專利名稱：：分離核酸的方法分離核酸的方法相關申請案本申請案為2005年9月20日申請的美國申請案第11/231,363號的接續申請案，其為2003年4月2日申請的美國申請案第10/406,141號的部分接續申請案且為國際申請案第PCT/US2004/009960號(其指定美國，申請于2004年4月1日，且以英文公開)的部分接續申請案。上述申請案的全部教示是以引用的方式并入本文中。技術背景考量哺乳動物細胞的轉染、轉導或微注射的許多分子生物學應用(諸如毛細管電泳、核苷酸測序、逆轉錄克隆和基因治療方案)需要分離高質量核酸制劑。高要求分子生物學應用的出現已增加對于能夠產生高質量核酸制劑的高產量且優選易于自動化的純化方案的需求。盡管近來技術進步和機器人技術的出現已促進測序反應和凝膠讀取步驟的自動化，但產量仍受到易于自動化的核酸純化方法的可用性的限制。
發明內容如本文中所述，本申請人提供一種方法，其中細胞或有機體的基因組核酸可直接從細胞或有機體生長培養物與細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸(例如質粒DNA)分離。另外，本申請人提供一種方法，其中在細胞或有機體溶解產物中基因組核酸可與分子量低于基因組核酸分子量的核酸分離，而無需制備澄清溶解產物(lysate)。傳統堿性溶解(lysis)需要以下步驟濃縮或粒化(pelleting)稀釋于生長培養基中的細胞；離心或渦旋；用堿性去垢劑溶解細胞；振蕩和/或攪拌溶解產物；添加中和緩沖液；過濾和/或處理樣品以移除絮狀物；添加固相載體；且添加結合緩沖液。通常需要如下其它純化步驟以移除去垢劑和鹽添加固相載體且添加結合緩沖液。本發明的優點在于其允許將細胞或有機體的基因組核酸與細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸分離的簡化程序。通過提供固相載體和使得細胞或有機體溶解且細胞或有機體的核酸沉淀于所述固相載體上的試劑(核酸沉淀劑)，可從純化來自完整或全細胞或有機體的核酸的標準純化方法中去除一或多個步驟。此外，通過提供固相載體和使得細胞或有機體的核酸沉淀于所述固相載體上.的試劑，可從純化來自細胞或有機體溶解產物的核酸的標準純化方法中去除一或多個步驟。固相載體和試劑與細胞、有機體、細胞溶解產物或有機體溶解產物合并的次序并不關鍵。固相載體和使得細胞或有機體的核酸沉淀于所述固相載體上和/或細胞或有機體溶解的試劑可依次(例如，以單獨組分形式；在兩個步驟中)或同時(例如，以單一組分形式；在一個步驟中)與細胞、有機體、細胞溶解產物或有機體溶解產物合并。當固相載體和試劑合并為單一組分時，本文中所述的方法允許將單一試劑添加到細胞或有機體、或細胞或有機體的培養物中，接著培養，分離(一或多種)固相載體且選擇性洗脫以實現細胞或有機體的基因組核酸與細胞或有機體的分子量低于基因組核酸分子量的核酸的分離。本發明的方法不需要pH值調節。由本文中所述的試劑和方法提供的減少的步驟數會簡化細胞、有機體、細胞溶解產物或有機體溶解產物的核酸純化方法的自動操作。因此，本發明涉及一種將細胞或有機體的基因組核酸與細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸(例如質粒DNA、游離基因DNA、線粒體DNA、細胞器DNA、病毒DNA)分離的方法，其包含合并i)固相載體(例如磁性微粒)，其表面上已結合可逆結合核酸的官能團(例如羧基、胺基)，ii)細胞或有機體和iii)試劑，其中所述試劑使得細胞或有機體溶解且細胞或有機體的核酸沉淀于固相載體上，從而產生組合。將所述組合保持在細胞或有機體發生溶解且細胞或有機體的核酸與固相載體可逆結合的條件下，從而產生具有與固相載體結合的細胞或有機體的核酸的固相載體。將固相載體與組合分離且與使得分子量低于基因組核酸的核酸從固相載體洗脫(選擇性洗脫)的洗脫緩沖液(例如水)接觸。基因組核酸保持與固相載體結合，從而使得細胞或有機體的基因組核酸與細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸分離。本發明也涉及一種將細胞或有機體的基因組核酸與細胞的質粒核酸分離的方法，其包含合并i)磁性微粒，其表面上已結合可逆結合核酸的官能團，ii)細胞或有機體和iii)試劑(例如，諸如乙醇、異丙醇、聚烷撐二醇的醇),其中所述試劑使得細胞或有機體溶解且細胞或有機體的核酸沉淀于磁性微粒上，從而產生組合。將所述組合保持在細胞或有機體發生溶解且細胞或有機體的核酸與磁性微粒可逆結合的條件下，從而產生具有與磁性微粒結合的細胞或有機體的核酸的磁性微粒。將具有與i茲性微粒結合的細胞或有機體的核酸的磁性微粒與組合分離且與使得質粒核酸從磁性微粒洗脫的洗脫緩沖液接觸。基因組核酸保持與固相載體結合，從而使得細胞或有機體的基因組核酸與細胞或有機體的質粒核酸分離。本發明也涉及一種將細胞或有機體的基因組核酸與細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸(例如質粒核酸)分離的方法，其包含合并i)固相載體，其表面上已結合可逆結合核酸的官能團，ii)細胞或有機體溶解產物和iii)試劑，其中所述試劑使得細胞或有機體溶解產物的核酸沉淀于固相載體上，從而產生組合。將所述組合保持在細胞或有機體溶解產物的核酸與固相載體可逆結合的條件下，從而產生具有與固相載體結合的細胞的核酸的固相載體。將固相載體與組合分離且與使得分子量低于基因組核酸的核酸從固相載體洗脫的洗脫緩沖液接觸。基因組核酸保持與固相載體結合，從而將細胞或有機體的基因組核酸與細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸分離。在本發明方法中，可使用任何適合方法(例如磁性方式、離心)將基因組核酸所結合的固相載體從包含分子量低于基因組核酸分子量的核酸的洗脫液分離。隨后可將固相載體與使得基因組核酸從固相載體洗脫的適合洗脫緩沖液接觸。本發明也涉及一種分離細胞(例如，原核細胞、諸如哺乳動物細胞的真核細胞)或有機體(例如病原體，諸如病毒、細菌、寄生蟲、真菌)的基因組核酸(例如RNA、DNA)的方法，其包含合并i)固相載體，其表面上已結合可逆結合核酸的官能團，ii)細胞或有機體和iii)試劑，其中所述試劑使得細胞或有機體溶解且細胞或有機體的核酸沉淀于固相載體上，從而產生組合。將所述組合保持在細胞或有機體發生溶解且細胞或有機體的基因組核酸與固相載體可逆結合的條件下，從而產生具有與固相載體結合的細胞或有機體的基因組核酸的固相載體。隨后將固相載體與組合分離，從而分離細胞或有機體的基因組核酸。可將固相載體與使得基因組核酸從固相載體洗脫的洗脫緩沖液4妄觸。在一個特定實施方式中，本發明涉及一種分離細胞或有機體的基因組核酸的方法，其包含將細胞或有機體與使得細胞或有機體溶解的試劑合并，從而產生第一組合；且將所述第一組合保持在細胞或有機體溶解的條件下，從而產生溶解產物。合并溶解產物與結合緩沖液，所述結合緩沖液包含固相載體，其表面上已結合可逆結合核酸的官能團；和試劑，其使得細胞或有機體的核酸沉淀于固相載體上，從而產生第二組合。將所述第二組合保持在細胞或有機體的基因組核酸與固相載體可逆結合的條件下，從而產生具有與固相載體結合的細胞或有機體的基因組核酸的固相載體。隨后將固相載體從第二組合中分離，從而分離細胞或有機體的基因組核酸。所述方法可進一步包含使固相載體與使得基因組核酸從固相載體洗脫的洗脫緩沖液接觸。本發明也涉及適用于本文中所述方法中的試劑盒。在一個實施方式中，所述試劑盒包含溶解緩沖液、結合緩沖液、移除雜質的試劑和洗滌緩沖液。所述溶解緩沖液可包含十二烷基硫酸鈉、曲拉通X-100(TritonX-100)、乙二胺四乙酸(EDTA)和Tris-HCl。結合緩沖液可包含磁性微粒、聚乙二醇和碘化鈉。移除雜質的試劑可包含消化蛋白質的試劑(諸如蛋白酶K)、消化DNA的試劑(例如脫氧核糖核酸酶(DNase))和/或消化RNA的試劑(例如核糖核酸酶(RNase))。洗滌緩沖液可包含聚乙二醇和尿素。在一個特定實施方式中，試劑盒包含i)溶解緩沖液，其包含十二烷基硫酸鈉、TritonX-IOO、EDTA和Tris;ii)結合緩沖液，其包含磁性微粒、聚乙二醇和碘化鈉；iii)蛋白酶K;和iv)洗滌緩沖液，其包含聚乙二醇和尿素。圖1為將細胞的基因組核酸與細胞中具有比基因組核酸更低分子量的核酸分離的方案說明；圖2為96孔瓊脂糖凝膠，其顯示細胞的大腸桿菌(E.coli)基因組核酸與細胞中質粒的分離；圖3為由讀數產生的Phred20(紅色)和Phred30(黑色)堿基的柱形圖；Y軸為讀數數目，X軸為增量為50bp的Phred20結合；圖4顯示由50(xl馬血制備的兩份gDNA;圖5顯示8個由馬血制備的gDNA樣品的PicoGreen分析；圖6顯示由馬血制備的gDNA的梯度PCR(使用預期擴增子大小為225bp的Y3B19才示i己)；圖7為從馬全血分離的基因組DNA的瓊脂糖電泳凝膠(e-gel);圖8為從豬全血分離的基因組DNA的瓊脂糖e-gel;圖9為使用溶解和結合以兩步發生的方法從人全血分離的基因組DNA的瓊脂糖e-gel;圖10為從培養的哺乳動物細胞分離的總RNA的瓊脂糖e-gel;圖11顯示從固體組織分離的RNA的毛細管電泳結果；圖12顯示從全血分離的RNA樣品的毛細管電泳結果和瓊脂糖e-gel;圖13顯示使用漱口收集從頰細胞分離的基因組DNA的瓊脂糖e-gel和PCR結果；圖14顯示使用擦拭收集從頰細胞分離的基因組DNA的瓊脂糖e-gel和PCR結果；圖15顯示在血漿樣品中分離和檢測B型肝炎病毒(hepatitisBvims;HBV)基因組DNA的PCR結果；圖16顯示從石蠟包埋樣品分離的基因組DNA的瓊脂糖e-gel和PCR結果。