透明質烷產量增加的植物的制作方法

專利名稱：：透明質烷產量增加的植物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及透明質烷合成量增加的植物細胞和植物，和涉及制備這類植物的方法，還有利用這些植物細胞或植物來制備透明質烷(hyaluronan)的方法。在此，與野生型植物細胞或野生型植物相比，根據本發明的植物細胞或遺傳修飾植物具有透明質烷合酶活性和額外增加的谷氨酰胺:果糖6-礴酸-酰胺轉移酶(GFAT)活仗本發明還涉及具有增強的透明質烷合成的植物在制備透明質烷和含有透明質烷的食品或祠料中的用途。
背景技術：
：透明質烷是天然存在的無分支、線型黏多糖(葡糖胺聚糖)，其由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的分子交替構成。透明質烷的基本構成區由葡萄糖醛酸二糖-P-l，3-N-乙酰氨基葡萄糖組成。在透明質烷中，這些重復單位通過P-1，4鍵彼此連接。在制藥業，常使用術語透明質酸。由于在多數情況下透明質烷以聚陰離子而不是以游離酸存在，在下文中，優選地使用術語透明質烷，但每一術語都應當理解為包含兩種分子形式。透明質烷具有特殊的物理化學性質，如聚合電解質性質、粘彈性質、高結合水能力、凝膠形成特性，透明質烷另外的性質參見Lapcik等人的綜述文獻(1998，ChemicalReviews98(8),2663-2684)。透明質烷是脊推動物細胞外結締組織和體液的成分。在人體內，透明質烷是由所有體細胞，特別是間充質細胞的細胞膜合成。其在結締組織、細胞外基質、臍帶、關節液、軟骨組織、皮膚及眼睛的玻璃體內以顯著高濃度普遍存在于人體內。最近，在動物無脊稚生物(軟體動物)中也發現了透明質烷(Volpi和Maccari，2003，Biochimie85，619-625)。此外，由于透明質烷是非免疫原性物質，某些革蘭氏陽性病原菌(鏈霉菌屬(&"/;tococc"s)A和C)和革蘭氏陰性菌(巴斯德菌屬(尸"stew/r""))合成透明質烷作為保護這些細菌免受其宿主免疫系統攻擊的胞外多糖。侵染小球藻屬(cAfow/^i)的單細胞綠藻的病毒，其中一些在草履蟲(pflm附e"'"w)種中以內共生體存在，病毒侵染后賦予單細胞綠藻合成透明質烷的能力(Graves等人，1999，Virology257，15-23)。然而，該合成透明質烷的能力并不是表征所研究藻類的特征。藻類合成透明質烷的能力由其基因組具有編碼透明質烷合酶序列的病毒的侵染介導(DeAngdis，1997，Science278，1800-1803)。此外，病毒基因組含有谷氨酰胺:果糖6-磷酸-酰胺轉移酶(GFAT)的編碼序列。GFAT將果糖6-磷酸和谷氨酰胺轉變成透明質烷合成代謝途徑中重要的代謝物葡糖胺6-磷酸。兩個基因編碼有活性的蛋白質，如病毒的透明質烷合酶，其在病毒侵染的早期被同時轉錄(DeAngelis等人，1997，Science278，1800-1803，Graves等人，1999，Virology257，15-23)。具有谷氨酰胺:果糖6-磷酸-酰胺轉移酶(GFAT)活性的蛋白質的活性既不能從未受病毒侵染的細胞提取物中也不能從病毒侵染的細胞中檢測到(Landstein等人，1998，Virology250,388-396)。因此，在病毒侵染的質烷合成必需的都是未知的。在天然存在的植物本身在其基因組內沒有任何編碼催化透明質烷合成的蛋白質的核酸，盡管許多植物碳水化合物已被描述和表征，迄今為止在未侵染的植物中仍無法檢測到透明質烷或與透明質垸有關的分子(Graves等人，1999，Virology257,15-23)。透明質烷合成的催化作用受單一膜整合或膜結合的酶，透明質烷合酶的影響。迄今已被研究的透明質烷合酶可分成兩組1類透明質烷合酶和II類透明質烷合酶(DeAngdis，1999，CMLS，CellularandMolecularLifeSciences56，670-682)。脊推動物的透明質烷合酶可通過標記的同工酶另外區分。不同的同工酶按照它們鑒定的順序使用不同的阿拉伯數字查閱(例如，hsHASl、hsHAS2、hsHAS3)。合成的透明質烷分子穿過細胞質膜進入細胞周圍介質的轉移機理尚未得到完全闡明。早期的假設認為穿過細胞膜的轉運受透明質烷合酶自身的影響。然而，最近的結果表明，透明質烷分子穿過細胞質膜的轉運是經由負責這一作用的轉運蛋白的能量依賴性轉運。因此，鏈球菌菌林由突變產生，其中有活性轉運蛋白的合成被抑制。這些菌林比相應的野生型細菌菌林合成較少的透明質烷(Ouskova等人，2004,Glycobiology14(10)，931-938)。通過特定抑制已知轉運蛋白的試劑的幫助，可證明在人類的纖維原細胞中可以減少產生的透明質烷量和透明質烷合酶的活性(Prehm和Schumacher,2004，BiochemicalPharmacology68，1401-1410)。存在于植物中的能夠轉運透明質烷的轉運蛋白(如果有的話)以多少量存在是未知的。透明質烷的特殊性質為應用于不同領域，比如制藥業、化妝品行業、食品和飼料生產過程、技術應用(如潤滑劑)等提供很多致富的可能。目前透明質烷的最主要的應用是在醫藥和化妝品領域(參見Lapcik等人，1998，ChemicalReviews98(8)，2663-2684，Goa和Benfield，1994，Drugs47(3),536-566)在醫學領域內，含有透明質烷的產品目前已被用于關節病的關節腔內治療及眼科中用于眼睛手術。透明質烷也用于治療賽馬比賽中的關節疾病。此外，透明質烷是某些鼻科的組成要素，例如以眼藥水和鼻骨孔的形式用來濕潤干燥的粘膜。含有透明質烷的注射液用作止痛劑和治療風濕的藥劑。含有透明質烷或衍生透明質烷的貼片被用于外傷治療。就皮膚而言，含有透明質烷的凝膠灌注物可在整形手術中用于矯正皮膚變形。對于藥理學應用，優選使用具有高分子量的透明質烷。在化妝品醫學中，透明質烷制劑是最適皮膚填充材料之一。通過在限定的時間內注入透明質烷可平整皺紋或增大唇體積。在化妝產品中，特別是在護膚膏和洗液中，透明質烷因其高束水能力而經常用作保濕劑。另外，含透明質烷的制劑以所謂的營養保健品(食品增補劑)銷售，其也可在動物(如狗、馬)中用于關節病的預防和緩解。用于商業目的的透明質烷目前從動物組織(如雄雞冠)中分離或使用細菌培養發酵制備。美國專利4,141,973描述從雄雞冠中或備選地從臍帶中分離透明質烷的工藝。除透明質烷外，動物組織(如雄雞冠、臍帶)也含有另外的和透明質烷有關的粘多糖，如硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、疏酸角質素、硫酸乙酰肝素及肝磷脂。此外，動物機體含有蛋白質(透明質烷黏附質(hyaladherins)),其特定地結合到透明質烷并在機體內是不同功能所必需的，比如透明質烷在肝臟內的降解、透明質烷作為細胞移植的引導結構的功能、細胞內吞作用的調節、透明質烷在細胞表面或透明質烷網絡構型上的錨定(Turley,1991,AdvDrugDeliveryRev7，257ff.;Laurent和Fraser,1992，FASEBJ.6，183ff.;Stamenkovic和Aruffo，1993，MethodsEnzymol.245，195ff;Knudson和Knudson，1993，FASEB7，1233ff.)。可用于透明質烷的細菌生產的鏈球菌菌林是專性病原菌。在培養過程中，這些細菌也產生釋放到培養基中的(致熱)外毒素和溶血素(鏈球菌溶血素，(特另J是oc和p溶血素)(Kilian，M.:5W/)tococc附andIn:MedicalMicrobiology.Greenwood,D.;Slack,RCA;Peutherer，J.F.(編輯).第16章.ChurchillLivingstone,Edinburgh,UK:第174-188頁，2002，ISBN0443070776)。這使借助鏈球菌菌林制備的透明質烷的凈化和分離更困難。特別是用于制藥上的應用，在制備中外毒素和溶血素的存在是難題。美國專利4,801,539描迷通過發酵誘變的細菌菌林獸疫鏈球菌(5to"印toctfcc附Z0oefife附z'c"s)制備透明質烷。使用的i秀變菌4朱不再合成P-溶血素。產量可達3.6g透明質烷/升培養基。歐洲專利0694616描述獸疫鏈球菌或馬鏈球菌OS^e/^coccwsqw〕的培養方法，其中在使用的培養條件下，沒有鏈球菌溶血素，但合成增量的透明質烷。產量可達3.5g透明質烷/升培養基。在培養過程中，鏈球菌菌林釋放透明質酸酶到培養基中，其結果是在這個生產系統中，純化期間也降低分子量。美國專利4,782,046中描述使用透明質酸酶陰性的鏈球菌菌林或生產透明質烷的方法的用途，其中在培養期間抑制透明質酸酶的產生。其產量可達2.5g透明質烷/升培養基，并且最大的平均分子量達到3.8x106Da,分子量范圍是2.4乂106到4.0x106。US20030175902和WO03054163描述在來自枯草桿菌(5""7/附s"6ft7is)中的類馬鏈球菌(S&epe《w/w'/m7/力的異源表達的透明質烷合酶的幫助下制備透明質烷。為實現足夠量的透明質烷的生產，除透明質烷合酶的異源表達外，芽胞桿菌細胞內UDP-葡萄糖脫氫酶的同步表達也是必要的。US20030175902和WO03054163沒有給出在枯草桿菌作用下生產獲得的透明質烷的絕對量。達到的最大平均分子量約為4.2xl06。然而，該平均分子量僅在重組的桿菌菌抹中得到，其中類馬鏈球菌中透明質烷合酶基因的編碼基因和枯草桿菌中UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼基因被整合到在tfmyQ啟動子的調控下的枯草桿菌基因組中，其中同時失活枯草桿菌內源cx/;Y基因(其編碼細胞色素P450氧化酶)。WO05012529描述遺傳修飾煙草植物的制備，其中轉化使用小球藻侵染病毒中編碼透明質烷合酶的核酸分子。在WO05012529中，一方面是采用編碼小球藻病毒菌林CVHI1透明質烷合酶的核酸序列轉化煙草植物，另一方面是采用編碼小球藻病毒菌林CVKA1透明質烷合酶的核酸序列轉化煙草植物。僅能證明透明質烷的合成是對于從小球藻病毒菌林CVKA1中分離出的編碼透明質烷合酶的核酸序列轉化的植物。對于從小球藻病毒菌林CVHI1中分離出的編碼透明質烷合酶的核酸序列轉移的煙草植物，是不可能在相應的轉基因植物中檢測到透明質烷的合成。據稱用在WO05012529中唯一的透明質烷生產轉基因煙草植物合成透明質烷的數量可以為約4,2ng透明質烷/ml測量體積，考慮進行討論中的實驗的描述，近似相當于12ng產生的透明質烷/g植物材料鮮重。透明質烷合酶可將初始原料UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-葡萄糖醛酸催化合成透明質烷。上述兩種初始原料均存在于植物細胞中。在植物細胞中，對于UDP-N-乙酰葡糖胺的合成，WO9835047描述氨基葡萄糖被許多連續酶催化反應步驟以N-乙酰葡糖胺代謝物、N-乙酰葡糖胺_6-磷酸、N-乙酰葡糖胺-l-磷酸的形式轉化成UDP-N-乙酰葡糖胺的代謝途徑。備選的代謝途徑包括果糖-6-磷酸和谷氨酰胺合成葡糖胺-6-磷酸的反應，其隨后被一系列連續的酶催化反應步驟以葡糖胺-l-磷酸代謝物和N-乙酰葡糖胺-l-磷酸的形式轉化成UDP-N-乙酰葡糖胺。果糖-6-磷酸和谷氨酰胺轉化成葡糖胺-6-磷酸是由具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸酰胺轉移酶(GFAT)活性的蛋白質催化的(Mayer等人，1968，PlantPhysiol.43，1097-1107)。WO0011192描述在轉基因玉米植物中編碼具有GFAT酶活性的蛋白質的玉米核酸分子胚乳特定過表達，其目的是在植物中合成具有2-氨基-葡糖酐分子的陽離子淀粉。依據WO0011192的描述，上述代謝途徑應導致2-氨基-葡糖酐聚合成淀粉其中包括經淀粉合酶和/或肝糖合酶將UDP-葡糖胺聚合成淀粉。該專利指出UDP-葡糖胺的增加量可從遺傳修飾玉米植物的胚乳粉末中檢測到，該遺傳修飾玉米植物可能會過表達編碼具有以質粒信號肽翻譯性融合的GFAT(酶)活性的蛋白質的核酸分子。在表達無信號肽的具有GFAT(酶)活性的蛋白質時，在相應的玉米胚乳組織的粉末中可能會檢測到增加量的葡糖胺-l-磷酸。在轉基因植物中不可能檢測到陽離子淀粉。通過細菌菌株發酵生產透明質烷涉及到高成本，因為細菌只能在高價控制的培養條件下的密閉無菌容器內發酵(參見例如美國專利4,897,349)。另外，細菌菌林發酵生產的透明質烷量受每一環節的生產設備的限制。在這里，根據物理學定律，必須考慮到發酵罐不能建成過大的培養體積。這里特別注意的可能是外界提供的底物(如細菌生長必需的營養源、調整pH的試劑、氧氣)必須和有效生產必需的培養基均勻混合，所述有效生產在大型的發酵罐中，如果有的話，僅可以用巨大的技術費用來保證。從動物機體中純化透明質烷是復雜的，因為在動物組織中存在著其他與透明質烷特定結合的粘多糖和蛋白質。在患者中，使用被動物蛋白污染的含有透明質烷的醫藥制劑可導致機體有害的免疫反應(US4,141，973)，尤其當患者對動物蛋白過敏時(如雞蛋蛋白)。另外，從動物組織中可以以期望的質量和純度獲得的透明質烷的量(產量)較低(雄雞冠0.079%w/w(體積比)，EP0144019，US4,782,046),其必須處理大量的動物組織。從動物組織中分離透明質烷的另一個問題是效果，即由于動物組織也含有透明質烷降解酶(透明質酸酶)因而在純化期間降低分子量。除透明質酸酶和提及的外毒素外，鏈球菌菌林也產生內毒素，當其存在于藥品中時，會對患者的健康造成威脅。科學研究表明甚至市場上含透明質烷的醫藥產品中也含有可檢測出的細菌內毒素(Dick等人，2003，EurJOpthalmol.13(2)，176-184)。以鏈球菌菌林作用生產的透明質烷的另一個缺點是分離到的透明質烷比從雄雞冠中分離到的透明質烷的分子量低的事實(Lapcik等人1998，ChemicalReviews98(8)，2663-2684)。US20030134393描述使用鏈球菌菌林生產透明質烷的用途，其合成特指的透明質烷膠嚢(超級膠嚢)。發酵后分離到的透明質烷具有9.lxl(^的分子量。然而產量僅為350mg/L。通過細菌發酵或動物組織中分離生產透明質烷的某些缺點可通過利用轉基因植物生產透明質烷來避免，然而，當前釆用轉基因植物可生產獲得的透明質烷的量要求相對大的培育面積以生產相對大量的透明質烷。此外，從具有低透明質烷含量的植物中分離或純化透明質烷比從高透明質烷含量的植物中分離和純化更加相當的復雜和昂貴。盡管透明質烷具有特殊的性質，但由于其稀少和昂貴，其很少(如果有的話)用于工業用途。
