模塊取代PE3停靠質粒中的各個模塊，從而改變該分子。以下描述指出了與現有技術相比，本發明的獨特之處。
各停靠點(由基因樞確定)代表優選有至少兩個固定的恒定的罕見限制性位點的區域，更優選有至少三個恒定的罕見限制性位點的固定群，最優選有不多于4個恒定的罕見限制性位點的固定群。各停靠點的具體限制性位點由其關聯限制性酶切割。這會產生所需的5'或3'端，與含有所選核苷酸序列，如啟動子、表達或調控核苷酸序列的預構建插入物之一的互補性5'或3'端相容。各自
的5'和3'端與感興趣的切割停靠點相容的至少兩種插入物可與切割的克隆載體
質粒一起加入合適的反應混合物中，在合適的熱力學環境下，插入物可同時(即在一個步驟中)整合到克隆載體質粒中。在這次單獨的加入和連接反應中，再次形成停靠點，克隆載體質粒變成模塊，因為可以用合適的限制性酶再次切割停靠點和兩個模塊之間的連接。隨后可去除該模塊，將新模塊放入其位置。雖然可能在側接模塊的樞點上采用單個限制性位點，但明顯可能的是，單
個"罕見"限制性位點在所述特定DNA分子中出現頻率很高。想到限制性酶位
點頻率是4"的函數，如上所述。例如，克隆載體質粒中的特定啟動子模塊的
DNA序列中可含有罕見限制性位點(也存在于其樞點上)，因此使樞點上含有一個以上限制性位點有優點。因此，優選在一個樞點上采用一個以上罕見限制性位點，因為感興趣模塊的DNA序列內存在一個以上某限制性位點的統計學概率低得多。然而，也優選單個樞點上存在不多于三個或四個限制性位點，否則限制性位點開始"群集"，影響靶分子的轉錄/翻譯。對于上述數目，群集的限制性位點組合的長度至多為18-24 bp。
結構域模塊載體
圖1顯示了本發明第一個實施方式結構域模塊停靠載體1的簡化示意圖。載體l由具有多克隆位點2的DNA鏈組成，一般是質粒。該結構域模塊停靠載體包含由五個克隆位點組成的多克隆模塊(MC模塊)，這五個克隆位點的排列依次是MC-1、 MC-2、 MC-3、 MC-4和MC-S。該多克隆位點包含獨立地選自常見限制性位點的多個限制性位點，如下所述。兩個限制性位點確定感興趣遺傳物質的停靠位置，如感興趣基因3。 MC模塊使得能夠將感興趣遺傳物質亞克隆到MC模塊多克隆位點中兩個限制性位點之間。感興趣基因3 —般由感興趣基因載體釋放(未顯示)，包含一對克隆位點4a和4b，如MC-1和MC-3所示。
結構域模塊停靠載體也包含側接多克隆位點2的一對限制性位點，稱為基因樞5和6。所述基因樞各自包含至少兩個恒定的罕見限制性位點，如下所述。基因樞5和6通過操作分別確定了 MC模塊的5'和3'部分。
在本發明的第二個實施方式中，關聯限制性酶MC-1和MC-3(未顯示)可
由感興趣基因的載體上切下感興趣基因，并在MC-l和MC-3 MC位點上打開 MC模塊，從而將感興趣基因連接到MC-1和MC-3 MC位點之間，形成結構域模塊載體7。在說明性實施方式中，感興趣基因包含表達結構域，因此該結構域模塊是表達模塊，該結構域模塊載體更具體是表達模塊載體。表達模塊載體包含表達模塊8，該模塊含有第一和第二基因樞5和6，所述基因樞側接的核酸序列包含亞克隆的含有表達結構域的感興趣基因3。
在說明性實施方式中，感興趣基因包含表達結構域，其中在下文中將第一基因樞(或表達結構域5'部分)稱為GP2，將第二基因樞(或表達結構域3'部分) 稱為GP3。可理解，在其它實施方式中，感興趣基因可包含啟動子結構域或3' 調控結構域，因此其亞克隆分別提供了啟動子模塊載體中的啟動子模塊和3' 調控模塊載體中的3'調控模塊模塊。在啟動子模塊停靠載體中，在下文中將第一基因樞(或啟動子結構域5'部分)稱為GP1 ，將第二基因樞(或啟動子結構域3' 部分)稱為GP2。在3'調控模塊停靠載體中，在下文中將第一基因樞(或3'調控結構域5'部分)稱為GP3,將第二基因樞(或3'調控結構域3'部分)稱為GP4。
任何結構域模塊停靠載體的基因樞，包括基因樞GP1、GP2、GP3和GP4，可包含選自下組的罕見限制性位點AsiSI、 Pacl、 Sbfl、 Fse I、 Asc I、 Mlu I、 SnaB I、 Not I、 Sal I、 Swa I、 Rsr II、 BsiW I、 Sfo I、 SgrA I、 AflIII、 Pvu I、 NgoMIV、 Asel、 Flpl、 Pmel、 Sdal、 Sgfl、 Srf I和Sse8781 I，更一般地選自AsiS I、 Pac I、 Sbf I、 Fse I、 Asc I、 Mlu I、 SnaB I、 Not I、 Sal I、 Swa I、 RsrII、 BSiWI。基因樞的更一般的實施方式含有一系列(至少3個、不多于 4個)罕見限制性位點，任何一種基因樞一般都不包含任何其它基因樞的罕見限制性位點。
在優選實施方式中，基因樞GP1至少選自AsiSI、 Pac I或Sbf I，基因樞 GP2至少選自Fsel、 Asc I或Mlu I，基因樞GP3至少選自SnaB I、 Not I或Sal I，基因樞GP4至少選自Swal、 RsrII和BSiWI。在一個特別優選的實施方式中，基因樞GPI依次由AsiSI、 PacI和SbfI組成；基因樞GP2依次由Fse I、 Asc I和Mlu I組成；基因樞GP3依次由SnaB I、 Not I和Sal I組成；基因樞 GP4依次由Swa I、 Rsr II和BSiW I組成。
也可理解，多克隆位點可包含采用反向順序(如MC-5、 MC-4、 MC-3、MC-2和MC-1)和其它類型克隆位點的限制性位點的其它組合(較多或較少數量的位點)。可改變多克隆位點，以適應具體感興趣基因的克隆位點對。
在另一實施方式中還考慮了結構域模塊停靠載體文庫，可采用這些載體容易地亞克隆各種感興趣基因。可構建結構域模塊停靠載體文庫，以用作專用的啟動子結構域模塊載體、表達結構域模塊載體或3'調控模塊載體，這取決于根據具體結構域模塊停靠載體選擇的基因樞的類型。啟動子、表達和3'調控結構域模塊載體的各個亞文庫含有其專用的基因樞對(即，GP1和GP2、 GP2和GP3 以及GP3和GP4)，以保證將各個結構域模塊適當地克隆到更高級的PE3停靠載體中，如下所述。
PE3停靠和PE3 MC停靠載體
圖2顯示了本發明第三個實施方式、第一 PE3停靠載體10的簡化示意圖。 PE3停靠載體10由具有至少第一克隆模塊lib的DNA鏈組成，一般是質粒。所述至少第一克隆模塊至少含有第一和第二基因樞，如GP2禾卩GP3所示，其側接于含有填充片段18b的核酸序列。DNA填充片段結構域是不編碼PE3停靠載體內存在的限制性位點或任何其它生物學功能的隨機核苷酸序列。填充片段DNA通過提供限制性酶可結合的較長的DNA鏈，而提高限制性酶切割活性的效率。這很重要，因為如果DNA長度有限，則許多限制性酶無法結合和切割其關聯識別位點。第一和第二基因樞如本文所述。構建第一克隆模塊llb，以便將至少一個第一結構域模塊克隆到PE3克隆模塊中。在第一克隆模塊是表達結構域克隆模塊的說明性實施方式中，第一和第二基因樞表示為GP2和 GP3，其定義如上所述。含有填充片段的第一克隆模塊llb也稱為表達填充模塊，它提供了用于插入含有相容性基因樞的表達結構域模塊的停靠位置。相容性基因樞是含有與克隆模塊的基因樞相同的限制性位點，或者至少一個獨特的罕見限制性位點相同的基因樞。