具體實施方式本專利或申請案文件含有至少一個使用彩色的圖式。在請求且支付必要費用后政府機關將提供具有彩色圖式的本專利或專利申請公開案的副本。如本文中所述，本發明提供使用最少步驟數可將細胞和/或有機體的基因組核酸與分子量低于基因組核酸分子量的細胞或有機體的核酸(例如質粒DNA)分離的方法。可直接對細胞或有機體培養物進行分離，而無需粒化細胞或有機體。另外，本文中所述的方法可直接對細胞或有機體溶解產物實施，而無需使用傳統方法(例如離心、化學處理)澄清基因組核酸的溶解產物。在細胞的核酸主要為內源核酸(例如DNA、RNA)的特定實施方式中，本發明提供將細胞或有機體的內源核酸(例如，基因組核酸(例如DNA、RNA)、線粒體核酸、線粒體RNA、轉移RNA、微RNA、信使RNA)與細胞或有機體分離的方法。所述方法也可用于將細胞或有機體的各種內源核酸彼此分離(例如，將內源DNA與內源RNA分離)。本發明提供分離核酸的方法和試劑。本文中所述的試劑可用于將(一或多種)細胞或有機體的基因組核酸與細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸分離，其是通過將細胞或有機體與固相載體和試劑合并進行，所述試劑使得細胞或有機體溶解，且細胞或有機體的核酸沉淀于固相載體上。或者，本文中所述的試劑可用于將細胞或有機體溶解產物的基因組核酸與細胞或有機體溶解產物中分子量低于基因組核酸分子量的核酸分離，其是通過將細胞或有機體溶解產物與固相載體和試劑合并進行，所述試劑使得細胞或有機體溶解產物的核酸沉淀于固相載體上。隨后將細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸從固相載體選擇性洗脫。在另一實施方式中，本文中所述的試劑可用于分離(一或多種)細胞或有機體的基因組核酸，其是通過將細胞或有機體與固相載體和試劑合并進行，所述試劑使得細胞或有機體溶解且細胞或有機體的基因組核酸沉淀于固相載體上。如本文中所述，方法包含將細胞、有機體、細胞溶解產物或有機體溶解產物的核酸與具有官能團包被表面(例如羧基包被表面)的固相栽體(例如磁性微粒)非特異性且可逆地結合。隨后可例如通過施加磁場以吸引磁性微粒來將微粒從上清液分離。隨后可移除剩余溶液(例如上清液)，留下具有結合核酸的微粒。一旦從上清液分離，就可使微粒與選擇性洗脫細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸的洗脫緩沖液接觸。因此，產生含有未結合核酸(細胞或有機體的核酸，其具有比細胞或有機體的基因組核酸的分子量更低的分子量)和細胞或有機體的基因組核酸仍與其結合的磁性微粒的洗脫緩沖液。用于洗脫細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸的洗脫緩沖液為核酸沉淀試劑的濃度在分子量低于基因組核酸分子量的核酸結合于磁性微粒上所需的范圍以下的溶液。在細胞或有機體中基本上所有核酸為基因組核酸的實施方式中，隨后將tt粒與將基因組核酸從^:粒洗脫的洗脫緩沖液接觸。在一個實施方式中，洗脫劑為水。另外，蔗糖(20°/。)和曱酰胺(100%)溶液可用于洗脫核酸。當使用低離子強度的洗脫緩沖液(例如水)時，在30秒或更短時間內發生核酸從微粒的洗脫。一旦結合核酸經洗脫，就可將磁性微粒從含有經洗脫核酸的洗脫緩沖液分離。優選通過石茲性方式(magneticmeans)將磁性微粒從洗脫緩沖液分離。所屬領域的技術人員已知的其它方法可用于將磁性孩么粒與上清液分離。舉例來說，可使用過濾或離心。在一個實施方式中，一旦將仍與細胞或有機體的基因組核酸結合的磁性微粒從含有未結合核酸(例如，細胞或有機體的核酸，其具有比細胞或有機體的基因組核酸分子量低的分子量)的洗脫緩沖液移出，也可使所述^f茲性微粒與適合洗脫緩沖液接觸以將細胞或有機體的基因組核酸從磁性微粒洗脫。所移出基因組核酸可用于(例如)瓊脂糖凝月交分析、PCR擴增、限制酶消化、診斷和/或治療分析、人身份鑒別試驗、膜雜交(例如南方及斑點狹縫印跡雜交(Southernanddot/slotblots))和AFLP、限制性內切酶多型性(RFLP)、隨機擴增多態DNA(RAPD)、微衛星和單核苷酸多態(SNP)分析(例如，用于基因定型、指紋識別等)。高質量核酸制劑與多成分和復雜性的起始溶液分離為分子生物學中的基礎技術。由于本文中所述的試劑和方法，如今存在將基因組核酸與分子量低于基因組核酸的核酸分離的迅速且易于自動化的方法。由所揭示方法分離的核酸可用于需要高質量核酸的分子生物學應用中，諸如DNA測序模板的制備、微注射、哺乳動物細胞的轉染或轉化、RNAi發夾的體外合成、逆轉錄克隆、cDNA文庫構建、PCR擴增和基因療法研究，以及具有較不嚴格性質量要求的其它應用，其包括(但不限于)轉化、限制性核酸內切酶或微陣列分析、選擇性RNA沉淀、體外(invitro)轉位、多元PCR擴增產物的分離、DNA探針和引物的制備和脫模板方案。本文中所述的試劑和方法可與多種核酸純化技術(包括美國專利第5,705,628號；第5,898,071號；第6,534,262號；美國申請案第2002/0106686號和WO99758664中所述的技術，這些文獻的內容是以引用的方式并入本文中)一起使用。在一個實施方式中，本發明涉及一種將細胞或有機體的基因組核酸與細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸(例如質粒DNA)分離的方法，其包含合并i)固相載體，其表面上已結合可逆結合核酸的官能團，ii)細胞或有機體和iii)試劑，其中所述試劑使得細胞或有機體溶解且細胞的核酸沉淀于固相載體上，從而產生組合。將所述組合保持在細胞或有機體發生溶解且細胞或有機體的核酸與固相載體可逆結合的條件下，從而產生具有與固相載體結合的細胞或有機體的核酸的固相載體。將固相載體與組合分離且與洗脫緩沖液接觸，所述洗脫緩沖液使得分子量低于基因組核酸分子量的核酸從固相載體洗脫，而不造成基因組核酸從固相載體洗脫，從而將細胞或有機體的基因組核酸與細胞或有才幾體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸分離。在另一個實施方式中，本發明涉及一種將細胞或有機體的基因組核酸與細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸分離的方法，其包含合并i)固相載體，其表面上已結合可逆結合核酸的官能團，ii)細胞或有機體溶解產物和iii)試劑，其中所述試劑使得細胞或有機體溶解產物的核酸沉淀于固相載體上，從而產生組合。將所述組合保持在細胞或有機體溶解產物的核酸與固相載體可逆結合的條件下，從而產生具有與固相載體結合的細胞或有機體的核酸的固相載體。將固相載體從組合移出且與洗脫緩沖液接觸，所述洗脫緩沖液使得具有低于基因組核酸的分子量的核酸從固相載體洗脫，而不會造成基因組核酸從固相載體洗脫，從而將細胞或有機體的基因組核酸與細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸分離。本發明此外涉及一種將細胞或有機體的基因組核酸與細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸分離的方法，其中具有較低分子量的核酸適用于手動或高產量自動化測序方法中。本發明也涉及一種分離細胞(例如，原核細胞、諸如哺乳動物細胞的真核細胞)或有機體(例如病原體，諸如病毒、細菌、分枝桿菌、寄生蟲、真菌)的內源核酸(例如RNA、DNA)的方法。如本文中所用，"細胞或有機體的內源核酸"指的是通常發現于細胞或有機體中的核酸(當細胞或有機體出現于自然界中時，在細胞或有機體中發現的核酸)。在一個實施方式中，本發明涉及一種分離細胞或有機體的基因組核酸的方法，其包含合并i)固相載體，其表面上已結合可逆結合核酸的官能團，ii)細胞或有機體和iii)試劑，其中所述試劑使得細胞或有機體溶解且細胞的核酸沉淀于固相載體上，從而產生組合。將所述組合保持在細胞或有機體發生溶解且細胞或有機體的基因組核酸與固相載體可逆結合的條件下，從而產生具有與固相載體結合的細胞或有機體的基因組核酸的固相載體。隨后將固相載體與組合分離，從而分離細胞或有機體的基因組核酸。可將固相載體與使得基因組核酸從固相載體洗脫的洗脫緩沖液接觸。在一個實施方式中，本發明涉及一種分離細胞或有機體的基因組核酸的方法，其包含將細胞與使得細胞或有機體溶解的試劑合并，從而產生第一組合；且將所述第一組合保持在細胞或有機體溶解的條件下，從而產生溶解產物。合并溶解產物與結合緩沖液，所述結合緩沖液包含固相載體，其表面上已結合可逆結合核酸的官能團；和試劑，其使得細胞或有機體的核酸沉淀于固相載體上，從而產生第二組合。將所述第二組合保持在細胞或有機體的基因組核酸與固相載體可逆結合的條件下，從而產生具有與固相載體結合的細胞或有機體的基因組核酸的固相載體。