發明內容因此，本發明的目的是提供方法和手段，允許提供大量、優質的透明質烷，并且其使提供透明質烷甚至用于工業應用和食品及祠料領域的應用成為可能。通過權利要求中列舉的實施方案實現這一目的。因此，本發明涉及遺傳修飾的植物細胞或遺傳修飾的植物，其含有穩定整合進它們的基因組中、編碼透明質烷合酶的核酸分子，與那些相應的無轉基因的野生型植物細胞或無轉基因的野生型植物相比，上述植物細胞或植物的表征是額外具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸酰胺轉移酶(GFAT)(酶)活性的增強的蛋白質活性。在此，根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物的遺傳修飾可以是任意的遺傳修飾，該遺傳修飾與那些相應的無遺傳修飾的野生型植物細胞或無遺傳修飾的野生型植物相比，導致將編碼透明質烷合酶的核酸分子穩定整合到植物細胞或植物內并在遺傳修飾的植物細胞或遺傳修飾的植物中增加具有GFAT(酶)活性的蛋白質活性。本發明情況中，術語"野生型植物細胞"可理解為指植物細胞，其根據本發明被提供作為初始原料用于制備遺傳修飾的植物細胞，即它們的遺傳信息是除了引入的遺傳修飾和產生編碼透明質烷合酶的核酸分子的穩定整合和增強具有GFAT活性的蛋白質活性外，相應于根據本發明的遺傳修飾的植物細胞的遺傳信息。本發明情況中，術語"野生型植物"可理解為指根據本發明用作制備遺傳修飾植物初始原料的植物。即它們的遺傳信息是除了引入的和引起編碼透明質烷合酶且增強具有GFAT活性的蛋白質的活性的核酸分子的穩定整合的遺傳修飾外，相應于那些根據本發明遺傳修飾植物所具有的遺傳信息。本發明情況中，術語"相應的，，指在比較多個對象時，討論中的用來與另一個作比較的對象被保持在相同條件下。本發明情況中，在野生型植物細胞或野生型植物情況下的術語"相應的，，是指相同培養條件下培養的彼此相比較的植物細胞或植物，同時它們具有相同的(培養)年齡。本發明情況中，術語"透明質烷合酶"(EC2.4.1.212)應理解為指從底物UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)和N-乙酰基-葡糖胺(UDP-GlcNAc)合成透明質烷的蛋白質。依據以下反應歷程催化透明質烷合成nUDP-GlcA+nUDPGlcNAc—pi，4-[GlcA-p-l，3-N-GlcNAc]n+2nUDP已描述編碼透明質垸合酶的核酸分子和相應的蛋白質序列，尤其是對于下列生物體兔(穴兔(0/j"0/flg附cwm'cw/"s))ocHas2(EMBLAB055978.1,US20030235893)、ocHas3(EMBLAB055979.1，US20030235893);狒狒(東非狒狒(戶fl/wV朋"6Zs))paHasl(EMBLAY463695.1);青蛙(光滑爪蟾(J^w印附xlHasl(EMBLM22249.1,US20030235893)、xlHas2(DG42)(EMBLAF168465.1)、xlHas3(EMBLAY302252.1);人(智人(/^附<s"/i/e朋))hsHASl(EMBLD84424.1，US20030235893)、hsHAS2(EMBLU54804.1，US20030235893)、hsHAS3(EMBLAF232772.1,US20030235893);小鼠(小家鼠(Af^柳"sc"/"s))，mmHasl(EMBLD82964.1,US20030235893>mmHAS2(EMBLU52524.2,US20030235893)、mmHas3(EMBLU86408.2，US20030235893);牛(歐洲牛(5osto"""*))btHas2(EMBLAJ004951.1，US20030235893);小雞(原雞ggHas2(EMBLAF106940.1,US20030235893);大鼠(褐家鼠(及",/附朋,v一"力)rnHas1(EMBLAB097568.1，ltano等人，2004，J.Biol.Chem.279(18)18679-18678)、rnHas2(EMBLAF008201.1);rnHas3(NCBINM—172319.1，ltano等人，2004，J.Biol.Chem.279(18)18679-18678)，馬(普氏野馬(E《w附c^"Z/附))ecHAS2(EMBLAY056582.1，Gl:23428486)，豬(野豬(S"s"ra/"))sscHAS2(NCBINM—214053.1，Gl:47522921)、sscHas3(EMBIAB159675)，斑馬魚(斑馬魚(D"mobrHasl(EMBLAY437407),brHas2(EMBLAF190742.1)brHas3(EMBLAF190743.1);多殺巴斯德菌(尸"s&w"/,fl附wfto"V/")pmHas(EMBLAF036004.2);生膿鏈球菌(&f印勿cocc附/y;^^"^y)spHas(EMBL，L20853.1、L21187.1、US6，455，304、US20030235893);馬鏈球菌(5^Wocc"s^tm/s)seHas(EMBLAF347022.1,AY173078.1)，乳鏈球菌(5^卬tococc"s"Ac&)suHasA(EMBLAJ242946.2,US20030235893)，類馬鏈球菌(5Vr印紐cocc附seqHas(EMBLAF023876.1,US20030235893);石危礦硫化葉菌(S"/>/M"s^//fl似n'c附)ssHAS(US20030235893)，超嗜熱古菌09"/>/^附to^rf似7)stHas(AP000988.1)，小球藻病毒1(/Vwfl附e".m附6"/^flnViCA/o/*e〃flVirus1)，cvHAS(EMBLU42580.3,PB42580,US20030235893)。本發明情況中，術語"谷氨酰胺:果糖-6-磷酸酰胺轉移酶(GFAT)"(E.C.2.6.1.16)，在專業文獻中也稱作葡糖胺合酶，應理解為指從底物谷氨酰胺和果糖-6-磷酸(Fruc-6-P)合成谷氨酰胺-6-磷酸(GlcN-6-P)的蛋白質。催化過程依據以下反應歷程谷氨酰胺+Fmc-6-P—GlcN-6-P+谷氨酸酯尤其是在動物機體中，可能顯示兩種不同的具有GFAT(酶)活性的蛋白質異構體(文獻中分別稱為GFAT-1和GFAT-2)。Hu等人((2004)，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)描述小鼠的相應蛋白質的差異除了討論中的具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸酰胺轉移酶1(GFAT-l)和谷氨酰胺:果糖-6-磷酸酰胺轉移酶2(GFAT-2)(酶)活性的蛋白質在組織特效表達上的差異外，可能這兩種異構體均受到cAMP依賴的蛋白激酶所引起的磷酸化作用的調節。具有GFAT-1(酶)活性的蛋白質的活性被討論中的氨基酸序列中的保守的絲氨酸殘基的磷酸化作用抑制(小鼠GFAT-1中的絲氨酸205，基因庫登錄號AF334736.1)，而具有GFAT-2活性的蛋白質的活性則被討論中的氨基酸序列中的保守的絲氨酸殘基的磷酸化作用增強(小鼠GFAT-2中的絲氨酸202,基因庫登錄號NM—013529)。具有GFAT-1活性的蛋白質和具有GFAT-2活性的蛋白質均以與濃度無關的方式受UDP-N-乙酰氨基葡萄糖濃度的抑制；然而，與具有GFAT-1活性的蛋白質相比(UDP-N-乙酰氨基葡萄糖引起的最大活性降低量約51%或80%),具有GFAT-2活性的蛋白質受UDP-N-乙酰氨基葡萄糖的抑制是較低的(UDP-N-乙酰氨基葡萄糖引起的最大活性降低量約15%)。有跡象表明在動物機體中具有GFAT-1活性的蛋白質的抑制作用與以下事實有關，即在提高UDP-N-乙酰氨基葡萄糖濃度的條件下，所討論的蛋白質存在O-葡萄糖-N-乙酰氨基葡萄糖糖基化作用。這種由O-糖基化作用引起的蛋白質活性調節是否也能發生在植物體內尚未充分了解(HuberundHardin,2004,CurrentOpinioninPlantBiotechnology7，318-322)。本發明情況中，術語"谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺轉移酶-l(GFAT-1)"應理解為指具有GFAT活性并且其活性通過cAMP依賴的蛋白激酶引起的磷酸化來抑制的蛋白質。本發明情況中，術語"谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺轉移酶-2(GFAT-2)"應理解為指具有GFAT活性并且其通過cAMP依賴的蛋白激酶引起的磷酸化激活的蛋白質。本發明情況中，術語"谷氨酰胺:果糖-6-磷酸酰胺轉移酶(GFAT)"被用作理解性術語，其包括所有具有GFAT活性的蛋白質。因此，它也包括文獻中提及作為"谷氨酰胺:果糖-6-磷酸酰胺轉移酶1(GFAT1)"或"谷氨酰胺:果糖-6-磷酸酰胺轉移酶2(GFAT2)"的蛋白質，但并不限于這些。本發明情況中，術語"具有GFAT(酶)活性的蛋白質的增強活性，，指編碼具有GFAT活性的蛋白質的內源基因的增強表達，和/或編碼具有GFAT活性的蛋白質的增加的轉錄量，和/或在細胞中具有GFAT活性的蛋白質的增加量，和/或在細胞中具有GFAT活性的蛋白質的增強的酶活性。例如通過測定編碼具有GFAT活性的蛋白質的轉錄體數量來確定增強的表達，如通過RNA印跡分析或RT-PCR。在此，增強優選地意指與相應的無遺傳修飾的野生型植物細胞或無遺傳修飾的野生型植物相比，轉錄體數量上增加至少50%,特別是至少70%，優選至少85%并且特別優選至少100%。編碼具有GFAT活性的蛋白質的轉錄體數量的增加也意指含有不可檢測數量的編碼具有GFAT活性的蛋白質的轉錄體的植物或植物細胞，在依據本發明進行遺傳修飾后，含有可檢測數量的編碼具有GFAT活性的蛋白質的轉錄體。具有GFAT活性的蛋白質數量的增加例如可通過免疫學方法如蛋白質印跡分析、ELISA(酶聯免疫吸附試驗)或RIA(放射免疫分析法)來檢測，其中GFAT導致提及的植物細胞中的這些蛋白質活性增強。制備與特殊蛋白質發生特定反應，即與所述蛋白質特定地結合的抗體的方法是本領域技術人員公知的(參見例如Lottspeich和Zorbas(編輯)，1998，Bioanalytik[Bioanalysisl，Spektrumakad.Verlag，Heidelberg,Berlin,ISBN3-8274-0041-4>某些公司(如比利時的歐洲基因技術(Eurogentec)公司)提供這些抗體的制劑的定購服務。在此，蛋白質量的增加優選地指與相應的無遺傳修飾的野生型植物細胞或無遺傳修飾的野生型植物相比，具有GFAT活性的蛋白質數量上的增加至少為50%,特別是至少70%,優選至少85%和特別優選至少100%。具有GFAT活性的蛋白質數量的增加也指含有不可檢測數量的具有GFAT活性的蛋白質的植物或植物細胞，在依據本發明進行遺傳修飾后，含有可檢測數量的具有GFAT活性的蛋白質。在植物提取物中具有GFAT活性的蛋白質增強的活性可通過所述的本領域才支術人員7〉知的方法來檢測，如Samac等(2004，AppliedBiochemistryandBiotechnology113-116,HumanaPress,EditorAshokMulehandani，1167-1182，ISSN0273-2289)。檢測具有GFAT活性的蛋白質活性量的優選的方法參見常用方法(GeneraIMethods),條目5。在本專利中，具有GFAT活性的蛋白質的(酶)活性的增量優選地指與類蛋白質活性的增加至少為50%，優選至少70%，尤其優選至少85%和特別優選至少100%。具有GFAT活性的蛋白質的酶活性量上的增加也指含有不可檢測數量的具有GFAT活性的蛋白質的植物或植物細胞，在依據本發明進行遺傳修飾后，含有可檢測數量的具有GFAT活性的蛋白質。本發明情況中，術語"基因組，，應理解為指存在于植物細胞中的全部遺傳物質。本領域技術人員公知的，除細胞核外，其他細胞器(如質粒、線粒體)也包含遺傳物質。本發明情況中，術語"穩定整合的核酸分子"應理解為指核酸分子整合進入植物基因組。穩定整合的核酸分子其特征在于在復制相應整合位點期間，其與在整合位點邊界的宿主的核,列同時加倍，因此復制的DNA鏈中的整合位點凈皮與充當復制子的讀碼鏈上的相同核*列包圍。許多扶術用于將核酸分子穩定結合到植物宿主細胞中。這些技術包括通過使用才艮癌土壤桿菌(Jgra6a"eW"附,"附e/flc/e/w)或毛根土》裏桿菌04gra6flrcfeW"wWi/zog^wes)轉化、原生質體融合、注射、DNA電穿孔、DNA基因槍導入的方式還有其他方法(參見"遺傳修飾植物"綜述，Leandro編輯，HumanaPress2004，ISBNl-59259-827-7)用T-DNA轉化植物細胞。根癌土壤桿菌介導的植物細胞轉化的用途已得到深入研究并已被詳盡地描述于EP120516中(Hoekema，IN:TheBinaryPlantVectorSystemOffsetdrukkerijKantersB.V.Alblasserdam(1985)，ChapterV;Fraley等人，Crit.Rev.PlantSci.4，1-46和在An等人EMBOJ.4，(1985)，277-287)。對于馬鈴薯轉化，參見例如Rocha-Sosa等人，EMBOJ.8，(1989),29-33);對于西紅柿轉化，參見例如US5,565,347。利用基于根癌土壤桿菌的載體轉化單子葉植物也已被描述(Chan等人，PlantMol.Biol.22，(1993)，491-506;Hiei等人，PlantJ.6，(1994)271-282;Deng等人，ScienceinChina33，(19卯)，28-34;Wilmink等人，PlantCellReports11，(1992),76-80;May等人，Bio/Technology13，(1995)，486-492;Conner和Domisse，Int.J.PlantSci.153(1992)，550-555;Ritchie等人,TransgenicRes.2，(1993)，252-265)。轉化單子葉植物的備選系統是利用基因槍方法(WanandLemaux，PlantPhysiol.104，(1994)，37-48;Vasil等人，Bio/Technology11(1993)，1553-1558;Ritala等人，PlantMol.Biol.24，(1994)，317-325;Spencer等人，Theor.Appl.Genet.79，(19卯)，625-631)、原生質轉化、部分浸透的細胞的電穿孔、使用玻璃纖維的DNA介導的轉化。特別地玉米的轉化已被多次描述于文獻中(例如，WO95/06128,EP0513849,EP0465875,EP0292435;Fromm等人，Biotechnology8，(19卯)，833-844;Gordon-Kamm等人，PlantCell2，(1990)，603-618;Koziel等人，Biotechnology11(1993)，194-200;Moroc等人，Theor.Appl.Genet.80，(1990),721-726)。其他草類植物的轉化，例如柳枝稷(Panicumvirgatum)也已被描述(Richards等人，2001,PlantCellReporters20，48-54)。其他谷類植物的成功轉化也已被描述，如大麥(Wan和Lemaux,s.o.;Ritala等人，s.o.;Krens等人，Nature296，(1982)，72-74)和小麥(Nehra等人，PlantJ.5，(1994)，285-297;Becker等人，1994，PlantJournal5，299-307)。上述所有方法均適于本專利的情況。與以前的