也說明了，第二克隆模塊1 la是啟動子填充模塊，其第一基因樞12是GP1 ，第二基因樞13是GP2， GP2是與克隆模塊lib的5'部分共有的連接。啟動子填充模塊lla包含填充片段，并提供了插入含有相容性基因樞的啟動子結構域模塊的停靠位置，所述啟動子結構域模塊在克隆后取代了啟動子填充模塊。第三克隆模塊llc是3'調控填充模塊，其第一基因樞14是GP3，第二基因樞15 是GP4， GP3是與克隆模塊lib的3'部分共有的連接。3'調控性填充模塊llc 含有填充片段，并為含有相容性基因樞的3'調控結構域模塊的插入提供了停靠位置，所述3'調控結構域模塊在克隆后取代3'調控填充模塊。
在本發明的第四個實施方式中，一種結構域模塊載體的各基因樞中所含的罕見限制性位點之一的關聯限制性酶(如表達模塊7所示)可切割載體上的罕見限制性位點，同樣在相應基因樞GP2和GP3中的相同罕見限制性位點上打開 PE3停靠載體，從而用表達模塊取代表達填充模塊。在另一獨立的克隆事件中，可采用啟動子模塊基因樞(未顯示)和啟動子填充模塊lla的相應基因樞12和 13的合適關聯限制性酶，以將啟動子模塊連接到PE3模塊中，從而用啟動子模塊取代啟動子填充模塊。同樣，可將3'調控模塊連接到PE3模塊中。
在本發明中，至少兩種，更一般地至少三種罕見限制性位點被用作停靠樞或基因樞。遺傳序列中罕見限制性位點的稀有性使得不可能在停靠載體中發現雙位點基因樞中的兩個罕見限制性位點，更不可能發現三位點基因樞中的全部三個罕見限制性位點。發現DNA克隆載體含有該基因樞罕見限制性位點中的一種時，技術人員可用一種其它關聯罕見限制性酶切割該基因樞。例如，如果 GP2基因樞由Fsel、 AscI和MluI組成，PE3停靠載體或E結構域本身的序列內含有Asc I，那么技術人員可采用Fse I或Mlu I來切割該基因樞。
PE3載體的DNA克隆載體一般還含有由PE3停靠載體釋放PE3克隆模塊，以便克隆到多基因停靠載體中的部件，如下所述。
圖3顯示了將結構域模塊克隆到PE3多克隆(MC)停靠載體20中的另一種實施方式。稱為PE3 MC-啟動子停靠載體20a的第一 PE3 MC停靠載體由含有至少第一克隆模塊21a的DNA鏈組成，一般是質粒。第一克隆模塊21a至少包含第一和第二基因樞(如GP1和GP2所示)，其側接的核酸序列包含含有獨立地選自常見限制性位點的多個限制性位點的多克隆位點(MCS)，如下所述。在說明性實施方式中，PE3MC-啟動子停靠載體20有三個克隆模塊21a、 21b和 21c，各自通過基因樞GP1、 GP2、 GP3和GP4結合，如本文所述。第二和第三克隆模塊表示為包含含有填充片段的核酸序列的填充模塊。
多克隆位點由五個克隆位點組成，它們依次是MC-l、MC-2、MC-3、MC-4、
MC-5和MC-6。任何兩個限制性位點可確定感興趣遺傳物質的停靠位置。在 PE3 MC停靠載體20a中，感興趣遺傳物質一般是啟動子結構域。可根據在PE3 MC停靠載體20a中這些限制性位點是獨特的這一理解來選擇兩個感興趣的克隆位點。
另一種實施方式包括PE3 MC-表達停靠載體，其中第二克隆模塊21b含有多克隆位點，其余第一和第三克隆模塊21a和21c含有填充片段，以及PE3 MC-3調控停靠載體，其中第三克隆模塊21c包含多克隆位點，其余第一和第二克隆模塊21a和21b含有填充片段。在其它另選實施方式中，三種克隆模塊中兩種可含有多克隆位點。
如上所述，在PE3停靠載體中，用感興趣遺傳物質亞克隆多克隆位點和將結構域模塊克隆到填充模塊中。
GP1、 GP2、 GP3和GP4基因樞相對于啟動子、表達和3'調控結構域模塊中各個模塊的位置如上所述。
本發明也提供了由模塊結構域載體和PE3模塊克隆載體制備PE3載體的方法。構建PE3模塊載體的第一種方法包括以下步驟
a) 提供含有PE3克隆模塊的PE3克隆載體，所述PE3克隆模塊依次包含含有至少兩個恒定的罕見限制性位點的第一基因樞，由含有填充片段的核酸序列組成的至少第一填充模塊，和第二基因樞；
b) 提供至少第一結構域模塊載體，其依次包含第一基因樞，由含有感興趣遺傳物質的核酸序列組成的感興趣遺傳模塊；和第二基因樞；
c) 提供第一基因樞罕見限制性位點之一的第一關聯限制性酶和第二基因樞罕見限制性位點之一的第二關聯限制性酶；
d) 用所述第一和第二關聯限制性酶由所述第一結構域模塊載體切下和分離感興趣遺傳模塊；
e訴所述第一和第二關聯限制性酶由所述PE3克隆載體的PE3克隆模塊切下第一填充模塊；和
f)將感興趣遺傳模塊連接到PE3克隆模塊中。
提供的PE3克隆模塊在第二基因樞后還依次包含第二填充模塊和第三基因樞時，該方法還包括以下步驟 g) 提供第二結構域模塊載體，其依次包含第二基因樞、由含有第二種感興趣遺傳物質的核酸序列組成的感興趣的第二遺傳模塊；和第三基因樞；
h) 提供第三基因樞罕見限制性位點之一的第三關聯限制性酶；
i) 用第二和第三關聯限制性酶由第二結構域模塊載體切下和分離感興趣的第二遺傳模塊；
j)采用第二和第三關聯限制性酶切下PE3克隆載體的PE3克隆模塊中的第
二填充模塊；和
k)將感興趣的第二遺傳模塊連接到PE3克隆模塊中。
相似地，可采用第三基因樞和關聯限制性酶將感興趣的第二遺傳模塊切下并連接到PE3克隆模塊中，從而將感興趣的第三遺傳模塊插入PE3中。該方法能將感興趣遺傳模塊連續安置到PE3克隆載體中。感興趣的第一、第二和第三遺傳模塊通常分別對應于啟動子模塊、表達模塊和3'調控模塊。在典型實施方式中，第一基因樞是GP1，第二基因樞是GP2，第三基因樞是GP3，第四基因樞是GP4，如上所述。
在另一實施方式中，提供了制備PE3克隆載體的方法，所述方法包括以下步驟
a) 提供具有主鏈的PE3克隆載體，所述主鏈至少包含第一、第二、第三和第四基因樞，這些基因樞以5'-3'方向連續(sequentially)排列，各自具有可通過操作被關聯限制性酶切割的至少兩個恒定的罕見限制性位點；
b) 用第一基因樞中恒定的罕見限制性位點之一的第一關聯限制性酶切割第一基因樞，產生3'端露出的切割的第一基因樞；
c) 用第二基因樞中恒定的罕見限制性位點之一的第二關聯限制性酶切割第二基因樞，產生5'端露出的切割的第二基因樞；
d) 提供含有5'端、感興趣的第一遺傳物質和第一基因樞3'端的第一結構域模塊，其中第一結構域模塊的5'端與切割的第一基因樞露出的3'端相容，第一結構域的3'端與切割的第二基因樞露出的5'端相容；和
