專利名稱：：酶的制造方法
技術領域：
：本發明是有關酶的制造方法，具體地來說是關于從含有酶的液體中高效率地回收酶的方法。
背景技術：
：過濾發酵液，除去發酵液中的微粒、培養細胞以及孢子等的不溶解物質并回收作為目的的酶等的發酵產物的方法是眾所周知的。但是，在過濾操作中由于接近于分離膜細孔大小的粒子會造成分離膜網眼的堵塞，并且不溶物質將在膜面上堆積，從而會招致過濾效率下降的問題。以前，對于這樣的分離膜的物理性的網眼堵塞和膜面上的不溶解物質的堆積，通過一邊在膜面上進行掃流(sweep-flow)—邊進行過濾等的操作，來避免網眼的堵塞和不溶解物質的堆積，可是在含有高濃度菌體的發酵液的情況下，因為發酵液的粘度較高，所以掃流時的壓力損失較大，從而使過濾壓力增大，以至于招致在膜面上的不溶解物質的固結化，反而帶來了過濾效率下降的問題。為了解決這樣的問題，在JP-A11-318482中，在精密過濾時將陽離子性表面活性劑添加到含有高濃度菌體的發酵培養液中，通過降低發酵液的粘度來抑制掃流時的壓力損失和過濾壓力的增大，由濃縮率的提高來提高發酵產物的回收率。另外，在JP-A4-354585中，建議在處理發酵液時將絮凝劑(陽離子型高分子物質)添加到發酵培養液中。但是，這些高分子絮凝劑的分子量達數十萬，在反復使用時反而會引起膜的網眼被陽離子型高分子堵塞，因此存在膜的清洗恢復變得不可能的問題。
發明內容本發明是一種酶的制造方法，其特征在于，該制造方法是從菌體的濃度為1%(v/v)以下且酶的濃度為1%(w/v)以上的含酶的液體，通過精密過濾來回收酶的方法，在上述含酶的液體中添加0.011%(W/V)的陽離子性表面活性劑并進行精密過濾。并且還提供一種酶的制造方法，其特征在于，從菌體濃度大于1%(V/V)的發酵培養液分離菌體，將所得到的含酶的液體通過超濾來進行精制濃縮，在所得到的菌體濃度為1%(v/v)以下且在酶的濃度為1%(w/v)的含酶的液體中添加0.011%(W/V)的陽離子性表面活性劑并進行精密過濾。具體實施方式在蛋白酶等的酶的發酵生產中采用的方法多數是，首先通過精密過濾等從發酵培養液中分離菌體，接著通過超濾來精制濃縮由分離菌體而得到的含酶的液體。根據該方法，雖然可以得到菌體濃度為1%(v/v)以下且酶濃度為1%(w/v)以上的含高濃度酶的液體，但是，從完全阻止酶產生菌、去除精制過程中所產生的雜菌、完全去除由于對酶溶液進行高濃度化而產生的不溶物以及殘存的少量的雜質等的觀點出發，就需要進一步精制分離該含高濃度酶的液體。在該含高濃度酶的液體的精制分離過程中，可以考慮使用精密過濾膜，但像這樣的含高濃度酶的液體的情況下，雖然是菌體濃度低且發酵液的粘度不成問題的溶液，還是因為蛋白質濃度高從而在精密過濾時的酶透過率以及透過流量不如人意，并存在生產效率非常差的問題。另外，一般在通過精密過濾來進行的高蛋白質溶液的精制過程中，會有以下的問題點即使存在少量的應去除的混入的細菌等的雜質，由于夾雜的ppb級的DNA等，在膜透過過程中的透過流量將會減少，并且蛋白質溶液的透過率變差。作為解決此問題的手段，在JP-A2004-89155中提出了如下方法在使用膜對蛋白質溶液進行過濾時，用DNA分解酶以及DNase處理蛋白質溶液之后進行過濾，或者，一邊進行DNase處理一邊進行過濾。但是，在高濃度的蛋白酶的發酵液中，因為DNase本身也是蛋白質，所以不能期待由蛋白酶使得分解容易地進行的效果。如以上所述，在含高濃度酶的液體的最終的精制分離即通過精密過濾進行的精制過程中，要體現充分的酶透過率和透過流量是非常困難的，并且還有生產效率非常差的問題。本發明者研究探討了在使用精密過濾膜的含高濃度酶的液體的最終的精制分離中實現充分大的酶透過率和透過流量的方法，其結果完成了上述的本發明。