技術領域：
相比，本發明中提到的遺傳修飾的植物細胞和遺傳透明質烷量。這使透明質烷以較低成本生產，因為從高透明質烷含量的植物中分離透明質烷較不復雜同時更經濟有效。此外，與現有技術中描述的植物相比，釆用本發明中的經遺傳修飾的植物生產透明質烷需要較小的種植面積。這使得甚至為目前因其稀少和昂責而無法進行的工業應用提供足夠量的透明質烷變成可能。病毒侵染的小球藻植物體不適用于生產相對大量的透明質烷。在透明質烷的生產中，病毒侵染的藻類具有缺點即透明質烷合成所需基因未穩定整合進它們的基因組中(VanEtten和Meints，1999，Annu.Rev.Microbiol.53，447-494J)，這導致為了生產透明質烷必須不斷重復病毒侵染。因此，不可能分離單個能連續合成所需質量和數量的透明質烷的小球藻細胞。而且，在病毒侵染的小球藻中，僅在有限時期內能夠生產透明質烷，并且病毒引起的裂解使得藻類在侵染后僅約8小時死亡(VanEtten等人，2002，ArchVirol147，1479-1516)。相反，本發明提供優勢即根據本發明的遺傳修飾的植物細胞和根據本發明的遺傳修飾的植物能以無限定的方式無性或有性繁殖且它們可連續生產透明質烷。WO05012529中描述的遺傳#"飾植物，其具有編碼透明質烷合酶的核酸分子，合成相對少量的透明質烷。與之相比，本發明提供優勢即根據本發明的遺傳修飾的植物細胞和根據本發明的遺傳修飾的植物合成相當多數量的透明質烷。因此，本發明也提供合成透明質烷的根據本發明的遺傳修飾的植物細胞和根據本發明的遺傳修飾的植物。優選地根據本發明的植物細胞或根據本發明的植物合成至少500嗎透明質烷/g鮮重，優選至少1500ng透明質烷/g鮮重，特別優選至少3500jig透明質烷/g鮮重，尤其優選至少4000jig透明質烷/g鮮重，最優選至少5500將透明質烷/g鮮重。優選地，根據本發明的植物細胞或根據本發明的植物合成至多25000Hg透明質烷/g鮮重，優選至多20000jig透明質烷/g鮮重，特別優選至多15000ng透明質烷/g鮮重，尤其優選至多10000fig透明質烷/g鮮重；最優選至多6500jig透明質烷/g鮮重。已觀察到在整個發育階段透明質烷累積在植物組織中，因此，根據本發明的遺傳修飾的植物細胞和根據本發明的遺傳修飾的植物中關于鮮重或干重的透明質烷量確定于具體指在上述植物或上述植物細胞收獲期間或收獲前l-2天。在此，關于用于進一步處理的透明質垸的量，特別地使用植物材料(例如塊莖、種子、葉)制備。傳修飾的植物可通過分離它們合成的的透明質烷并證實其結構來識別。由于植物組織具有優點即其不含透明質酸酶，可用簡單、快速的分離方法在根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物中確定透明質烷的存在。為此，將水加入待測植物組織中，然后才直物組織被機械性粉碎(如借助珠磨機、攪拌研磨機、互撞式攪拌器、壓汁機等)。如果需要，可將更多的水加入到該懸浮液中，然后細胞碎片和不溶于水的成分可通過離心或篩分移除。然后可通過使用例如特異地結合到透明質烷的蛋白質來證明離心后獲得的上清液中透明質烷的存在。借助特異地結合到透明質烷的蛋白質用于檢測透明質烷的方法描述于例如US5,019,498。檢測試劑盒(如美國科羅拉多州的科占尼克(Corgenix)有限公司的透明質烷(HA)檢測試劑盒，產品號029-001)參見常用方法中條目4)。同時，它能以透明質酸酶初步消化獲得的整分試樣的離心上清液，然后如上所述借助特異地結合到透明質烷的蛋白質確定透明質烷的存在。通過平行組中透明質酸酶的作用，其中存在的透明質烷被降解，這使得徹底消化后，不再能檢測到明顯數量的透明質烷。在離心上清液中透明質烷的存在也可使用其他分析方法證實，如紅外(IR)、磁共振(NMR)或質i普法。玉米中具有與質粒信號肽翻譯融合的GFAT(酶)活性的蛋白質的過表達導致UDP-葡糖胺含量的增加，并且玉米中具有GFAT(酶)活性的蛋白質的細胞溶質的過表達導致地面上胚乳組織中葡糖胺-l-磷酸含量的增加。然而UDP-葡糖胺和葡糖胺-l-磷酸并不是通過透明質烷合酶合成透明質烷的底物。此外，公知的葡糖胺對植物細胞具有細胞毒素作用(Roberts等人，1971，PlantPhysiol.48，36-42)，而且在植物細胞中如果存在相對高濃度的葡糖胺，其會轉變成葡糖胺-6-磷酸。葡糖胺-6-磷酸對植物細胞同樣具有毒性(WO9835047，US6,444,878)。此外，公知的具有GFAT活性的蛋白質可以抑制方式被在另外合成IJDP-N-乙酰葡糖胺的代謝途徑中形成的代謝物調控。例如，從真核細胞(動物和植物體內)中分離的具有GFAT活性的蛋白質被UDP-N-乙酰葡糖胺抑制，其是透明質烷合酶兩種底物之一(Kornfeld，1967，J.Biol.Chem.242(13)，3135-3141;Graack等人，2001，Biochem.J.360，401-412;Mayer等人，1968，PlantPhysiol.43，1097-1107)。GFAT催化反應的直接反應產物葡糖胺-6-磷酸抑制具有GFAT活性的細菌蛋白質(Deng等人，2005，MetabolicEngineering7,201-214)。文獻中沒有指明在植物細胞中可限制合成的透明質烷量的物質。因此，已經驚奇地發現與(僅)具有透明質烷合酶活性的遺傳修飾的植物細胞或遺傳修飾的植物相比，含有編碼透明質烷合酶的核酸分子和額外增強的GFAT活性的遺傳修飾的植物細胞或遺傳修飾的植物產生明顯高的透明質烷量。在優選的實施方案中，本發明涉及根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物，其特征在于與僅具有透明質烷合酶活性的遺傳j資飾的植物細胞或遺傳修飾的植物相比，或與具有透明質烷合酶活性但不具有增強GFAT活性的蛋白質活性的遺傳修飾的植物細胞或遺傳修飾的植物相比，它們產生增加量的透明質烷。本發明情況中，術語"(僅)具有透明質烷合酶活性的植物細胞或植物，，可理解為遺傳修飾的植物細胞或遺傳修飾的植物，其中與相應的無遺傳修飾的野生型植物細胞或無遺傳修飾的野生型植物相比，遺傳修飾存在于包括編碼透明質烷合酶的核酸分子中。特別地，"(僅)具有透明質烷合酶活性的植物細胞或植物"其特征在于它們合成透明質烷且它們除將編碼透明質烷合酶的核酸分子引入無遺傳飾。優選這類植物沒有增強的具有GFAT活性的蛋白質的活性。可借助上述方法確定由植物細胞或植物產生的透明質烷的量。如采用商品化的檢測試劑盒(如美國科羅拉多州的科占尼克(Corgenix)有限公司的透明質烷(HA)檢測試劑盒，產品型號029-001)。本發明情況中用于確定植物細胞或植物中透明質烷含量的優選方法描述于常用方法中的條目4。在本發明另外的實施方案中，根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物分別是合成透明質烷的綠色陸生植物的植物細胞或綠色陸生的植物。在本發明情況中，術語"綠色陸生植物(有胚植物)"應以Strasburger的"LehrbuchderBotanik"(植物學教科書)34版，SpektrumAkad.Verl.，1999，(ISBN3-8274-0779-6)中的定義理解。本發明優選的實施方案涉及多細胞植物的根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或其為多細胞有機體的根據本發明的遺傳修飾的植物。因此，該實施方案涉及并不源于單細胞植物(原生生物)或不是原生生物的植物細胞或植物。它們優選的是農作物，即人工種植用于人和動物食用或用于生產生物量和/或用于技術、工業目的制備原料的植物(例如玉米、稻、小麥、紫花苜蓿、黑麥、燕麥、大麥、樹薯、馬鈴薯、西紅柿、柳枝稷(戶am'cw附Wrgfl似附)、西米、綠豆、pas、高粱、胡蘿卜、茄子、蘿卜、蕓苔、大豆、花生、黃瓜、南瓜、甜瓜、韭菜、大蒜、巻心菜、菠菜、甘薯、,夢、小胡瓜、萵苣、朝鮮薊、甜玉米、歐洲防風草、鴉蔥、耶路撒冷薊、香蕉、甜菜、甘蔗、甜菜根、椰菜、巻心菜、洋蔥、黃甜茱、蒲公英、草莓、蘋果、杏、李子、^^子、葡萄、花椰菜、芽菜、燈籠椒、蕉青甘藍(swede)、大黃)。特別優選的是稻、西紅柿或馬鈴薯植物。在優選的實施方案中，本發明涉及根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物，其中編碼透明質烷合酶的核酸分子的特征在于它編碼病毒的透明質烷合酶。編碼透明質烷合酶的該核酸分子優選編碼侵染藻類的病毒的透明質烷合酶。關于侵染藻類的病毒，編碼透明質烷合酶的核酸分子優選編碼侵染小球藻的病毒的透明質烷合酶編碼，特別優選小球藻病毒l的透明質烷合酶并且尤其優選H1菌林的小球藻病毒的透明質烷合酶。在另外優選的實施方案中，本發明涉及根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物，其中編碼透明質烷合酶的核酸分子的特征在于與透明質烷合酶所源自有機體的編碼透明質烷合酶的核酸分子的密碼子相比，其密碼子是經修飾的。特別優選地，透明質烷合酶的密碼子已被修飾，這使它們適應那些基因組被整合或將被整合的植物細胞或植物的密碼子的使用頻率。由于遺傳密碼的簡并性，氨基酸可被一個或多個密碼子編碼。在不同的有機體中，編碼氨基酸的密碼子的使用頻率不同。使編碼核酸序列的密碼子適應它們在那些表達的序列已被整合到基因組中的植物細胞或植物中的使用頻率會有助于增加特定植物細胞或植物中所討論的翻譯蛋白的數量和/或mRNA的穩定性。所討論的植物細胞或植物中的密碼子的使用頻率可由本領域技術人員通過盡可能多地檢測所討論有機體的編碼核^列，從而確定用于編碼某一氨基酸的某一密碼子的頻率。某些有4幾體密碼子的使用頻率是本領域技術人員公知的并且也可以通過使用計算機程序以簡單而又快捷的方式確定。相應的計算機程序是公開易得的，并且尤其在網上免費提供(葉列^口http:〃gcua.schoedl.de/;http:〃www.kazusa.or.jp/codon/;http:〃www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html)。可通過體夕卜突變或優選通過基因序列的從頭合成來實現使編碼核酸序列的密碼子適應它們在那些所表達的序列已被整合到基因組中的植物細胞或植物中的使用頻率。從頭合成核酸序列的方法是本領域技術人員公知的。例如從頭合成的進行可通過首先合成單個核酸寡核苷酸，將這些核酸寡核苷酸與互補的寡核苷酸雜交，使它們形成DNA雙鏈，然后將這些單個的雙鏈寡核苷酸連接以獲得所需核酸序列。包括適應某靶標有機體所使用的密碼子頻率的核酸序列的從頭合成也可從提供這項服務的公司(例如德國雷根斯堡的安太勒克公司(EntelechonGmbH))獲得。該透明質烷合酶的氨基酸序列與SEQIDNO2中所示的氨基酸序列的同一性至少為70%，優選至少80%，更優選至少90%，特別優選至少95%和最優選至少98%。在特別優選的實施方案中，編碼透明質烷合酶的核酸分子的特征在于它編碼具有SEQIDNo2中所示的氨基酸序列的透明質烷合酵。在另外的實施方案中，編碼透明質烷合酶的核酸分子與SEQIDNO1或SEQIDNO3中所示的核酸序列的同一性至少為70%,優選至少80%，更優選至少90%，特別優選至少95%和最優選至少98%。在特別優選的實施方案中，編碼透明質烷合酶的核酸分子的特征在于它具有SEQIDNo3中所示的核酸序列。根據布達佩斯條約規定，含有編碼小球藻病毒透明質烷合酶的合成核酸分子的質粒IC341-222在2004年8月25日，被保藏在DSMZ(德意志二微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmBH)，馬舍爾歐德路(Mascheroderweg)lb，D-38124不倫瑞克(Braunschweig)，德國)，保藏號為DSM16664。SEQIDNO2中所示的M酸序列可源自于整合到質粒IC341-222中且編碼小球藻病毒透明質烷合酶的核酸序列的編碼區。的遺傳修飾的植物，其中編碼透明質烷合酶的核酸分子的特征在于它編碼的蛋白質的氨基酸序列源自插入到質粒DSM16664中的核酸序列編碼區，或它編碼的蛋白質的氨基酸序列與源自插入到質粒DSM16664中的核*列編碼區的氨基酸序列的同一性至少為70%,優選至少80%,更優選至少卯％，特別優選至少95%和最優選至少98%。本發明也涉及根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物，其中編碼透明質烷合酶的核酸分子的特征在于它是整合ii^粒DSM16664中的透明質烷合酶編碼核酸序列，或其與整合進質粒DSM16664中的核酸序列的同一性至少為70%,優選至少80%,更優選至少卯％，特別優選至少95°/。和最優選至少98%。此外本發明涉及根椐本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物，其特征在于它們具有穩定整合進它們基因組的外源核酸分植物相比，所述的外源核酸分子增強具有GFAT活性的蛋白質的活性。