e) 將第一結構域模塊和切割的PE3克隆載體放入合適的反應混合物中，以便使所述第一結構域模塊連接和自身定向到第一基因樞和第二基因樞之間的主鏈內，重新組裝所述主鏈。
該方法還可包括以下步驟
f) 隨后用第二關聯限制性酶切割第二基因樞，產生3'端露出的切割的第二基因樞；
g) 用第三基因樞的罕見限制性位點之一的第三關聯限制性酶切割第三基因樞，產生5，端露出的切割的第三基因樞；
h) 提供含有5'端、感興趣的第一遺傳物質和3'端的第二結構域模塊，其中第二結構域模塊的5'端與切割的第二基因樞露出的3'端相容，第二結構域模塊的3，端與切割的第三基因樞露出的5，端相容；和
i) 將第二結構域模塊和切割的PE3克隆載體放入合適的反應混合物中，以便使所述第二結構域模塊連接和自身定向到第二基因樞和第三基因樞之間的主鏈內，重新組裝所述主鏈。
該方法還可提供以下步驟
j)隨后用第三關聯限制性酶在第三基因樞上切割主鏈，產生3'端露出的切割的第三基因樞；
k)用第四基因樞的罕見限制性位點之一的第四關聯限制性酶切割第四基因樞，產生5'端露出的切割的第四基因樞；
1)提供含有5，端、感興趣的第三遺傳物質和3，端的第三結構域模塊，其中第三結構域模塊的5'端與切割的第三基因樞露出的3'端相容，第三結構域模塊的3'端與切割的第四基因樞露出的5'端相容；和
m)將第三結構域模塊和切割的PE3克隆載體放入合適的反應混合物中，以便使第三結構域模塊連接和自身定向到第三基因樞和第四基因樞之間的主鏈內，重新組裝所述主鏈。
感興趣的第一、第二和第三遺傳模塊通常分別對應于啟動子模塊、表達模塊和3'調控模塊。在典型的實施方式中，第一基因樞是GP1，第二基因樞是 GP2，第三基因樞是GP3，第四基因樞是GP4，如上所述。
多基因克隆載體
本發明的PE3停靠載體和MC停靠載體提供了容易和快速地組裝一個或多個感興趣的PE3轉基因的方法。本發明也提供了將一個或多個PE3模塊快
速和容易地插入模塊多基因載體中的方法。圖4顯示將PE3模塊插入含有一個或(如本文所述)多個PE3填充模塊的多基因停靠載體的簡化示意圖，其中不難釋放所述填充模塊，以便插入一個或多個PE3模塊。下文和圖16-21中更詳細地描述了多基因載體。
按照出現等級選擇本發明所用的限制性位點。為了確定限制性位點出現的頻率，用載體NTI軟件分析對應于19種不同基因的DNA序列信息。這種搜索總共覆蓋了 DNA序列中的110,530個核苷酸。按照所分析的110,530個核苷酸中限制性位點的出現次數計算這些分析的結果。然后按照四種分類指定這些限制性位點的等級，其中"常見"位點在每110,530個核苷酸中出現25次以上， "低頻6bp位點"在每110,530個核苷酸中出現6-24次，"罕見"位點在每110,530 個核苷酸中出現0-5次。按照其出現情況的分類，列出了"合適"酶的部分列表
常見限制性位點
合適的常見限制性酶可包括但不限于Ase I、 BamH I、 Bgl II、 Blp I、 BstX I、 EcoR I、 Hine II、 Hind III、 Nco I、 Pst I、 Sac I、 Sac II、 Sph I、 Stu I、 Xbal。
含有6 bp識別位點、但出現頻率較低的合適的限制性位點可包括但不限于Aarl、 AatII、 AflII、 Agel、 ApaL I、 AvrII、 BseA I、 BspD I、 BspEI、 BstBI、 Clal、 Eagl、 Eco0109 I、 EcoRV、 Hpal、 Kpnl、 Mfe I、 Narl、 Nde I、 NgoMIV、 Nhel、 Nsi I、 Pml I、 SexAI、 Smal、 Spel、 Xhol。
罕見限制性位點
合適的罕見酶可包括但不限于Acl I、 Nru I、 Pac I、 Pme I、 Sbf I、 Sfi I、 PI-Sce I、 I-Sce I、 I-Ceu I、 PI隱Psp I、 I-Tli I、 Fse I、 Sfo I 、 Asi SI、 Sgr Al、 Ascl、 Mlul、 SnaBI、 Not I、 Sal I、 Swal、 Rsr II、 Bsi WI、 AflIII、 Pvu I、 NgoMIV、 Asel、 Flpl、 Pme I、 Sdal、 Sgfl、 Srf I和Sse8781 1。
尋靶核酸內切酶
合適的尋靶核酸內切酶可包括但不限于I-Scel、 PI-Sce I、 I-Ceu I、PI-Psp I、 I-Chu I、 I-Cmoe I、 I-Cpa I、 I-Cpa II、 I-Cre I、 I陽Cvu I、 I-Dmo I、 ILlaI、 I-Msol、 I-Nanl、 I-Nitl、 I-Njal、 I-Pakl、 I-Porl、 I-Ppo I、 I-Scal、 I-Sce II、 I-Sce III、 ISce N、 I-Sce V、 I-Sce VI、 I誦Ssp68031、 I-Tev I、 I-Tev II、 I-Two I、 PI-Mga I、 PI畫Mtu I、 PIPfu I、 PI-Pfii II、 PI誦Pko I、 PI-Pko II、 PI-TfuI、 PI-TfuH、 PI-Thy I和PI-Tli
本發明實施方式詳述
PE3載體或轉基因的單個組分是啟動子增強子模塊(稱為"P")、表達的蛋白質模塊("E")和/或3'調控區模塊("3")，可作為模塊組裝，由結構域模塊(或"穿梭 ")載體轉移到PE3停靠載體(也可稱為停靠站點)的。圖5顯示了啟動子載體內的啟動子模塊，可將其切下并插入PE3停靠載體的預定停靠位置中。也如圖5 所示，如果需要較高的復雜性級別，那么可將組裝的PE3模塊轉基因或其它核苷酸序列轉移到多基因停靠載體(也稱為原始停靠站點質粒)或位點靶向性 (locus targeting)停靠載體中。分別更詳細地解釋五種類型的克隆載體質粒(啟動子模塊、表達模塊和3'調控模塊載體、PE3停靠載體和多基因載體)，以便說明摻入其中的組分。
結構域模塊停靠載體也稱為"穿梭載體"，其包含多克隆位點，所述多克隆位點一般含有常見限制性位點并側接于基因樞，所述基因樞一般包含罕見限制性位點和/或HE位點。由pUC19主鏈構建結構域模塊停靠載體，它對pUC19 主鏈進行了以下修飾，其中按照pUC 19 Genbank序列文件，登錄號L09137對該序列進行編號
1. 停靠質粒中只采用806-2617 (Afl3-Aat2)的序列，
2. pUC19中1729上的BspHl位點由TCATGA突變為GCATGA，
3. pUC19中1493上的Acll位點由AACGTT突變為AACGCT，
4. pUC19中1120上的Acll位點由AACGTT突變為CACGCT，
5. pUC19中的Ahdl位點由GACNNNNNGTC突變為CACNNNNNGTC，在上述突變步驟2之后，將編碼BspHl/I-Ppo 1/BspHl的序列插入pUC19