隨后將固相載體與第二組合分離，從而分離細胞或有機體的基因組核酸。所述方法可進一步包含使固相載體與使得基因組核酸從固相載體洗脫的洗脫緩沖液接觸。在另一個實施方式中，本文中所述的分離基因組核酸的方法可用于(例如)分離病毒的基因組核酸。在此實施方式中，所述方法包含合并i)固相載體，其表面上已結合可逆結合核酸的官能團，ii)病毒和iii)試劑，其中所述試劑使得所述病毒溶解且病毒的核酸沉淀于固相載體上，從而產生組合。將所述組合保持在病毒發生溶解且病毒的基因組核酸與固相載體可逆結合的條件下，從而產生具有與固相載體結合的病毒的基因組核酸的固相載體。隨后將固相載體與組合分離，從而分離病毒的基因組核酸。可將固相載體與使得基因組核酸從固相載體洗脫的洗脫緩沖液接觸。或者，病毒可首先與使得病毒溶解的試劑接得病毒的核酸沉淀于固相載體上)接觸。在分離基因組核酸的方法中，所述方法可進一步包含添加促進非基因組核酸移除的試劑(例如，當基因組核酸為DNA時，試劑為核糖核酸酶；當基因組核酸為RNA時，試劑為脫氧核糖核酸酶；移除蛋白質的蛋白酶(例如蛋白酶K))。本文中所述的方法也可用于自細胞或有機體分離RNA(例如內源RNA)。在一個實施方式中，所述方法包含合并i)固相載體，其表面上已結合可逆結合核酸的官能團，ii)細胞或有機體和iii)試劑，其中所述試劑使得細胞或有機體溶解且細胞的核酸沉淀于固相載體上，從而產生組合。將所述組合保持在細胞或有機體發生溶解且細胞或有機體的內源核酸與固相載體可逆結合的條在一個特定實施方式中，隨后將固相載體與移除或消化DNA的試劑接觸，且保持在DNA被移除或消化且RNA保持完整(RNA未被移除或消化)的條件下。當移除DNA的試劑處于將核酸(例如DNA、RNA)從固相載體洗脫的溶液(例如水溶液)中時，隨后將固相載體與使得RNA沉淀于固相載體上的試劑接觸。隨后將固相載體與組合分離，從而分離細胞或有機體的RNA。可將固相載體與使得RNA從固相載體洗脫的洗脫緩沖液接觸。在分離RNA的另一個實施方式中，方法包含將細胞與使得細胞或有機體溶解的試劑合并，從而產生第一組合；且將所述第一組合保持在細胞或有機體溶解的條件下，從而產生溶解產物。合并溶解產物與結合緩沖液，所述結合緩沖液包含固相載體，其表面上已結合可逆結合核酸的官能團；和試劑，其使得細胞或有機體的核酸沉淀于固相載體上，從而產生第二組合。在一個特定實施方式中，隨后將固相載體與移除或消化DNA的試劑接觸，且保持在DNA被移除或消化且RNA保持完整(RNA未被移除或消化)的條件下。當移除DNA的試劑處于將核酸(例如DNA、RNA)從固相載體洗脫的溶液(例如水溶液)中時，隨后將固相載體與使得RNA沉淀于固相載體上的試劑接觸。隨后將固相載體與組合分離，從而分離細胞或有機體的RNA。可將固相載體與使得RNA從固相載體洗脫的洗脫緩沖液接觸。本文中所述的方法為用于核苦酸測序的分離質粒DNA模板的易于自動化方法。使用本文中所述的試劑提供另一種且易于自動化的核酸分離方式。如本文中所用，術語"分離"意謂所論述物質存在于不同于其天然存在的物理環境中和/或已自其它核酸分子或細胞成分(例如細胞膜、細胞器)完全、充分或部分分離或純化。如本文中所用，術語"核酸"和"核酸分子"與術語聚核苷酸同義使用且其意欲涵蓋DNA(例如，單鏈、雙鏈、共價閉合和松弛環狀形式)、RNA(例如，單鏈和雙鏈)、RNA/DNA雜合體和聚酰胺核酸(PNA)。"基因組核酸"指的是存在于細胞或有機體中的基因組或染色體核酸。典型地，基因組或染色體核酸的分子量為約500千堿基(kilobase;kb)(例如支原體)至約500十億堿基(gigabase;Gb)。在特定實施方式中，基因組或染色體核酸的分子量在約1000kb至約250Gb(例如洋蔥(onion));約10,000kb至約5Gb;約100,000kb至約1Gb;和約500,000kb至l，OOO，OOOkb的范圍內。基因組核酸可為DNA或RNA。"細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸"指的是存在于細胞或有機體中的除基因組或染色體核酸之外的核酸且可為內源或外源核酸。細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸通常具有約1kb至約250,000kb的分子量(例如BAC)。在特定實施方式中，細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸在約5kb至約100,000kb;約100kb至約10,000kb;及約1000kb至約5000kb的范圍內。如本文中所用，"內源核酸"(宿主細胞核酸)指的是在獲得細胞或有機體時存在于細胞或有機體中的核酸。"外源核酸"(外來核酸；重組核酸)指的是在獲得細胞或有機體(例如，轉染細胞或有機體、轉導細胞或有機體)時不存在于細胞或有機體中的核酸。在于細胞或有機體中。外源核酸可由所屬領域的一般技術人員已知的方式(例如轉化或轉染)直接或間接引入細胞或有機體或其祖先中。引入細胞或有機體中的外源核酸的實例包括細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)、質粒、柯斯質粒(cosmid)、PI載體和由于擴增過程(例如聚合酶鏈反應(PCR))而引入的核酸。如本文中所用，術語"質粒"指的是雙鏈環狀DNA物質，其源自外源來源(例如，經引入宿主細胞中)且能夠獨立于宿主染色體DNA進行自復制。因此，所述術語涵蓋由任何上述載體的復制產生的克隆DNA。用于將核酸引入細胞中的載體的實例包括pUC、pOT、pBluescript、pGEM、pTZ、pBR322、pSC101、pACYC、SuperCos和pWE15。或者，可將外源核酸自包裹核酸的噬菌體(例如柯斯質粒、PI)引入細胞或有機體中。"細胞或有機體中分子量低于基因組核酸分子量的核酸"的其它實例包括(但不限于)游離基因核酸、線粒體核酸、細胞器核酸、RNA、siRNA、質體、微染色體、細胞器核酸、引物、病毒核酸、細菌核酸和來自其它病原體的核酸。"固相載體，，為在核酸可沉淀的條件下基本上不溶的實體。適用于本發明方法中的適合固相載體具有足夠表面積以允許有效結合且進一步表征為具有能夠可逆結合核酸的表面。適合固相載體包括(但不限于)微粒、纖維、珠粒和支撐物，其對核酸具有親和力且其可體現規則或不規則形式的多種形狀，只要所述形狀最大化固相的表面積且體現受到微尺度操作的載體即可。在一個實施方式中，固相載體為順磁性，例如順磁性微粒(磁性響應)。在另一個實施方式中，固相載體包括官能團包被表面。舉例來說，固相載體可為胺包被順磁性微粒、羧基包被順磁性微粒或嚢封羧基包被順磁性微粒。如本文中所用，"順磁性微粒"指的是響應外部磁場(例如具有嵌入稀土(例如釹)磁體的塑膠管或微量滴定板固定器)、而在移除磁場后消磁的微粒。因此，可使用磁體將順磁性微粒與溶液有效分離，但在不發生磁性誘導聚集的情況下其可輕易再懸浮。優選順磁性微粒包含由純聚合物殼嚢封的富含磁石的核。適合順磁性微粒包含約20%-35%磁石/嚢封比率。舉例來說，包含約23%、25%、28%、30%、32%或34%的磁石/嚢封比率的磁性粒子適用于本發明中。包含小于約20%比率的磁性粒子僅受到用于實現磁性分離的磁體的弱吸引。視宿主細胞的性質、細胞生長的粘度和載體的性質(例如高或低拷貝)而定，應考慮包含較高百分比磁石的順磁性微粒。使用在其表面上不具有暴露鐵或Fe304的嚢封順磁性微粒消除在經分離DNA的某些后續操作中鐵干擾聚合酶功能的可能性。然而，磁石核越大，則囊封泄漏(例如釋放氧化鐵)的可能性越高。適用于本發明中的適合順磁性微粒可獲自(例如)BangsLaboratoriesInc.,Fishers,IN(例如，estapor⑧羧酸酯改性嚢封石茲性孩先球)、AgencourtBiosciences和Seradyn。適合順磁性微粒應具有特定大小以使得其(例如)通過磁性方式或過濾從溶液中分離并不困難。另外，優選順磁性微粒不應過大以使得其表面積經最小化或其不適于微尺度操作。適合尺寸在約0.1平均直徑至約ioo平均直徑的范圍內。優選尺寸為約l.O平均直徑。適合磁性微粒購自PerSeptiveDiagnostics且被稱作BioMagCOOH。如本文中所用，術語"官能團包被表面"指的是經可逆結合核酸(例如DNA、RNA或聚酰胺核酸(PNA))的部分包被的表面。一個實例為經各自具有游離官能團的部分包被的表面，所述游離官能團與氨基硅烷的氨基或微粒結合；因此，微粒表面經含有官能團的部分包被。官能團充當預沉淀核酸(例如聚烷撐二醇預沉淀DNA)的生物親和吸附劑。在一個實施方式中，官能團為羧酸。具有游離羧酸官能團的適合部分為丁二酸部分，其中一個羧酸基團通過酰胺鍵與氨基硅烷的胺鍵結且第二羧酸未鍵結，使得游離羧酸基團連接或拴系到順磁性微粒的表面上。羧酸包被磁性粒子購自PerSeptiveDiagnostics(BioMagCOOH)。具有可逆結合核酸分子的官能團包被表面的適合固相載體為(例如)具有官能團包被表面的磁性響應固相載體，諸如(但不限于)氨基包被、羧基包被和嚢封羧基包被順磁性微粒。適當起始物質包括有機體、細胞(完整或全細胞)、組織(例如實體組織、石蠟包埋組織)、細胞溶解產物(在生長或培養基中的細胞)和由這些細胞或有機體制備的溶解產物。