在本發明情況中，術語"外源核酸分子"應理解為指既不是天然存在于相應的野生型植物細胞中，也不是天然存在于野生型植物細胞的具體空間排列中，而是定位在野生型植物細胞基因組中非天然存在的位點上的分子。優選地，外源核酸分子是包括多種元件的重組分子，這些元件的組合或特殊的空間排列并不天然存在于植物細胞中。在本發明情況中，術語"重組的核酸分子，，應理解為指其具有的多個因此，重組的核酸分子除編碼透明質烷合酶和/或具有GFAT活性的蛋白質的核酸分子之外，另外具有與提及的核酸分子非天然組合存在的核酸序列。提及的存在于與編碼透明質烷合酶或具有GFAT活性的蛋白質的核酸分子組合的重組核酸分子中的另外的核酸序列可以是任何序列。例如，它們可以是基因組植物核酸序列。另外的核酸序列優選是調節序列(啟動子、終止信號、增強子)，特別優選的調節序列是在植物組織中有活性的，特別優選的組織特異性調節序列是在植物組織中有活性的。產生重組核酸分子的方法是本領域技術人員公知的，包括基因工程方法，例如通過連接反應的核酸分子連接、遺傳重組或核酸分子的從頭合成(參見例如Sambrok等人,MolecularCloning,ALaboratoryManual，笫3版(2001)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY.ISBN:0879695773，Ausubel等人，ShortProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons;第5版(2002)，ISBN:0471250929)。遺傳修飾的植物細胞和遺傳修飾的植物，其具有一個或多個穩定整合子與相應的無遺傳修飾的植物細胞和無遺傳修飾的植物相比增強具有GFAT活性的蛋白質的活性，可與所述野生型植物細胞和所述野生型植物分別相區分，尤其分別通過它們包含非自然存在于野生型植物細胞和野生型植物中的外源核酸分子的事實，或由于該分子被整合在根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物的基因組中的位點上，其中該位點并不分別存在于野生型植物細胞和野生型植物中，即在不同的基因環境中。而且，此類根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物可分別與無遺傳修飾的植物細胞和無遺傳修飾的植物相區分，如果合適，除了這樣的存在于野生型植物細胞或野生型植物中的分子拷貝外，它們至少包括穩定整合到其基因組中的外源核酸分子的一個拷貝。如果引入到根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修的分子之外的附加拷貝，可將根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳^"飾的植物與野生型植物細胞或野生型植物相區分，特別是通過該附加拷貝/這些附加拷貝被定位在基因組中的某些位點上，而它/它們并不分別存在于野生型植物細胞和野生型植物中的事實。物的基因組間的穩定整合。核酸分子與植物細胞或植物的基因組間的穩定整合的特征在于在遺傳上述核酸分子的后代中，穩定整合的核酸分子存在于和其親代相同的基因組環境中。可通過采用本領域技術人員公知的方法，尤其借助RFLP(限制性片段長度多態性)分析的DNA印跡分析(Nam等人，1989，ThePlantCell1，699-705;Leister和Dean，1993，ThePlantJournal4(4)，745-750);基于PCR的方法，如擴增片段長度中的差異分析(擴增片段長度多態性，AFLP)(Castiglioni等人，1998，Genetics149，2039-2056;Meksem等人,2001,MolecularGeneticsandGenomics265,207-214;Meyer等人，1998，MolecularandGeneralGenetics259，150-160)或采用限制性核酸內切酶酶切的擴增片段(酶切擴增的多態序列，CAPS)(Konieczny和Ausubel，1993，ThePlantJournal4,403-410;Jarvis等人，1994，PlantMolecularBiology24，685-687;Bachem等人，1996,ThePlantJournal9(5)，745-753)來證明在植物細胞基因組或植物基因組中穩定整合的核酸序列的存在。原則上，外源核酸分子可以是在植物細胞或植物中增強具有GFAT活性的蛋白質的活性的任何核酸分子。在本發明情況中，也可通過采用插入誘變的方式制備根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物(參見Thomeycroft等人，2001，JournalofexperimentalBotany52(361)，1593-1601)。在本發明情況中，插入誘變應理解為指將轉座子或轉運DNA(T-DNA)插入到基因或具有GFAT活性的蛋白質的編碼基因的附近，從而提高所討論細胞中具有GFAT活性的蛋白質的活性。轉座子既可以是存在于天然細胞中的轉座子(內源轉座子)也可以是那些非天然存在于上述細胞中，卻由基因工程，例如細胞轉化引入細胞中的轉座子(外源轉座子)。由轉座子引起的基因表達的修飾是本領域技術人員公知的。Ramachandran和Simdaresan撰寫了關于在植物生物
技術領域：
內，應用內源、外源轉座子作為工具的綜述(2001，PlantPhysiologyandBiochemistry39，234-252)。T-DNA插入誘變基于根據根癌土壤桿菌中Ti質粒的某些片段(T-DNA)可被整合到植物細胞基因組中的事實。整合進植物染色體中的位點不是預定的。整合可發生在任何位置。如果T-DNA被整合進片段或被整合ii^現基因功能的染色體片段附近，這可導致增強的基因表達并因此也致使由所討論基因編碼的蛋白質活性改變。導致具有GFAT活性的蛋白質的編碼基因的調節序列激活的序列。優選地，插入到基因組(尤其是轉座子或T-DNA)中的序列的特征在于它們被整合到編碼具有GFAT活性的蛋白質的植物細胞或植物的基因組中的內源核酸分子附近。可使用如激活標記的方法產生根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物(參見例如Walden等人，PlantJ.(1991)，281-288;Walden等人，PlantMol.Biol.26(1994)，1521-1528)。該方法基于增強子序列引起的內源啟動子活^例如花椰菜花葉病毒的35SRNA啟動子的增強子或者章魚堿合酶的增強子。在本發明情況中，術語"T-DNA激活標記"應理解為指T-DNA片段，該T-DNA片段包括增強子序列和通過整合進入植物細胞的基因組來增強具有GFAT活性的蛋白活性。在本發明情況中，術語"轉座子激活標記，，應理解為指轉座子，該轉座子包括增強子序列和通過整合進植物細胞的基因組來增強具有GFAT活性的蛋白活性。本發明優選的實施方案涉及根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物，其特征在于至少有一種編碼具有GFAT(酶)活性的蛋白質的外源核酸分子。本發明特別優選的實施方案涉及根椐本發明的遺傳j務飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物，其特征在于有編碼具有GFAT(酶)活性的蛋白質的外源核酸分子。根據本發明，編碼具有GFAT(酶)活性的蛋白質的外源核酸分子可來自任何有機體，所述核酸分子優選的源自細菌、真菌、動物、植物或病毒，特別優選來自哺乳動物、植物或細菌并且尤其優選來自小鼠或大腸桿菌就病毒而言，編碼具有GFAT(酶)活性的蛋白質的外源核酸分子源自侵染藻類的病毒，優選來自侵染小球藻屬藻類的病毒，特別優選來自小球藻病毒并且尤其優選來自HI菌林的小球藻病毒。也可能將突變產生的核酸分子51入根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物，代替天然存在的編碼具有GFAT(酶)活性的蛋白質的核酸分子，其中所迷誘變的外源核酸分子的特征在于它編碼具有GFAT(酶)活性的蛋白質以減少通過代謝物的抑制作用(例如葡糖胺代謝)。從大腸桿菌中制備具有GFAT(酶)活性的蛋白質的這類誘變核酸分子的制備以示例性的方式被描述在Deng等(2005，MetabolicEngineering7，201-214;WO04003175)中。從小鼠中獲得的具有GFAT活性的蛋白質的突變體^t描述于例如Hu等人(2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)中。編碼具有GFAT活性的蛋白質的核酸分子是本領域技術人員公知的并描述于文獻中。因此，描述了編碼具有GFAT活性的蛋白質的核酸分子，其來自病毒，如小球藻病毒k2(EMBL登錄號AB107976.1);來自細菌，如大腸桿菌(Du汰a-Malen，1988，Biochemie70(2)，287-290;EMBL登錄號Ll0328.1);來自真菌，如釀酒酵母OS"cc/^"/w^c^cweWs/fle)(EMBL登錄號AF334737.1，Watzele等人，1989,J.Biol.Chem.264，8753-8758)、黑曲霉(^5/;e/^7/附w/gw)(EMBL登錄號AY594332.1)、白色念珠菌(am力Vfeflt/Wca";0(EMBL登錄號X94753.1);來自昆蟲，如伊蚊(^erfey(Kato等人，2002，Insect.Biol.11(3),207,216;EMBL登錄號AF399922.1)、黑腹果蠅("nw印/^7"we/做o^wter)(GFAT-1:EMBL登錄號Y18627.1，GFAT-2:NCBI登錄號NMJ43360.2);來自藻類，如草菇(KoMmV""vo/v"cefl)(EMBL登錄號AY661466.1);來自脊推動物，如智人(J7^ms"/^"力(GFAT-1:EMBL登錄號AF334737.1;GFAT-2:NCBI登錄號BC000012.2，Oki等人，1999,Genomics57(2)，227-34)、小家鼠(M"s附"sc"Zms)(GFAT-1:EMBL登錄號AF334736.1;GFAT-2:EMBL登錄號AB016780.1)、或者來自植物，如擬南芥(Jra6/^pws^ff"朋")(EMBL登錄號AP001297.1;cdsNCBI登錄號BAB03027.1)。在優選的實施方案中，本發明涉及根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或沖艮據本發明的遺傳修飾的植物，其中編碼具有GFAT活性的蛋白質的核酸分子選自以下組成的組a)核酸分子，其編碼具有SEQIDNO5中提供的氨基酸序列的蛋白質，或具有SEQIDN07中提供的氨基酸序列的蛋白質，或具有SEQIDN09中提供的氨基,列的蛋白質；b)核酸分子，其編碼的蛋白質的序列與SEQIDNOS、SEQIDNO7或SEQIDN09中提供的氨基酸序列具有至少為60%、優選至少為80%、更優選至少為90%、特別優選至少為95%和最優選至少為98%的同一性；c)核酸分子，其包含SEQIDNO4中所示的核苦酸序列或其互補序列、SEQIDNO6中所示的核苷酸序列或其互補序列、SEQIDNO8中所示的核苷酸序列或其互補序列，或SEQIDNO10中所示的核苷酸序列或其互補序列；d)核酸分子，其與a)或c)中描述的核酸序列的同一性至少為70%，優選至少為80%，更優選至少為90%,特別優選至少為95%和最優選至少為98%;e)核酸分子，其在嚴緊條件下與a)或c)中描述的核酸序列的至少一條鏈雜交；f)核酸分子，其核苷酸序列由于遺傳密碼簡并性而不同于a)或c)中提到的核酸分子的序列；和g)核酸分子，其可以是a)、b)、c)、d)、e)或f)中提到的核酸分子的片段、等位基因變體和/或衍生物。在本發明情況中，術語"雜交"應理解為指在傳統雜交條件下的雜交，優選在嚴緊條件下，描述于例如Sambrock等人(參見MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)中。優選地，"雜交，，指在如下條件下的雜交雜交緩沖液2xSSC;10xDenhardt溶液(Fikoll400+PEG+BSA;比例1:1:1);0.1%SDS;5mMEDTA;50mMNa2HP04;250jig/ml的緋魚精DNA;50ng/ml的tRNA;或25M磷酸鈉緩沖溶液pH7.2;1mMEDTA;7%SDS。雜交溫度T=65-68。C;洗滌緩沖液0.1xSSC;0.1%SDS;洗滌溫度T=65-68°C。與編碼具有GFAT活性的蛋白質的核酸分子雜交的核酸分子可來自任何有機體，因此它們可來自細菌、真菌、動物、植物或病毒。與編碼具有GFAT活性蛋白質的核酸分子雜交的核酸分子特別優選來自哺乳動物、植物或細菌并且尤其優選來自小鼠或大腸桿菌。與編碼具有GFAT-1或GFAT-2活性蛋白質的核酸分子雜交的核酸分子優選來自真核生物，特別優選來自動物有機體，尤其優選來自小鼠。例如，與上述分子雜交的核酸分子可從基因組或cDNA文庫中分離。可用上述核酸分子或這些分子的片段或這些分子的互補體，如根據標準方法(參見Sambrook等人，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)進行的雜交或通過PCR的擴增來識別和分離這樣的核酸分子。例如，作為用于分離編碼具有GFAT活性或GFAT-1活性或GFAT-2活性蛋白質的核酸序列的雜交樣本，可能使用準確的或主要的具有SEQIDN04或SEQIDNO6或SEQIDNO8或SEQIDNO10提供的核香酸序列或這些序列的部分中的核酸分子。寡核苷酸，其序列和本發明情況中描述的核酸分子的序列基本上一致。一旦和本發明情況中描述的核酸序列雜交的基因被鑒定和分離，應確定該序的蛋白質。如何確定蛋白質是否是具有GFAT(例如Mayer等人，1968，PlantPhysiol.43，1097-1107;Deng等人，2005，MetabolicEngineering7，201-214>GFAT-1或GFAT-2(例如Hu等人，2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)活性的蛋白質的方法是本領域才支術人員乂>知的，而且描述于上述文獻中。的片段、衍生物和等位基因變體。在本發明情況中，術語"衍生物，，指這些分子的序列在一個或多個方面與上述核酸分子序列有所不同并且與這些序列高度一致。