在本發明中，以菌體濃度為1%(V/V)以下且酶濃度以蛋白質的含量計為1%(W/V)以上的含酶的液體作為對象，通過對其進行精密過濾來回收酶。從在精密過濾過程中降低負荷的觀點出發，菌體濃度更優選為0.5%(v/v)以下，特別優選為00.3%(v/v)。從根據處理液量和過濾速度的過濾效率以及酶的溶解性的觀點出發，酶濃度更優選為2%(w/v)以上，特別優選為210%(w/v)。菌體濃度是以在離心效果12000G以及沉淀時間5min的條件下進行離心分離時的相對于含酶的液體量的菌體所占的容積的比例來定義。本發明中的酶可以列舉蛋白酶、酯酶以及糖酶等。作為蛋白酶的具體例子可以列舉胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、膠原酶、角蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、氨基肽酶以及羧肽酶等。作為酯酶的具體例子可以列舉胃脂肪酶、胰脂肪酶、植物脂肪酶類、磷脂酶類、膽堿酯酶類以及磷酸酯酶。作為糖酶可以列舉纖維素酶、麥芽糖酶、蔗糖酶、淀粉酶、果膠解聚酶、a-以及(3-糖苷酶等。另外，考慮到本發明的效果大，優選酶的等電點為713，更為優選的是812，特別優選的是911。并且，本發明中的酶從酶的有用性以及本發明的效果大的方面出發優選使用蛋白酶，更加優選的是堿性蛋白酶。酶的濃度以蛋白質的含量來定義。本發明中的精密過濾使用精密過濾膜來進行。至于精密過濾膜的形式，只要是在膜面上進行掃流并進行過濾的形式就沒有特別的限制，平膜、中空絲狀膜以及管狀膜等的任何一種都可以。膜的材質比如可以列舉氧化鋁、二氧化鈦和氧化鋯等的陶瓷、玻璃和金屬等的無機膜，或者，乙酸纖維素類、硝化纖維素類、脂肪族聚酰胺類、聚砜類、聚烯烴類、聚丙烯腈類、聚醚砜類、聚氯乙烯類、聚乙烯醇類以及氟化高分子等的有機膜。從在分離膜面上的掃流的觀點來看，膜面速度越大膜面上的掃流效果就越大。但是，到了一定的速度之上壓力損失就會變大，就會引起在膜附近的膠體層的壓緊化，通過膜的流量以及含酶的液體中的酶的回收率就會降低。另外，如果膜面速度過低那么壓力損失就會降低，雖然能避免壓緊化的發生，但是膠體層的剝離效果會降低，含酶的液體中的酶的回收率也就會下降。從這些要點出發，膜面速度優選為0.53m/s，更為優選的是0.51.5m/s。在本發明中，由精密過濾進行分離的時候的膜間壓差是指入口與出口的膜之間的平均壓差，通常優選為0.2MPa以下，更為優選的是0.020.15MPa。膜間壓差如果小于0.02MPa那么透過流量就會下降，有處理性惡化的傾向。另外，如果膜間壓差大于a2MPa那么由膜面上的膠體層的壓緊化等而產生膜閉塞，從而導致產生透過流量下降的情況，所以不優選。另外，給予膜間壓差的方法可以是原液側加壓式、透過液側減壓式或者也可以是兩者的組合。操作溫度通常為040°C，優選為530°C。操作溫度如果小于0'C則因為含酶的液體的粘度變大將導致透過膜的流量會下降，另外，如果溫度超過40'C則含酶的液體的性狀就會惡化，所以不優選。作為本發明的運作方法，不僅可以采用如上所述的施加一定的壓力使透過流量隨之決定的定壓過濾方式，還可以采用以一定的流量抽出透過液的定流量過濾方式。另外，為了維持膜的高過濾性，可以定期性地施行從膜的透過側使透過液逆流的操作(逆向清洗)。在本發明中，在施行精密過濾之前，有必要在上述含酶的液體中添加0.011%(w/v)的陽離子性表面活性劑。在本發明中所使用的陽離子性表面活性劑沒有特別的限定，但是從作用效果的觀點出發，優選使用具有一個或者二個長鏈烷基的季銨鹽型的化合物，具體可以列舉含有平均碳原子數818的直鏈垸基的單烷基三甲基氯化銨、單烷基三甲基溴化銨、二烷基二甲基氯化銨、二垸基二甲基溴化銨以及單烷基二甲基芐基氯化銨(苯扎氯銨，benzalkoniumchloride)等。