昆蟲抗性轉基因草坪草的制作方法

專利名稱：昆蟲抗性轉基因草坪草的制作方法
技術領域：
本發明包括一種轉基因草坪草，該種植物具有攻擊草坪草的某種昆蟲的 抗性。本發明也包括產生昆蟲抗性轉基因草坪草的方法。本發明還提供了 轉基因草的應用，來保護草坪使之免于昆蟲攻擊。
背景技術：
蘇云金芽胞桿菌是芽孢型，棒狀，革蘭氏陽性細菌，與所說的蠟樣芽胞 桿菌相近。我們發現了大量的蘇云金芽胞桿菌菌株，它們組成了蘇云金芽 胞桿菌亞種，如蘇云金芽胞桿菌，蘇云金芽胞桿菌庫斯塔克亞種，蘇云金
芽胞桿菌鲇澤亞種等等，這是根據最初由Bonnefoi和de Barjac于1963 年提出的分類方案來分類的。蘇云金芽胞桿菌在細胞內晶體的產生上，明 顯區別于其它的芽胞桿菌，這些晶體是不溶性蛋白質沉淀物，其中許多對 于不同種類的昆蟲具有殺蟲的活性。在孢子形成的過程中，蘇云金芽胞桿 菌合成大量這種蛋白質，然后這些蛋白質結晶成許多類型的晶體。
蘇云金芽胞桿菌中編碼這種晶體蛋白的基因，由于其晶體產生的表現型 被稱為"cry"。隨后被命名為crylAa的第一個cry基因是由Schn印f和 Whiteley約在20年前克隆的(1981， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78， 2893-2897)。此后，發表了許多其它的cry基因克隆的報告。
蘇云金芽胞桿菌產生了許多種晶體蛋白，其在對昆蟲的專一性是不同 的，甚至在一個菌株內也是不同的。大多數蘇云金芽胞桿菌產生晶體殺蟲 蛋白對于抵抗鱗翅類是很有效的。另外，有一種蘇云金芽胞桿菌菌株，它 能產生具有能抵抗雙翅目和鞘翅目類昆蟲的晶體殺蟲蛋白。在蘇云金芽胞桿菌的晶體蛋白中，己經知道Cry3， Cry7， Cry8， Cry9， Cry43對于抵抗 鞘翅目類昆蟲是有效的。其中，據報道Cry8Ca對于抵抗金龜子是有效的 (0hba et al. ， 1992， J. Appl. Microbiol. 14， 54-57) 。 2003年，Asano 等人(2003， Biological Control 28 (2003)， 191-196)發現了一種新的蘇 云金芽胞桿菌菌株，叫做SDS-502，它對于抵抗金龜子類的古銅麗金龜，東 方麗金龜，和豆金龜子顯示出非常高水平的有效性。豆金龜子， 一種日本麗 金龜，在美國有著特別的重要性。它偶然的被引入了美國，變成了一種對 于草地和公園植物種類如觀賞性植物嚴重有害的昆蟲。這種昆蟲的幼蟲食 草根，這會導致對草坪草的嚴重毀壞。成年日本麗金龜食不同的莊稼和包 括玫瑰和草莓類植物的觀賞植物。這個基因對于SDS-502菌株的高郁李抗 性是非常重要的，它已經被分離出來，被命名為cry8Da。編碼cry8Da這個 基因的蛋白質被發現具有抵抗日本麗金龜的高比活性，它至少是Cry8Ca和 Cry43Aa比活性的兩倍高，Cry8Ca和Cry43Aa是兩種其它的蘇云金芽胞桿 菌，它們具有日本麗金龜和其它甲蟲抗性的晶體蛋白。
最近，采用所選的蘇云金芽胞桿菌cry基因在莊稼植物中表達來進行昆 蟲防治。從表達crylAb基因的玉米和表達crylAc基因的棉花中獲得了技 術和商業上的成功。然而，據報道無論是轉基因草坪草還是觀賞植物都不 具有這種昆蟲抗性。有報道稱，經轉化的草坪草具有真菌抗性和除草抗性 (e.g., Cho， et al. ， 2000， Plant Cell R印orts 19, 1084-1089)，但是 沒有表明草坪草或觀賞植物的轉化。這是因為其中有許多未解決的難題。 例如，在高活性草坪草細胞中，高轉化率對于引入昆蟲抗性是非常重要的， 但是，技術上的難題阻礙了成功轉化草坪草細胞的進行。此外，高效率的 從轉化細胞再生成完整植物對于產生一個抵抗幼蟲和成年日本麗金龜的轉 基因草坪草和轉基因觀賞植物是也是具有決定性的。這兩點證明了產生一
9個完整的轉基因草坪草植物或完整的觀賞植物的過程中，存在一些嚴重的 技術上的困難，阻礙了過程的發展。
此外，技術上的困難還體現在產生可轉化植物細胞或愈傷組織上，缺乏一 個有效的昆蟲抗性基因，特別是一個高效抵抗圣甲蟲類昆蟲的基因，這個 困難是產生昆蟲抗性轉基因草坪草和其它觀賞植物另外一個主要的障礙。
本專利的一個申請者發現了蘇云金芽胞桿菌的一個cry基因，cry8Da，它 編碼一個對金龜子有高效抗性的蛋白質(參見U. S. Patent Application No. 20030017967，該文獻通過引用而被合并于此)。本發明克服了產生了具有 昆蟲抗性的轉基因草坪草技術上的困難，證明了昆蟲抗性可以引入草坪草， 接下來這種轉化的草坪草具有生長成具有昆蟲抗性的完整植物的能力。

發明內容
本發明包括一種轉基因草坪草，該種植物具有攻擊草坪草的某種昆蟲的 抗性。本發明也包括產生昆蟲抗性轉基因草坪草的方法。本發明還提供了 轉基因草的應用，來保護草坪使之免于昆蟲攻擊。
本發明采用了一種方法，這種方法能產生具有再生成完整草坪草植物的 能力的高效(可轉化)草坪草愈傷組織。
在另一個實施例中，提供了具有昆蟲抗性基因cry8Da轉基因草，這是 在蘇云金芽胞桿菌SDS—502菌株中發現的。
在一個實施例中，提供了不同的蘇云金芽胞桿菌昆蟲抗性基因，用來轉 化成活性草愈傷組織。這些蘇云金芽胞桿菌基因與抵抗不同昆蟲種類昆蟲 抗性作比較。cry8Da基因對于金龜子具有專一性，另一個蘇云金芽胞桿菌 基因crylCa與粘蟲復合物，如甜菜粘蟲的抗性作比較，在本發明中也發現 了其應用。
在另一個實施例中，提供了區別轉化草細胞和非轉化細胞的不同標記。
10在另一個實施例中，提供了一個含有昆蟲抗性基因的轉基因草坪草。這
個昆蟲抗性基因可以從蘇云金芽孢桿菌中獲得，例如，cry8Da是來自蘇云 金芽孢桿菌SDS502菌株。
在另一個實施例中，昆蟲抗性基因與選自南部蒙面金龜子，無斑金龜； 草坪草蒙面金龜子，多毛犀金龜和西北黑頭金龜子；六月或五月甲蟲，綠金 龜；玫瑰金龜子，薔薇鰓角金龜；歐洲金龜子，歐洲鰓角金龜子；棕色金龜 子,雌性金龜子；栗褐色金龜子,斑喙麗金龜；東方麗金龜，東方異麗金龜；日 本麗金龜，豆金龜子；大豆金龜子，紅銅麗金龜；綠金龜，古銅異麗金龜；黑 草坪草金龜,黑絨金龜；貪夜蛾，甜菜夜蛾；粘蟲,美洲粘蟲；土蠶,球菜夜蛾； 雜色地老虎,雜色夜蛾；顆粒地老虎，地老虎；紫苜蓿蛾,麥牧野螟；西方 菌苔蛾，西方草螟；和斯佩里菌苔蛾，斯佩里草螟中的昆蟲抗性作比較。
昆蟲抗性基因可以從對草坪草有害昆蟲致病的細菌中獲得。在一個實 施例中，這個基因可從選自蘇蕓金芽胞桿菌，日本甲蟲芽胞桿菌，如緩死 芽孢桿菌(Paenibacilluslentimorbus)，幼蟲芽孢桿菌菌株的微生物中獲得。
這種昆蟲抗性基因可編碼對昆蟲活性蛋白質，可從以下基因選擇， CrylAal, CrylAa2， CrylAa3， CrylAa4， CrylAa5， CrylAa6， CrylAa7， CrylAa8， CrylAa9， CrylAalO， CrylAall， CrylAal2， CrylAal3， CrylAal4， CrylAbl， CrylAb2， CrylAb3， CrylAb4， CrylAb5, CrylAb6， CrylAb7， CrylAb8， CrylAb9， CrylAblO， CrylAbll， CrylAbl2， CrylAbl3， CrylAbl4， CrylAbl5， Cry固6， CrylAcl， CrylAc2, CrylAc3, CrylAc4， CrylAc5， CrylAc6， CrylAc7， CrylAc8， CrylAc9， CrylAclO， CrylAcll， CrylAcl2， CrylAcl3， CrylAcl4， CrylAcl5， CrylAdl， CrylAd2， CrylAel， CrylAfl， CrylAgl， CrylAhl， CrylAil， CrylBal， CrylBa2， CrylBa3， CrylBa4, CrylBbl， CrylBcl， CrylBdl, CrylBd2， CrylBel， CrylBe2， CrylBfl，CrylBf2，CrylBgl，CrylCal，CrylCa2，CrylCa3，CrylCa4，CrylCa5，
CrylCa6，CrylCa7，CrylCa8，CrylCa9，CrylCalO，CrylCbl，CrylCb2，
CrylDal，CrylDa2，CrylDbl，CrylDb2，CrylEal，CrylEa2，CrylEa3，
CrylEa4，CrylEa5，CrylEa6,CrylEbl，CrylFal，CrylFa2，CrylFbl，
CrylFb2，CrylFb3，CrylFb4，CrylFb5,CrylGal，CrylGa2，CrylGbl，