中剩余的唯一BspHl位點中。
在具體實施方式
中描述了本發明的三種單獨的穿梭載體啟動子模塊停靠
載體、表達模塊停靠載體和3'調控模塊停靠載體，它們分別稱為啟動子/內含子
穿梭載體("SVP")、表達穿梭載體("SVE")和3'調控穿梭載體("SV3")。下面更詳細地描述各載體。
穿梭載體P
圖IO中顯示了 SVP，它是可用于制備組裝到PE3停靠載體(轉基因構建物) 中的啟動子和內含子序列的克隆載體質粒，如上所述。
圖11顯示了 MCS中依次含有以下元件的SVP質粒的例子
1. 兩個恒定和獨特的常見限制性位點，它們限定了上述突變pUC19載體的5'插入位點(如AatII和Blpl)，
2. T7引物位點，
3. 能夠有效克隆T7引物位點下游的穿梭載體模塊的恒定和獨特的常見限制性位點(如EcoOl(M)，
4. 限定啟動子模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點的固定群(例如AsiSI 和SgrAI)，
5. 由在穿梭載體中獨特的常見或罕見限制性位點的任何群組成的可變 MCS(例如，圖ll所示的一系列限制性位點)，
6. 限定啟動子模塊3'部分的恒定的罕見限制性位點的固定群(如PacI、AscI 和Mlul)，
7. 能夠有效克隆T3引物位點上游的穿梭載體模塊的恒定和獨特的常見限制性位點(如BspEI)，
8. 反向T3引物位點，和
9. 限定上述突變的pUC19載體的3'插入位點的兩個恒定和獨特的常見限制性位點(例如Pmel和Sapl)。
在另一個例子中，限定啟動子模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點的固定群(GPl基因樞)包含AsiSI、 PacI和SbfI，限定啟動子模塊3'部分的罕見限制性位點(GP2基因樞)包含Fse I、 AscI和MluI。在一個更具體的例子中，GP1 基因樞由AsiSI、 Pacl和Sbfl的序列組成，GP2基因樞由Fsel、 AscI禾BMlu I的序列組成。
穿梭載體E (SVE)
圖12所示的SVE是可用于制備轉基因表達的序列，以便模塊化組裝到 PE3載體(轉基因構建物)中的克隆載體質粒，如本文所述。
圖13顯示了 MCS中依次含有以下元件的SVE質粒的例子
1. 兩個恒定和獨特的常見限制性位點，它們限定了上述突變pUC19載體的5'插入位點(如Blpl)，
2. T7引物位點，
3. 能夠有效克隆T7引物位點下游的穿梭載體模塊的恒定和獨特的常見限制性位點(如EcoO109I)，
4. 限定表達模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點的固定群(如PacI、 Ascl 和Mlul)，
5. 由在穿梭載體中獨特的常見或罕見限制性位點的任何群組成的可變 MCS(例如，圖13所示的一系列限制性位點)，
6. 限定表達模塊3'部分的恒定的罕見限制性位點的固定群(如SnaBI、Notl 和Sall)，
7. 能夠有效克隆T3引物位點上游的穿梭載體模塊的恒定和獨特的常見限制性位點(如BspEI)，
8. 反向T3引物位點，和
9. 限定上述突變的pUC19載體的3'插入位點的兩個恒定和獨特的常見限制性位點(如Pmel)。
在另一個例子中，限定表達模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點的固定群(GP2基因樞)包含Fsel、 AscI和MluI，限定表達模塊3'部分的罕見限制性位點(GP3基因樞)包含SnaB I、 Not I和Sal I。在一個更具體的例子中，GP2基因樞由Fse I、 Asc I和Mlu I的序列組成，GP3基因樞由SnaB I、 Not I和Sal I 的序列組成。
穿梭載體3 (SV3)
圖14所示的SV3是可用于制備3'調控序列，以便組裝到PE3載體(轉基因構建物)中的克隆載體質粒，如本文所述。
在圖15中，示例性SV3質粒的MCS中可依次包含以下元件
1. 兩個恒定和獨特的常見限制性位點，它們限定了上述突變pUC19載體的5'插入位點(如Blpl)，
2. T7引物位點，
3. 能夠有效克隆T7引物位點下游的穿梭載體模塊的恒定和獨特的常見限制性位點(如EcO0109I)，
4. 限定3'調控模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點的固定群(如SnaBI、 Notl和Sall)，
5. 由在穿梭載體中獨特的常見或罕見限制性位點的任何群組成的可變 MCS(例如，圖15所示的一系列限制性位點)，
6. 限定3'調控模塊3'部分的恒定的罕見限制性位點的固定群(如Swal、 RsrII和BsiWI),
7. 能夠有效克隆T3引物位點上游的穿梭載體模塊的恒定和獨特的非罕見限制性位點(如BspEI)，
8. 反向T3引物位點，和
9. 限定上述突變的pUC19載體的3'插入位點的兩個恒定和獨特的非罕見限制性位點(如Pmel)。
在另一個例子中，限定表達模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點的固定群(GP3基因樞)包含SnaB I、 Not I和Sal I，限定表達模塊3'部分的罕見限制性位點(GP4基因樞)包含Swal、 RsrII和BsiWI。在一個更具體的例子中，GP3 基因樞由SnaBI、Notl和Sail的序列組成，GP4基因樞由Swa I、Rsr II和BsiW I的序列組成。
圖6所示的PE3停靠載體(PE3停靠質粒)包含如上述例子所述修飾的 pUC19主鏈。
圖7所示的PE3停靠質粒中的多克隆位點(MCS)依次包含以下元件
1. 三個恒定和獨特的常見限制性位點，它們限定了上述突變pUC19載體的5'插入位點(如Aat II、 Blpl和EcoO109I)，
2. T7引物位點，
3. 第一獨特HE位點(例如，I-Scel(在本文中是正向))，
4. 一對恒定和獨特的常見限制性位點，它們側接于可用作染色質修飾結構域接受模塊(RNAS-CMD-1)的隨機核苷酸序列(如Kpn I和Avr 11)，
5. 限定啟動子模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點的固定群。在啟動子模塊5'端用作基因樞的恒定的罕見限制性位點的例子優選包括AsiS I、 Pacl和 Sfol，但也可包括PvuI、 AsiSI和SgrAI。
6. 可用作啟動子/內含子接受模塊(RNAS-P)的隨機核苷酸序列，
7. 限定啟動子/內含子模塊3'部分和表達模塊5'部分之間的共有連接的恒定的罕見限制性位點的固定群。在啟動子模塊3'端用作基因樞的恒定的罕見限制性位點的例子優選包括Fsel、 AscI和MluI，但也可包括Pacl.