例如，與上述核酸分子間的差異可能是由于缺失(尤其是5，-和/或3'-缺失，導致相應蛋白質的N-和/或C-末端缺失)、增加、取代、插入或重組。在本發明情況中，術語"同一性"指在核酸分子編碼區的全長范圍內或在編碼蛋白質的氨基酸序列全長范圍內至少70%，優選至少80%,特別優選至少為90。/。并且尤其優選至少95%和最優選至少98%的序列同一性。在本發明情況中，術語"同一性"應理解為指與其他蛋白質/核酸相同的氨基^/核苷酸的數目，以百分數表示。優選地，對于具有GFAT活性的蛋白質的同一性可通過與SEQIDN05或SEQIDNO7或SEQIDNO9提供的氨基酸序列比較來確定，對于編碼具有GFAT活性的蛋白質的核酸分子的同一性可借助計算機程序通過將SEQIDNO4或SEQIDNO6或SEQIDNO8或SEQIDNO10提供的核酸序列與其他蛋白質/核酸比較來確定。如果彼此進行比較的序列具有不同長度，其同一性可通過確定短序列與長序列共有的氨基酸數量的百分比來確定。優選地，可通過采用熟知的、公開采用的計算機程序ClustalW來確定同一'^(Thompson等人，NucleicAcidsResearch22(1994)，4673-4680)。公開可用的ClustalW由JulieThompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和TobyGibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE)兩人開發(歐洲分子生物學實驗室，Meyerhofstrasse1，D69117海德爾堡，德國)。ClustalW也可從各種網頁上下載，另外從IGBMC(InstitutdeGenetiqueetdeBiologieMoleculaireetCellulaire，B.P.163,67404廳rchCedex,France;ftp:〃ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)或從EBI(ftp:〃ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)以及所有的EBI(EuropeanBioinformaticsInstitute,WellcomeTrustGenomeCampus,Hinxton，CambridgeCB101SD，UK)鏡像網頁上下載。優選地，利用1.8版本的ClustalW計算機程序來確定本發明情況中描述的蛋白質與其他蛋白質間的同一性。在此，設置參數如下KTUPLE=1,TOPDIAG=5,WINDOW=5,PAIRGAP=3，GAPOPEN=10，GAPEXTEND=0.05，GAPDIST=8，MAXDIV=40，MATRIX=GONNET，ENDGAPS(OFF),NOPGAP，NOHGAP。優選地，1.8版本的ClustalW計算機程序的用途是用來確定本發明情治乂:^^^紐船比々ui曰j性。在此，設置參數如下KTUPLE=2，TOPDIAGS=4，PAIRGAP=5，DNAMATRIX:IUB，GAPOPEN=10，GAPEXT-5,MAXDIV=40，TRANSITIONS:不加4又。同一性還指在上述核酸分子間或是由其編碼的蛋白質間具有功能和/或結構方面的等值。與上述分子同源的并代表這些分子的衍生物的核酸分子通常是不同于那些代表具有相同生物學功能的修飾的分子。它們既可以是天然存在的差異，例如來自其他物種的序列，或突變，其中這些突變可以自然的方式發生或由靶標突變引入。此外，這些變異也可以是合成產生的序列。等位基因變體可以是天然存在的變體或合成產生的變體或由重組DNA技術產生的變體。衍生物的特殊形式是例如，由于遺傳密碼的簡并性而不同于本發明情況中描述的核酸分子的核酸分子。的性質。例如，這些性質可以是生物活性、底物特異性、分子量、免疫反應、構象等，以及物理性質，如凝膠電泳中的遷移率性質、層析特性、沉降系數、溶解性、分光性質、穩定性、最適pH值、最適溫度等。具有GFAT活性的蛋白質的優選性質是本領域技術人員公知的，已在上文中提到并且在此以類似方式應用。在另外優選的實施方案中，本發明涉及根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物，其中編碼具有GFAT活性的蛋白質的質的核酸分子的特征在于所述核酸分子的密碼子不同于親代有機體中編碼具有GFAT(酶)活性的所述蛋白質的核酸分子密碼子。特別優選地，編碼具有GFAT(酶)活性的蛋白質的核酸分子密碼子被改變，從而使它們適應基因組被整合或將被整合的植物細胞或植物的密碼子的使用頻率。傳修飾的植物，其特征在于穩定整合進入編碼透明質烷合酶和/或編碼具有植物細胞中起始轉錄的調節元件(啟動子)相連接。這些可以是同源的或異源的啟動子。該啟動子可以是組成型的、組織特異的、發育特異的或是受外界因子調節的(例如在應用化學物質后，由非生物因子作用，如熱和/或冷、干旱、疾病等)。在此，編碼透明質烷合酶或具有GFAT1(酶)活性的蛋白質的核酸分子被整合iiX根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物的基因組中，在各個情況下均可連接到相同啟動子，或個體序列可連接到不同啟動子。本發明優選的實施方案涉及根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物，其中選自編碼透明質烷合酶或具有GFAT(酶)活性的蛋白質的核酸分子組成的組的至少一種外源核酸分子，特別優選至少兩種外源核酸分子，尤其優選三種外源核酸分子與組織特異性啟動子連接。優選的組織特異性啟動子是在植物塊莖、果實或種子細胞或葉內特異性起始轉錄的啟動子。為表達編碼透明質烷合酶或具有GFAT(酶)活性的蛋白質的核酸分子，優選其與植物細胞內確保轉錄的調控DNA序列連接。這些特別包括啟動子。通常在植物細胞內任何有活性的啟動子均適用表達。在此，可選擇啟動子，從而使表達是組成型的或僅在某一組織內、在植物發育的某一時間點或由外界因子決定的時間點表達。對于植物和將被表達的核酸分子，啟動子可以是同源的或異源的。例如對于組成型表達，合適的啟動子是花椰菜花葉病毒的35SRNS啟動子或來自玉米或洋丁香(Cestrum)YLCV(YellowLeafCurlingVirus;WO0173087;Stavolone等人，2003，PlantMol.Biol.53，703畫713)的泛素啟動子；馬鈴薯中塊莖特異表達的patatingen啟動子B33(Rocha-Sosa等人，EMBOJ.8(1989)，23-29);或者西紅柿的果實特異性啟動子，例如西紅柿的多聚半乳糖醛酸酶啟動子(Montgomery等人，1993,PlantCell5，1049-1062)或西紅柿的E8啟動子(Metha等人，2002，NatureBiotechnol,20(6)，613-618)或桃中的ACC氧化酶啟動子(Moon和Callahan,2004，J.ExperimentalBotany55(402)，1519-1528)或僅在有光合作用活性的組織內確保表達的啟動子，例如ST-LS1啟動子(Stockhaus等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(1987)，7943-7947;Stockhaus等人，EMBOJ.8(1989)，2445-2451);來自小麥的胚乳特異表達的HMWG啟動子、USP啟動子、菜豆蛋白啟動子、玉米中玉米醇溶蛋白基因的啟動子(Pedersen等人，Cell29(1982)，1015-1026;Quatroccio等人，PlantMol.Biol.15(1990)，81-93)、谷蛋白啟動子(Leisy等人，PlantMol.Biol.14(19卯)，41-50;Zheng等人,PlantJ.4(1993)，357-366;Yoshihara等人，FEBSLett.383(1996)，213-218)、shrunken-1啟動子(Werr等人，EMBOJ.4(1985)，1373-1380)、血球素啟動子(Nakase等人，1996，Gene170(2)，223-226)或醇溶谷蛋白啟動子(QuundTakaiwa，2004，PlantBiotechnologyJournal2(2)，113-125)。然而，也可能采用僅在由外界因子確定下的時間點有活性的啟動子(例如WO9307279)。這里特定的靶標是允許簡單誘導的熱休克蛋白質的啟動子。此外可采用種子特異性啟動子，例如可在蠶豆(W"Vi/"6fl)和其他植物中確保種子特異性表達的蠶豆的USP啟動子(Fiedler等人，PlantMol.Biol,22(1993)，669-679;Baumlein等人，Mol.Gen.Genet.225(1991)，459-467)。存在于感染藻類的病毒基因組中的啟動子也適用于在植物中表達核酸序歹'J(Mitra等人，1994，Biochem.BiophysResCommun204(1)，187-194;Mitra和Higgins,1994，PlantMolBiol26(1)，85-93，VanEtten等人，2002，ArchVirol147，1479-1516)。在本發明情況中，術語"組織特異"應理解為指對某組織的現象的實質性限定(例如轉錄的起始)。本發明情況中，術語"塊莖、果實或種子的細胞"應理解為指存在于塊莖、果實或種子中的所有細胞。本發明情況中，術語"同源啟動子"應理解為指天然存在于植物細胞或植物中用于制備根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物的啟動子(對于植物細胞或植物而言是同源的)或指在從其分離序列的有機體中調節基因的表達調控的啟動子(對于將被表達的核酸分子而言是同源的)。本發明情況中，術語"異源啟動子"應理解為指非天然存在于用于制備根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物的植物細胞或植物中的啟動子(對于植物細胞或植物而言是異源的)或指在從其表達的啟動子(對于將被表達的核酸分子而言是異源的)。也可以是向轉錄物增加poly-A尾的終止序列(多腺苷酸化信號)。poly-A尾被認為是起穩定轉錄物作用。這樣的元件描述于文獻中(參見Gielen等人，EMBOJ.8(1989)，23-29)并可根據需要進行調換。內含子序列也可能存在于啟動子和編碼區之間。這些內含子序列可能導致植物中的表達和增強表達的穩定性(Callis等人，1987，GenesDevel.1，1183-1200;Luehrsen和Walbot，1991，Mol.Gen.Genet.225,81-93;Rethmeier等人，1997;PlantJournal12(4),895-899;Rose和Beliakoff,2000，PlantPhysiol.122(2)，535-542;Vasil等人，1989，PlantPhysiol.91，1575-1579;XU等人，2003，ScienceinChinaSeriesCVol.46No.6，561-569)。例如，合適的內含子序列是玉米shl基因的首個內含子、玉米聚泛素基因1的首個內含子、水稻EPSPS基因的首個內含子、或擬南芥PAT1基因的前兩個內含子之一。物可通過根據本發明的遺傳修飾的植物細胞再生來產生。本發明也涉及根據本發明的遺傳修飾植物的可加工或可消耗的部分，其包括根據本發明的遺傳修飾的植物細胞。在本發明情況中，術語"可加工部分"應理解為指用來制備食品或飼料的植物部分，其被用作工業加工的原材料來源、用作制備藥品的原材料來源、或作為用于制備化妝產品的原材料來源。在本發明情況中，術語"可消耗部分"應理解為指用作人類食物或用作動物飼料的植物體部分。本發明也涉及根據本發明的遺傳修飾的植物的繁殖材料，其包括根據本發明的遺傳修飾的植物細胞。這里，術語"繁殖材料"包括適用于通過生長或生殖途徑產生后代的植物的那些組分。適于植物生長繁殖的如插條、愈傷組織培養物、根莖或塊莖。其他繁殖材料包括如果實、種子、秧苗、原生質體、細胞培養物等。優選繁殖材料主要采用塊莖、果實或種子的形式。在另外的實施方案中，本發明涉及根據本發明的遺傳修飾的植物的可收獲植物體部分，例如果實、貯藏根或其他類型的根、花、蓓蕾、芽、葉子或秸稈，優選種子、果實或塊莖，這些可收獲的部分包括根據本發明的遺傳修飾的植物細胞。優選地，本發明涉及包括透明質烷的根據本發明的繁殖材料或根據本發明的植物的可收獲部分。尤其優選的是合成透明質烷的根據本發明的繁殖材料或根據本發明的植物的可收獲部分。在本發明情況中，術語"馬鈴薯植物"或"馬鈴薯"應理解為指茄(^/aw"附)屬中的植物種，尤指茄屬中的產生塊莖的物種并且特別是馬鈴薯在本發明情況中，術語"西紅柿植物"或"西紅柿"應理解為指番茄(Z^;co/;er5i'cow)屬中的植物種,特另'J是番癡(Z^co/erw'cowescw/ew^i附)。本發明另外的優點是根據本發明的遺傳修飾的植物的可收獲部分、繁殖材料、可加工部分或可消耗部分比在文獻中描述的合成透明質烷的轉基因植物可產生更多的透明質烷。因此，根據本發明的遺傳修飾的植物不僅特別適于用作分離透明質烷的原料，而且還可直接用作食品/銅料或用于制備具有預防或治療疾病特征的食品/飼料(例如用于骨關節炎預防，US6,607,745)。由于根據本發明的遺傳修飾的植物具有比文獻中描述的植物更高的透明質烷含量，這類食品/銅料制備需要較少數量的根據本發明的遺傳修飾植物的可收獲部分、繁殖材料、可加工部分或可消耗部分。例如，如果根據本發明的遺傳修飾植物的可消耗部分被例如作為所謂的"營養食品"直接消耗，可能甚至通過消化相對少量的物質也能獲得陽性效果。這一點在動物飼料生產中尤其具有特殊意義，因為具有太高含量植物成分的動物飼料不適于用作不同動物物種的飼料。由于透明質烷具有強結合水能力，根據本發明的遺傳f務飾的植物的可收獲部分、繁殖材料、可加工部分或可消耗部分還具有當生產固化食品/飼料時需要較少增稠劑的優點。因此，例如，果凍的生產需要低糖，這對健康有著附加的積極作用。在需要植物原料脫水的食品/飼料的生產中，使用根據本發明的遺傳修飾的植物的可收獲部分、繁殖材料、可加工部分或可消耗部分的優點在于從所討論的植物原料中需要移出的水較少，導致生產成本降低，并且由于采用更溫和的制備方法(例如，較低和/或較短的加熱)，所討論的食品/飼料獲得提高的營養價值。因此，例如，在生產番茄醬中，為了獲得期望的稠度而需要導入的能量更少。