CrylGb2,CrylGc，CrylHal，CrylHbl,Cryllal，Crylla2，Crylla3，
Crylla4，Crylla5，Crylla6，Crylla7,Crylla8,Crylla9，CrylIalO，
Cryllall，Cryllbl，Cryllcl，Cryllc2，Crylldl，Cryllel，Cryllfl，
Cryljal，Cryljbl，Cryljcl，Cryljc2，Cryljdl，CrylKal，Cry2Aal，
Cry2Aa2，Cry2Aa3，Cry2Aa4，Cry2Aa5,Cry2Aa6，Cry2Aa7，Cry2Aa8，
Cry2Aa9，Cry2Aal0，Cry2Aal1Cry2Abl，Cry2Ab2，Cry2Ab3，Cry2Ab4，
Cry2Ab5，Cry2Ab6，Cry2Acl，Cry2Ac2，Cry2Ac3，Cry2Adl，Cry2Ael，
Cry3Aal，Cry3Aa2，Cry3Aa3，Cry3Aa4，Cry3Aa5，Cry3Aa6,Cry3Aa7，
Cry3Bal，Cry3Ba2，Cry3Bbl，Cry3Bb2，Cry3Bb3，Cry3Cal，Cry4Aal，
Cry4Aa2，Cry4Aa3，Cry4Bal，Cry4Ba2，Cry4Ba3，Cry4Ba4,Cry4Ba5，
Cry5Aal，Cry5Abl，Cry5Acl，Cry5Bal，Cry6Aal，Cry6Aa2，Cry6Bal，
Cry7Aal，Cry7Abl，Cry7Ab2，Cry8Aal，Cry8Bal，Cry8Bbl，Cry8Bcl，
Cry8Cal，Cry8Ca2，Cry8Dal，Cry8Da2，Cry8Da3，Cry8Eal，Cry9Aal，
Cry9Aa2,Cry9Bal，Cry9Cal，Cry9Ca2，Cry9Dal，Cry9Da2，Cry9Eal，
Cry9Ea2，Cry9Ebl，Cry9Ecl， CrylOAal， CrylOAa2，(二rylOAa3，CryllAal，
CryllAa2,CryllAa3，CryllBal，CryllBbl， Cryl2Aal，Cryl3Aal，
Cryl4Aal，Cryl5Aal，Cryl6Aal，Cryl7Aal， Cryl8Aal，Cryl8Bal，
Cryl8Cal，Cryl9Aal，Cryl9Bal，Cry20Aal， Cry21Aal，Cry21Aa2，
Cry21Bal，Cry22Aal，Cry22Aa2，Cry22Abl， Cry22Ab2，Cry22Bal，Cry23Aal，Cry24Aal，Cry25Aal，Cry26Aal，Cry27Aal，Cry28Aal，
Cry28Aa2，Cry29Aal，Cry30Aal，Cry30Bal，，Cry31Aal，Cry31Aa2,
Cry32Aal，Cry32Bal，Cry32Cal，Cry32Dal，Cry33Aal，Cry34Aal，
Cry34Aa2，Cry3楊l，Cry34Acl，Cry34Ac2，Cry34Bal，Cry35Aal，
Cry35Aa2，Cry35Abl，Cry35Ab2，Cry35Acl，Cry35Bal，Cry36Aal，
Cry37Aal，Cry38Aal，Cry39Aal，Cry40Aal，Cry40Bal，Cry41Aal，
Cry41Abl，Cry42Aal， Cry43Aal， Cry43Bal， Cry楊a， Cry45Aa，Cry46Aa，
Cry47Aa， CytlAal， CytlAa2， CytlAa3， CytlAa4， CytlAa5， CytlAbl， CytlBal， Cyt2Aal， Cyt2Aa2， Cyt2Bal， Cyt2Ba2， Cyt2Ba3， Cyt2Ba4， Cyt2Ba5， Cyt2Ba6， Cyt2Ba7， Cyt2Ba8， Cyt2Ba9， Cyt2Bbl， Cyt2Bcl， Cyt2Cal， Vip3A(a) and Vip3A(b). and Vip3a(b)。
這種昆蟲抗性基因可從選自沙雷菌類，發光桿菌類和致病桿菌類的微 生物中獲得。這種沙雷菌類包括變形斑沙雷菌，嗜蟲沙雷氏菌，熒光假單 孢菌，嗜線蟲致病桿菌和伯氏致病桿菌。
這種昆蟲抗性基因可包括來自于蘇云金芽孢桿菌蓓蓓(buibui)菌株 的cry8Ca基因，來自于日本甲蟲芽胞桿菌或蘇云金芽孢桿菌crylCa基因 的cry43A基因。
本發明進一步指出了通過將一種或多種昆蟲抗性基因引入到草坪草 中，來減少或消除任何噴射到草坪草上化學或生物上殺蟲劑的方法。
這種轉基因草坪草可以選自堿地鼠尾粟(Sporobolus airoides); 窄穎賴草(Leymus angustus) ^ 多花黑麥草(Xolium multiflorum) 5 百 喜草(Paspalum notatum);披堿草雜交的大麥(Elyhordeum);狗牙根 (Cynodon dactylon) 須芒草(AndropogorO ;雀麥(Bromus) 5黍(Panicum miliaceum);岡!j夷竹(Microstegium);養麥(Eriogonum);野牛草(Buchloe
13dactyloides) 喜濕薦草(Phalaxis叫uatica) 5力口州雀麥 (California brome);阿拉斯加雀麥(Bromus sitchensis);加拿大早熟禾(Poa compressa); 金黃草(Phalaxis); 紫羊茅(Festuca rubra); 草
(Echinochloa) 5剪股穎(rostis tenuis) 5大麥(Hordeum vulgare); 小麥(Triticum aestivum);匍每剪股穎(Agrostis stolonifera); 蘋 狀看麥娘(Alopecurus arundinaceus);扁禾惠冰草(Agropyron cristatum); 披堿草(Elymus dahuricus); 毛花雀稗(Paspalum dilatatum);羊茅
(Festuca); 絲狀疣羊茅(Festuca filiformis);糝子(Eleusine coracana) 鴨茅狀磨擦禾(Tripsac咖)5甜高粱(Sorghum bicolor); 牧草(Bouteloua); 無芒雀麥(Bromus stamineus) 硬羊茅(Festuca trachyphylla);假高粱(Sorghastrumnutans) 5中間偃麥草(Thinopyxum intermedium); 食用稗(Echinochloa esculenta); 草地早熟禾 (Poa pratensis) 5 狼尾草(Pennisetum clandestinum) ^ 雜色黍(Panicum coloratum); 知風草(Eragrostis); 多毛雀麥Bromus coramutatus); 牛尾草(Festuca pratensis); 草原看麥娘(Alopecurus pratensis); 草地黑麥草(Lolium pmtense);粟草(Milium);燕麥(Avena);鴨 茅(Dactylis glomerata); 黑黍(Pennisetum americanum); 多年生黑 麥草(Lolium perenne) 5 草原草(Bromus wildenowii) 5 北美草原牧 草(Koeleria macrantha) 5 鼠尾羊茅(Vulpia myuros);紫羊茅(Festuca rubra);小糠草(Agrostis gigantea);哈定草(Phalaris axundinacea); 粗蓮早熟禾(Poa trivialis) 5 高冰草(Thinopyrum ponticum) 5俄羅 斯新麥草(Psathyrostachys juncea); 黑麥(Secale cereale); 黑麥 草(Lolium) 5 羊茅(Festuca ovina); 紫羊茅(Festuca rubra) 5 籽 粒莧(Bromus inermis);雙色高粱(Sorghum bicolor);河邊冰草(Elymuslanceolatus);蘇丹草(Sorghum bicolor);賴卩枝稷(Panicum virgatum); 高羊茅(Xolium arundinaceum); 高燕麥草(Arrhenatherum elatius) 5 長穗偃麥草(Thinopy羅ponticum); 貓尾草(Phleum pratense);小 黑麥(Triticosecale rimpaui); 發草(Deschampsia caespitosa); 藍莖冰草(Pascopyrum smithii); 小麥(Triticum);芽草(Agropyron) 和披堿草(Elymus)。