在一個實施方式中，起始物質為可含有檸檬酸鹽、EDTA或肝磷脂凝血劑的新鮮或冷凍血液(例如全血)和血清。在另一個實施方式中，起始物質為頰細胞。適當起始物質包括獲自哺乳動物(即人、靈長類動物(黑猩猩)、馬科動物、犬科動物、貓科動物、牛科動物、豬科動物、鼠科動物)組織或體液的細胞和由這些細胞制備的溶解產物。因此，可使用具有核酸(例如，基因組核酸；分子量低于基因組核酸分子量的核酸)的任何類型物細胞(例如血細胞，諸如全血細胞)、纟田菌細胞(例如大腸桿菌(E.Coli),諸如DH5、DH10B、DH12S、C600或XL-1Blue)、酵母細胞、植物細胞、組織細胞(例如來自線蟲(C.elegans)、小鼠尾、人類活組織檢查的細胞)和含有外源核酸(例如重組DNA、細菌DNA或復制型DNA)的宿主細胞，其經輩巴向以與宿主細胞染色體DNA和其它宿主細胞生物分子分離。有機體的實例包括病毒(例如肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、皰滲病毒、流感病毒)、細菌、分枝桿菌(牛型結核分枝桿菌(M.bovisBCG)、麻風桿菌(M.leprae)、結核分枝桿菌(M.tuberculosis))、真菌(例如酵母，諸如釀酒酵母(C.cerevisiae)、白色念珠菌(C.albicans))和寄生蟲(例如利什曼原蟲(Leishmania))。或者，起始物質可為由這些細胞制備的溶解產物。如本文中所用，"宿主細胞"或"宿主有機體"為可將外源核酸引入其中，從而產生除宿主細胞或有機體核酸以外含有外源核酸的宿主細胞或有機體的任何細胞。如本文中所用，術語"宿主細胞或有機體核酸"和"內源核酸"指的是在獲得細胞或有機體時存在于宿主細胞或有機體中的核酸物質(例如基因組或染色體核酸)。如本文中所用，術語"外源"指的是除宿主細胞或有機體核酸以外的核酸(例如質粒)；外源核酸可由于被引入宿主細胞或有機體中或被引入宿主細胞或有機體的祖先中而存在于宿主細胞或有機體中。因此，例如，特定宿主細胞或有機體的外源核酸物質為非內源核酸物質(當獲得宿主細胞或有機體中時不存在于其中或不存在于其祖先中)。適當宿主細胞包括(但不限于)細菌細胞、酵母細胞、植物細胞和哺乳動物細胞。如本文中所述，本發明的優點在于可使用最少數目的步驟將細胞或有機體的基因組核酸與分子量低于基因組核酸分子量的細胞或有機體的核酸分離。如本文中所述，可直接對細胞或有機體培養物進行分離，而無需粒化細胞或有機體。另外，所述方法可對細胞或有機體溶解產物實施，其中本發明方法使其不必澄清溶解產物以將細胞或有機體的基因組核酸與分子量低于內源核酸分子量的核酸分離。在細胞或有機體中基本上所有核酸為內源核酸(例如DNA、RNA)的實施方式中，本文中所述的方法可用于將特定種類的內源核酸(例如基因組核酸；總RNA)與細胞或有機體分離。如本文中所用，"溶解產物"為含有細胞或有機體成分的溶液，其含有基因組核酸和具有比基因組核酸更低分子量的核酸，且其細胞膜已由任何方式破壞，使得細胞或有機體的內含物(包括其中的核酸)都處于溶液中。"澄清溶解產物，，為細胞或有機體的染色體或基因組核酸、蛋白質和膜已(諸如)通過化學處理或離心溶解產物而移除的溶解產物。使用已知方法溶解細胞或有機體，從而制備適于本發明方法使用的混合物。舉例來說，可使用化學方式(例如，堿性或堿性且陰離子型去垢劑處理)、等張沖擊或物理破壞(例如均質化)溶解細胞或有機體。如本文中所用，術語"溶解宿主細胞懸浮液"或"溶解宿主有機體懸浮液"指的是包含宿主細胞或有機體的懸浮液，其膜已通過任何方式(例如，化學(諸如堿性或堿性且陰離子型去垢劑處理)、等張沖擊或通過均質化進行物理破壞)破壞；此懸浮液為宿主細胞生物分子、細胞成分和經破壞膜碎片的混合物。在一個實施方式中，適用于本發明中的溶解宿主細胞或有機體懸浮液是通過將宿主細胞或有機體與堿性且陰離子型去垢劑(例如十二烷基硫酸鈉(SDS))溶液(例如，0.2NNaOH、1%SDS)接觸來制備。視情況，溶菌酶可包括于溶解緩沖液中。溶解溶液中陰離子型去垢劑的存在用于通過中和蛋白質的有效電荷而產生抗蛋白質環境，從而最小化其對官能團包被順磁性微粒表面的吸引。在一個實施方式中，溶解宿主細胞或有機體懸浮液未經中和。視情況，可將核糖核酸酶添加到宿主細胞或有機體溶解產物中以分解宿主細胞RNA，從而使DNA與不含或基本上不含RNA的磁性微粒結合。根據本發明的方法，將細胞或有機體與固相載體和試劑合并，其中所述試劑使得細胞或有機體的核酸非特異性且可逆地與固相載體結合。"非特異性核酸結合，，指的是對磁性微粒具有大約相同親和性的不同核酸分子的結合，但核酸序列或不同核酸分子的大小存在差異。如本文中所用，"促進吸附"指的是使用沉淀試劑(例如聚烷撐二醇)來促進DNA分子物質(其初始在混合物中)沉淀且隨后吸附于固相載體表面上的過程。所得可逆相互作用與(例如)兩種結合搭配物(例如抗生蛋白鏈菌素/生物素、抗體/抗原或序列特異性相互作用)之間的相互作用不同，其通常用于根據其組成或序列來分離特定生物分子的目的。"核酸沉淀試劑"或"核酸沉淀劑"或"聚集劑(crowdingreagent)"為使得細胞或有機體的核酸離開溶液的組合物。適合沉淀劑包括醇(例如短鏈醇，諸如乙醇或異丙醇)和多羥基化合物(例如聚烷撐二醇)。核酸沉淀試劑可包含一或多種這些試劑。核酸沉淀試劑以足夠濃度存在以非特異性且可逆地將細胞的核酸結合于固相載體上。適用于本發明方法中的適當醇(例如乙醇、異丙醇)濃度(最終濃度)為約40%至約60%;約45%至約55%;和約50%至約54%。適當聚烷撐二醇包括聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇。適合PEG可獲自西格瑪(Sigma)(SigmaChemicalCo.,StLouisMO.;分子量8000,不含脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶(DnaseandRnasefee)，目錄號25322-68-3)。聚乙二醇(PEG)的分子量可在約6000至約10,000、約6000至約8000、約7000至約9000、約8000至約10,000的范圍內。在一個特定實施方式中，使用分子量為約8000的PEG。一般來說，PEG的存在提供疏水性溶液，其強迫親水性核酸分子離開溶液。在一個實施方式中，PEG濃度為約5%至約20%。在其它實施方式中，PEG濃度在約7%至約18%;約9%至約16%;和約10%至約15%的范圍內。如上文所述，在起始物質為細胞或有機體的實施方式中，試劑經調配以使得細胞或有機體溶解。可使用多種溶解組分來破壞膜(諸如^咸性、堿性且陰離子型去垢劑處理或等張沖擊)。使得細胞或有機體溶解的試劑可包含(例如)氫氧化鈉(NaOH)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、Triton、月桂基肌氨酸鈉和/或異硫氰酸胍。在一個實施方式中，試劑的溶解組分為堿性(NaOH)溶液和/或陰離子型去垢劑(例如十二烷基硫酸鈉(SDS))溶液(例如，當添加到細胞中時，最終濃度為0.2NNaOH、1%SDS)。視情況，溶菌酶可包括于第一試劑的溶解組分中。溶解組分中陰離子型去垢劑的存在用于通過中和蛋白質的有效電荷而產生抗蛋白質環境，從而最小化其對固相載體(官能團包被順磁性微粒)表面的吸引。視情況，可將核糖核酸酶(例如，1.75ng/iil核糖核酸酶/ddH20)添加到溶解組分中以分解宿主細胞RNA，從而使DNA與不含或基本上不含RNA的固相載體結合。包括核糖核酸酶步驟的必要性將在極大程度上由核酸物質的大小決定，所述核酸物質經靶向以在所進行的特定核酸沉淀中分離。舉例來說，如果所選分離條件適于分離包含至少4,000個堿基對的核酸，那么RNA不太可能成為明顯污染物。上述方法中所用的試劑適于將核酸與細胞或有機體分離。此試劑含有核酸沉淀劑和固相載體，且也可經調配以使一或多種細胞或有機體溶解。核酸沉淀劑具有足夠濃度以使細胞或有機體的核酸沉淀。此試劑中的固相載體含有結合細胞或有機體的核酸的表面。可包含呈單一試劑或單獨組分形式的試劑組分。所述組分可同時或依次與細胞合并。合并組合成分的次序并不關鍵。試劑中所包含組分的性質和量如上述方法中所述。試劑可調配為濃縮形式，使得需要稀釋以獲得本文方法中所述的功能和/或濃度。視情況，可將鹽添加到試劑中以使得細胞的核酸沉淀于固相載體上。適于促進經把向分離的核酸分子吸附于磁性響應微粒上的適合鹽包括氯化鈉(NaCl)、氯化鋰(LiCl)、氯化鋇(BaCl2)、鉀(KC1)、氯化鈣(CaCl2)、氯化鎂(MgCl2)和氯化銫(CsCl)。在一個實施方式中，使用氯化鈉。一般來說，鹽的存在用于最小化核酸分子的負電荷排斥。適用于所述方法中的鹽的寬范圍指示也可使用許多其它鹽且適合含量可由所屬領域的一般技術人員憑經驗決定。鹽濃度可為約0.1M至約0.5M;約0.15M至約0.4M;和約2M至約4M。在高鹽濃度(例如，與高離子強度同義)下，適合順磁性微粒將吸附所有尺寸的DNA片段。術語"高鹽濃度"指的是大于約0.5M的鹽濃度。在"低鹽濃度"(或低離子強度)下，如本文中所用其暗示濃度小于約0.2M，基本上任何尺寸的DNA即使在高達12%(重量/體積)的PEG濃度存在下也不會沉淀(Lis,JohnT,MethodsinEnzymology65:437-353(1980))。