本發明還提供制備合成透明質烷植物的方法，其包括a)遺傳修飾的植物細胞，其中遺傳修飾包括下面步驟i和ii，i)將編碼透明質烷合酶的外源核酸分子導入植物細胞，ii)將遺傳^務飾導入植物細胞，與相應的無遺傳修飾的野生型植物細胞相比，該遺傳修飾導致具有GFAT(酶)活性的蛋白質活性的增強，其中步驟i和ii可以任何順序單獨進行，或可同時進行步驟i和ii的任一組合；b)將步驟a)中的植物細胞再生成植物；c)如果合適，使用步驟b)的植物產生更多的植物，其中如果合適，從步驟b)的植物中分離植物細胞并且重復該方法的步驟a)至c)，直到產生具有編碼透明質烷合酶的外源核酸分子并且與相應的無遺傳修飾的野生型植物細胞相比具有增強的GFAT(酶)活性的蛋白質活性的植物。本發明優選地涉及用于制備合成透明質烷植物的方法，該方法包括a)遺傳修飾的植物細胞，其中遺傳修飾包括以下步驟i至ii的任一順序或單獨或同時進行步驟i至ii的任一組合，i)將編碼透明質烷合酶的外源核酸分子導入植物細胞，ii)將遺傳〗奮飾導入植物細胞，與相應的無遺傳修飾的野生型植物細胞相比，該遺傳修飾導致具有GFAT(酶)活性的蛋白質活性增強；b)從包含根據以下步驟的遺傳修飾的植物細胞再生植物i)a)iii)a)iiiii)a)i和a)ii;c)導入根據以下步驟的植物的植物細胞i)b)i根椐步驟a)ii的遺傳修飾，ii)b)ii根據步驟a)i的遺傳修飾，和再生植物；d)如果合適，借助根據b)iii或c)i或c)ii的任一步驟獲得的植物生成更多的植物。原則上根據步驟a)導入植物細胞內的遺傳修飾可以是任一類型的導致具有GFAT(酶)活性的蛋白質活性增強的修飾。依據本發明的方法，可通過本領域技術人員公知的方法實現按照步驟b)和(如果合適)步驟c)的植物再生(例如描述于"PlantCellCultureProtocols",1999，editedbyR.D.Hall，HumanaPress,ISBN0-89603-549-2)。例如，根據本發明的方法的另外植物的產生(取決于按步驟c)或步驟d)的方法)可通過植物的繁殖(例如通過插條、塊莖或通過愈傷組織培養和完整植物再生)或通過生殖繁殖實現。在本發明情況中，生殖繁殖通常發生在控制條件下，即選擇的具有特定性質的植物彼此雜交并繁殖。優選的世代延續以這樣的方式發生即更多的植物(取決于按步驟c)或步驟d)產生的方法)包含在前述步驟中引入的修飾。在根據本發明的用于制"成透明質烷的植物的方法中，用于產生根據本發明的遺傳修飾的植物細胞的遺傳修飾可同時或按連續步驟完成。在此，是否^f吏用與將編碼透明質烷合酶的外源核酸分子導入植物細胞中的遺傳修飾相同的方法對于在導致具有GFAT(酶)活性的蛋白質活性增強的連續遺傳修飾是不重要的。在根據本發明的用于制備合成透明質烷的植物的方法的另外的實施方案中，遺傳4奮飾包括將至少一個外源核酸分子引入植物細胞的基因組中，其中外源核酸分子的存在或表達在植物細胞內導致具有GFAT(酶)活性的蛋白質活性增強。如上所述，引入植物細胞或植物中用于遺傳修飾的外源核酸分子是依據本發明方法的步驟a)中引入以用于制備合成透明質烷的植物，其可以是單個核酸分子或多個核酸分子。因此，編碼透明質垸合酶和/或編碼具有GFAT(酶)活性蛋白質的外源核酸分子可在單一核酸分子上共存，或它們可以存在于分開的核酸分子上。如果編碼透明質烷合酶和編碼具有GFAT(酶)活性蛋白質的核酸分子存在于多個核酸分子上，可以同時或以連續的步驟將這些核酸分子導入植物細胞中。此外，為在本發明方法的實踐中引入用來制備合成透明質烷的植物的外源核酸分子，可能采用突變體細胞或突變體來代替野生型植物細胞或野生型植物，這些突變體細胞或突變體因其已具備具有GFAT(酶)活性的蛋白質的增強活性而區別。與相應的野生型植物細胞或野生型植物相比，如果突變體細胞或突變體已具備具有GFAT(酶)活性的蛋白質的增強活性，質烷合酶的外源核酸分子引入所述突變體細胞或突變體中。所有上述涉及突變體用于制備根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的遺傳修飾的植物的用途是以相似方式應用于此。在優選的實施方案中，本發明涉及根據本發明用來生產合成透明質烷的植物，其中步驟a)中編碼透明質烷合酶的核酸分子選自a)核酸分子，其特征在于編碼病毒的透明質烷合酶；b)核酸分子，其特征在于編碼小球藻侵染病毒的透明質烷合酶；c)核酸分子，其特征在于編碼小球藻病毒l的透明質烷合酶；d)核酸分子，其特征在于編碼小球藻病毒1的Hl菌林的透明質烷合酵；e)核酸分子，其特征在于與透明質烷合酶親代有機體中編碼透明質烷合酶的核酸分子的密碼子相比，編碼透明質烷合酶的核酸分子的密碼子是被修飾的；f)核酸分子，其特征在于透明質烷合酶密碼子已被修飾從而可適應那些將被結合或已結合到植物細胞或植物基因組中的密碼子的使用頻率；g)核酸分子，其特征在于它們編碼具有SEQIDNO2中所示的氨基酸序列的透明質烷合酶或編碼的的透明質烷合酶的氨基酸序列與SEQIDN02中所示的氨基酸序列的同一性至少為70%，優選至少為80%，特別優選至少為卯％，尤其優選至少為95%，以及最優選至少為98%;h)核酸分子，其特征在于其編碼蛋白質的氨基酸序列可源于插入質粒DSM16664中的核酸序列編碼區，或其編碼蛋白質的氨基酸序列與源于插入到質粒DSM16664中的核酸序列的編碼區的氨基酸序列具有至少為70%，優選至少為80%，特別優選至少為90%,尤其優選至少為95%,和最優選至少為98%的同一性；i)核酸分子，其包含SEQIDN01或SEQIDN03中所示的核,列，或其包含的核酸序列與SEQIDNO1或SEQIDNO3中所示的核酸序列具有至少為70%,優選至少為80%,更優選至少為90%,尤其優選至少為95%,和最優選至少為98%的同一性；j)核酸分子，其包括插入到質粒DSM16664中的核酸序列，或其核酸序列與插入到質粒DSM16664中的核酸序列具有至少為70%優選至少為80%，優選至少為90%，特別優選至少為95%,個最優選至少為98%的同一性；k)編碼透明質烷合酶的核酸分子，其中編碼透明質烷合酶的核酸序列被連接到植物細胞中啟動轉錄的調節元件(啟動子)，或1)依據k)的核酸分子，其中啟動子是組織特異性啟動子，特別優選尤其是在植物的塊莖、果實或種子細胞中啟動轉錄起始的啟動子。在優選的實施方案中，本發明涉及根據本發明用于生產合成透明質烷的植物的方法，其中編碼具有GFAT活性的蛋白質的核酸分子選自以下組成的組a)核酸分子，其特征在于編碼源自細菌、動物或植物，優選源自大腸桿菌或小鼠的具有GFAT活性的蛋白質；b)核酸分子，其特征在于編碼小球藻侵染病毒的具有GFAT活性的蛋白質；c)核酸分子，其特征在于編碼小球藻病毒的具有GFAT活性的蛋白質；d)核酸分子，其特征在于與親代有機體中編碼具有GFAT活性的相應蛋白質的核酸分子的密碼子相比，該編碼具有GFAT活性的蛋白質的核酸分子的密碼子是被修飾的；e)核酸分子，其特征在于該具有GFAT活性的蛋白質的密碼子是被修飾的從而可適應將被結合或已結合到植物細胞或植物基因組中的密碼子的使用頻率；f)核酸分子，其編碼具有SEQIDNO5所示的氨基酸序列的蛋白質或具有SEQIDNO7所示的氨基酸序列的蛋白質或具有SEQIDNO9所示的氨基酸序列的蛋白質；g)核酸分子，其編碼的蛋白質的序列與SEQIDNO5或SEQIDNO7或SEQIDNO9中所示的氨基酸序列具有至少為70%，優選至少為80%,優選至少為90%,特別優選至少為95%,以及最優選至少為98%的同一性；h)核酸分子，其包含SEQIDN04中所示的核酸序列或其互補序列，或SEQIDNO8中所示的核酸序列或其互補序列，或SEQIDNO10中所示的核酸序列或其互補序列；i)核酸分子，其與h)中描述的核酸序列具有至少為70%,優選至少為80%，優選至少為90%，特別優選至少為95%,以及最優選至少為98%的同一性；j)核酸分子，其與i)或h)中描述的核酸序列的至少一條鏈在嚴緊條件下雜交；k)核酸分子，其核苷酸序列由于基因密碼的簡并性而不同于f)或h)中提到的核酸分子的序列；以及1)核酸分子，其為在a)、b)、c)、d)、e)、i)或h)中提到的核酸分子的片段、等位基因變體和/或衍生物；m)核酸分子，其編碼具有GFAT活性的蛋白質，其中在植物細胞中編碼具有GFAT活性的蛋白質的核酸序列被連接到啟動轉錄的調控元件(啟動子)上；或n)依據m)的核酸分子，其中啟動子是組織特異性啟動子，尤其優選特別是在植物塊莖、葉片、果實或種子細胞中啟動轉錄的啟動子。在另外的優選實施方案中，使用生產合成透明質烷的植物的依據本發明的方法用于生產依據發明的遺傳修飾植物。獲得的植物。本發明另外涉及生產透明質烷的方法，該方法包括從根據本發明的遺傳修飾的植物細胞中、從根據本發明的遺傳修飾植物中、或從根據本發明的繁殖材料中、從根據本發明的可收獲的植物部分中、或通過從根據本發的步驟。優選地，這樣的方法也包括收獲培養的根據本發明遺傳修飾的植物細胞、根據本發明遺傳修飾的植物、根據本發明的繁殖材料、根據本發明可收獲的植物部分、根據本發明可加工的植物部分的步驟，和特別優選的還包括在收獲前培養根據本發明的遺傳修飾的植物細胞或根據本發明遺傳修飾植物的步驟。與細菌或動物組織相比，植物組織不含透明質酸酶且不含任何透明質酸粘素。因此，如上所述，可以采用相對簡單的方法從植物組織中提取透明質烷。如果需要，可通過本領域技術人員公知的方法進一步純化上述的含有透明質烷的植物細胞或組織的含水提取物，例如用乙醇重復沉淀。優選的純化透明質烷的方法描述于常用方法的條目2。提取透明質烷的方法已有描述，其也適用于從根據本發明的繁殖材料、根據本發明的可收獲的植物部分或通過根據本發明用于制備合成透明質烷植物的方法可獲得的植物或植物部分中分離透明質烷。本發明也提供根據本發明的遺傳修飾的植物細胞、根據本發明的遺傳修飾的植物、根據本發明的繁殖材料、根據本發明的可收獲的植物部分、獲得的植物的用途。本發明還涉及包含根據本發明遺傳修飾的植物細胞的組合物。在此，植物細胞是完整的或由于其例如通過加工已遭破壞而不再完整已不重要。該組合物優選是食品或飼料、藥品或化妝品。本發明優選提供組合物，該組合物包含根據本發明的遺傳修飾的植物細胞、根據本發明的遺傳修飾植物、根據本發明的繁殖材料、根據本發明重組的核酸分子，其中重組核酸分子的特征在于其包含編碼透明質烷合酶和具有GFAT活性的蛋白質的核酸分子。外源核酸分子穩定整合進植物細胞或植物的基因組中導致整合進植物細胞或植物基因組后外源核酸分子側翼為基因組植物核酸序列。因此，在優選的實施方案中，根據本發明組合物的特征在于存在于根據本發明組合物中的重組核酸分子側翼為基因組植物核酸序列。因組中用于制備組合物的任一序列。根據本發明的組成物中存在的重組核酸分子可以是單個或多個重組核酸分子，該編碼透明質烷合酶和具有GFAT(酶)活性的蛋白質的核酸分子存在于核酸分子上，或可存在于分開的重組核酸分子上的那些核酸分子。編碼透明質烷合酶或編碼具有GFAT(酶)活性的蛋白質的核酸分子可共存于單一的重組核酸分子中，或兩個上述核酸分子可共存于單一的重組核酸分子上且笫三個核酸分子可以任何可能的組合存在于另一重組核酸分子中，或上述所有核酸分子在任何情況下均可存在于單個分開的重組核酸分子中。取決于編碼透明質烷合酶或編碼具有GFAT(酶)活性的蛋白質的核酸分子是如何存在于根據本發明的組合物中，它們可以以相同的或不同的基因組的植物核^列為側翼。可以使用本領域技術人員公知的方法，例如基于雜交的方法或優選地采用基于PCR(聚合酶鏈式反應)的方法證明根據本發明包括重組的核酸分子的組合物。優選地，根據本發明的組合物包含至少0.005%、優選至少0.01%、特別優選至少0.05%和尤其優選至少0.1%的透明質烷。優選地，根據本發明的組合物包含至多5%、優選至多2%、特別優選至多1%和尤其優選至多0.5%的透明質烷。正如上面已提到，利用根據本發明遺傳修飾的植物細胞、根據本發明遺傳修飾的植物、根據本發明的繁殖材料、根據本發明的可收獲的植物部分、根據本發明的可加工的植物部分、根據本發明的可消耗的植物部分或通過根據本發明方法可獲得的植物來制備食品或飼料是可能的。然而，也可能作為原材料用于工業應用，而無須分離透明質烷。因此，例如，根據種植區域以實現增強土壤結合水能力。此外，根據本發明遺傳修飾的植物或根據本發明遺傳修飾的植物細胞可用于制備干燥劑(如在裝配濕度敏感于這些應用,根據需要;采用完整的根據^發明ij傳^飾的植物、根據本發明遺傳修飾的植物的部分，或粉碎的根據本發明遺傳修飾的植物或根據本發明植物部分。在采用地被植物或植物部分的領域中適于應用的特別是含有透明質烷但僅含低比例水的植物部分。優選的是谷類植物(玉米、水稻、小麥、黑麥、燕麥、大麥、西米或高粱)的谷粒。由于根據本發明遺傳修飾的植物細胞和根據本發明遺傳修飾植物具有比文獻中描述的遺傳修飾植物更高的透明質烷含量，與這些相比，當采用的原料為根據本發明的遺工業應用。本發明也提供用于制備根據本發明的組合物的方法，其中采用根據本發明的遺傳修飾的植物細胞、根據本發明的遺傳修飾的植物、根據本發明的繁殖材料、根據本發明的可收獲的植物部分、根據本發明的可加工的植物部分、根據本發明的可消耗的植物部分或通過根據本發明用來生產合成透明質烷植物的方法能獲得的植物作為原料。制備根據本發明組合物的方法優選的是用于制備食品或飼料的方法、用于制備藥品的方法或用于制備化妝品的方法。用于制備食品或祠料的方法是本領域技術人員公知的。在工業領域使術人員公知的并且其中包括粉碎和切割根據本發明遺傳修飾的植物或根據本發明植物部分的方法，然而，他們并不是專有的限制于此。在上文已描述了使用根據本發明用于制備食品/飼料或用于工業領域的目的材料產生的某些優點。烷組合物的方法。本發明也涉及根據本發明遺傳修飾的植物細胞的用途、根據本發明遺傳修飾的植物的用途、根據本發明繁殖材料的用途、根據本發明可收獲的植物部分的用途、根據本發明可加工的植物部分的用途、根據本發明可消耗的植物部分的用途或通過根據本發明生產合成透明質烷用于制備根據本發明的組合物的植物的方法獲得的植物的用途。優選的是根據本發明遺傳修飾的植物細胞的用途、根據本發明遺傳修飾的植物的用途、根據本發明繁殖材料的用途、根據本發明可收獲的植物部分的用途、根據本發明可加工的植物部分的用途、根據本發明可消耗的植物部分的用途或通過根據本發明生產合成透明質烷用于制備根據本發明的食品或飼料的植物的方法獲得的植物的用途。序列描述SEQIDN01:編碼小球藻病毒1的透明質烷合酶的核酸序列。SEQIDN02:小球藻病毒1的透明質烷合酶的氨基酸序列。所示的氨基酸序列可衍生自SEQIDNO1。SEQIDNO3:編碼小球藻病毒1的透明質烷合酶的合成的核^列。完成所示序列的密碼子合成從而適應在植物細胞中的密碼子使用。所示的核酸序列編碼具有SEQIDNO2中所示氨基酸序列的蛋白質。