在另一個實施例中，產生昆蟲抗性草坪草的方法包括a)將包含一個 或多個昆蟲抗性基因的一個或多個質粒引入一個或多個草坪草愈傷組織， 其中所述的愈傷組織是轉化物；b)培養愈傷組織；c)愈傷組織生長為成 熟的草坪草；d)測試成熟草坪草的昆蟲抗性。
詳細說明
A發明概況
本發明提供了來自不同桿菌微生物如來自蘇云金芽孢桿菌SDS-502菌 株的cry8Da基因的昆蟲抗性基因轉化而來的轉基因草坪草和觀賞植物。最 終轉化的草坪草和觀賞植物具有了昆蟲捕食抗性。本發明還提供了來自于 桿菌微生物如由SDS—502菌株的cry8Da基因的昆蟲抗性基因轉化而來的 草坪草和觀賞植物的方法。
殺蟲晶體蛋白如cry8Da是大量蛋白的聚集物(約130 149k道爾頓)， 實際上，它是一個原毒素，它必需經過活化才能起作用。在正常條件下， 這個晶體蛋白是高不溶解的，所以一般來講，它對人類，高等動物和大多 數昆蟲是安全的。然而，在高PH (約^=9.5以上)的還原條件下，它是 可溶的，這個條件通常存在于鱗翅類幼蟲的中腸中。因此，蘇云金芽孢桿 菌的晶體蛋白是高度專一的殺蟲劑。
一旦它在昆蟲的腸中溶解，這個原毒素由腸蛋白酶分開生產約60k道爾頓的活性毒素。這個毒素術語叫A-內毒素。它連接中腸上皮細胞，在細
胞膜上產生小孔來保持離子平衡。因此，腸道迅速被固定化，上皮細胞溶 解，幼蟲停止生長，經由血液PH平衡，腸道PH降低。
轉基因植物如由編碼殺蟲蛋白的基因如cry8Da基因轉化的草坪草和觀 賞植物通過表達這個晶體蛋白來抵抗昆蟲侵襲和捕食以得到保護，晶體蛋 白的作用與晶體蛋白作為植物生物殺蟲劑的外源應用是一樣的。這樣，昆 蟲抗性與轉基因植物作比較，結果表明，野生植物很正常的成為昆蟲喜歡 捕食的目標。
B常規技術
本發明的實踐應用除了特別指出的，將廣泛應用分子生物學，微生物 學細胞生物學，生物化學和免疫學的常規技術，這些在技術的技能之內。 這些技術在文獻中已經完全解釋說明了，例如，在細胞生物學中實驗手 冊(J.E. Cellis， ed.， 1998);分子生物學最新實驗指導(F. M. Ausubel et al.， eds， 1987); 分子生物學精編實驗指南(Wiley and Sons， 1999)。 此外，商業上采用的測試試劑盒和試劑的實驗操作完全根據實驗冊規定的 操作方法來操作，除了特別指出的。
C定義
此處采用的"外源DNA片段"，"異源序列"，"異源核苷酸"或"異 源基因"是來自于與特定宿主細胞或生物體不同的來源，或者說，如果來 自于相同的來源，多聚核苷酸或氨基酸序列就要被修改。因此， 一個宿主 細胞或生物體的異源基因包括特定宿主細胞的一個內源基因，但是它必需 來自于不同的來源或者被修改。本發明異源序列的修改是通過不同DNA片 段連接到一起來構建一個異源基因。或者是一個異源基因可由核苷酸合成 來產生。這個術語指的是一個DNA片段，這個片段是細胞外來的或異源的，或細胞同源的，或在通常不存在元素的宿主細胞核苷酸內的一個異源和同
源基因序列的聯合體。當外源DNA片段被表達時，它們產生外源多肽。
術語"基因"被廣泛應用，指的是與生物體功能有關的任何DNA片段。 基因包括需表達的編碼序列或調節序列，還有具有組合功能的序列，如本 發明中的例子，兩個基因經由一個連接序列合并來構建一個單個新基因， 這個基因具有許多復雜的生物功能。基因也包括非表達的DNA片段，這片 段具有許多種表達如其它蛋白質的識別序列基因的功能。基因可由許多種 來源來獲得，包括目的基因的克隆，如任何活體，或由已知或推測序列信 息合成，還包括根據所希望獲得的特性來設計的人工序列。
術語"轉基因"，當它用于描述一個細胞或多細胞生物體時，指的是 這個細胞或生物體復制了一個異源核苷酸或表達了由異源核苷酸編碼的一 個肽或蛋白質。轉基因細胞或生物體可含有細胞本身(非重組體)不存在 的基因。轉基因細胞和生物體除了被修改和由人工方式再導入的基因還可 以含有細胞或生物體本身就有的基因。這個術語也包含了含有以不將核苷 酸從細胞或生物體移除的形式修改的細胞內源性核苷酸的細胞或生物體； 這種修改包括由基因替代，定點變異和相關技術來獲得。
術語"昆蟲抗性"意思是與抵抗有害昆蟲攻擊(例如，細胞或多細胞 生物體的昆蟲侵襲或昆蟲捕食)相對照的一種基因，細胞或多細胞生物體 的一種特性。這種特性包括殺蟲，擊退昆蟲和抑制昆蟲捕食的能力。在昆 蟲抗性的例子中，包括的特性有由于植物產生的一種或多種昆蟲活性(例 如，殺蟲的或昆蟲頓態)復合物，或由植物產生的一種或多種驅蟲劑或喂 食抑制劑復合物，有害昆蟲不以植物為食。
術語"昆蟲活性"在此的意思是一種具有殺蟲，抵抗昆蟲或抑制昆蟲 喂食能力的基因，這是蛋白質的一種特性。它指的是對某種昆蟲具有非常高的專一性或者具有一個廣普的活性。在廣譜昆蟲活性基因或蛋白的例子 中，這種活性指的是植物能以許多種昆蟲種類為目標或者說對這些昆蟲具 有抵抗的活性，甚至對于非昆蟲類如蜘蛛也有抵抗的活性，但是它必需具 有抵抗某種種類昆蟲的能力，這是本發明預期到達的目標，使得草坪草和 觀賞植物免于昆蟲的攻擊。 D本發明的方法和應用
本發明涉及到具有有害昆蟲抗性的轉基因草坪草的生產和應用。
采用一些不同的方法，本發明產生了許多具有很強抵抗金龜子攻擊轉
基因草坪草的能力，但是本發明的方法和應用并不是有限的，它還適用于
其它適合的昆蟲抗性基因轉化的草坪草對有害昆蟲的控制。
為了產生昆蟲抗性轉基因草坪草，申請者改善了產生轉化草坪草愈傷
組織的效率和由轉化的愈傷組織再生成完整植物的效率。申請者開展了不
同培養條件的廣泛調査，發現高效率產生一些昆蟲抗性轉基因片段活性愈
傷組織的一些條件。為了產生昆蟲抗性轉基因草坪草，申請者采用了以一
個合理的速率產生高效活性能再生的草愈傷組織的條件。申請者的沒有轉 基因草具有昆蟲抗性活性的實驗和事實指出可以再生成完整植物的高活性
(例如，可轉化的)草坪草愈傷組織的誘導是一個重要的突破。
在一個實施例中，采用兩個載體來轉化活性草坪草。在一個載體中，
pBI221， 一個昆蟲活性基因連同花椰菜花葉病毒35S啟動子和根癌農桿菌 Ti質粒胭脂堿合成酶終止子一起被克隆。應當注意，除了 pBI221以外，許 多載體可以在它們整合到宿主植物基因的時候采用，這個在載體中被克隆 的昆蟲抗性基因具有一個適合的啟動子和終止子。任何一個轉化載體的適 當選擇都可以由人們采用技術中的 一般技能來完成。
多數的啟動子對于表達轉基因植物中的一個基因是有用的。技術中熟練的技工就可以從已知的數據庫中獲得有用的植物啟動子。例如，植物 CARE : 植物啟動子和順式調控元件的數據庫在
http:〃sphinx. rug. ac. be:8080/PlantCARE/網頁中有最近的明細。 (Lescot, et al. ， 2002， Nucl. Acids Res. ， 30， 325-327)
在轉基因植物中表達的昆蟲抗性基因可以是一個結合蛋白。例如，原 生質體靶向引導序列可添加到昆蟲抗性蛋白中來。或者說，昆蟲活性蛋白 可由chroloplast靶向序列結合來使基因在chroloplast中表達。
在另一個實施例中，采用了兩個載體包括PBI221，另外一個載體，GFP (綠色熒光蛋白)基因與相同的35S啟動子和N0S終止子一起被克隆。這 兩個載體混合起來覆蓋金粉。覆蓋金粉的DNA由基因槍注射到活性草細胞 中。顯示出綠色熒光的轉化的草細胞被切開，進一步培養直到生長成完整 植物體。在這個例子中，GFP作為一個"報道"基因。當轉化發生時，它由 綠色熒光蛋白報道。報道基因另一個例子是gus基因。文獻報道的大腸桿 菌(EC 3.2.1.31)的葡糖苷酸酶(GUS)在轉化植物中，能夠作為標記基 因提供期望的特性。Gus基因和其它報道基因對于技術上熟練的人們來說是 相當了解了。
本發明不僅僅局限于選擇轉化草細胞的GFP報道基因。在另一個例子 中，采用了雙丙氨膦除草劑抗性基因(bar)。這個方法也產生了一個昆蟲 抗性草片段。這是一個采用選擇基因的例子。只有轉化草細胞可以在專門 的組織培養基中生存(因此所選擇)。其它可以用來產生昆蟲抗性轉基因 草的除草劑抗性基因包括草甘磷抗性(例，3-烯酰(基)丙酮酸莽草酸5-磷 酸酶)基因，溴草腈抗性(例，溴草腈水解酶)基因，磺胺類藥物抗性(例， 二氫蝶酸合酶)基因，和磺脲類抗性(例，乙酰乳酸合酶)基因。此外， 抗生素抗性基因例如卡那徽素和均霉素抗性基因也可以采用。另一方面，
19代謝相關的基因也可釆用來選擇轉化草細胞。例如，編碼磷酸甘露糖異構
酶的大腸桿菌的manA基因(Miles et al.， 1984， Gene 32, 41-48)可以轉 化甘露糖-6-磷酸為果糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸接下來可被植物細胞利用。 當被放入含有唯一糖原甘露糖的培養基中時，非轉化細胞又轉化細胞過渡 生長。植物轉化中這些選擇標記基因的采用對于技術中般熟練的技工是熟 知的。