8. 可用作表達接受模塊(RNAS-E)的隨機核苷酸序列，
9. 限定表達模塊3'部分和3'調控模塊5'部分之間的連接的恒定的罕見限制性位點的固定群(如SnaBI、 Notl和Sall)，
10. 可用作3'調控結構域接受模塊(RNAS-3)的隨機核苷酸序列，
11. 限定3'調控模塊3，部分的恒定的罕見限制性位點的固定群(如Swal、 Rsr II禾卩BsiW 1)，
12. —對恒定和獨特的常見限制性位點，它們側接于可用作染色質修飾結構域接受模塊(RNAS-CMD-2)的隨機DNA核苷酸序列(如Xho I和Nhe 1)，
13. 第二獨特的RE位點(與上述第3項中的位點(IScel)相同，反向)。然而，近期觀察到，如果兩個獨特的HE位點相同并反向，則可能發生不想要的重組。因此，優選采用不同于第一獨特HE位點的第二獨特HE位點。
14. 反向T3引物位點，和
15. 四個恒定和獨特的常見限制性位點，它們限定了上述突變pUC19載體的3'插入位點(如BspEI、 Pmel、 SapI和BspHI)。
在另一個例子中，限定啟動子模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點的固定群(GPI基因樞)包含AsiS I、 Pac I和Sbf I;限定啟動子模塊3'部分和表達模塊 5'部分的罕見限制性位點(GP2基因樞)包含Fsel、 Asc I和Mlu I;限定表達模塊3，部分和3'調控模塊5，部分的罕見限制性位點(GP3基因樞)包含SnaB 1、Not I和Sal I;限定3'調控模塊3'部分的罕見限制性位點(GP4基因樞)包含Swa I、
Rsr II和BsiWI。
在一個更具體的例子中，GPI基因樞由AsiS I、Pac I和Sbf I的序列組成， GP2基因樞由Fse I、 Asc I和Mlu I的序列組成，GP3基因樞由SnaB I、 Not I 和SalI的序列組成，GP4基因樞由Swal、 Rsr II和BsiW I的序列組成。
多基因停靠載體
圖16顯示了含有pUC19主鏈的多基因停靠載體，所述pUC19主鏈與PE3 停靠載體中的主鏈相同，除了還包含其它限制性位點，以產生側接載體主鏈模塊的模塊邊界。這些主鏈模塊包括復制宿主選擇物(RHS)基因模塊和復制起點基因模塊(ORI)。 RHS由載體主鏈樞(VII)Aat II(編碼復制宿主選擇物基因的 DNA序列)以及兩個其它的載體主鏈樞Age I和Avr II限定。圖16的RHS模塊由載體主鏈樞VB-l=Aat II、 RHS模塊=氨節青霉素抗性基因和載體主鏈樞 VB-2=Age I和VB-3=Avr II限定。ORI由載體主鏈樞Age I和Avr II(復制起點的DNA序列)以及載體主鏈樞Pme I限定。圖16的ORI模塊由載體主鏈樞 VB-2=Age I和VB-3=Avr II、 ORI模塊zpUC10復制起點和載體主鏈樞 VB-4=PmeI限定。
為了產生結構域接受區的多樣化陣列，通過準確安置隨機核苷酸序列和限定常見、罕見和尋靶核酸內切酶位點的非隨機核苷酸序列，確定多基因停靠載體。這些模塊接受區分為以下類型GHS、 BRD、 SRS、 CMD、 (CMD/BRD)、 PE3填充片段、PE3MCS。這些模塊的定義如下
A. GHS:基因組表達宿主選擇基因(如NEO或PURO)
B. BRD:可用作"能夠進行重組工程"的細菌細胞系中的同源重組位點的非隨機核酸序列
C. SRS:可用作位點特異性重組酶基因產物介導的位點特異性同源重組的位點的非隨機核酸序列(如Cre/Lox或Flp/Frt)
D. CMD:可改變宿主基因組的染色質結構的非隨機核酸序列(如HS4雞p 珠蛋白絕緣子)
E. CMD/BRD:編碼可用作在"能夠進行重組工程"的細菌細胞系中進行同源重組的DNA序列的染色質修飾結構域的非隨機核酸序列
F. PE3填充片段=不編碼限制性位點或多基因停靠載體內存在的任何其它功能的隨機核苷酸序列
G. PE3 MCS:由多基因停靠載體特有的多個限制性位點組成的非隨機核
苷酸序列
這些模塊側接于可用于制備模塊停靠載體的限制性位點。可按照以下分類確定這些連接于模塊的限制性位點
A. VB:限定載體主鏈模塊的邊界的限制性位點
B. ES:限定基因組表達宿主選擇模塊的邊界的限制性位點
C. TX-產生與特定罕見和尋靶核酸內切酶位點相容的突出端的合成 BstXI位點(如I誦CeuI， I-Scel， Sbfl)
D. CM-限定染色質修飾模塊的邊界的限制性位點
E. SB-限定位點特異性重組模塊的邊界的限制性位點
F. BI^產生鈍端的限制性位點
本發明的一個實施方式可由存在于載體主鏈樞VB-1和VB-5之間的核苷酸序列限定，其中VB-l=AatII， VB-5=BspEI。
1. VB-1是AatII
2. 無序列或隨機核苷酸序列
3. ES-l=SexAI
4. 隨機核苷酸序列填充片段(或GHS模塊)
5. ES-2=SrfI
6. 隨機核苷酸序列填充片段(或BRD模塊)
7. HE-3=I-PpoI
8. 隨機核苷酸序列填充片段(或SRS模塊)
9. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
10. CM-l=KpnI
11. 隨機核苷酸序列(或CMD模塊)
12. CM-2=SacI
13. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
14. TX-l-BstXI(I-CeuI)正向
15. 隨機核苷酸序列填充片段(或PE3模塊)
16. TX-2=Bst XI (I-Sce I)反向
17. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
18. CM-3=MfeI
19. 隨機核苷酸序列填充片段(或CMD模塊)
20. CM-4=SacII
21. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
22. GP- l=(AsiS I/Pac I/Sbf I)
23. 隨機核苷酸序列填充片段(或PE3模塊)
24. G-4/CM-5=(Swa I/Rsr II/BsiW I)
25. 隨機核苷酸序列填充片段(或CMD模塊)
26. CM-6=NarI，其含有與Kas I相同的基序
27. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
28. SB-l=NsiI，粘性突出端與SbfI相容
29. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
30. BL-l=SfoI
31. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
32. BL-2=PvuII
33. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
34. BL-3=NruI
35. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
36. SB-2=BsrGI，粘性突出端與BsiW I相容
37. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
38. CM-7=SpeI
39. 隨機核苷酸序列填充片段(或CMD模塊)
40. CM-8=SphI
41. 隨機核苷酸序列填充片段(或SRS模塊)
42. HE-4二PI-Scel(正向)
43. 隨機核苷酸序列填充片段(或BRD模塊)
44. VB-5=BspEI
圖17、 18和19說明采用常規的亞克隆方法如何將圖16中的多基因停靠載體用作DNA主鏈，以建立含有兩個或多個PE3模塊的多基因載體。根據多基因載體主鏈內已經包含的任何PE3模塊中不存在停靠載體中產生PE3接受結構域所需樞軸的統計學概率，這種建立含有三個不同PE3模塊的多基因載體的例子采用優選的亞克隆順序。
將PE3模塊亞克隆到圖16所示的多基因停靠載體中的優選順序如下 1.應該首先將PE3模塊亞克隆到PE3-2填充片段結構域中，應按照不存在以下位點的順序選擇此PE3模塊
1. Nsi I或BsrG I
ii. Sfol、 PvuII或NruI