SEQIDNO4:小鼠的編碼具有GFAT-1活性的蛋白質的核酸序列。SEQIDNO5:小鼠的具有GFAT-1活性的蛋白質的氨基^列。所示的氨基酸序列可衍生自SEQIDNO4。SEQIDNO6:小鼠的編碼具有GFAT-2活性的蛋白質的核酸序列。SEQIDNO7:小鼠的具有GFAT-2活性的蛋白質的氨基,列。所示的氨基酸序列可衍生自SEQIDNO6。SEQIDNO8大腸桿菌的編碼具有GFAT活性的蛋白質的核酸序列。SEQIDNO9:大腸桿菌的具有GFAT活性的蛋白質的氨基酸序列。所示的氨基*列可4汙生自SEQIDNO8。SEQIDNOltt大腸桿菌的編碼具有GFAT活性的蛋白質的合成的核酸序列。完成所示序列的密碼子的合成從而適應在植物細胞中的密碼子使用。所示的核酸序列編碼具有SEQIDNO9中所示的氨基酸序列的蛋白質。SEQIDNOll:實施例1中采用的合成的寡核苷酸。SEQIDNO12:實施例1中采用的合成的寡核苷酸。SEQIDNO13:實施例10中用作PCR引物的合成的寡核苷酸。SEQIDNO14:實施例10中用作PCR引物的合成的寡核苷酸。所有引用的文獻，包括但不限于核酸和氨基酸序列的登錄號，全部作為參考引入說明書中。附圖描述圖1:顯示校準曲線和用于計算植物組織中透明質烷含量的相應線性回歸方禾艮借助商品試劑盒(美國科羅拉多州科占尼克(Corgenix)公司的透明質烷(HA)試劑盒，產品號029-001)和由其提供的標準溶液繪制校準曲線。常規方法可用于本發明的方法如下所迷。這些方法為特定的實施方案。然而本發明并不限于這些方法。本領域技術人員公知，可以相同的方式通過修改部分來實現本發明。1.馬鈴薯植物的轉化借助土壤桿菌轉化馬鈴薯植物，描述于Rocha-Sosa等(EMBOJ.8，(1989)，23-29)。2.從植物組織中分離透明質烷為檢測透明質烷的存在和檢測植物組織中透明質烷的含量，按以下方式處理;f直物材料將200nl水(去離子化，電導率》18Mfl)加入到約0.3g材料中，并將混合物在實驗室振蕩珠磨機(MM200型，德國萊馳生產，30Hz下30秒)中粉碎。然后再加入800nl水(去離子化，電導率》18MQ)，并將混合物混勻(例如使用渦流攪拌器)。在16000xg條件下離心5分鐘使細胞碎片及不溶組分與上清液分離。3.透明質烷的純化將大約100g的塊莖剝、切成尺寸約為lci^的小塊，然后加入100ml水(去離子化，電導率〉18Mil),用互撞式攪拌機在最大速度下粉碎約30秋然后通過茶葉濾網去除細胞碎片。將去除的細胞碎片重新懸浮于300ml水中(去離子化，電導率>18Mil)并再使用茶葉濾網將其去除。將兩次得到的懸浮液(IOOml+300ml)組合并在13000xg下離心15分鐘。將氯化鈉加入到離心后獲得的上清液中，^使其在上清液中的終濃度達到1%。加完氯化鈉后，加入兩倍體積的乙醇進行沉淀，然后徹底混合并在-20。C孵育過夜。然后將混合物在13000xg下離心15分鐘。將離心后獲得的沉淀物溶解于100ml的緩沖液(50mMTrisHCl，pH8，1mMCaCl2)并然后加入蛋白酶K，使其終濃度達到100ng/ml并且該溶液在42°C孵育2小時。然后在95。C孵育10分鐘。再次將氯化鈉加入到該溶液中并使其終濃度達到1%。加完氯化鈉后，再次用兩倍體積的乙醇進行沉淀，徹底混合并在-20。C孵育約96小時。接下來在13000xg下離心15分鐘。將離心獲得的沉淀物溶解于30ml水中(去離子化，電導率>181\1),并再次加入氯化鈉并使其終濃度達到1%。加入兩倍體積的乙醇，徹底混合并在-20。C孵育過夜，再次沉淀。將在13000xg下離心15分鐘獲得的沉淀物溶解于20ml水中(去離子化，電導率^18M11)。通過離心過濾完成進一步純化。為此，每次將5ml溶解的沉淀物加到膜過濾器中(CentriconAmicon，孑L隙寬度10000NMWL，產品號UCF801096)，并將樣品在2200xg下離心直到過濾器中僅剩約3ml左右的溶液。然后以兩次以上，每次將3ml水(去離子化，電導率》18MQ)加入到膜上的溶液中并每次在相同的條件下再次離心直到過濾器上僅剩約3ml的溶液為止。將離心過濾后仍存在于膜上的溶液棄除并且膜用約1.5ml水(去離子化，電導率>18MQ)反復沖洗(3-5次)。將仍存在于膜上的所有溶液與沖洗得到的溶液組合，加入氯化鈉并使其終濃度達到1%。加完氯化鈉后，加入兩倍體積的乙醇，樣品混合并在-20。C貯存過夜以獲得沉淀物。將在13000xg下離心15分鐘后獲得的沉淀物溶解于4ml水(去離子化，電導率>18MJ1)中，然后冷凍干燥(在壓力為0.37毫巴下冷凍干燥24小時，冷凍干燥器ChristAlpha1-4產自德國Osterode市的克里斯坦(Christ)公司)。4.透明質烷的檢測和透明質烷含量的測定透明質烷的檢測采用商品試劑盒(美國科羅拉多州科占尼克(Corgenix)公司的透明質烷(HA)試劑盒，產品號029-001)并按生產商提供的說明書進行，其凈皮引用作為參考。測試原理是基于可特異地結合透明質烷的蛋白質(HABP)的可用性并通過類似酶聯免疫吸附實驗(ELISA)完成，其中樣品檢測中的顏色反應指示透明質烷含量。因此，對于定量檢測透明質烷，被測樣品應在規定的濃度限制范圍內(例如所討論的樣品的稀釋或使用少量水從植物組織中提取透明質烷，取決于是否超過或未達到限定量。在平行樣中，部分待測樣品首先被透明質酸酶消化并然后使用商品試劑盒(美國科羅拉多州科占尼克(Corgenix)公司的透明質烷(HA)試劑盒，產品號029-001)測量。透明質酸酶消化可通過在透明質酸酶緩沖溶液(0.1M磷酸鉀緩沖溶液，pH5.3;150mMNaCl)中加入400ji1的馬鈴薯塊莖汁和5pg(約3個單位)透明質酸酶(希格瑪(Sigma)公司的透明質酸酶III型，產品號H2251),并在37°C孵育30分鐘。在每一情況下按1:10稀釋，然后使用所有樣品測其透明質烷含量。5.GFAT活性的測定測定具有GFAT活性的蛋白質活性凈皮描述于Rachel等(1996，J.Bacteriol.178(8),2320-2327)。為了區分蛋白質是否具有GFAT-1或GFAT-2的活性，使用描述于Hu等人(2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)的方法。6.稻植物的轉化通過Hiei等人描述的方法轉化稻植物(1994，PlantJournal6(2),271-282)。7.西紅柿才直物的轉化按照US5,565,347中描述的方法，借助土壤桿菌轉化西紅柿植物。實施例1.植物表達載體IR47-71的制備質粒pBinAR是二元栽體質粒pBinl9(Bevan，1984，NuclAcidsRes12:8711-8721)的衍生物。其按照如下構建將長度為529bp、包含花椰菜花葉病毒35S啟動子的核普酸6909-7437的片段作為五"及I/X/mI片段從質粒pDH51中分離(Pietrzak等人，1986NucleicAcidsRes.14，5858)，并連接到pUC18的多接頭中的I和《/mI限制性位點之間。以這種方式形成質粒pUC18-35S。采用限制性核酸內切酶仔,>1</III和戶vwII，可將長度為192bp、包括Ti質粒pTiACH5(Gielen等人，1984,EMBOJournal3，835-846)(核苷酸11749-11939)的T-DNA的章魚堿合酶基因(基因3)的多聚腺苦酸化信號(3，端)的片段從質粒pAGV40中分離(Herrera-Estrdla等人，1983Nature,303，209-213)。接下來將I接頭添加到iVwII的限制性位點，該片段就被連接到pUC18-35S的5^AI和好Zm/III限制性位點間。這就得到了質粒pA7。在此，使用五"及I和好/m/III將包含35S啟動子和ocs終止子的整個多接頭切離并連接進適當切割的載體pBin19中。這就得到了植物表達載體pBinAR(H6fgen和Willmitzer，1990,PlantScience66，221-230)。來自馬鈴薯植物塊莖的patatin基因B33的啟動子(Rocha-Sosa等人，1989，EMBOJ.8，23-29)被作為I片段(核*酸-1512-十14)連接進入其末端已用T4-DNA聚合酶平末端化的^/I切割栽體pUC19上這就得到了質粒pUC19-B33。使用Em及I和S附flI將B33啟動子從該質粒中切離并連接進適當的限制性載體pBinAR中。這就得到了植物表達載體pBinB33。為筒化進一步的克隆步驟，延長MCS(多克隆位點)。為此，合成兩個互補寡核苷酸在95。C加熱5分鐘，緩慢冷卻到室溫以產生較好的固定(退火)并克隆進pBinB33的Sa/I和A/mI限制性位點。用于此目的的寡核苷酸具有以下序列5國TCgACAggCCTggATCCTTAATTAAACTAgTCTCgAggAgCTCggTAC-3，5畫CgAgCTCCTCgAgACTAgTTTAATTAAggATCCAggCCTg-3'所得質粒命名為IR47-71。2.植物表達栽體pBinARHyg的制備使用限制性核酸內切酶I和//Z/iflfIII將包含35S啟動子、ocs終止子和整個多克隆位點的片段從pA7中切離并克隆進采用相同限制性核酸內切酶切割的載體pBIBHyg中(Becker，1990，NucleicAcidsRes.18，203)。所得質粒命名為pBinARHyg。3.植物表達載體pBinB33-Hyg的制備將包含B33啟動子、多接頭部分和ocs終止子的五c^I-F//^111片段從質粒pBinB33上切離并克隆進合適的限制性載體pBIB-Hyg中(Becker，19卯，NucleicAcidsRes.18，203)。所得植物表達載體命名為pBinB33-Hyg。4.核酸分子的合成a)編碼小球藻病毒l的透明質烷合酶的核酸分子的合成編碼小球藻病毒1的透明質烷合酶(HAS)的核酸序列由麥迪基因組(MedigenomixGmbH)有限公司(慕尼黑，德國)合成并克隆進來自英杰(Invitrogen)公司的載體pCR2.1中(產品號K2000-01)。所得質粒命名為IC323-215。編碼來自小球藻病毒1的HAS蛋白的合成的核,列顯示于SEQIDN03中。從小球藻病毒l中最初分離的相應的核酸序列顯示于SEQIDNOl中。b)從大腸桿菌中合成編碼具有GFAT活性的蛋白質的核酸分子編碼具有GFAT活性的蛋白質的核酸分子由安太勒克公司(EntelechonGmbH)從大腸桿菌中合成并克隆進入來自英杰(Invitrogen)公司的載體pCR4Topo中(產品號K4510-20)。所得質粒命名為IC373-256。從大腸桿菌中合成的編碼具有GFAT活性的蛋白質的核酸序列顯示于SEQIDNO10。從大腸桿菌中最初分離的相應的核酸序列顯示于SEQIDNO8。5.其他核酸分子的來源a)源自小鼠的編碼具有GFAT-1活性的蛋白質的核酸分子編碼具有GFAT-1活性的蛋白質的核酸序列購自海德爾堡的生物貓有限司(BioCatGmbH)(ArtNo,MMM1013畫65346，cDNA克隆MGC:58262，映像(IMAGE):6742987)。這是由LM.A.G.E.Konsortium生產的克隆(http:Vimage.llnl.gov)，且由生物貓有限公司(BioCatGmbH)銷售。在此，將編碼具有GFAT-1活性的蛋白質的cDNA克隆進來自英杰(Invitrogen)公司的載體pCMVSport6中。所得質粒命名為IC365-256。與SEQIDNO4中所示核酸序列相比，插入IC365-256中、來自小家鼠(TkT^/mwcM/附)的編碼具有GFAT-1活性的蛋白質的核酸序列在1090位有從T到C的堿基交換且在2027位有從G到A的堿基交槐這些堿基交換并未導致由兩種不同核酸分子編碼的氨基酸序列的氨基酸交換。來自小鼠的編碼具有GFAT-1活性的蛋白質的核酸序列顯示于SEQIDNO4中。為了簡化后續的克隆步驟，采用限制性核酸內切酶X/irI和五coRV將編碼具有GFAT-1活性的蛋白質的序列從IC365-256中分離并克隆進入用相同的限制性核酸內切酶切割的具有修飾的多克隆位點的質粒pME9(來自斯徹特(Stratagene)公司的pBlueSkript載體)中，該質粒在兩端額外的具有尸"cI限制性位點。獲得的質粒命名為IC367-256b)來自小鼠的編碼具有GFAT-2活性的蛋白質的核酸分子來自小鼠的編碼具有GFAT-2活性的蛋白質的核酸分子購自英杰(Invitrogen)公司(克隆ID4167189，eDNA克隆MGC:18324，映象(IMAGE):4167189)。這是由I.M.A.G.E.Konsortium生產的(http:y7image.llnl.gov)、由英杰(Invitrogen)公司銷售的克隆。在此，編碼具有GFAT-2活性的蛋白質的cDNA被克隆進入來自英杰(Invitrogen)公司的載體pCMVSport6中。該質粒命名為IC369-256。源自小家鼠的編碼具有GFAT-2活性的蛋白質的核酸序列顯示于SEQIDNO6中。6.包括編碼小球藻病毒l的透明質烷合酶的核酸序列的植物表達載體IC341-222的制備釆用5fl附FI和A7roI限制性消化，將包括透明質烷合酶編碼序列的核酸分子從質粒IC323-215中分離并克隆進質粒IR47-71的I和JV7^I的限制性位點。所得植物表達栽體命名為IC341-222。7.來自小鼠、包括編碼具有GFAT-2活性蛋白質的核酸序列的植物表達栽體IC399-299的制備采用XAoI和爿s/;718限制性消化，將來自小釓包含編碼具有GFAT-2活性的蛋白質序列的核酸分子從質粒369-256中分離并克隆進入已被相同限制性核酸內切酶切割的植物表達載體pBinB33-Hyg中。所得植物表達載體凈皮命名為IC399-299。8.來自大腸桿菌、包含編碼具有GFAT活性蛋白質的核酸序列的植物表達載體IC399-300的制備通過用5VicI和限制性消化，將來自大腸桿菌、包含具有GFAT活性的蛋白質編碼序列的核酸分子從質粒373-256中分離并克隆進已被相同限制性核酸內切酶切割的植物表達載體pBinB33-Hyg中。所得植物表達載體命名為IC399-300。9.含有編碼小球藻病毒l的透明質烷合酶的核酸序列的植物表達載體pBA16的制備采用限制性核酸內切酶j印7181，將包括編碼小球藻病毒l的透明質烷合酶的核^列的片段從質粒IC323-215中分離，片段末端用Klenow聚合酶平末端化并然后將得到的片段再次用限制性核酸內切酶尸MI切割。以這種方式獲得的片段被連接進入已被限制性核酸內切酶尸"cI和五c/"6II切割的質粒IR103-123中(見WO2006032538)。