在本發明中，采用基因槍技術轉化活性草坪草愈傷組織，在下文的例 子中有敘述。此外，也采用農桿菌介導，花器浸蘸法，原生質體和電穿孔 轉化技術方法。這些轉化方法對于技術中般熟練的技工是熟知的。
再生的完整的植物被移植到盆栽的泥土中來接收受日本麗金龜幼蟲的 攻擊。日本麗金龜幼蟲選擇性的捕食那些缺乏昆蟲抗性的植物(例如，那 些沒有被適合的昆蟲抗性基因轉化的植物)，但是它并不捕食那些由適合 昆蟲抗性基因轉化的植物(見下文)。比較昆蟲保護的水平，由昆蟲抗性 基因轉化為草坪草的昆蟲保護水平與采用非轉化草坪草植物的化學殺蟲劑 (倍硫磷)獲得的保護水平一樣高。
在另一個例子中，本發明證明了申請者的方法可以產生兩個其它草類 的昆蟲抗性轉基因片段，茅花黑麥草和多年生黑麥草。
昆蟲抗性草可由任何下面的草類來獲得。盡管是非限制性的，適當的 列出其一般的名字和拉丁文名字，如下堿地鼠尾粟(Sporobolus airoides); 窄穎賴草(Leymus angustus); 多花黑麥草(Lolium multiflorum); 百喜草(Paspalum notatum); 大麥(Elyhordeum); 狗牙根(Cynodon dactylon); 須芒草(Andropogon); 雀麥(Bromus); 泰(Panicummiliaceum); 剛夷十亇(Microstegium); 養麥(Eriogonum); 野牛草(Buchloe dactyloides); 喜濕藹草(Phalaris叫uatica) 5 力口
20州雀麥 (California brome)， 阿拉斯力口雀麥(Bromus sitchensis); 力口 拿大早熟禾(Poa compressa); 金黃草(Phalaris); 紫羊茅(Festuca rubra); 稗草(Echinochloa); 剪股穎(rostis tenuis) 5 大麥(Hordeum vulgare); 小麥(Triticum aestivum); 匍匍剪股穎 (Agrostis stolonifera); 華狀看麥娘 (Alopecurus arundinaceus); 扁穩冰 草(Agropyron cristatum) 5 披堿草(Elymus dahuricus); 毛花雀稗
(Paspalum dilatatum); 羊茅(Festuca); 絲狀疣羊茅(Festuca filiformis); 糝子(Eleusine coracana); 甲鳥茅狀磨擦禾(Tripsacum); 甜高粱(Sorghum bicolor); 牧草(Bouteloua); 無芒雀麥(Bromus stamineus) 5 硬羊茅(Festuca trachyphylla) 5 假高粱(Sorghastrum nutans) 5 中間偃麥草(Thinopyrum intermedium) 5 食用稗(Echinochloa esculenta) 5 草地早熟禾 (Poa pratensis) ^ 狼尾草(Pennisetum clandestinum); 雜色黍(Panicum coloratum); 失口風草(Eragrostis); 多毛雀麥Bromus commutatus); 牛尾草(Festuca pratensis); 草原 看麥娘(Alopecurus pratensis); 草i也黑麥草(Loliumpratense); 粟 草(Milium);燕麥(Avena);鴨茅(Dactylis glomerata); 黑黍
(Pennisetum americanum) 5 多年生黑麥草(Xolium perenne) 5 草原 草(Bromus wildenowii) ^ 北美草原牧草(Koeleria macrantha) 5 鼠 尾羊茅(Vulpiamyuros); 紫羊茅(Festuca rubra); 小糠草(Agrostis gigantea) 5 哈定草(Phalaxis arundinacea) 5 禾且蓬早熟禾(Poa trivialis); 高冰草(Thinopyrum ponticum); 俄羅斯新麥草
(Psathyrostachys juncea) 5 黑麥(Secale cereale) 5 黑麥草(Xolium); 羊茅(Festuca ovina); 紫羊茅(Festuca rubra); 籽粒莧(Bromus inermis );雙色高粱(Sorghum bicolor); 河邊冰草(Elymuslanceolatus); 蘇丹草(Sorghum bicolor) 5 柳枝稷(Panicum virgatum); 高羊茅(Lolium arundinaceum); 高燕麥草(Arrhenatherum elatius); 長穗偃麥草(Thinopyrum ponticum); 貓尾草(Phleum pratense); 小 黑麥(Triticosecale rimpaui); 發草(Deschampsia caespitosa); 藍 莖冰草(Pascopyrum smithii ); 小麥(Triticum); 芽草(Agropyron); 和披堿草(Elymus)。
一旦具有昆蟲抗性特性的一個轉基因草片段產生，這個特性可以由雜 交技術轉移到其它草片段中，這些對于技術中一般熟練的技工是熟知的。
本發明的另一方面，草坪草的昆蟲抗性由蘇云金芽孢桿菌昆蟲活性毒 素來完成，如下文的例子所述。在這個例子中，采用一個編碼cry8Da蛋白 的蘇云金芽孢桿菌基因cry8Da。這個基因被克隆到一個載體中，用來轉化 來自于茅花黑麥草和多年生黑麥草活性草細胞。為了產生抵抗金龜子的草 坪草，可采用除cry8Da外的蘇云金芽孢桿菌昆蟲活性基因。例如，可采用 cry8Da， cryl8' s和cry43Aa。這些基因可以由蘇云金芽胞桿菌日本亞種 (cry8Ca)和日本甲蟲孢子桿菌，如，緩死芽孢桿菌(cryl8's和cry43Aa) 分離出來。另一個例子說明了在轉化載體中怎樣克隆cry43Aa。這些基因屬 于蘇云金芽孢桿菌cry基因種類，盡管一些來自于非蘇云金芽孢桿菌(例 如cry18禾口 cry43Aa)。
其它有效抵抗金龜子的微生物的毒素包括那些來自于其它桿菌如幼蟲 芽孢桿菌和來自于非桿菌細菌的。例如，沙雷菌屬某種，如變形斑沙雷菌 和嗜蟲沙雷氏菌(Hurst et al. ， 2004， J. Bacteriol. 186， 5116-5128); 發光桿菌，如熒光假單孢菌；(Hurst et al. ， 2004， J. Bateriol. 186， 5116-5128， and Bowen et al. ， 1998， Science, 280, 2129—2132)，和 致病桿菌如嗜線蟲致病桿菌和伯氏致病桿菌(Brillard et al.， 2001， Appl.Environ. Microbiol" 67， 2515-2525)，這些是已知的用來產生對昆蟲致 病的蛋白，在本發明中打算采用。
申請者發明的范圍不僅僅局限于金龜子。貪夜蛾和甜菜夜蛾是很有害 的草坪草害蟲。采用本發明的方法，鱗翅類的昆蟲抗性可被導入到草坪草
中。這個昆蟲活性基因可從蘇云金芽孢桿菌中分離出來，并在草坪草中表 達來產生一種或多種昆蟲活性蛋白。例如，本發明打算采用下面的蘇云金
芽孢桿菌昆蟲活性蛋白，包括::CrylAal，CrylAa2，CrylAa3，CrylAa4，
CrylAa5，CrylAa6，CrylAa7， CrylAa8， CrylAa9， CrylAalO，CrylAal 1，
CrylAal2，CrylAal3， CrylAal4， CrylAbl，CrylAb2，CrylAb3，CrylAb4，
CrylAb5,CrylAb6，CrylAb7， CrylAb8， CrylAb9， CrylAbl0，Cry固l，
Cry固2，CrylAbl3,,CrylAbl4,Cry脂5， CrylAbl6，CrylAcl，CrylAc2，
CrylAc3，CrylAc4，CrylAc5，CrylAc6，CrylAc7，CrylAc8，CrylAc9，
Cry 1 Ac 10，CrylAcll,,CrylAcl2，CrylAcl3，CrylAcl4，CrylAcl5， CrylAdlCrylAd2，CrylAel，CrylAfl，CrylAgl，CrylAhl，CrylAil，CrylBal，
CrylBa2，CrylBa3，CrylBa4，CrylBbl，CrylBcl，CrylBdl'CrylBd2，
CrylBel，CrylBe2，CrylBfl，CrylBf2，CrylBgl，CrylCal，CrylCa2，