可將其它組分添加到試劑中。在一個實施方式中，將核糖核酸酶添加到核酸沉淀劑中。根據本發明的方法，通過將核酸包被固相載體從組合移出來實現細胞或有機體的核酸分子的分離。可(例如)通過真空過濾、離心或通過施加磁場以吸引固相載體(例如順》茲性微粒)而將固相載體(例如順磁性微粒)從第一組合回收。優選^f吏用^茲性方式(諸如施加至少1000高斯(Gauss)的f茲場)將順^茲性微粒與溶液分離。然而，可使用所屬領域的技術人員已知的其它方法(例如真空過濾或離心)將磁性微粒從上清液移出。隨后可移除剩余溶液，留下具有吸附于其表面上的細胞或有機體的核酸的固相載體。一旦從混合物分離，可通過使固相載體與適合洗脫緩沖液接觸來回收吸附于固相載體上的分子量低于細胞或有機體的基因組核酸的分子量的核酸。因此，產生l)在洗脫緩沖液中包含分子量低于基因組核酸分子量的核酸分子的溶液和2)結合細胞或有機體的基因組核酸的固相載體。在一個實施方式中，適用于本發明方法中的適合"洗脫緩沖液"為選擇性洗脫分子量低于細胞或有機體的基因組核酸的分子量的細胞或有機體的核酸的緩沖液。在細胞或有機體中基本上所有核酸為基因組核酸(例如DNA、RNA)的實施方式中，適合洗脫緩沖液為從固相載體洗脫基因組核酸的緩沖液。在一個實施方式中，適用于本發明中的適合洗脫緩沖液可為水或如上所述的任何水溶液，其中核酸沉淀劑(例如異丙醇和/或PEG)濃度低于將分子量低于細胞或有機體的基因核酸分子量的細胞或有機體的核酸與固相載體結合所需的濃度。舉例來說，有用緩沖劑包括(但不限于)TRIS-HC1、三羥甲基氨基曱烷乙酸鹽(Trisacetate)、蔗糖(20%)和曱酰胺(100%)溶液。當使用適合低離子強度洗脫緩沖液時，可迅速(例如，在30秒或更短時間內)發生分子量低于細胞或有機體的基因組核酸分子量的細胞或有機體的核酸從固相載體的洗脫。一旦結合的核酸被洗脫，就將細胞或有機體的基因組核酸所結合的固相載體與包含分子量低于基因組核酸分子量的核酸的洗脫緩沖液分離。隨后可將固相載體與使得基因組核酸從固相載體洗脫的適合洗脫緩沖液接觸。視情況，可通過使具有與其結合的核酸的順磁性微粒與去除和/或溶解雜質的試劑接觸(例如，通過使微粒與適合洗滌緩沖溶液接觸)來去除雜質(例如，宿主細胞組分、特定核酸、蛋白質、代謝物、化學劑或細胞碎片)，然后將微粒所結合的核酸與固相載體分離。去除和/或溶解雜質的試劑可為溶解特定核酸的試劑，諸如DNA(例如脫氧核糖核酸酶)、RNA(例如核糖核酸酶)或蛋白質(例如蛋白酶K)。或者，溶解雜質的試劑可為"洗滌緩沖液"或包括于洗滌緩沖液中，其為溶解或去除與微粒直接結合或與所吸附核酸締合的雜質，但不溶解吸附于固相上的核酸的組合物。洗滌緩沖液的pH值和溶質組成和濃度可根據預期存在的雜質類型而改變。舉例來說，乙醇(例如70%)例示適用于去除過量PEG和鹽的優選洗滌緩沖液。也可用一種以上洗滌緩沖溶液來洗滌具有所結合核酸的磁性微粒。可按需要多次(例如三到五次)洗滌微粒以去除所需雜質。然而，優選限制洗滌次數以最小化所結合核酸產量的損失。適合洗滌緩沖溶液具有若干種特性。首先，洗滌緩沖溶液應具有足夠高鹽濃度(足夠高離子強度)以使得與磁性微粒結合的核酸不會從微粒洗出，而仍與微粒結合。適合鹽濃度大于約0.1M且優選為約0.5M。其次，緩沖溶液經選褲以使得與核酸或微粒結合的雜質溶解。緩沖溶液的pH值和溶質組成和濃度可根據預期會存在的雜質類型而改變。適合洗滌溶液包括以下0.5x5SSC;100mM硫酸銨，400mMTrispH9，25mMMgCl2和1%牛血清白蛋白(BSA);和0.5MNaCl。在一個實施方式中，滌緩沖溶液包含25mM三羥曱基氨基曱烷乙酸鹽(pH7.8)、100mM乙酸鉀(KOAc)、10mM乙酸鎂(Mg2OAc)和1mM二硫蘇糖醇(DTT)。在另一個實施方式中，洗滌溶液包含2。/。SDS、10%吐溫(Tween)和/或10%Triton。高質量核酸制劑與多成分和復雜性的起始溶液的分離為分子生物學中的基礎技術。因此，由于本文中所述的研究，如今存在分離分子量低于基因組核酸分子量的核酸分子的新穎且易于自動化的方法。在一個實施方式中，通過多樣品轉移裝置將試劑添加到細胞或有機體中。在另一個實施方式中，將第一試劑同時添加到多個樣品(例如至少6、12、24、96、384或1536個樣品)中，各樣品含有一或多種細胞或有機體。在另一個實施方式中，將第一試劑依次傳遞到多個樣品(例如至少6、12、24、96、384或1536個樣品)中，各樣品含有一或多種細胞或有機體。本發明包括分析多個核酸樣品的方法。所述方法包括提供由本文中所述的方法分離的多個核酸樣品且分析所述樣品(例如，對樣品進行序列分析)。在另一個實施方式中，使一或多個樣品的分離核酸進行其它分析(例如，序列分析)。由所揭示方法分離的核酸可用于需要高質量核酸的分子生物學應用，例如DNA測序模板的制備、微注射、哺乳動物細胞的轉染或轉化、RNA探針的體外合成、逆轉錄克隆、cDNA文庫構建、PCR擴增或基因療法研究，以及具有較不嚴^"性質量要求的其它應用，其包括(但不限于)轉化、限制性核酸內切酶或微陣列分析、選擇性RNA沉淀、體外轉位、多元PCR擴增產物的分離、體外siRNA、RNAi發夾、DNA探針和引物的制備和脫模板(detemplate)方案。本發明也涵蓋包含一或多種適用于本文中所述方法中的試劑的試劑盒。在一個實施方式中，所述試劑盒包含使得細胞或有機體溶解的試劑(例如溶解緩沖液，諸如TRIS-HC1、去垢劑、十二烷基硫酸鈉、TritonX-IOO、EDTA)和使得核酸與固相載體結合的試劑(例如結合緩沖液)。在一個特定實施方式中，結合緩沖液包含核酸沉淀試劑，諸如PEG;鹽，諸如Nal;和/或固相載體，諸如磁性微粒。試劑盒可進一步包含溶解雜質的試劑。在一個實施方式中，溶解雜質的試劑為消化蛋白質的試劑(例如蛋白酶K)。試劑盒可進一步包含其它緩沖液，諸如(一或多種)洗滌緩沖液(例如PEG、尿素、NaCl、Tris-HCl)和/或(一或多種)洗脫緩沖液。在一個特定實施方式中，試劑盒包含溶解緩沖液(例如TRIS、去垢劑)、結合緩沖液(例如核酸沉淀試劑(諸如PEG)和/或鹽(諸如NaI)和磁性微粒)、消化蛋白質的試劑(例如蛋白酶K)和洗滌緩沖液(例如PEG、尿素)。試劑盒的試劑可單獨存在或試劑盒中一或多種試劑可經合并。可提供于試劑盒中的其它組分包括多樣品容器(例如微量滴定板)、磁性多樣品固定器(例如微量滴定板固定器)和多樣品轉移裝置(例如多通道移液管)。試劑盒可進一步包含關于使用試劑盒和其組分的說明。實施例實施例1用于分離細胞中具有比基因組核酸更低分子量的核酸的方案的一個實施方式以下方案說明于圖1中。細菌培養物的生長1.將200L含有適當抗生素的2xYT細菌生長培養基用滴管吸取到3001Costar96孔圓底培養板(目錄號3750)的每一孔中。2.將各孔植入含有大腸桿菌細菌菌落的單一質粒(DH10B,DH5alpha:Invitrogen)。生長培養物可從瓊脂菌莒或甘油儲備液直接植入。3.用多孔蓋覆蓋培養板且在37。C下強烈振蕩(例如300rpm)16小時。純化程序1.將60L順磁性溶解緩沖液(0.4NNaOH、2%SDS、0.0016%固體AgencourtCOOH磁性微粒)溶液添加到源培養板的各孔中且振蕩或傾斜混合。2.將60LA洗滌溶液(100%異丙醇)添加到樣品中。在添加A洗滌溶液后進行15次傾斜混合。傾斜混合條件可視錘頭孔(tuporifice)而改變。3.將源培養板放在磁性SPRIplate96-R(TM)(目錄號AgencourtBiosciences)上5分鐘以從溶液分離珠粒。4.從目的培養板吸出且棄去澄清溶液，同時將其放在SPRIplate96_R(TM)(環形磁體)上。孔中。6.移除乙醇洗滌溶液且將步驟重復四次。7.將目的培養板在37'C下干燥30分鐘。8.將40L洗脫緩沖液(ddH20+1.75ng/1核糖核酸酶A)添加到培養板的各孔中且振蕩。建議試劑級水作為洗脫緩沖液，在添加洗脫緩沖液或等待10分鐘后渦旋或振蕩培養板以使洗脫發生。測序程序對于1/24thxBigDye反應添加601純化DNA1IBigDye混合液BigDye混合液5份BigDye終止劑1份200m-Ml3-21引物4份15xBigDye緩沖液循環測序95°C，2分鐘50個循環的(54°C，15秒；60°C,2.5分鐘；95°C，5秒)4°C,直到純化使用AgencourtCleanSeq試劑盒(目錄號000121和000222)的任一標準EtOH沉淀反應來純化測序反應物。于301去離子水(ddH20)中洗脫CleanSeq產物的沉淀且放在ABI3700或3730上進4于測序^r測。使用P0P5聚合物在ABI3700上進行11,000個以上序列讀數產生90%通過率(通過讀數應在bp100-300內對phred20取平均)和625個Phred20堿基。實施例2細菌細胞中具有比基因組核酸更低分子量的外源核酸的分離方法和才才泮牛克隆和純化將黑猩猩基因組DNA剪切，用T4聚合酶和Klenow(NEB)末端修復，且克隆于pOT細菌載體中。將DH10B細胞(Invitrogen)電穿孔且涂于25jig/ml氯霉素(chloramphenicol)瓊脂上且生長過夜。用GentixQpix將菌落拾取入200pl2XYT、50[ig/ml氯霉素肉湯中且生長16小時。