所得植物表達載體稱為pBA16。10.植物表達栽體IC386-299的制備來自稻醇溶谷蛋白啟動子的DNA(EMBL登錄號D63901，Sha等人，1996，Biosci.Biotech.Biochem.60，335-337，Wu等人，1998.PlantCellPhysiol.39(8)，885-889)通過使用從稻(Oryzasativa)(栽培變種M202)葉片中分離的基因組DNA來擴增。使用的PCR擴增條件使用DNA聚合酶高保真擴增系統(PCR系統，羅氏公司(Roche)產品Nr.:1732641)進行擴增。采用前述試劑盒制造商提供的條件和緩沖液。DNA:50ng的基因組稻DNAdNTP:0.83jiMdNTP混合物0.25fiM引物prol-Fl5-AAAAACTAGTTCTACATCGGCTTAGGTGTAGCAACACG0.25jiM引物prol-Rl5-AAAAGATATCTGTTGTTGGATTCTACTACTATGCTTCAA反應條件步驟l94X:15秒步驟215秒步驟372。C45秒將步驟1至3重復35次，之后冷卻反應到4。C。通過使用TA克隆試劑盒(英杰(Invitrogen)公司，產品號KNM2040-01)將PCR擴增得到的片段克隆進質粒pCR2.1中。將獲得的質粒命名為Ml4-154。通過使用限制性核酸內切酶7VWI和/T/mI將源自小鼠、包含具有GFAT-2活性的蛋白質編碼序列的核酸片段從質粒IC369-256中分離并克隆進載體pMCS5的iVWI和iTp/iI位點(購自MoBiTec)。所得質粒命名為IC385-299。通過使用限制性核酸內切酶AT^I和好/^I將來自小鼠、包含具有GFAT-2活性的蛋白質編碼序列的核酸片段從質粒IC385-299中分離并克隆進質粒Ml9-154的A7ioI和Ec/"611位點。所得質粒命名為IC386-299。制備載體Ml9-154的基礎是質粒ML18-56(WO05030941)。通過兩個互補的合成寡核苷酸的退火來制備包含用來克隆進限制性位點F/m/III和/^I的粘性末端且包含額外的限制性位點尸"I、Sacl、仏ViI、XZioI、H/;"I、S/7el和好i'mfIII的多重克隆位點(MCS)。將退火的寡核苷酸克隆進質粒ML18-56的限制性位點i^>/III和戶WI。所得載體命名為MI8-154。通過采用限制性核酸內切酶五"7V和5^eI將包括醇溶谷蛋白啟動子的核酸片段從質粒M14-154中分離并克隆進載體M18-154中。所得質粒命名為Ml9-154。采用常用方法中條目l給出的方法，在馬鈴薯植物塊莖的patatin基因B33啟動子控制下(Rocha-Sosa等人，1989，EMBOJ.8,23-29)，使用植物表達載體IC341-222轉化馬鈴薯植物(cvDesiree),該載體包含編碼小球藻病毒l的透明質烷合酶的核酸序列。用質粒IC341-222轉化獲得的遺傳修飾馬鈴薯植物被命名為365ES。12.用包含編碼透明質烷合酶的核酸分子的植物表達栽體轉化的轉基因植物的分析a)校準曲線的構建依據生產商描迷的方法使用商品試劑盒(美國科羅拉多州科占尼克(Corgenix)公司的透明質烷(HA)試劑盒，產品號029-001)提供的標準溶液來構建校準曲線。為確定透明質烷含量為1600ng/ml時的消光值，采用兩倍于根據生產商指出的供給標準量(使用含800ng/ml的透明質烷)。在每一情況下，完成三個獨立測量系列并確定相應的均值。該方法給出以下的標準曲線<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>表1:在植物組織中用于構建定量檢測透明質烷含量的標準曲線的數值。借助軟件(微軟Excel2002，SP2)將所得測量值輸入到圖表中并得到趨勢線的函數方程式(見圖1)。Ew指在波長為450nm處的消光值，s.d.是個體數值的計算平均值的標準差。b)365ES品系的馬鈴薯塊莖分析在溫室中，將365ES品系的個體植林培養在6cm厚土壤的盆內。在每一情況下，根據常用方法中條目2描述的方法將大約0,3g的單林馬鈴薯塊莖材料進行加工。采用常用方法中條目4描述的方法，借助實施例12a)和圖1中所示的校準曲線，可確定存在于各植物提取液中的透明質烷量。在此，離心后獲得的上清液以1:10稀釋用于檢測透明質烷含量。對于待選植物，獲得以下結果<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>.表2:由365ES品系單獨的轉基因植物產生的透明質烷量(以ng透明質烷/g鮮重計)。第1列指從其獲取塊莖材料的植物(這里的"野生型"指未轉化的植物，然而其具有用作轉化起始材料的基因型)。第2列指所討論的用于檢測透明質烷含量的植物塊莖材料的量。第3列含有各個植物提取液以1:10稀釋所測得的消光值。第4列是考慮稀釋因子借助線性回歸方程(見圖l)計算的結果，計算如下(第3列數值-0.149)/0.00185)x10)。第5列指基于使用的鮮重的透明質烷的量，和按如下計算(第4列數值/第2列數值)/1000。"n.d."指未檢出。13.用來自大腸桿菌、包含編碼具有GFAT活性的蛋白質的核酸序列的植物表達載體轉化合成透明質烷的植物a)植物的轉化在每一情況下使用常用方法中條目1給出的方法用植物表達載體IC399-300轉化365ES13和365ES74品系的馬鈴薯植物。用質粒IC399-300轉化365ES74品系后，獲得的遺傳修飾馬鈴薯植物命名為433ES。b)433ES品系的馬鈴薯塊莖的分析在溫室中，將433ES品系的個體植林培養在6cm厚土壤的盆內。在每一情況下，根據常用方法中條目2描述的方法將大約0.3g的單林馬鈴薯塊莖和/或葉片材料進行加工。采用常用方法中條目4描述的方法，借助實施例12a)和圖1中所示的校準曲線，可確定存在于各植物提取液中透明質烷的量。在此，使用離心后獲得的上清液以1:10稀釋用于檢測透明質烷含量。對于選擇的植物，可得出以下結果<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>表3:由433ES品系單獨的轉基因植物產生的透明質烷量(以ng透明質烷/g鮮重計)。第1列指從其獲取塊莖或葉材料的植物(這里的"野生型，，是指未轉化的才直物并且ES36574指用作以質粒c399-300轉化的起始材料的植物)。第2列和第3列分別指在植物葉和塊莖中檢測到的透明質烷量。14.稻植物的轉化a)使用具有包括編碼小球藻病毒1的透明質烷合酶的核酸分子的植物表達載體采用常用方法中條目6給出的方法，在稻的球蛋白基因啟動子控制下，使用植物表達栽體pBA16轉化稻植物(栽培變種M202),該載體包括編碼小球藻病毒l的透明質烷合酶的核酸序列(Wu等人，1998，PlantCellPhysiol.39(8)，885-889)。用質粒pBA16轉化的轉基因稻植物稱作Os-pBA16。b)使用包含來自小鼠的編碼具有GFAT-2活性的蛋白質的核酸序列的植物表達載體采用常用方法中條目6給出的方法，在稻的13-kDa醇溶谷蛋白多肽啟動子控制下，使用植物表達載體IC386-299轉化稻植物(栽培變種M202),該載體含有來自小鼠的編碼具有GFAT-2活性的蛋白質的核^列。用質粒pBA16轉化的遺傳修飾水稻植物稱作GAOS0788。15.Os-pBA16品系的稻植物的分析a)未成熟的稻種子收集由OS-pBA16品系的個體植林產生的、在溫室土壤中培養的未成熟的稻種子(授粉后5至10天)、在液氮中冷凍并于-80。C保存。隨機選擇個體植物三粒冷凍谷粒，擠出胚乳、集合、稱重并再次在液氮中冷凍。樣品用珠磨器(MM200型，FirmaRetsch，德國)破碎，加入100jil水，將勻漿物混合、離心(13000xg，5分鐘)并且根據常用方法中條目4描述的方法來確定每一樣品的透明質烷的濃度。在37個種子庫中，每個庫包含來自OS-pBA16品系的獨立植物的3粒未成熟種子，超過70%被證明在種子中合成顯著量的透明質烷(至少0.1Hg透明質烷/g鮮重)。從獨立的稻植物中制備的種子庫中透明質烷的量在0.1至15.7ng透明質烷/g鮮重之間變化。對于由獨立植物制備的每個種子庫的結果顯示于下表<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>表4:檢測在來自OS-pBA16轉基因品系的獨立植物制備各個種子庫中的透明質烷。b)米粉從每林轉化植物上收獲20-25粒成熟種子。用脫皮機(美國佛羅里達州邁阿密市谷曼(Grainman)公司制造的實驗室水稻脫殼機)除掉外皮并用實驗室研磨機(Cyclotec，樣品研磨機，丹麥福斯(Foss)公司)研磨褐色稻谷。從每林獨立的植物上收集的種子制得的米粉約40mg,加入lml水，混合樣品，離心(13000xg，5分鐘)并且根據常用方法中條目4描述的方法來確定每一樣品上清液中透明質烷的濃度。對于選定的由獨立植物制備的米粉樣品的結果顯示于下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>表5:從OS-pBA16轉基因品系的每一獨立植物的種子制備的米粉樣品中的透明質烷檢測。采用常用方法中條目4描述的方法進行檢測。b)GAOS0788品系的稻才直物分析將用質粒IC386-299轉化后獲得的GAOS0788品系的獨立的稻植物培養于溫室的土壤中。從每林植物上收獲20-25粒成熟種子(谷粒)，用脫皮機(美國佛羅里達州邁阿密市谷曼(Grainman)公司制造的實驗室水稻脫殼機)除掉外皮并用實驗室珠磨機(MM200，若斯徹(RetschV^司，德國，30秒.bei30HZ)研磨來自每一品系的約7粒褐色稻谷制成米粉然后根據Elson和Morgan(1933，JBiochem.27，1824)描述的方法確定每一樣品中N-乙酰基葡糖胺衍生物的含量。分析的幾組樣品確實顯示在N-乙酰基葡糖胺衍生物含量上的增加，范圍從約2nmol至約20nmolN-乙酰基葡糖胺衍生物/g樣品鮮重。如上分析，選擇的植物(GAOS0788-00501)的單個谷粒確實顯示N-乙酰基葡糖胺矛汴生物的含量高達約43nmol/g樣品鮮重。將OS-pBA16和GAOS0788品系的選定植物彼此相互雜交以獲得包含編碼透明質烷合酶的蛋白質和編碼具有GFAT-2活性的蛋白質的核酸分子的植物。權利要求1.遺傳修飾的植物細胞，其具有穩定整合進入其基因組的編碼透明質烷合酶的核酸分子，其中所述植物細胞與相應的無遺傳修飾的野生型植物細胞相比，具有額外增強的具有谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺轉移酶(GFAT)活性的蛋白質的活性。2.如權利要求1要求的遺傳修飾的植物細胞，其中具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸酰胺轉移酶(GFAT)活性的蛋白質的增強的活性是由外源核酸分子導入植物細胞引起的。3.如權利要求2要求的遺傳修飾的植物細胞，其中外源核酸分子編碼具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸酰胺轉移酶(GFAT)的酶活性的蛋白質。4.如權利要求1、2或3中的任一項要求的遺傳修飾的植物細胞，其與具有透明質烷合酶活性且無增強的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸酰胺轉移酶(GFAT)活性的植物細胞相比，合成增量的透明質烷。5.植物，其包含如權利要求1至4的任一項要求的遺傳修飾的植物細胞。6.如權利要求5要求的植物的繁殖材料，其包含權利要求1至4的任一項要求的遺傳修飾的植物細胞。7.如權利要求5要求的植物的可收獲的植物部分，其包含權利要求l至4的任一項要求的遺傳修飾的植物細胞。8.生產合成透明質烷的植物的方法，該方法包括a)遺傳修飾的植物細胞，其中遺傳修飾包括如下步驟i至ii:i)將編碼透明質烷合酶的外源核酸分子導入植物細胞ii)將遺傳修飾導入植物細胞，該遺傳修飾與相應的無遺傳修飾的野生型植物細胞相比導致具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸酰胺轉移酶(GFAT)的酶活性的蛋白質活性增加，其中可以任何順序單獨地進行步驟i至ii，或可同時進行步驟i至ii的任一組合；b)從來自步驟a)的植物細胞再生植物；c)如果合適，使用根據步驟b)的植物產生更多的植物，其中如果合適，將植物細胞從根據步驟b)i或b)ii獲得的植物中分離并且重復該方法的步驟a)至c)直至產生與相應的無遺傳修飾的野生型植物相比，具有編碼透明質烷合酶的外源核酸分子且其具有的具有GFAT酶活性的蛋白質活性增強的植物。9.制備透明質烷的方法，該方法包括從權利要求1至4的任一項所要求的遺傳修飾的植物細胞中、從權利要求5所要求的植物中、從權利要求6所要求的繁殖材料中、從權利要求7所要求的可收獲的植物部分中、或從通過權利要求8所要求的方法獲得的植物中提取透明質烷的步驟。10.權利要求1至4的任一項中要求的遺傳修飾的植物細胞、權利要求5中要求的植物、權利要求6中要求的繁殖材料、權利要求7中要求的可收獲植物部分、或通過權利要求8中要求的方法獲得的植物在用于制備透明質烷中的用途。11.組合物，其包含權利要求1至4的任一項中要求的遺傳修飾的植物細月包。12.用于制備包括透明質烷的組合物的方法，其中使用在權利要求1至4的任一項中要求的遺傳修飾的植物細胞、權利要求5中要求的植物、權利要求6中要求的繁殖材料、權利要求7中要求的可收獲植物部分、或通過權利要求8中要求的方法獲得的植物。13.權利要求1至4的任一項中要求的遺傳修飾的植物細胞、權利要求5中要求的植物、權利要求6中要求的繁殖材料、權利要求7中要求的可收獲植物部分、或通過權利要求8中要求的方法獲得的植物在用于制備如權利要求ll中要求的組合物中的用途。全文摘要本發明涉及合成增量的透明質烷的植物細胞和植物，并且涉及制備這類植物的方法，也涉及借助這些植物細胞或植物制備透明質烷的方法。在此，與野生型植物細胞或野生型植物相比，根據本發明的植物細胞或遺傳修飾的植物具有透明質烷合酶活性和額外增強的谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺轉移酶(GFAT)活性。本發明還涉及具有增加的透明質烷合成的植物在制備透明質烷和含有透明質烷的食品或飼料中的用途。文檔編號C12N15/82GK101273135SQ200680035690公開日2008年9月24日申請日期2006年10月5日優先權日2005年10月5日發明者B·埃西格曼,C·弗羅貝格申請人:拜爾作物科學股份公司