CrylCa3，CrylCa4，CrylCa5，CrylCa6，CrylCa7，CrylCa8，CrylCa9，
CrylCalO，CrylCbl，Cry脂，CrylDal，CrylDa2,CrylDbl，CrylDb2，
CrylEal，CrylEa2，CrylEa3，CrylEa4，CrylEa5，CrylEa6，CrylEbl,
CrylFal，CrylFa2，CrylFbl，CrylFb2，CrylFb3，CrylFb4，CrylFb5，
CrylGal，CrylGa2，CrylGbl，CrylGb2，CrylGc，CrylHal,CrylHbl，
Cryllal，Crylla2，Crylls3,Crylla4，Crylla5，Crylla6，Crylla7，
Cryl風Crylla9，Crylla10，Cryllall，Cryllbl，Cryllcl，Cryllc2，
Crylldl，Cryllel，Cryllfl，Cryljal，Cryljbl，CrylJ"cl，Cryljc2，
23Cryljdl,Cry歸，Cry2Aal，Cry2Aa2，Cry2Aa3，Cry2Aa4，Cry2Aa5，
Cry2Aa6，Cry2Aa7，Cry2Aa8，Cry2Aa9，Cry2Aal0，Cry2Aal1,Cry2Abl，
Cry2Ab2，Cry2Ab3，Cry2Ab4，Cry2Ab5，Cry2Ab6，Cry2Acl，Cry2Ac2，
Cry2Ac3，Cry2Adl，Cry2Ael，Cry3Aal，Cry3Aa2，Cry3Aa3，Cry3Aa4，
Cry3Aa5，Cry3Aa6，Cry3Aa7，Cry3Bal，Cry3Ba2，Cry3Bbl，Cry3Bb2，
Cry3Bb3，Cry3Cal，Cry4Aal，Cry4Aa2，Cry4Aa3，Cry4Bal，Cry4Ba2，
Cry4Ba3，Cry4Ba4,Cry衡5，Cry5Aal，Cry5Abl，Cry5Acl，Cry5Bal，
Cry6Aal,Cry6Aa2，Cry6Bal，Cry7Aal，Cry7Abl，Cry7Ab2，Cry8Aal，
Cry8Bal，Cry8Bbl，Cry8Bcl，Cry8Cal，Cry8Ca2，Cry8Dal，Cry8Da2，
Cry8Da3，Cry8Eal，Cry9Aal，Cry9Aa2，Cry9Bal，Cry9Cal，Cry9Ca2，
Cry9Dal，Cry9Da2，Cry9Eal，Cry犯a2，Cry犯bl，Cry犯cl，CrylOAal,
CrylOAa2，CrylOAa3，CryllAal,CryllAa2，CryllAa3，CryllBal，
CryllBbl，Cryl2Aal，Cryl3Aal，Cryl4Aal，Cryl5Aal，Cryl6Aal，
Cryl7Aal，Cryl8Aal，Cryl8Bal，Cryl8Cal，Cryl9Aal，Cryl9Bal，
Cry20Aal，Cry21Aal，Cry21Aa2，Cry21Bal，Cry22Aal，Cry22Aa2，
Cry22Abl，Cry22Ab2，Cry22Bal，Cry23Aal，Cry24Aal，Cry25Aal，
Cry26Aal，Cry27Aal，Cry28Aal，Cry28Aa2，Cry29Aal，Cry30Aal，
Cry30Bal，，Cry31Aal，Cry31Aa2，Cry32Aal，Cry32Bal，Cry32Cal，
Cry32Dal，Cry33Aal，Cry34Aal，Cry34Aa2，Cry34Abl，Cry34Acl，
Cry34Ac2，Cry34Bal，Cry35Aal，Cry35Aa2，Cry35Abl，Cry35Ab2，
Cry35Acl，Cry35Bal，Cry36Aal，Cry37Aal，Cry38Aal，Cry39Aal，
Cry40Aal，Cry40Bal，Cry41Aal，Cry41Abl，Cry42Aal，Cry43Aal，
Cry43Bal， Cry44Aa， Cry45Aa， Cry46Aa, Cry47Aa， CytlAal， CytlAa2 CytlAa3， CytlAa4， CytlAa5， CytlAbl， CytlBal， Cyt2Aal， Cyt2Aa2Cyt2Bal， Cyt2Ba2， Cyt2Ba3， Cyt2Ba4， Cyt2Ba5， Cyt2Ba6， Cyt2Ba7, Cyt2Ba8，Cyt2Ba9，Cyt2Bbl，Cyt2Bcl，Cyt2Cal，Vip3A(a) and Vip3A(b).and Vip3a(b)。采用本發明的方法來表達植物細胞中的蛋白，可 以在草坪草或觀賞植物中產生上面列出的蛋白。(例如，通過克隆編碼以上 蛋白的基因到適合載體和轉化植物細胞，這在上面和下面有詳細的描述)。 在另一方面，本發明提供了一個保護草坪草使其免于昆蟲攻擊的方法。 根據一個實施例，被普遍稱為蠐螬的甲蟲幼蟲可應用本發明來控制。蠐螬 是甲蟲的幼蟲期階段，如南部蒙面金龜子，無斑金龜；草坪草蒙面金龜子， 多毛犀金龜和西北黑頭金龜子；六月或五月甲蟲，綠金龜；玫瑰金龜子，薔 薇鰓角金龜；歐洲金龜子，歐洲鰓角金龜子；棕色金龜子，雌性金龜子；栗 褐色金龜子，斑喙麗金龜；東方麗金龜，東方異麗金龜；日本麗金龜，豆金 龜子；大豆金龜子，紅銅麗金龜；綠金龜，古銅異麗金龜；黑草坪草金龜， 黑絨金龜。
除了這些金龜子以外，本發明還產生了具有抗蛾子和蝴蝶幼蟲活性的轉 基因草坪草片段。例如，可獲得地蠶和黏蟲抗性如甜菜黏蟲，甜菜夜蛾； 黏蟲，美洲粘蟲；土蠶，球菜夜蛾；蘋果銀蛾，雜色夜蛾；顆粒夜蛾，地 老虎還有抵抗紫苜蓿蛾，麥牧野螟；西部大草坪蛾，西方草螟；和斯佩 里菌苔蛾，斯佩里草螟。
另一方面，提供了昆蟲抗性觀賞植物。表一舉例說明了本發明采用的一 些觀賞植物。
表一 易于被成年日本麗金龜攻擊的景觀植物 學名 通用名 雞爪槭(Acer palmatum) 日本槭 紫葉挪威槭(Acer plananoides) 挪烕楓歐洲七葉樹(Aesculus hippocastanum) 灰色樺樹(Betula populifolia) 美洲版栗(Castanea dentata) 木槿(Nibiscus syriacus) 黑核杉"Juglans nigra) 蘋果屬(Malus species) 懸鈴木(Platanus acerifolia) 鉆天楊(Populus nigra italica) 李屬 (Primus species) 薔薇屬(Rosa species) 黃棒(Sassafras albidum) 美洲花揪(Sorbus americana) 美洲l椴樹(Tilia americana) 美洲輸樹(Ulmus americana) 英國榆樹(Ulmus procera) 葡萄屬(Vitis species )
那些生長迅速而且對甲蟲特別有吸弓I力的植物是最難保護的。玫瑰開花 迅速而且對甲蟲特別有吸引力。當甲蟲量很多時，采用掐掉小芽和噴射殺 蟲劑來保護葉子或者用網覆蓋玫瑰，使得甲蟲不能入內。
甲蟲喜愛某種雜草和非經濟型植物，如蕨菜，接骨木，野薔薇，印度錦 葵，黃樟，常春藤，蕁麻，野生葡萄和野生夏季葡萄。當毀壞這些昆蟲侵 襲連續源時，這些植物就被消除。
以上列出的植物(表一)和其它植物采用技術中熟練技工熟知的標準分 子生物學和植物學方法由昆蟲抗性基因轉化，使植物生長，由接受昆蟲攻
26
馬栗樹 楊葉樺 美國栗子
白槿、木槿
海棠、蘋果
二球懸鈴木 意大利白楊
櫻桃、黑梅、李子、桃子 玫瑰
黃樟 美國花楸 美國菩提樹 美國榆樹
英國榆樹 食用葡萄擊來確定昆蟲抗性，在例子中舉例說明了這種轉基因草坪草，如下。
下面的例子顯示出本發明可以用來產生具有昆蟲抗性的轉基因草坪草。 技術中的那些熟練的技工可以知道當特定的實施例被圖解和描述時，它們 不限制這個發明。


圖一描述了轉化的草坪草的PCR分析，顯示的是以2kb帶形式的cry8Da 基因(右側3條泳道)。左泳道是一個大小標記。左邊第二泳道是非轉基因 草的陰性對照。
圖二描述的是一張含有一些轉基因草坪草片段盆栽的圖片。這盆盆栽 含有兩只處在第三齡期的日本麗金龜幼蟲，允許它們在盆栽里消耗草坪草 為期一個月。 一些植物顯示出抗性，而另一些植物被昆蟲毀壞。
圖3A—3D顯示的是SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:10的序列。
具體實施例方式
下面通過實施例，對本發明的技術方案作進一步具體的說明。 實施例l:克隆cry8Da基因