將克隆物在BeckmanFX機器人平臺上于生長培養板中純化。純化方法將本文中所述的方法(OneStepPrep)與美國專利第6，534，262號中所述的方法(McPrep)進行比較。使用兩種不同純化方法(McPrep和本文中所述的單步驟純化方法)來純化24個樣品。將受控樣品裝載于瓊脂糖凝膠上以比較回收(圖2)。除60jil100%異丙醇(或100pl40%PEG)之外，將60(il順磁性溶解緩沖液(0.4NNaOH、2%SDS、160毫克/升SeradynCOOH順磁性珠粒)添力口到細胞培養物中且傾斜混合15次。將樣品在Agencourt磁體培養板(1000高斯)上分離達6分鐘。移除上清液且用70%乙醇將分離珠粒沖洗5次。在用1.75ng/pl核糖核酸酶A/ddH20(Sigma)洗脫后，在96E-Gel(Invitrogen)上操作樣品以評估相對DNA回收(圖2)。也對樣品進行PicoGreen分析(MolecularProbes)且平均DNA回收為20ng/pL記錄樣品的平均電導率以通過匯集來自10個孔的全部40|il洗脫劑來評估來自生長肉湯的任何鹽污染。導電率小于20|is/cm。測序反應設定將樣品稀釋于40pi1.75ng/pl核糖核酸酶/ddH20中且在2Hz下進行機器人攪拌20個循環的.5cm。吸出3piDNA且將其》文在0.5fil(1/3XBigDye)試劑加3皮摩爾-21引物中。用礦物油覆蓋反應物且于384孔培養板中進行循環測序。根據制造商建議對樣品進行循環測序。將測序反應物用Agencourt的CleanSeq試劑盒進行純化且在15(JddH20中洗脫且進行熱密封，然后裝載于ABI3700上。檢測使用ABI3700測序平臺和1/48thXBigDyeV3.1測序化學和POP5聚合物產生DNA測序資料。用30秒注射在5800V下進行電泳。結果由6336個純化樣品產生12672個測序讀數(表1)。對于48倍稀釋BigDye測序化學來說，所獲得的高通過率、高信號強度和高平均Phred20堿基對(Ewing等人,GenomeResearch,8:175-185(1998))為異常的。讀數表現的柱形圖繪制于圖3中。圖2顯示具有13列x8行的96孔瓊脂糖凝膠。第13列為200ngpGEM3.2kb載體(Promega)。正電極在圖片底部。將制備樣品在40|il各種洗脫緩沖液中洗脫且將IOpl裝載于凝膠上。可見凝膠上的3-5kb質粒不具有大腸桿菌基因組DNA留在瓊脂糖孔中的跡象。在未經1.75ng/(il核糖核酸酶洗脫的孔(行F)中可見RNA。相對于使用McPrep方法來說，可見使用單步法回收到更多質粒DNA(行A對行B和行C對行D)。此預期為McPrep方法需要大腸桿菌基因組DNA結合于一組珠粒上且富含質粒的上清液被移到另一培養板中以與第二混合物結合。此上清液移除步驟使其難以在不擾亂基因組DNA磁性珠粒的情況下吸出100%質粒上清液，因此預期存在DNA損失。行A:10|il/40plMcPrep行B:10(il/40jilOneStepPrep行C:10|il/40piMcPrep行D:10(i扁(ilOneStepPrep行E和F:具有和不具有核糖核酸酶的10|il/40piOneStep行G:不具有核糖核酸酶的10(ilMOpiMcPrep使用3pi經洗脫質粒DNA進行BigDye測序。通過操作Phred來測定電遠距圖{象(Eletropherogram)讀H質量(Ewing等人，GenomeResearch,8:175-185(1998))。Phred30堿基具有1/1000的錯誤率，Phred40堿基具有1/10,000的錯誤率。將各讀數產生的phred20堿基數計數為標準測序質量度量(表)。通過率經定義為滿足通過標準的讀數數目/總讀數P30=每384孔培養板的Phred30的平均數P20=每384孔培養板的Phred20的平均數CP20=每384孔培養板的連續Phred20的平均數P15=每384孔培養板的Phred15的平均數Qual=全部讀數的平均Phred分數:384孔培養板的平均值通過標準-讀數應將從bp100到bp300的200bp窗口中的Phred20質量取平均。SigA^對于96個讀數來說，A通道中的平均相對熒光單位SigG-對于96個讀數來說，G通道中的平均相對熒光單位SigC^t于96個讀數來說，C通道中的平均相對熒光單位SigT-對于96個讀數來說，T通道中的平均相對熒光單位<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>圖3為由讀數產生的Phred20(紅色)和Phred30(黑色)堿基的柱形圖。Y軸為讀數數目，X軸為增量為50bp的phred20盒。實施例3馬全血細胞中具有比基因組核酸更低分子量的核酸的分離材料和方法來源獲得與Alsevers抗凝劑(2.05%右旋糖、0.5%檸檬酸鈉、0.055%檸檬酸、0.42%氯化鈉)為1:1比率的馬全血。純化方法除80100%異丙醇之外，將60W順磁性溶解緩沖液(0.4NaOH、2%SDS、160毫克/升SeradynCOOH順磁性珠粒)添加到細胞培養物中且傾斜混合15次。將樣品在Agencourt磁體培養板(1000高斯)上分離達15分鐘。移除上清液且用70%乙醇將分離珠粒沖洗5次。在用ddH20(Sigma)洗脫后，將樣品于96E-Gel(Invitrogen)上操作以評估相對DNA回收(圖4)。也對樣品進行PicoGreen分析(MolecularProbes)且平均DNA回收為0.5ng/^1(圖5)。以其對于聚合酶鏈反應(PCR)(常見后續應用)的適用性來證實DNA質量(圖6)。圖4顯示由50jil馬血制備的兩份gDNA。圖5顯示8個由gDNA制備的樣品的PicoGreen分析。圖6顯示上述所制備的gDNA的梯度PCR(使用預期擴增子大小為225bp的Y3B19標記)。實施例4使用單步溶解和結合法將基因組DNA從馬全血分離1.將50|il馬血放在多孔培養板中。2.添加200|il溶解緩沖液(20%PEG1000、1MNaCl、0.5%SDS、1%TritonX-IOO、10mMEDTA、20mMTrisHCl、0.29%固體磁性珠粒)，通過吸取10次進行混合。培養5分鐘。3.放在;茲板上約5分鐘。4.移除上清液，留下珠粒。5.將珠粒再懸浮于250|Lil洗滌緩沖液(6M尿素/14。/。PEG1000、1MNaCl)中。等待5分鐘，不具有磁性底座。6.放在磁性底座上5分鐘。移除上清液。7.重復步驟5和6。8.將珠粒再懸浮于70%乙醇中且將珠粒磁性分離3次。9.風干5-10分鐘。10.添加50(il-200fil不含核酸酶的水，在60。C-70。C下預熱。混合10分鐘。11.將培養板放在磁板上以分離珠粒。移出經洗脫DNA。結果將DNA裝載于0.8。/。瓊脂糖e-gel上。使用OD260讀數來測定濃度。使用OD260/280讀數來指示純度。結論如圖7中所示，本文中所述的方法可用于從全血分離高產量、高質量基因組DNA。實施例5使用兩步溶解和結合法將基因組DNA從豬全血分離1.將200|il新鮮豬血等分到1.2ml96孔培養板中。2.添加2體積溶解緩沖液(0.5%SDS、1%-Triton-X-I00、10mMEDTA、20mMTrispH7.4)和12(al20pg^1蛋白酶K且輕微傾斜混合5次。3.在37。C下培養10分鐘。4.添加0.5體積結合緩沖液(40%PEG1000、1.5MNaCl、0.29%固體磁性珠粒)且輕微傾斜混合10次。5.放在》茲板上15分鐘。6.移除上清液且將其棄去。7.將珠粒再懸浮于遠離磁體的800^洗滌緩沖液(6M尿素、14%PEG1000、lMNaCl)中。8.放在-茲板上IO分鐘。9.棄去上清液，重復步驟7和8以進行第二次洗滌。10.在磁體上用每次800(il70。/。乙醇將珠粒洗滌3次，不擾亂珠粒。11.在最后洗滌后，移除所有痕量乙醇。將珠粒在磁板上干燥5分鐘。12.將遠離磁體的珠粒再懸浮于1體積不含核酸酶的水中且擱在試驗臺上2分鐘，隨后將珠粒再次再懸浮。13.放在磁板上IO分鐘。14.將含有DNA的上清液轉移到清潔孔中進行存儲。結果將來自9個孔的10|ilDNA裝載于0.8%瓊脂糖e-gel上。使用OD260讀數來測定濃度和產量。使用OD260/280讀數來指示純度。結論如圖8中所示，本文中所述的方法可用于從全血分離高產量、高質量基因組DNA。實施例6使用兩步溶解和結合法將基因組DNA從人全血分離1.將來自三個不同健康供體的200(il冷凍人血等分到1.2ml96孔培養板中。2.添加2體積溶解緩沖液(0.5%SDS、1%-Triton-X-I00、10mMEDTA、20mMTrispH7.4)和12jal20(ag^il蛋白酶K且輕微傾斜混合5次。3.在37。C下培養10分鐘。4.添加0.5體積結合緩沖液(40%PEGIOOO、1.5MNaCl、0.29%固體磁性珠粒)且輕微傾斜混合10次。5.放在磁板上15分鐘。6.移除上清液且將其棄去。7.將珠粒再懸浮于遠離磁體的800pl洗滌緩沖液(6M尿素、14%PEG1000、1MNaCl)中。8.放在磁板上IO分鐘。9.棄去上清液，重復步驟7和8以進行第二次洗滌。10.在磁體上用每次800jJ70。/。