從在含酶的液體中的溶解性以及作用效果的觀點出發，平均碳原子數更優選為1018，特別優選為1218。陽離子性表面活性劑的添加量以純組分來定義。從提高酶的透過性以及提高透過流量的觀點出發，陽離子性表面活性劑向含酶的液體中的添加量為，以在含酶的液體中的濃度計，優選0.011%(w/v)，更為優選的是0.020.5%(w/v)，特別優選的是0.030.3%(w/v)。添加方法沒有特別的限定，但是從能夠充分作用于含酶的液體的觀點出發，優選以將陽離子性表面活性劑預先溶解于水或者異丙醇等的溶劑中的狀態添加到含酶的液體中，并優選以某些手段(比如通過攪拌馬達的攪拌或者通過泵的液體循環)進行IO分鐘左右的攪拌混合。本發明中的陽離子性表面活性劑的添加量根據含酶的液體的種類和性狀而不同。優選以如下所述的方法求得對應于含酶的液體的種類和性狀的合適的陽離子性表面活性劑的添加量。在求得合適的添加量的過程中可以變換各種添加量并分別單獨進行過濾，但由于操作繁瑣，所以由以下的簡便的過濾方法能夠一次性求得必要的添加量。即，用指定的條件以全循環進行過濾(以不改變原液的活性的形式使透過液直接返回到原液中去)，直至透過液的過濾速度以及酶的濃度達到恒定為止，進行大約2小時的過濾。透過液的過濾速度以及酶的濃度達到恒定后對透過液進行取樣，測定透過液中的酶的濃度以及透過流量。透過液被取樣后立刻倒回到原液中，以盡可能保持原液的酶的濃度以及液量不變。到達恒定狀態后暫時停止裝置的運轉，將指定量的陽離子性表面活性劑添加到原液中并混合15分鐘，再一次同樣地進行15分鐘過濾，之后測定透過液中的酶的濃度以及透過流量。之后，同樣地添加陽離子性表面活性劑以增加活性劑的濃度，由此調査活性劑濃度與酶的透過率以及透過流量的關系。根據如上所述的操作可以簡便地求得合適的添加量。在本發明中，從菌體濃度超過1。/。(v/v)的發酵培養液中分離菌體，對所得含酶的液體通過超濾來進行精制濃縮，在所得到的菌體濃度為1%(v/v)以下且酶的濃度以蛋白質的含量計為1%(w/v)以上的含酶的液體中，優選添加0.011°/。(w/v)的陽離子性表面活性劑，并進行精密過濾。本發明中的發酵培養液是指發酵生成物，即，微生物分解有機物，含有作為其代謝物而積聚的生成物的溶液。發酵培養液比如可以是培養細菌、放線菌、真菌以及酵母等的微生物的培養液，也可以是培養動物或者植物的細胞的培養液。具體可以列舉酒精發酵、醬油以及食醋等的食品發酵、抗生素物質以及抗癌物質的發酵、有機酸發酵、氨基酸發酵和酶的發酵等。發酵培養液優選菌體濃度超過1%(v/v)，更為優選的是3%(v/v)以上，特別優選的是1020%(Wv)。另外，發酵培養液中的酶的濃度為0.12%(w/v)左右。在該發酵終了時的發酵培養液中微生物等的菌體以高濃度存在，所以優選首先分離菌體。本發明中從發酵培養液分離菌體的方法可以列舉比如精密過濾法、離心分離法以及壓濾法等，可以將這些方法組合使用，但是優選使用精密過濾膜來進行過濾分離。在進行從發酵培養液的菌體分離即發酵生成物的回收之后，通常優選通過超濾來進行濃縮。超濾是指如下工藝，使用膜口徑為比如0.1nm2nm的范圍或者截留分子量為50010萬的范圍的超濾膜來進行過濾，從而使比該值大的粒子和高分子物質被過濾膜阻止，而使低分子物質透過過濾膜，從而去除低分子物質。根據該操作，能夠將發酵生成物的0.12%(w/v)的酶濃度濃縮至120%(w/v)的程度。關于本發明中使用的超濾膜的形式材質，與上述的精密過濾膜的情況相同。由超濾膜進行濃縮時用于在膜面上進行掃流的膜面速度越大則掃流效果也就越好，適當的范圍為0.53m/s。膜間壓差越大過濾速度變得越大，但是如果膜間壓差過大則在膜附近的膠體層會被壓緊化，所以不能提高過濾速度。