根據Asano等((2003)， Biological Control 28， 191-196，這文獻由 于整體上應用而合并與此)發表的文章描述的方法，從蘇云金芽孢桿菌SDS 一502菌株中克隆cry8Da基因。含有活性區域的cry8Da基因的一個片段以 以下兩個序列作引物和以克隆的cry8Da基因作為模版進行PCR擴增， 5， -GGATCCCATGAGTCCAAATMTCAAMTG (SEQ ID N0:1) 5， -CCCGGGTCACACATCTAGGTCTTCTTCTGC (SEQ ID NO:2) PCR在含有10pg模版DNA和適當濃度的其它成分的一個lOOul反應混 合物中進行(對于技術中熟練技工熟知的)。在一個例子中，PCR混合物包 含lOullOX緩沖液，2uld-NTP， 2. 5ul引物1 (20uM) ， 2. 5ul引物2 (20uM)，2ul耐熱性DNA聚合酶，lul模版DNA和80ul水。根據給定的質粒制造說 明書PCR中的循環溫度為96。 C (30秒)45° C (45秒)72° C (l分鐘30 秒)，循環25次。PCR擴增基因片段在pGEM-T-Easy (美國威斯康辛州麥迪 遜Promega公司)中被克隆，克隆的基因被依次證明了 cry8Da基因的序列， 如美國專利申請20030017967發表的(這個文獻由于整體引用而合并與此)。 pGEM-T-Easy中PCR擴增的cry8Da基因利用pGEM-T-Easy提供的位點和 PBI221克隆的位點，由BamHI和Sacl切斷這些位點已經由BamHI和Sacl 切斷移除gusA基因。產物質粒來自于pBI221，其中，cry8Da基因由叫做 pBI221-8Dl (SEQ IDN0:3)的克隆，并在植物轉化中采用。在植物轉化中 采用的質粒pBI221-8Dl和其它質粒，p35S-GFP，購買自Clonetech (美國 加利福尼亞洲Mountain View)。
實施例2:克隆除cry8Da以外的甲蟲活性基因
Cry43Aa基因(基因庫序列號AB115422)編碼一個金龜子蛋白質毒素， 如古銅異麗金龜和豆金龜子。這些是對草坪草嚴重有害的害蟲，它們的捕 食行為能引起相當大的毀壞。Cry43Aa基因從日本甲蟲芽胞桿菌菌株中克 隆，這個菌株是從患病的綠金龜和古銅異麗金龜分離出來的。全長的 cry43Aa基因以兩個以下序列為引物進行PCR擴增。 5， -GGATCCATGAATCAGTATCATMCCAAAACG (SEQ ID NO :4) 5， -CCCGGGTTACTTTTCCATACAAATCMTTCCAC (SEQ ID NO :5) 在PCR反應混合物中，采用由含有約lOOngDNA的B. polilliae Hime菌株 配制的lul基因組DNA 。
cry8Ca基因(基因庫序列號U04366)也編碼一個金龜子蛋白質毒素。 cry8Ca基因在Bacillus thrungiensis蓓蓓(buibui) 菌株中克隆，這 個菌株是從日本國際貿易和工業部工業科學與技術機構發酵研究所中獲得
28的。全長的cry8Ca基因以兩個下列序列為引物進行PCR擴增。 5， -GGATCCATGAGTCC嵐TMTCAAAATGAG (SEQ ID NO :6) 5， -CCCGGGTTACTCTTCTTCTAACACGAGTTCTAC (SEQ ID NO :7)
在PCR反應混合物中，采用由含有約100ngDNA的B. thrungiensis蓓 蓓(buibui)菌株配制的lul基因組DNA 。
PCR擴增的cryAa和cryCa基因在pBI221中克隆，如實施例1中所描 述的，在抗甲蟲活性測試之后，在草坪草轉化中采用，如實施例IO中描述 的，如下。
實施例3:克隆crylCa基因
CrylCa基因僅因庫序列號X07518)編碼一個黏蟲復合物的蛋白毒素，
如甜菜夜蛾，秋粘蟲，美洲粘蟲等。這些是對草坪草的嚴重有害的害蟲， 能引起相當大的毀壞。CrylCa基因在B. thringiensis subsp. aizawai HD133菌株中克隆，這個菌株是從美國伊利諾州北方研究中心農業調研服務 美國農業部中獲得的。全長的crylCa基因以兩個以下序列為引物進行PCR 擴增，
5， -GGATCCCATGGAGGAMATAATCAAAATCAATGC (SEQ ID NO :8)
5， -CCCGGGTTATTCCTCCATAAGGAGTMTTCC (SEQ ID NO :9)
在PCR反應混合物中，采用由含有100ngDNA的HD_133菌株配制的lul基
因組DNA。 PCR擴增的crylCa基因在pBI221中克隆，如實施例1中所描述
的，在抗甲蟲活性測試之后，在草坪草轉化中采用，如實施例10中描述的，如下。
實施例4:富含GC的cry8Da的合成
合成的cry8Da基因(SEQ ID NO: 10)是從美國加利福尼亞洲Menlo Park Phyllom LLC公司中獲得。在這個基因中，GC和AT含量的比率被修改來增
29加天然存在的蘇云金芽孢桿菌cry8Da序列的GC含量。蘇云金芽孢桿菌基 因利用富含AT的密碼子多過如動物和植物的真核生物。在合成的cry8Da 中，肽序列沒有改變。合成的基因具有BamHI和NotI位點，這些位點可以 直接克隆到被限制性內切酶酶切的PBI221中。基因在pBI221中克隆，在 抗甲蟲活性測試之后，在草坪草轉化中采用，如實施例10中描述的，如下。 實施例5愈傷組織誘導
在例子中采用茅花黑麥草和多年生黑麥草兩種草坪草。將草的種子浸 漬到1%的次氯酸鈉中15分鐘，以將種子表面滅菌。在不育的種子中，將 種皮除去，去皮的種子浸漬到蒸餾水中過夜。種子由1%的次氯酸鈉再處理 15分鐘。在第二次次氯酸鈉處理后，切開種子，將種胚分離出來。胚在基 于MS培養基的愈傷組織誘導培養基中培養(Murashige and Skoog， 1962， Physiol. Plant, 15， 473-497)。在這個愈傷組織誘導培養基中，硝酸銨 濃度減小到原始的MS培養基配方的50X，再加入3%的蔗糖。在實驗中， 不同的植物生長調節物質被測試以得到最好的結果，如表2所示。表2說 明了由30個茅花黑麥草胚樣品誘導的大量愈傷組織和大量的愈傷組織都可 以再生成完整的植物。 表2:草坪草愈傷組織誘導和再生
PGR (植物生長調節劑)CuS04 (愈傷組織誘導率)(%)愈傷組織再生 D2 - 27 (90) 6 D2 + 19 (63) 1 D2/B001 - 21 (70) 6 D2/B001 + 24 (80) 8 *
30D2/B01-21(70)3
D2/B01+19(63)1
D2/T001—21 (70)5
D2/T001+17 (57)3
D2/T01-15(60)4
D2/T01+15(60)3
DC2 -25(83)1
DC2 +21(70)3
DC2細1—15 (50)3
DC2/B001+23 (77)3
DC2/B01—17 (57)2
DC2/B01+18 (60)3
DC2/T001-17 (57)1
DC2/T001+12 (40)3
DC2/T01一16 (53)1
DC2/T01+17 (57)2
PGR解植物生長激素
D2: 2 mg/1 2， 4- 2， 4 一二氯苯氧乙酸(2, 4-D) DC2: 2 mg/l二氯甲氧苯酸(3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸) 細胞因子
B01/B001: 0.01 or 0.001 mg/1節氨基嘌呤(BAP) T01/T001: 0.01 or 0.001 mg/1 TDZ (苯基噻二唑脲)CuS04 +表明CuS04濃度增加了原始MS培養基的50X。 CuS04 -表明沒有增加。 *采用這個組合來誘導轉化中采用的愈傷組織
實驗中，申請者采用的MS培養基中2， 4 一二氯苯氧乙酸(2， 4-D)和芐 氨基嘌呤(BAP)的濃度分別為2mg/l，0.001mg/1。硫酸銅的濃度增加了 50 %。培養基含有0. 25%的Gelrite (美國賓夕法尼亞紀北威爾士 Merck公 司)。胚在24 ° C條件下，愈傷組織誘導培養基中每天光照16小時，培養 2個星期，直到愈傷組織形成。每三個星期，將愈傷組織轉移到新鮮的培養 基中持續到轉化為止。 實施例6:轉化
轉化采用基因槍轉化技術來完成。實驗設計基于由日本北海道基因槍 (GIE-III IDER)制造前沿科學提供的使用者手冊。在愈傷組織誘導培養基 中生長的愈傷組織，浸漬在高滲透壓(HOP)，含有愈傷組織誘導培養基的全 部成分和0. 5M甘露醇的培養基中過夜。浸漬在高滲透壓培養基的愈傷組織 被切成lnmi3的小尺寸。在一個轉化中采用約有40塊愈傷組織，將其放入愈 傷組織誘導培養基中。用不同量(lug—4ug)的pBI221—8Dl和p35S—GEP 在4ul乙醇中覆蓋不同量的(10g到40ug)的金粉(1.5 3.0微米)，在樣 品上12cm處向愈傷組織塊注射一次或兩次。采用GFP作為轉化率的指示劑， 發現2ug產生的最高轉化率的DNA覆蓋了 100ug金粉。注射一次和兩次轉 化率沒有明顯差別。因此，許多大規模實驗在此條件下進行。在一次轉化 中要采用草坪草種子的1600塊愈傷組織。 實施例7:再生轉化的愈傷組織被轉移到新鮮培養基中。每塊愈傷組織被放到培養基