乙醇將珠粒洗滌3次，不擾亂珠粒。11.在最后洗滌后，移除所有痕量乙醇。將珠粒在》茲:板上干燥5分鐘。12.將遠離磁體的珠粒再懸浮于1體積不含核酸酶的水中且擱在試驗臺上2分鐘，隨后將珠粒再次再懸浮。13.放在磁板上10分鐘。14.將含有DNA的上清液轉移到清潔孔中進行存儲。結果將來自各樣品的10(ilDNA裝載于0.8%瓊脂糖e-gel上。使用OD260讀數來測定濃度和產量。使用OD260/280讀數來指示純度。結論如圖9中所示，本文中所述的方法可用于從人全血分離高產量、高質量基因組DNA。實施例7總RNA與培養細胞分離(##法)程序1.從所培養的293T細胞的96孔培養板中的各孔(每孔約lxl05個細胞)中完全移除所有細胞培養基。將溶解緩沖液(20mM檸檬酸鈉pH7.5、10mMEDTApH8、1mM金精三羧酸(Aurintricarboxylicacid)、1%triton-x-100、2%月桂基肌氨酸鈉、1MLiCl、0.075%固體磁性J朱粒)直接用滴管吸取到各孔中的細胞上。通過重復滴管吸取混合，直到似乎大多數細胞離開培養板進入懸浮液中為止。使其靜置數分鐘，隨后再滴管吸取多次以確保所有細胞離開培養板。2.轉移到靜放在磁場中的1.7ml不含核糖核酸酶的艾本德管(eppendorftube)中。使其靜置5分鐘以將珠粒與溶液分離。3.將澄清溶液從管緩慢吸出且棄去。4.用1ml-1.5ml70。/。乙醇將珠粒洗滌一次。直接滴管吸取到磁性珠粒上且使其靜置5分鐘或直到上清液似乎澄清為止。小心吸出乙醇而不擾亂珠粒。5.將艾本德管移動遠離石茲體且添加30pl脫氧核糖核酸酶I溶液(10mMTrispH7.5、2.5mMMgCl2、0.5mMCaCl2、0.4U/|il脫氧核糖核酸酶I)。6.用滴管吸取，直到珠粒回到懸浮液中為止，且使其遠離磁體靜置15分鐘以消化DNA。7.在脫氧核糖核酸酶I培養完成后，向珠粒/脫氧核糖核酸酶I混合物中添加150(il結合緩沖液(20mM檸檬酸鈉pH7.5、10mMEDTApH8、1mM金精三羧酸、l%triton-x-100、2%月桂基肌氨酸鈉、1MLiCl、30%異丙醇)且用滴管吸耳又5次，直到充分混合。8.將管放回到;茲性底座上且使其靜置5分鐘。9.小心吸出上清液。10.添加150|il洗滌緩沖液(25mM檸檬酸鈉、1M鹽酸胍、1%Triton-x-100)且將遠離磁體再懸浮珠粒。立即放回到磁性底座上且使其靜置5分鐘或直到上清液似乎澄清。11.小心吸出上清液。12.用存于70%乙醇中的另外四種洗滌液重復洗滌。將lml70。/。乙醇用32滴管吸取到在磁性底座上的艾本德管中，使其靜置1分鐘且移除。13.在吸出最后乙醇洗滌液后，使反應管在磁性底座上風干IO分鐘。14.通過將珠粒完全再懸浮于40|al不含核糖核酸酶的水中而將純化產物從珠粒洗脫。15.使其遠離磁體靜置5分鐘，隨后放在磁性底座上5分鐘。16.將經純化RNA轉移到新培養板中。17.將來自各培養板的12個樣品裝載于0.8%瓊脂糖e-gel上。使用OD260讀數來測定濃度和產量。使用OD260/280讀數來指示純度。結果將來自96孔培養板的兩行8個孔的RNA裝載于0.8%瓊脂糖e-gel上。圖8顯示高產量、完整核糖體RNA譜帶，指示優質RNA。使用OD260讀數來測定濃度和產量。使用OD260/280讀數來指示純度。結論如圖IO中所示，本文中所述的方法可用于從培養哺乳動物細胞分離高產量、高質量總RNA。實施例8總RNA與固體組織的分離1.向96孔溶解培養板的各孔中添加400(il溶解緩沖液(2M異硫氰酸胍、200mM檸檬酸鈉、1mMDTT、1%triton-x-100、1.2mg/ml蛋白酶K)、一個金屬珠和至多10mg各種大鼠組織。用透明培養板密封帶將培養板密封且連接到旋渦器上。將旋渦器設定為高且將培養板渦旋IO分鐘以均質化組織。2.將培養板從旋渦器移出且在50。C下放在溫度循環器中15分鐘。3.使其在室溫下冷卻5分鐘。4.將400pl結合緩沖液(80%異丙醇、1%磁性珠粒固體)添加到溶解產物中且通過用滴管吸取5次進行混合。在室溫下培養2分鐘。5.將400結合反應物轉移到新鮮1.2ml培養板中且放在磁板上5分鐘。6.移除上清液且將剩余400(il結合反應物轉移到磁板上的1.2ml培養板上5分鐘。7.完全移除上清液。8.從磁板移出培養板且通過向每孔添加600pl70%EtOH進行洗滌且通過吸耳又5次進4于混合。9.將培養板^L回到磁板上5分鐘。10.完全移除乙醇洗滌液且使培養板離開磁板。11.添加100pl脫氧核糖核酸酶溶液(10mMTrispH7.5、2.5mMMgCl2、0.5mMCaCl2、0.4U/pl脫氧核糖核酸酶I),通過吸取5次進行混合且在37°C下培養15分鐘。12.添加550jil再結合緩沖液(1M異硫氰酸胍、100mM檸檬酸鈉、0.5mMDTT、0.5%triton-x-100、40%異丙醇)，通過滴管吸取5次進行混合且在室溫下培養2分鐘。13.將培養板放在磁板上且培養15分鐘。14.移除上清液且通過添加600|il70%EtOH洗滌且通過吸取5次進行混合(磁體上的培養板)。15.將步驟13再重復四次，共洗滌4次。16.完全移除最后乙醇洗滌液且使珠粒在室溫下風干IO分鐘。17.將培養板從f茲板移出且通過添加最少40fil不含核糖核酸酶的水來洗脫RNA且通過用滴管吸取混合10次。在室溫下培養2分鐘。18.將培養板放回到磁板上1分鐘且小心移出經洗脫RNA。結果通過在Bioanalyzer2100上進行毛細管電泳來分析1iil各RNA樣品。使用OD260讀數來測定濃度和產量。使用OD260/280讀數來指示純度。結論圖11顯示本文中所述的方法可用于從固體組織分離高質量總RNA。實施例9總RNA與全血的分離1.在3個50mL離心管中將3個單獨的10mLPaxgene管收集血樣與3.3mL溶解緩沖液(4MGITC、400mM檸檬酸鈉、2%TX-100)、13.2pl0.5MDTT和660蛋白酶K(20mg/mL)混合。2.在55。C下培養30分鐘。3.將6.2mL異丙醇和100(il5%固體》茲性珠粒添加到樣品中。充分混合。在室溫下培養IO分鐘。4.將離心管放在^茲性底座上30分鐘以將珠粒與溶液磁性分離。小心移出上清液。5.用30mL洗滌溶液(30%異丙醇、2MGITC、200mM檸檬酸鈉、1%TX-100、1mMDTT)將珠粒洗滌兩次。6.用30mL70%乙醇將J朱粒洗滌兩次。7.將珠粒風干IO分鐘。8.將珠粒再懸浮于640不含核糖核酸酶的水中，轉移到2mL離心管中。在室溫下培養5分鐘。9.將珠粒在磁性底座上與上清液磁性分離。將上清液轉移到2mL管中。10.將160|il脫氧核糖核酸酶I緩沖液(10mMTrispH7.5、2.5mMMgCl2、0.5mMCaCl2、0.4U/(il脫氧核糖核酸酶I)添加到樣品中。通過用滴管上下吸取混合。11.在室溫下培養15分鐘。12.添加540|il異丙醇、350|il溶解緩沖液和10|il新鮮珠粒。充分混合且在室溫下培養5分鐘。13.將珠粒與上清液磁性分離。棄去上清液。14.用1.6mL70%乙醇將5朱粒洗滌3次。15.將珠粒風干IO分鐘。16.將珠粒再懸浮于50)il不含核糖核酸酶的水中。在室溫下培養5分鐘。17.收集RNA且存儲在-80。C下。結果通過在Bioanalyzer2100上進行毛細管電泳來分析1(il各RNA樣品。使用OD260讀數來測定濃度和產量。使用OD260/280讀數來指示純度。也顯示在0.8%瓊脂糖e-gel上所分析的一個樣品。結論圖12顯示本文中所述的方法可用于從全血分離高質量總RNA。實施例10使用漱口收集將基因組DNA與頰細胞分離1.使用10ml漱口劑漱口且收集于50ml圓錐形管中。2.在3000xg下離心10分鐘以將細胞粒化。3.棄去上清液且將細胞再懸浮于400|il再懸浮緩沖液(10mMTrispH8、1mMEDTApH8、1.75ng/pl核糖核酸酶A)中。4.添加600(il溶解緩沖液(10mMTrsipH8、4M鹽酸胍、10%Tween-20、1%正月桂基肌氨酸)且輕輕混合。5.在室溫下培養30分鐘。6.將150pi溶解產物轉移到新管中且與150pi結合緩沖液(18%PEG8000、2.2MNaCl、0.115%固體磁性珠粒)合并，傾斜混合10次且放在磁體上以分離珠粒。7.棄去上清液且用200pl70。/。乙醇洗滌三次。8.將珠粒干燥5分鐘。9.添加40jil水，傾斜混合10次且放在磁體上以進行分離。10.移出含有DNA的上清液。結果通過在0.8%e-gel上進行瓊脂糖凝膠電泳來分析分離基因組DNA。每制劑的平均產量為1.8嗎，但在不同個體之間顯著改變。將一個lpl各樣品與人類ADP核糖基化因子1引物一起用于PCR中，得到543bp產物。結論圖13顯示本文中所述的方法可用于使用漱口收集方案從頰細胞分離高質量、高產量gDNA。將gDNA用于后續PCR分析中。實施例11使用擦拭收集將基因組DNA與顛細胞分離1.用無菌藥簽擦拭面頰內部20次。2.將藥簽放在200|il再懸浮緩沖液(10mMTrispH8、1mMEDTApH8、1.75ng/pl核糖核酸酶A)中且旋轉10次以釋放細胞。3.添加300|il溶解緩沖液(10mMTrispH8、4M鹽酸胍、10%Tween-20、1%正月桂基肌氨酸)且將藥簽旋轉10次以混合。將藥簽相對管底部按壓以自纖維中釋放任何液體。