因此，適當的膜間壓差是00.50.3MPa。操作溫度為04(TC，優選53(TC。操作溫度如果小于0。C那么發酵生成物含有液的粘度就會變大，操作性就會惡化。另外，操作溫度如果超過40'C那么發酵生成物的活性就會降低，所以不優選。作為超濾的操作條件，在1次過濾后為了更進一步提高精制度也可以進行加水精制，即在加水后進一步進行濃縮。此時，存在若發酵液的鹽濃度降低則酶的溶解度也會下降的情況，在加水精制過程中也可以使用氯化鈣水溶液或者硫酸鈉水溶液等。另外，也可以將這些鹽添加到超濾結束后的濃縮液中。圖1是表示表面活性劑濃度與酶透過率以及表面活性劑濃度與透過膜的流量的關系的圖表。實施例下面的實施例中就有關本發明的實施進行敘述。實施例是關于本發明的例示所進行的敘述，并不是為了限定本發明。實施例17以及比較例1、2將Bacillussp.KSM-9865(FEM-P18566號)的堿性蛋白酶(等電點9.5附近)的發酵液(菌體濃度10.8%(v/v))100L在l(TC的溫度條件下由有效膜面積0.41m2、細孔徑O.lpm、絲內徑1.9mmO的中空絲精密過濾膜(旭化成株式會社，PSP-113L)進行精密過濾(MF)。濃縮3倍后，相對于濃縮液量添加等量的去離子水，進行再一次濃縮的操作重復3次，共計得到168L的MF透過液。將所得的MF透過液以截留分子量6000的超濾膜(旭化成株式會社，AIP-2013,膜面積lm2)進行超濾濃縮(UF)。濃縮7倍后，相對于濃縮液量添加等量的0.4%(v/v)氯化鈣水溶液，進行再一次濃縮的操作重復9次，從而得到蛋白濃度4.8%(w/v)的UF濃縮液23.5L。此時的UF濃縮液中的菌體濃度為0%(v/v)。其后，以成為2%(v/v)的濃度的形式將硫酸鈉溶解于UF濃縮液中。將所述溶液1.5L在l(TC的溫度條件下由有效膜面積0.015m2、細孔徑0.25nm、絲內徑0.7mm0)、模塊長度130mm、絲數目100的中空絲精密過濾膜(旭化成株式會社，PSP-003)進行精密過濾。處理條件為循環流量1.8L/min(膜內線速度0.8m/s)、平均壓力0.06MPa、以15分鐘間隔從膜的透過側進行逆向清洗、測定從逆向清洗之后到下一次逆向清洗為止之間的15分鐘期間的平均的酶透過率以及透過流量，達到成為恒定為止大約進行2小時的過濾。透過液進行取樣后立刻倒回到原液中，以盡可能保持原液的酶的濃度以及液量不變(以下稱之為"全循環操作")。酶的透過率達到恒定后暫時停止裝置的運轉，分別添加表l所示的量的表l所示的表面活性劑，混合15分鐘，再一次同樣地在逆向清洗之后進行15分鐘過濾，測定透過液中的酶的透過率以及透過流量。之后，同樣地添加陽離子性表面活性劑以增加活性劑的濃度，由此調査活性劑濃度與酶的透過率以及透過流量之間的關系。酶的透過率以下面的(1)式來進行定義。酶的透過率(。/。"透過液活性(單位)/原液活性(單位)X100(1)酶的活性測定法-酪蛋白法將含有酪蛋白1%(v/v)(hanmerstein，MERCK公司)的50mM硼酸緩沖液(pH10)1.0ml在30。C的溫度條件下保溫5分鐘后，加入O.lml的酶溶液，使之反應15分鐘。加入反應停止液(0.11M三氯醋酸-0.22M醋酸鈉-0.33M醋酸)2.0ml，在室溫下放置10分鐘之后進行過濾(Nol濾紙，ADVANTEC東洋)，將濾液中的酸可溶蛋白質通過Lowry法(J.Biol.Chem.,193,265275,1981)以如下方式進行定量。將堿性銅溶液(1%酒石酸鈉鉀1%硫酸銅1%碳酸鈉=1:1:100)2.5ml添加到0.5ml的濾液中，在30'C的溫度條件下放置10分鐘后，加入苯酚稀釋液(用去離子水將苯酚試劑(關東化學)稀釋2倍)0.25ml并恒溫30分鐘之后，測定660nm波長下的吸光度。