中間距約lcm。幾天內，轉化細胞顯示出GFP熒光。 一周內，將顯示出很強 的GFP熒光的細胞群從每塊愈傷組織中切下來，移植到一個再生培養基中。 除了沒有添加激素以外，這個再生培養基與愈傷組織誘導培養基相同。轉 化細胞在24 ° C的條件下每天光照16小時進行培養。每兩個星期，將細 胞轉移到新鮮的培養基中。在四個星期內，3株GFP陽性茅花黑麥草片段生 長成帶有葉子和根的完整植物。 實施例8:轉化愈傷組織的選擇方法
除了 GFP以外，雙丙氨瞵抗性(bar)基因也可被采用作為轉化細胞 的選擇標記。雙丙氨瞵是谷氨酰胺合成酶抑制劑，bar基因編碼的這個酶草 胺膦酰基轉移酶使得雙丙氨瞵失去活性。Bar基因由PGTV-BAR(Becker， et al.， 1992， Plant Mol. Biol. 20， 1195-1197)連同采用如下引物進行PCR 的啟動子和終止子中獲得，
5， -CCGGMTTCGATCATGAGCGGAGMTTMGG (SEQ ID NO: 11) 5， -CCGGMTTCATCTTGAAAGAMTATAGTTTAAAT (SEQ ID NO :12) 該基因在Stratagene公司的pBluescriptII-SK+中克隆，被用來轉化草坪 草愈傷組織和pBI221-8Dal質粒。 一些由雙丙氨瞵選擇的轉化草細胞生長 成雙丙氨瞵抗性的完整植物。上面描述的昆蟲攻擊顯示出一些植物對日本 麗金龜的確有抗性。在另一個實施例中，采用潮霉素B對轉化草細胞進行 選擇。在這個例子中，潮霉素B抗性基因由NOS啟動子和終止子來進行克 隆。
實施例9:轉化草植物的PCR分析
當轉化愈傷組織生長成完整植物時，從每個植物中取一部分葉子，根
據試劑盒中的說明書(美國加州巴倫西亞Qiagen公司)采用Qiagen公司的微量植物DNA提取試劑盒(DNeasy Plant Mini Kit)從葉子樣本中提取DNA。 樣本中cry8Da基因采用以下序列為引物進行PCR擴增分析， 5， -GGATCCCATGAGTCCAAATAATCAAMTG (SEQ ID NO: 13) 5, -CCCGGGTCACACATCTAGGTCTTCTTCTGC (SEQ ID NO:14)
如果cry8Da基因存在于模板DNA樣本(植物葉子提取)中，那這些 引物可以產生2kb的擴增片段。所有的葉子樣本都來源于GFP陽性愈傷組 織部分，由插入植物基因組的cry8Da基因的PCR分析顯示出這2kb片段(圖 1)。四個片段，其中三個來自于茅花黑麥草， 一個來自于多年生黑麥草， 它們由PCR分析選擇出來，來進行昆蟲抗性測試。 實施例10:昆蟲抗性測試
將來自于轉化愈傷組織的再生完整植物轉移到含有盆栽肥料的15厘 米直徑的盆栽中。每個盆栽植入約6種植物。每個盆栽中，放入2個收集 自草地的第三齡期的日本麗金龜幼蟲，允許它們以草根為食，為期一個月。 昆蟲捕食了對昆蟲沒有抗性的植物的根(如，沒有由昆蟲抗性基因轉化)， 從而殺死植物。然而，那些經PCR分析(實施例9)對cry8Da成陽性的植 物顯示出對日本麗金龜的抗性而生存下來(圖2)。保護植物的水平不比采 用化學殺蟲劑好，但與其相似。在這個例子中，采用的倍硫磷有機磷酸鹽 殺蟲劑為0. 45 AI (活性成分)g/cm2。
通過第一次昆蟲抗性測試和每個盆栽中5只第三齡期的日本麗金龜測 試而生存下來的一種植物采用更多的昆蟲攻擊進行進一步的測試。含有 cry8Da的草片段在更多昆蟲攻擊的第二次昆蟲抗性測試也能生存下來。一 個月的測試之后，所有5只昆蟲在含有非轉化草的盆栽中生存下來，而在 大多數轉基因盆栽沒有生存的昆蟲。
權利要求
1. 一種轉基因草坪草，它包含一個昆蟲抗性基因。
2.根據權利要求1所述的轉基因草坪草，其中所述的昆蟲抗性基因來 自于蘇云金芽孢桿菌。
3. 根據權利要求1所述的轉基因草坪草，其中所述的昆蟲抗性基因包 含的cry8Da來自于蘇云金芽孢桿菌SDS—502菌株。
4. 根據權利要求1所述的轉基因草坪草，其中所述的昆蟲抗性基因與 昆蟲的抗性作比較，這些昆蟲選自南部蒙面金龜子，無斑金龜；草坪 草蒙面金龜子，多毛犀金龜和西北黑頭金龜子；六月或五月甲蟲，綠 金龜；玫瑰金龜子，薔薇鰓角金龜；歐洲金龜子，歐洲鰓角金龜子； 棕色金龜子，雌性金龜子；栗褐色金龜子，斑喙麗金龜；東方麗金龜， 東方異麗金龜；日本麗金龜，豆金龜子；大豆金龜子，紅銅麗金龜； 綠金龜，古銅異麗金龜；黑草坪草金龜，黑絨金龜；貪夜蛾，甜菜夜 蛾；粘蟲，美洲粘蟲；土蠶，球菜夜蛾；雜色地老虎，雜色夜蛾；顆 粒地老虎，地老虎；紫苜蓿蛾，麥牧野螟；西方菌苔蛾，西方草螟； 和斯佩里菌苔蛾，斯佩里草螟。
5. 根據權利要求1所述的昆蟲抗性基因，其中所述的基因由對草坪草 有害昆蟲致病的細菌獲得。
6. 根據權利要求3所述的昆蟲抗性基因，其中所述的基因由選擇自蘇 云金芽胞桿菌，日本甲蟲芽胞桿菌，例如，緩死芽孢桿菌，和幼蟲芽 胞桿菌的微生物獲得。
7. 根據權利要求1所述的昆蟲抗性基因，其中所述的基因編碼昆蟲活性蛋白，這些基因選擇自CrylAal, CrylAa2， CrylAa3， CrylAa4，CrylAa5， CrylAa6， CrylAa7， CrylAa8， CrylAa9， CrylAalO, CrylAal 1，CrylAal2， CrylAal3， CrylAal4， CrylAbl， CrylAb2， CrylAb3， CrylAb4，CrylAb5， CrylAb6， CrylAb7， CrylAb8， CrylAb9， CrylAblO， CrylAbl 1，CrylAbl2， CrylAbl3， CrylAbl4， CrylAbl5， CrylAbl6， CrylAcl，CrylAc2， CrylAc3， CrylAc4， CrylAc5， CrylAc6， CrylAc7， CrylAc8，CrylAc9， CrylAclO， CrylAcll， CrylAcl2， CrylAcl3， CrylAcl4，CrylAcl5， CrylAdl， CrylAd2， CrylAel，CrylAfl，CrylAgl，CrylAhl，CrylAil， CrylBal，CrylBa2， CrylBa3，CrylBa4，CrylBbl,CrylBcl，CrylBdl， CrylBd2，CrylBel, CrylBe2，CrylBfl，CrylBf2，CrylBgl，CrylCal， CrylCa2，CrylCa3， CrylCa4，CrylCa5，CrylCa6，CrylCa7，CrylCa8， CrylCa9，CrylCalO， CrylCbl，CrylCb2，CrylDal，CrylDa2，CrylDbl， CrylDb2，CrylEal， CrylEa2，CrylEa3，CrylEa4，CryiEa5，CrylEa6， CrylEbl，CrylFal， CrylFa2，CrylFbl，CrylFb2，CrylFb3，CrylFb4， CrylFb5，CrylGal， CrylGa2，CrylGbl，CrylGb2:，CrylGc，CrylHal， CrylHbl，Cryllal， Crylla2，Crylla3，Crylla4，Crylla5，Crylla6， Crylla7， Crylla8， Crylla9， Crylla10， Cryllall， Cryllbl，Cryllcl， Cryllc2， Crylldl， Cryllel， Cryllfl， Cryljal， Cryljbl，Cryljcl， Cryljc2， Cryljdl， CrylKal， Cry2Aal， Cry2Aa2， Cry2Aa3，Cry2Aa4， Cry2Aa5， Cry2Aa6， Cry2Aa7， Cry2Aa8， Cry2Aa9， Cry2Aal0，Cry2Aal1， Cry2Abl， Cry2Ab2， Cry2Ab3， Cry2Ab4， Cry2Ab5， Cry2Ab6，Cry2Acl， Cry2Ac2， Cry2Ac3， Cry2Adl， Cry2Ael， Cry3Aal， Cry3Aa2，3Cry3Aa3，Cry3Aa4， Cry3Aa5， Cry3Aa6， Cry3Aa7， Cry3Bal，Cry3Ba2,Cry3Bbl，Cry3Bb2， Cry3Bb3， Cry3Cal， Cry4Aal， Cry4Aa2，Cry4Aa3，Cry4Bal，Cry4Ba2， Cry4Ba3， Cry4Ba4， Cry4Ba5， Cry5Aal，Cry5Abl，Cry5Acl，Cry5Bal， Cry