iii. BstX I
2. 接著應將第二個PE3模塊亞克隆到PE3-3結構域中，應按照不存在以下位點的順序選擇此PE3模塊
iv. Sbfl或BsiWI
v. 單獨的Sbf I
vi. BsiW I
vii. BstX I
3. 應將第三個PE3模塊亞克隆到PE3-1結構域中
可采用兩種限制性酶消化而獨立地制備載體主鏈和PE3模塊，從而將滿足第1項所述標準的PE3模塊亞克隆到多基因停靠載體中，其中一種酶識別 GP-1結構域中的單個限制性位點，第二種酶識別GP-4結構域中的單個限制性位點。所選酶一定不能在PE3模塊內切割。圖17說明了這一方法的例子。將圖17所示PE3-A模塊亞克隆到PE3-2填充片段結構域中的一種方法需要通過酶AsiS I和Rsr II切割該多基因停靠載體而產生線狀載體主鏈。這種分子生物學方法產生含有AsiS I-特異性和Rsr II-特異性粘性突出端的DNA停靠點。也可采用AsiS I和Rsr II消化來制備含有所需PE3-A模塊的線狀DNA片段。可通過生化方法用DNA連接酶將得到的載體主鏈和PE3-A模塊連接在一起，產生含有PE3-A模塊的多基因載體。
圖18引入了一種方法，可將滿足第2項標準的PE3模塊亞克隆到含有 PE3-A模塊的多基因停靠載體中的PE3-3多克隆位點(PE3-3 MCS)上。在這個例子中，PE3-A模塊不含Nsi I或BsrG I位點(在圖16中分別標為SB-1和SB-2)， PE3-B模塊不含Sbf I或BsiW I位點。如圖18所示，用Sbf I和BsiW I消化 PE3-B模塊載體而產生線狀PE3-B模塊。通過Nsi I和BsrG I的消化制備線狀多基因載體主鏈。可通過生化方法采用DNA連接酶將PE3-B模塊和多基因載體主鏈的互補粘性末端連接在一起。得到的DNA分子由多基因載體組成，其中PE3-A和PE3-B模塊現在是DNA分子的毗連部分。
圖18僅代表將PE3模塊亞克隆到多基因停靠載體的PE3-3填充片段結構域中的許多方案之一。其它亞克隆方案包括產生顯示粘性/鈍性、鈍性/粘性或鈍性/鈍性停靠點的線狀PE3模塊和線狀多基因停靠載體。預計這些另選的亞克隆方案產生連接產物的成功率低于粘性/粘性方案。如果PE3-A或PE3-B模塊的結構不滿足第2項所列的一項或多項標準，則可選擇這些另選方案。
圖19說明了如何將PE3-C模塊亞克隆到含有PE3-A和PE3-B模塊的多基因載體中。這種方案需要PE3-A和PE3-B均不含BstXI位點。在這種方案中，通過BstX I消化使多基因停靠載體成為線狀。通過尋靶核酸內切酶I-Ceu I和 I-Sce I的消化使PE3-C模塊成為線狀。通過生化方法用DNA連接酶將得到的線狀PE3-C模塊和多基因停靠載體連接在一起。得到的DNA分子由多基因載體組成，其中PE3-A、 PE3-B和PE3-C模塊現在是DNA分子的毗連部分。
圖21說明了如何采用細菌重組工程方法將側接染色質修飾結構域(CMD) 或細菌重組工程結構域(BRD)的PE3模塊引入多基因停靠載體中。在這個例子中，PE3模塊通過側接PE3模塊載體的PE3模塊和多基因停靠載體的PE3-1 填充片段結構域的CMD/BRD結構域之間的同源重組取代了 PE3-1填充片段結構域。這種方案需要采用輔助性DNA載體或可通過環境(化學、溫度或代謝環境)改變而誘導重組酶表達的特殊細菌菌株。
圖16所示的本發明另一實施方式可由載體主鏈樞VB-l和VB-5之間存在的核苷酸序列限定，其中VB-l=AatII和VB-5=BspEI。
1. VB-1是AatII
2. 無序列或隨機核苷酸序列
3. ES-l=SexAI
4. 隨機核苷酸序列填充片段(或GHS模塊)
5. ES-2=SrfI
6. 隨機核苷酸序列填充片段(或BRD模塊)
7. HE-3=I-PpoI
8. 隨機核苷酸序列填充片段(或SRS模塊)
9. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
10. CM-l=KpnI
11. 隨機核苷酸序列(或CMD模塊)
12. CM-2=SacI
13. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
14. HE-l=I-CeuI正向
15. 隨機核苷酸序列填充片段(或PE3模塊)
16. HE-2=I-SceI反向
17. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
18. CM-3=MfeI
19. 隨機核苷酸序列填充片段(或CMD模塊)
20. CM-4=SacII
21. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
22. GP- l=(AsiS I/Pac I/Sbf I)
23. 隨機核苷酸序列填充片段(或PE3模塊)
24. G-4/CM-5=(Swa I/Rsr IIBsiW I)
25. 隨機核苷酸序列填充片段(或CMD模塊)
26. CM-6=NarI，其含有與Kas I相同的基序
27. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
28. TX-l=BstXI(I-CeuI)正向
29. SB-l=NsiI，粘性突出端與SbfI相容
30. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
31. BL-l=SfoI
32. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
33. BL-2=PvuII
34. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
35. BL-3=NruI
36. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
37. SB-2=BsrGI，粘性突出端與BsiW I相容
38. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
39. TX-2=Bst X I (I-Sce I)反向
40. 無序列或隨機核苷酸序列填充片段
41. CM-7=SpeI
42. 隨機核苷酸序列填充片段(或CMD模塊)
43. CM-8=SphI
44. 隨機核苷酸序列填充片段(或SRS模塊)
45. HE-4:PI-Scel(正向)
46. 隨機核苷酸序列填充片段(或BRD模塊)
47. VB-5=BspEI
圖20顯示了如何采用尋耙核酸內切酶將PE3模塊引入上述多基因停靠載體中。在這個例子中，通過尋靶核酸內切酶I-CeuI和I-Scel的消化使PE3模塊和多基因停靠載體成為線狀。可通過生化方法采用DNA連接酶將得到的線狀PE3模塊連接到線狀多基因停靠載體中。如果多基因停靠載體內或引入停靠載體的PE3模塊不滿足第1-3項所列的一項或多項標準，則可采用這種亞克隆方案。
可采用圖8所示多基因停靠載體(原始停靠質粒)組裝首先在PE3停靠站點質粒中構建的兩個完整的PE3轉基因，或者構建靶向基因(gene-targeting)的轉基因或引入兩種類型的陽性或陰性選擇元件所需的兩個同源臂。
多基因(或原始)停靠質粒中多克隆位點(MCS)的非限制性例子見圖9，其依次包含以下元件
1.限定上述突變的pUC19載體的5'插入位點的兩個恒定和獨特的常見限制性位點(如AatII和Blp 1)， 2. M13反向引物位點，
3. 反向側接DNA隨機核苷酸序列的一對獨特的HE位點，所述DNA隨機核苷酸序列可用作基因組表達宿主選擇基因接受模塊(RNAS-GEH-S1)(如 PI-SceI(正向)和PI-SceI(反向))，
4. 能夠克隆HE對下游的穿梭載體模塊的恒定和獨特的常見限制性位點 (如EcoO謹)，
5. 限定左重組臂模塊5，部分的恒定的罕見限制性位點的固定群(如SgrAI 和AsiS 1)，
6. 可用作左重組臂接受模塊的隨機核苷酸序列(RNAS-LRA)，
7. 限定左重組臂接受模塊3'部分的恒定的罕見限制性位點的固定群(如 Pacl、 MluI和AscI)，
8. 獨特的HE位點(如I-CeuI(正向))，