酶的1個單位是，在上述反應中在1分鐘期間游離相當于lmmol的酪氨酸的酸可溶蛋白質分解物所必要的酶的量。蛋白質濃度的測定法根據上述Lowry法，以牛血清白蛋白作為標準，測定蛋白質濃度。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從表i的結果可知，通過添加陽離子性表面活性劑，精密過濾中的酶的透過率以及透過流量有了大幅度的提高。另外，可知陰離子性表面活性劑與陽離子性表面活性劑相比較提高酶的透過率的效果小，并且陰離子性表面活性劑沒有提高透過流量的效果。實施例8以及比較例3、4以成為2%濃度的形式將硫酸鈉溶解于上述實施例1中所使用的堿性蛋白酶的UF濃縮液(蛋白濃度4.8%(w/v))中，將該溶液23.5L在10。C的溫度條件下由有效膜面積0.2m2、細孔徑0.25(im、絲內徑0.7mmO模塊長度347mm、絲數目400根的中空絲精密過濾膜(旭化成株式會社制，PMP-102)以全循環操作進行精密過濾。處理條件為循環流量7.2L/min(膜內線速度0.8m/s)、平均壓力0.05MPa，施行的操作與實施例1相同。酶的濃度達到恒定后暫時停止裝置的運轉，分別以表2所示的量將表2所示的表面活性劑添加到原液中，混合15分鐘，再一次同樣地在逆向清洗之后進行15分鐘過濾，測定透過液中的酶的濃度以及透過流量。另外，圖1表示相對于各自的表面活性劑的濃度的效果的差異。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從表2以及圖1的結果可知，即使膜的尺寸有所改變，但同樣通過添加陽離子性表面活性劑，精密過濾中的酶的透過率以及透過流量仍然會有大幅度的提高。另外，可知陰離子性表面活性劑與陽離子性表面活性劑相比較提高酶的透過率的效果小，并且陰離子性表面活性劑提高透過流量的效果也小。實施例9以及比較例5在比較例1和實施例4-1中，除了代替Bacillussp.KSM-9865(FEM-P18566號)的堿性蛋白酶(等電點9.5附近)而使用Bacillussp.KSM-K16的堿性蛋白酶(等電點10.2附近)的UF濃縮液(菌體濃度0%(v/v)、蛋白濃度5.6%(w/v))以夕卜，施行的操作與比較例l和實施例4-l相同。其結果由表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>從表3可知，即使是在不同的酶當中，通過添加陽離子性表面活性劑，精密過濾中的酶的透過率以及透過流量仍然會有大幅度的提高。權利要求1.一種酶的制造方法，其特征在于是一種從菌體濃度為1％(v/v)以下且酶的濃度以蛋白質的含量計為1％(w/v)以上的含酶的液體通過精密過濾來回收酶的方法，在該含酶的液體中添加0.01～1％(w/v)的陽離子性表面活性劑并進行精密過濾。2.—種酶的制造方法，其特征在于從菌體濃度大于1%(v/v)的發酵培養液分離菌體，將所得到的含酶的液體通過超濾來進行精制*濃縮，在所得到的菌體濃度為1%(V/V)以下且酶的濃度以蛋白質的含量計為1%(W/V)以上的含酶的液體中添加0.011%(w/v)的陽離子性表面活性劑并進行精密過濾。全文摘要本發明是一種從菌體濃度為1％(v/v)以下且酶的濃度以蛋白質的含量計為1％(w/v)以上的含酶的液體通過精密過濾來回收酶的方法，其中，在該含酶的液體中添加0.01～1％(w/v)的陽離子性表面活性劑并進行精密過濾。文檔編號C12N9/00GK101273125SQ200680035459公開日2008年9月24日申請日期2006年9月25日優先權日2005年9月26日發明者佐藤仁,小山伸吾,生賀裕,白倉生道申請人:花王株式會社