6Aal， Cry6Aa2， Cry6Bal， Cry7Aal，Cry7Abl，Cry7Ab2，Cry8Aal， Cry8Bal， Cry8Bbl， Cry8Bcl， Cry8Cal，Cry8Ca2，Cry8Dal，Cry8Da2， Cry8Da3， Cry8Eal， Cry9Aal， Cry9Aa2，Cry9Bal，Cry9Cal，Cry9Ca2， Cry9Dal， Cry9Da2， Cry犯al， Cry犯a2，Cry9Ebl，Cry犯cl，CrylOAal，CrylOAa2， CrylOAa3， CryllAal, CryllAa2，CryllAa3，CryllBal，CryllBbl， Cryl2Aal， Cryl3Aal，Cryl4Aal，Cryl5Aal，Cryl6Aal，Cryl7Aal， Cryl8Aal， Cryl8Bal，Cryl8Cal，Cryl9Aal，Cryl9Bal，Cry20Aal， Cry21Aal， Cry21Aa2，Cry21Bal，Cry22Aal，Cry22Aa2，Cry22Abl， Cry22Ab2， Cry22Bal，Cry23Aal，Cry24Aal，Cry25Aal，Cry26Aal， Cry27Aal， Cry28Aal，Cry28Aa2，Cry29Aal，Cry30Aal，Cry30Bal" Cry31Aal， Cry31Aa2，Cry32Aal，Cry32Bal，Cry32Cal，Cry32Dal， Cry33Aal， Cry34Aal，Cry34Aa2，Cry34Abl，Cry34Acl，Cry34Ac2， Cry34Bal， Cry35Aal，Cry35Aa2，Cry35Abl，Cry35Ab2，Cry35Acl， Cry35Bal， Cry36Aal，Cry37Aal，Cry38Aal，Cry39Aal，Cry40Aal， Cry40Bal， Cry41Aal，Cry41Abl，Cry42Aal，Cry43Aal， Cry43Bal， Cry44Aa， Cry45Aa， Cry46Aa， Cry47Aa，CytlAal， CytlAa2， CytlAa3， CytlAa4， CytlAa5， CytlAbl， CytlBal，Cyt2Aal， Cyt2Aa2， Cyt2Bal， Cyt2Ba2， Cyt2Ba3， Cyt2Ba4， Cyt2Ba5，Cyt2Ba6， Cyt2Ba7， Cyt2Ba8， Cyt2Ba9， Cyt2Bbl， Cyt2Bcl， Cyt2Cal，Vip3A (a)和Vip3A (b)和Vip3a (b)。
8. 根據權利要求1所述的昆蟲抗性基因，其中所述的昆蟲抗性基因由選自沙雷菌類，發光桿菌類，致病桿菌類的微生物獲得。變形斑沙雷菌，嗜蟲沙雷氏菌，熒光假單孢菌，嗜線蟲致病桿菌和伯氏致病桿菌
9. 根據權利要求8所述的沙雷菌類，其中所述的種類包括變形斑沙雷菌和嗜蟲沙雷氏菌。
10. 根據權利要求8所述的發光桿菌類，其中所述的種類包括熒光假單孢菌。
11. 根據權利要求8所述的致病桿菌類，其中所述的種類包括嗜線蟲致病桿菌和伯氏致病桿菌。
12. 根據權利要求1中所述的轉基因草坪草，其中所述的昆蟲抗性基因包括來自于蘇云金芽胞桿菌蓓蓓(buibui)菌株的cry8Ca基因。
13. 根據權利要求1中所述的轉基因草坪草，其中所述的昆蟲抗性基因包括來自于日本甲蟲芽胞桿菌的c:ry43A基因。
14. 根據權利要求1中所述的轉基因草坪草，其中所述的昆蟲抗性基因包括蘇云金芽胞桿菌crylCa基因。
15. 根據權利要求1中所述的轉基因草坪草，包含有SEQIDN0:10的多聚核苷酸序列。
16. —種減少或消除任何針對草坪草的化學或生物的殺蟲劑噴射的方法，這種方法通過在草坪草中引入一個或多個昆蟲抗性基因來控制蟲害。
17.根據權利要求1或6中所述的轉基因草坪草，其中所述的草種類選擇自堿地鼠尾粟(Sporobolus airoides);窄穎賴草(Leymusangustus);多花黑麥草(Loliummultiflorum);百喜草(Paspalumnotatum);披堿草雜交的大麥(Elyhordeum);狗牙根(Cynodondactylon);須芒草(Andropogon);雀麥(Bromus);黍(Panicummiliaceum);岡瞎竹(Microstegium);蕎麥(Eriogonum);野牛草(Buchloe dactyloides);喜濕藹草(Phalaris aquatica);力口州雀麥 (California brome);阿拉其Jf力口雀麥(Bromus sitchensis);加拿大早熟禾(Poa compressa);金黃草(Phalaris);紫羊茅(Festucarubra); 草(Echinochloa);剪股穎(rostis tenuis);大麥(Hordeum vulgare); 小麥(Triticum aestivum);匍匍剪股穎(Agrostis s.tolonifera ); 蘋狀看麥娘 (Alopecurusarundinaceus) 5扁穗冰草(Agropyxon cristatum) 5披堿草(Elymusdahuricus);毛花雀稗(Paspalum dilatatum);羊茅(Festuca);絲狀疣羊茅(Festuca filiformis); 糝子(Eleusine comcana);鴨茅狀磨擦禾(Tripsacum);甜高粱(Sorghum bicolor);牧草(Bouteloua);無芒雀麥(Bromus stamineus);硬羊茅(Festucatrachyphylla);假高粱(Sorghastrum nutans);中間偃麥草(Thinopyrum intermedium); 食用稗(Echinochloa esculenta) 5草地早熟禾 (Poa pratensis);狼尾草(Pennisetum clandestinum) 5雜色黍(Panicum coloratum) 5知風草(Eragrostis) 5 多毛雀麥Bromus co腿utatus); 牛尾草(Festuca pratensis); 草原看麥娘(Alopecurus pratensis);草地黑麥草(Lolium pratense);粟草(Milium);燕麥(Avena);鴨茅(Dactylis glomerata);黑黍(Pennisetum americanum); 多年生黑麥草(Xolium perenne);草原草(Bromus wildenowii);北美草原牧草(Koeleria macrantha);鼠尾羊茅(Vulpia myuros);紫羊茅(Festuca rubra);小糠草(Agrostis gigantea); 哈定草(Phalaris arundinacea); 粗莖早熟禾(Poa trivialis) 5 高冰草(Thinopyrum ponticum);俄羅斯新麥草(Psathyrostachys juncea); 黑麥(Secale cereale);黑麥草(Xolium);羊茅(Festuca ovina);紫羊茅(Festuca rubra);茅子粒莧(Bromus inermis); 雙色高粱(Sorghum bicolor) 5 河邊冰草(Elymus lanceolatus); 蘇丹草(Sorghum bicolor); 賴卩枝稷(Panicum virgatum) 5 高羊茅(Xolium axundinaceum); 高燕麥草(Arrhenatherum elatius);長穗偃麥草(Thinopyrum ponticum);貓尾草(Phleum pratense); 小黑麥(Triticosecale rimpaui);發草(Deschampsia caespitosa);藍莖冰草(Pascopyrum smithii);小麥(Triticum);芽草(Agropyron)和披堿草(Elymus)。
18. —種產生昆蟲抗性草坪草的方法，包括a) 將包含一個或多個昆蟲抗性基因的一個或多個質粒引入草坪草愈傷組織，其中所述的愈傷組織是轉化了的；b) 培養所述的愈傷組織；c) 使所述的愈傷組織生長成成熟草坪草；d) 測試所述的成熟草坪草的昆蟲抗性。
全文摘要
本發明涉及到具有草坪草有害昆蟲抗性的轉基因草坪草。敘述了產生這種昆蟲抗性轉基因草坪草片段的方法。本發明還涉及到這種昆蟲抗性轉基因草坪草的應用，來消除或減少噴射型殺蟲劑的使用，來保護草坪草免于受到昆蟲的毀壞。
文檔編號C12N15/82GK101505589SQ200680039410
公開日2009年8月12日 申請日期2006年8月30日 優先權日2005年8月30日
發明者廣田貢, 淺野真一郎 申請人:菲龍有限責任公司