9. 側接DNA隨機核苷酸序列的一對恒定和獨特的常見限制性位點，所述DNA隨機核苷酸序列可用作染色質修飾結構域接受模塊(RNAS-CMD-1)(如 Kpnl禾卩AvrII)，
10. T7引物位點，
11. 一對反向的獨特BstXI位點(其中限定BstXI限制性位點中的可變核苷酸區的核苷酸與通過排列反向互補取向的兩個相同HE限制性位點產生的非互補性尾相同；例如，PI-SceI(正向)和PI-SceI(反向))側接DNA隨機核苷酸序列，所述DNA隨機核苷酸序列可用作復雜的轉基因接受模塊(RNAS-PE3-1)，
12. 側接DNA隨機核苷酸序列的一對反向的獨特HE位點，所述DNA 隨機核苷酸序列可用作復雜的轉基因接受模塊(RNASPE3-2)(如I-Scel(正向)和 I-Scel (反向))，
13. 反向T3引物位點，
14. 側接DNA隨機核苷酸序列一對恒定和獨特的常見限制性位點，所述 DNA隨機核苷酸序列可用作染色質修飾結構域接受模塊(RNAS-CMD-2)(如 XhoI禾口Nhe 1)，
15. 獨特的HE位點(在這里與上述第8項的位點(Iscel)相同，也是反向)，
16. 限定右重組臂模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點的固定群(如SnaBI、 SalI和NotI)，
17. 可用作右重組臂接受模塊的隨機核苷酸序列(RNAS-RRA)，
18. 限定右重組臂接受模塊3'部分的恒定的罕見限制性位點的固定群(如 RsrII、 SwaI和BsiWI)，
19. 能夠將穿梭載體模塊克隆到HE對上游的恒定和獨特的常見限制性位點(如BspE 1)，
20. 反向側接DNA隨機核苷酸序列的一對獨特的HE位點，所述DNA 隨機核苷酸序列可用作基因組表達宿主選擇基因接受模塊(RNAS-GEH-S2)(如 PI-Psp I(正向)和PI-Psp I(反向))，
21. 反向安置的M13正向引物位點，
22. 限定上述突變pUC19載體3'插入位點的三個恒定和獨特的常見限制性位點(如Pme I、 Sap I和BspH 1)。
作為實施本發明的方法例子，可構建含有這些元件的轉基因
1. 表面活性劑蛋白C(SP-C)的人啟動子的核苷酸序列，
2. 編碼小鼠基因粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子-受體(3-c(GMRI3c)的蛋白產物的序列
3. 兔P珠蛋白內含子序列，和
4. SV40聚A信號。
SP-C序列含有內部BamHI位點，可僅用Notl和EcoRl從母體質粒釋放。 GMR卩c含有內部Notl位點，可用BamHl和Xhol由母體質粒切下GMR(3c。可采用EcoRl從母體質粒上切下兔(3珠蛋白內含子序列。可用Xhol和Sacl 從其母體質粒上切下SV-40聚A尾。因為幾種限制性位點的冗余度，所有母體質粒均無法用于組裝所有所需片段。
在本發明PE3停靠質粒中構建所需轉基因所用的步驟如下
1. 由于Notl和PspOMl產生相容性粘性末端，所以用Notl和EcoRl切下人SP-C啟動子序列，并將其克隆到穿梭載體P的PspOMl和EcoRl位點中。此反應的產物稱為pSVP-SPC
2. 按照本領域技術人員熟知的增殖和回收步驟，將兔p珠蛋白內含子序列克隆到pSVP-SPC的EcoRl位點中。通過測序該產物，驗證得到的中間體構
建物中內含子的取向，為pSVP-SPC-rpG。
3. 用AsiSl和Ascl切下pSVP-SPC-rpG的啟動子和內含子，分離成一個毗連片段。同時，用AsiSl和Ascl切割PE3停靠質粒，以便與啟動子/內含子節段連接。將啟動子/內含子片段連接到停靠質粒中，增殖并回收。
4. 采用本領域技術人員熟知技術填滿GMRI3c片段的Xhol位點，產生鈍性3，端。然后將其克隆到pSVP-SPC-rpG的BamHl位點和鈍端Pvu2位點中。增殖和回收得到的質粒(pDPSPC-GMR卩c-r(3G)。
5. 最后的克隆步驟是加入SV-40聚A尾。用Xho 1和Sac 1切割SV40-聚A片段，對接受載體pDSl-SPC-GMRpc-rbpG進行同樣操作。凝膠純化并回收這兩種DNA。用摩爾比為10:1的SV-40聚A與pDSl-SPC-GMpc-rpG制備連接混合物。增殖并收獲連接產物。
新質粒pDSl-SPC-GMR|3c-rpG-pA含有轉基因所需的所有元件，包括3' 端的獨特限制性位點，通過它使整個pDSl-SPC-GMR卩c-rpG-pA質粒成為線狀，以便轉染到真核細胞中或顯微注射到受精卵原核中。
關于HE位點，通常將各自能夠被至少一種HE限制性酶切割的至少兩個 HE限制性位點安置在側接模塊區的位置，以便產生無法自身退火的基因盒接受位點。另外，如果需要，可能但不一定使這些HE位點互相反向得安置。艮P，因為HE位點不對稱并且無回文序列，可能通過反向安置兩個HE限制性位點產生非互補的3'粘性突出尾。例如，HEI-Scel切割其關聯限制性位點(如"/"所示)
5'.. .TAGGGAT AA/C AGGGTAAT. .3, 3'…ATCCC/TATTGTCCCATTA…5'
將第二位點反向安置在MCS內會產生兩種非互補的粘性突出尾 5'…TAGGGATAA CCCTA...3' 3'…ATCCC AATAGGGAT...5'
當載體中需要包含大的轉基因時，這特別有用。由于插入物較大，從熱力學角度看載體更易于自身退火，而非接受大插入物。通過安置HE限制性位點產生的非互補尾提供了有利的化學作用力，以抵消自身連接的熱力學傾向。
另外，與BstXI限制性酶位點(5'CCANNNNN/NTGG3')聯用時，大多數 HE突出尾的不對稱特性也產生了有力的克隆工具。可采用BstXI的序列-中性區("N"可以是任何核苷酸)產生兩個反向HE突出尾的相容性粘性末端，而防止自身退火。
BstXI(I-SceI正向)I-Scel正向I-Scel反向 BxtXI(I-SceI反向) 5'-CCAGATAA CAGGGTAAT〃ATTACCCTGTTAT GTGG-3' 3'-GGTC TATTGTCCCATTA〃TAATGGGAC AATACACC-5'
也可采用這些列表中未包括、但保持相同功能且屬于本發明構思和內涵的其它核酸內切酶。
在本發明的許多優點中，不難理解的是，可以在非常短的時間內快速組裝一般含有啟動子、表達和3'調控模塊的轉基因，以及快速和容易地改變或重新設計新組裝的轉基因。釆用己知方法改變組裝的轉基因的常規方式通常需要一年或更長時間的實驗室工作。采用本發明方法，可以在數天或數周內制備所需的轉基因，然后對其進行所需測試，從而為研究人員節省大量時間和花費。可將最初通過從頭合成、重組工程和PCR終止子突出端克隆法產生的穿梭載體用于本發明停靠點技術，以將這些預先制備的元件快速組裝到多個轉基因中。只要稍作改動或無需改動，即可將采用本發明產生的PE3轉基因用于單個生物體，或用于各種生物體，包括細菌、酵母、小鼠和其它真核生物。
雖然通過本發明實施方式介紹本發明，并且相當詳細地描述了這些實施方式，但它們不應局限或以任何方式限制所附權利要求書的范圍。本領域技術人員容易明白其它優點和修改。因此，廣義來看，本發明不僅限于顯示和描述的
具體細節、代表性方法和結構以及實施例。因此，背離這些細節并不一定背離本發明的權利范圍。
權利要求
1.一種由DNA克隆載體組成的結構域模塊停靠載體，其包含用于將感興趣遺傳物質亞克隆到多克隆(MC)模塊中的MC模塊，所述MC模塊包含a. 第一基因樞(GP)，其含有可通過操作限定MC模塊5′部分的至少兩個恒定的罕見限制性位點；b. 含有包括多個限制性位點的多克隆位點(MCS)的核酸序列，以便為將感興趣遺傳物質克隆到MC模塊中提供克隆位點，所述限制性位點選自結構域模塊停靠載體中獨特的常見限制性位點；和c. 第二基因樞，其含有可通過操作限定MC模塊3′部分的至少兩個恒定的罕見限制性位點。
2. 如權利要求1所述的結構域模塊停靠載體，其特征在于，所述第一基因樞和第二基因樞獨立地包含至少3個、不多于4個恒定的罕見限制性位點。
3. 如權利要求1所述的結構域模塊停靠載體，其特征在于，所述感興趣的遺傳物質選自啟動子結構域、表達結構域或3'調控結構域。
4. 如權利要求1所述的結構域模塊停靠載體，其特征在于，所述恒定的罕見限制性位點選自AsiSI、 Pacl、 Sbfl、 Fsel、 Ascl、 Mlul、 SnaB I、 Notl、 Sall、 Swal、 RsrII、 BSiWI、 Sfo I、 SgrAI、 AflIII、 Pvul、 Ngo MIV、 Asel、 Flpl、 Pmel、 Sdal、 Sgfl、 Srf I或Sse8781 I。
5. 如權利要求4所述的結構域模塊停靠載體，其特征在于，當所述感興趣遺傳物質是啟動子結構域時，所述第一組恒定的罕見限制性位點至少選自 AsiSI、 PacI或SbfI，所述第二組恒定的罕見限制性位點至少選自Fsel、 AscI或Mlul;當所述感興趣遺傳物質是表達結構域時，所述第一組恒定的罕見限制性位點至少選自Fsel、 AscI或MluI，所述第二組恒定的罕見限制性位點至少選自 SnaBI、 Not I或Sal I;和當所述感興趣遺傳物質是3'調控結構域時，所述第一組恒定的罕見限制性位點至少選自SnaB I、 Not I或Sal I，所述第二組恒定的罕見限制性位點至少選自Swal、 RsrII或BSiWI。
6. 如權利要求5所述的結構域模塊停靠載體，其特征在于，當所述感興趣遺傳物質是啟動子結構域時，所述第一組恒定的罕見限制性位點依次由AsiS I、 PacI和SbfI組成，所述第二組恒定的罕見限制性位點依次由FseI、 Asc I 和MluI組成；當所述感興趣遺傳物質是表達結構域時，所述第一組恒定的罕見限制性位點依次由Fse I、 Asc I和Mlu I組成，所述第二組恒定的罕見限制性位點依次由SnaB I、 Not I和Sal I組成；和當所述感興趣遺傳物質是3'調控結構域時，所述第一組恒定的罕見限制性位點依次由SnaB I、 Not I和Sal I組成，所述第二組恒定的罕見限制性位點依次由Swa I、 Rsr II和BSiW I組成。
7. —種由DNA克隆載體組成的PE3停靠載體，其包含含有多個克隆模塊的PE3克隆模塊，經構建該模塊可用于將多個結構域模塊克隆到PE3克隆模塊中，所述PE3克隆模塊包含a. 第一基因樞，其含有克隆后可通過操作限定啟動子模塊5'部分的至少兩個恒定的罕見限制性位點；b. 由含有填充片段的第一核酸序列組成的第一填充模塊，克隆后被啟動子模塊取代；c. 第二基因樞，其含有克隆后可通過操作限定啟動子模塊3'部分與表達模塊5'部分之間的共有連接的至少兩個恒定的罕見限制性位點；d. 由含有填充片段的第二核酸序列組成的第二填充模塊，克隆后被表達模塊取代；e. 第三基因樞，其含有克隆后可通過操作限定表達模塊3，部分與3'調控模塊5'部分之間的共有連接的至少兩個恒定的罕見限制性位點；f. 由含有填充片段的第三核酸序列組成的第三填充模塊，克隆后被3' 調控模塊取代；和g. 第四基因樞，其含有克隆后可通過操作限定3'調控模塊3'部分的至少兩個恒定的罕見限制性位點。
8. 如權利要求7所述的PE3停靠載體，其特征在于，所述第一基因樞和第二基因樞獨立地包含至少3個、不多于4個恒定的罕見限制性位點。
9. 如權利要求7所述的PE3停靠載體，其特征在于，所述恒定的罕見限制性位點選自AsiSI、 Pacl、 Sbfl、 Fsel、 Ascl、 Mlu I、 SnaB I、 Notl、 Sall、 Swal、 RsrII、 BSiWI、 Sfol、 SgrAl、 AflIII、 Pvul、 NgoMIV、 Asel、 Flp I、 Pmel、 Sdal、 Sgfl、 Srf I或Sse8781 I。
10. 如權利要求9所述的結構域模塊停靠載體，其特征在于，當所述感興趣遺傳物質是啟動子結構域時，所述第一組恒定的罕見限制性位點至少選自 AsiSI、 PacI或SbfI，所述第二組恒定的罕見限制性位點至少選自Fsel、 AscI或MluI;當所述感興趣遺傳物質是表達結構域時，所述第一組恒定的罕見限制性位點至少選自Fsel、 AscI或MluI，所述第二組恒定的罕見限制性位點至少選自 SnaBI、 NotI或Sail;和當所述感興趣遺傳物質是3'調控結構域時，所述第一組恒定的罕見限制性位點至少選自SnaB I、 Not I或Sal I，所述第二組恒定的罕見限制性位點至少選自SwaI、 RsrII或BSiWI。
11. 如權利要求10所述的結構域模塊停靠載體，其特征在于，當所述感興趣遺傳物質是啟動子結構域時，所述第一組恒定的罕見限制性位點依次由 AsiSI、 PacI和SbfI組成，所述第二組恒定的罕見限制性位點依次由FseI、 AscI和MluI組成；當所述感興趣遺傳物質是表達結構域時，所述第一組恒定的罕見限制性位點依次由FseI、 AscI和MluI組成，所述第二組恒定的罕見限制性位點依次由SnaB I、 Not I和Sal I組成；和當所述感興趣遺傳物質是3'調控結構域時，所述第一組恒定的罕見限制性位點依次由SnaBI、 NotI和SalI組成，所述第二組恒定的罕見限制性位點依次由Swa I、 Rsr II和BSiW I組成。
12. 如權利要求7所述的PE3停靠載體，還包含將所述PE3模塊插入多基因停靠載體的部件。
13. —種由DNA克隆載體組成的PE3多克隆(MC)停靠載體，其包含PE3 克隆模塊，經構建該模塊可用于將啟動子、表達和3'調控模塊克隆到PE3克隆模塊中，所述PE3克隆模塊包含a.第一基因樞，其含有克隆后可通過操作限定啟動子模塊5'部分的至少兩個恒定的罕見限制性位點；b. 第一核酸序列；c. 第二基因樞，其含有克隆后可通過操作限定啟動子模塊3'部分與表達模塊5'部分之間的共有連接的至少兩個恒定的罕見限制性位點；d. 第二核酸序列；e. 第三基因樞，其含有克隆后可通過操作限定表達模塊3，部分與3'調控模塊5'部分之間的共有連接的至少兩個恒定的罕見限制性位點；f. 第三核酸序列；和g. 第四基因樞，其含有克隆后可通過操作限定3'調控模塊3'部分的至少兩個恒定的罕見限制性位點；其中所述第一、第二和第三核酸序列中至少一個是包含多克隆位點(MCS) 的多克隆模塊，以便為將感興趣遺傳物質克隆到多克隆模塊中提供克隆位點，其余核酸序列是填充片段序列，所述多克隆位點(MCS)含有選自在PE3停靠載體中獨特的常見限制性位點的多個限制性位點。
14. 如權利要求13所述的PE3 MC停靠載體，其特征在于，所述第一核酸序列是多克隆模塊，所述第一基因樞至少選自AsiSI、 PacI或SbfI，所述第二基因樞至少選自Fsel、 AscI或MluI。
15. 如權利要求13所述的PE3MC停靠載體，其特征在于，所述第二核酸序列是多克隆模塊，所述第二基因樞至少選自Fsel、 AscI或MluI，所述第三基因樞至少選自SnaB I、 Not I或Sal I。
16. 如權利要求13所述的PE3 MC停靠載體，其特征在于，所述核酸序列是多克隆模塊，所述第二基因樞至少選自SnaB I、 NotI或SalI，所述第三基因樞至少選自SwaI、 RsrII或BSiWI。
17. 如權利要求13所述的PE3MC停靠載體，其特征在于，所述第一基因樞依次由AsiS I、 Pac I和Sbf I組成，所述第二基因樞依次由Fse I、 Asc I 和Mlu I組成，所述第三基因樞依次由SnaB I、 Not I和Sal I組成；所述第四基因樞依次由SwaI、 RsrII和BSiWI組成。
18. 如權利要求13所述的PE3MC停靠載體，還包含由所述PE3載體釋放PE3模塊，以插入多基因停靠載體的部件。
全文摘要
提供用于合成轉基因或其它復雜DNA構建物的一組模塊克隆載體質粒。可通過本發明，采用經優化減少頻繁需要的操作量的克隆載體將各種DNA片段組裝到從頭DNA構建物或轉基因中。模塊載體含有以線性方式排列的至少一個多克隆位點和多組罕見限制性位點和/或獨特的尋靶核酸內切酶(“H”)位點。這種排列方式限定了模塊結構，這種結構使得使用者能夠將結構域模塊或插入物放入PE3轉基因載體構建物、但不破壞在先克隆步驟中已摻入PE3的DNA元件的完整性。只要稍作改動或無需改動，即可將采用本發明產生的PE3轉基因用于單個生物體，或用于各種生物體，包括細菌、酵母、小鼠和其它真核生物。
文檔編號C12N7/00GK101370936SQ200680043379
公開日2009年2月18日申請日期2006年9月22日優先權日2005年9月22日
發明者J·F·周, T·里德申請人:英特瑞克斯頓股份有限公司

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