4.在室溫下培養15分鐘。5.將150pl溶解產物轉移到新管中且與150pi結合緩沖液(18°/。PEG8000、2.2MNaCl、0.115%固體磁性珠粒)合并，傾斜混合10次且放在磁體上以分離^M立。6.棄去上清液且用200jil70%乙醇洗滌3次。7.將珠粒干燥5分鐘。8.添加40pl水，傾斜混合10次且放在^茲體上以進行分離。9.移出含有DNA的上清液。結果通過在0.8%e-gel上進行瓊脂糖凝膠電泳來分析分離的基因組DNA。每制劑的平均產量為1.8jig,但在不同個體之間顯著改變。將一個lpl各樣品與人類細胞骨架(3-肌動蛋白引物用于PCR中，得到370bp產物。結論圖14顯示本文中所述的方法可用于使用擦拭收集方案從頰細胞中分離高質量、高產量gDNA。將gDNA用于后續PCR分析中。實施例12病毒基因組DNA的分離和檢測1.將147|il溶解緩沖液(4MGITC、400mM檸檬酸鈉、2%TX-100)、0.5filPolyA認A(10ug/(oJ)和40(il蛋白酶K(20mg/mL)添加到含有每毫升50個拷貝的HBV的400人血漿中。通過用滴管上下吸取至少15次進行混合。2.在56。C下將樣品培養30分鐘。3.使培養板冷卻到室溫。添加260100%異丙醇和10(il5%固體磁性珠粒。通過用滴管上下吸取至少15次進行混合。4.將一半樣品(約430pl)轉移到新孔中。使培養板在試驗臺上靜置5分鐘。5.將培養板放在磁板上至少7分鐘以進行分離。6.吸出上清液。7.將培養板自磁體移出。添加500pl洗滌緩沖液(30%異丙醇、2MGITC、200mM檸檬酸鈉、1%TX-100、1mMDTT)且用滴管吸取混合10次。8.使培養板在試驗臺上靜置5分鐘。將培養板放回到磁體上7分鐘。吸出上清液。9.將洗滌步驟7-8再重復兩次。10.將培養板從磁體移出。添加500|1170%乙醇且通過滴管吸取混合將珠粒再懸浮。11.將培養板放回到磁體上7分鐘。吸出上清液。12.將乙醇洗滌步驟10-11再重復兩次。在第三次洗滌后移除盡可能多的乙醇。13.使培養板在磁體上靜置20分鐘以干燥珠粒。14.使培養板離開磁體。添加20pl不含核糖核酸酶的水，滴管吸取混合且培養5分鐘。15.將培養板放回到磁體上。將上清液轉移到清潔管中。結果在50plPCR反應中使用10iil各樣品與HBV特異性引物。不含HBV的血漿的模擬提取物為陰性，而所有16個含有HBV的樣品為陽性。結論圖15顯示本文中所述的方法可用于從極低拷貝數的病毒分離和檢測基因組DNA。實施例13從石蠟包埋樣品分離基因組DNA組織消化1.從2mg-20mg石蠟包埋組織塊，將組織切為薄(10jim)切片且放在1.5ml管中。蓋上蓋子且在試驗臺上輕拍管，直到組織樣品落到管底部。2.添加100jil去交聯緩沖液(50mMHEPES緩沖液pH7.9、1%氫氧化銨)且在70。C下培養l小時。3.添加100jil溶解緩沖液(50mMHEPESpH7.9、1%SDS、1mMEDTA)與20(al20mg/ml蛋白酶K。4.在55。C下消化組織1小時。DNA提取1.向含有200(il消化組織的管中添加結合緩沖液(200iil4MGITC、400mM檸檬酸鈉(pH7.0)、2%TritonX-100;6pl5%固體磁性珠粒；200iul異丙醇)。2.混合且在室溫下培養1分鐘。3.將管放在^茲性底座上1分鐘。4.棄去上清液。5.將珠粒再懸浮于300]il洗滌緩沖液(2MGITC、200mM檸檬酸鈉、P/oTX-100和30。/。異丙醇)中，在室溫下培養l分鐘。6.放在^f茲性底座上1分鐘。棄去上清液。7.重復步驟6和步驟7。8.將珠粒再懸浮于200pd70%乙醇中。在室溫下培養l分鐘。9.棄去上清液。10.將步驟9和步驟10重復兩次。11.將珠粒風干10-15分鐘。12.將珠粒再懸浮于50ial水中，在室溫下靜置l分鐘。13.將管放在》茲性底座上1分鐘。14.將DNA洗脫劑轉移到新管中。結果將20jilDNA裝載于0.8%瓊脂糖凝膠上。來自20mg組織的DNA產量為1.5-3jig。(上凝膠)泳道1和2顯示已從固定于石蠟中的組織分離的DNA的典型圖案。(下凝膠)來自兩個提取樣品(泳道1和2)、無模板對照物(泳道3)和陽性對照物DNA(泳道4)的基因特異性PCR擴增。結論如圖16中所示，本文中所述的方法可用于從石蠟包埋組織切片分離足夠質量的基因組DNA以用于后續PCR擴增中。盡管本發明已關于其優選實施例進行特定展示和描述，但所屬領域的技術人員將了解可在不偏離由隨附權利要求涵蓋的本發明范疇的情況下，可對其作出各種形式和細節的改變。權利要求1.一種分離細胞或有機體的基因組核酸的方法，其包含a)合并i)固相載體，其表面上已結合可逆結合核酸的官能團，ii)細胞或有機體，以及iii)試劑，其中所述試劑使得所述細胞或所述有機體溶解且所述細胞或所述有機體的基因組核酸沉淀于所述固相載體上；從而產生組合；b)將該組合保持在所述細胞或有機體發生溶解且所述細胞或有機體的基因組核酸與所述固相載體可逆地結合的條件下，從而產生具有與固相載體結合的所述細胞或有機體的基因組核酸的固相載體；以及c)將所述固相載體從該組合中分離；從而分離所述細胞或有機體的所述基因組核酸。2.根據權利要求1所述的方法，其進一步包含^f吏c)的所述固相載體與使得所述細胞或有機體的基因組核酸從所述固相載體洗脫的洗脫緩沖液接觸。3.根據權利要求1所述的方法，其中所述固相載體為磁性微粒。4.根據權利要求3所述的方法，其中所述磁性微粒具有包被表面，其中所述包被表面選自由羧基包被表面和胺基包被表面組成的組中。5.根據權利要求1所述的方法，其中所述試劑包含醇。6.根據權利要求5所述的方法，其中所述醇選自由乙醇、異丙醇和聚烷撐二醇所組成的組中。7.根據權利要求1所述的方法，其中所述試劑進一步包含鹽。8.根據權利要求7所述的方法，其中所述鹽選自由NaCl、LiCl和MgCl2所組成的組中。9.根據權利要求2所述的方法，其中洗脫緩沖液包含水。10.根據權利要求1所述的方法，其中所述固相載體使用選自由以下方法所組成的組中的方法從組合中分離施加磁場、施加真空過濾和施加離心。11.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞選自由細菌細胞、血細胞、培養細胞、頰細胞和它們的組合所組成的組中；且所述有機體為病毒。12.根據權利要求11所述的方法，其中所述病毒為肝炎病毒。13.根據權利要求1所述的方法，其中所述基因組核酸為DNA或RNA。14.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法進一步包含使步驟b)中的所述固相載體與選自由以下各試劑所組成的組中的試劑接觸移除或消化DNA的試劑、移除或消化RNA的試劑、移除或消化蛋白質的試劑和它們的組合。15.—種分離細胞或有機體的基因組核酸的方法，其包含a)合并細胞或有機體和使得所述細胞或有機體溶解的試劑，從而產生第一組合；b)將所述第一組合保持在所述細胞或有機體發生溶解的條件下，從而產生溶解產物；c)合并所述溶解產物與結合緩沖液，所述結合緩沖液包含固相載體，該固相載體表面上已結合可逆結合核酸的官能團；和試劑，該試劑使得所述細胞或有機體的基因組核酸沉淀在所述固相載體上，從而產生第二組合；d)將所述第二組合保持在所述細胞或有機體的基因組核酸與所述固相載體可逆結合的條件下，從而產生具有與固相載體結合的所述細胞或有機體的基因組核酸的固相載體；e)將所述固相載體從所述第二組合分離；以及從而分離所述細胞或有機體的基因組核酸。16.根據權利要求15所述的方法，其進一步包含使d)的所述固相載體與洗脫緩沖液接觸，所述洗脫緩沖液使得所述細胞或有機體的基因組核酸從所述固相載體洗脫。17.根據權利要求15所述的方法，其中所述磁性微粒具有包被表面，其中所述包被表面選自由羧基包被表面和胺基包被表面所組成的組中。18.根據權利要求15所述的方法，其中所述結合緩沖液包含醇。19.根據權利要求18所述的方法，其中所述醇選自由乙醇、異丙醇和聚烷撐二醇所組成的組中。20.根據權利要求15所述的方法，其中所述結合緩沖液進一步包含鹽。21.根據權利要求20所述的方法，其中所述鹽選自由NaCl、LiCl和MgCl2所組成的組中。22.根據權利要求15所述的方法，其中所述洗脫緩沖液包含水。23.根據權利要求15所述的方法，其中所述磁性微粒使用選自由以下方法所組成的組中的方法從所述組合中分離施加磁場、施加真空過濾和施加離心。24.根據權利要求15所述的方法，其中所述細胞選自由細菌細胞、血細胞、培養細胞、頰細胞和它們的組合所組成的組中；且所述有機體為病毒。25.根據權利要求24所述的方法，其中所述病毒為肝炎病毒。26.根據權利要求15所述的方法，其中所述方法進一步包含使步驟b)中的所述固相載體與選自由以下各試劑所組成的組中的試劑接觸移除或消化DNA的試劑、移除或消化RNA的試劑、移除或消化蛋白質的試劑和它們的組合。27.—種試劑盒，其包含溶解緩沖液、結合緩沖液、移除雜質的試劑和洗滌緩沖液。28.根據權利要求27所述的試劑盒，其中所述溶解緩沖液包含十二烷基硫酸鈉、TritonX-100、EDTA和Tris-HCl。29.根據權利要求27所述的試劑盒，其中所述結合緩沖液包含磁性微粒、聚乙二醇和碘化鈉。30.根據權利要求27所述的試劑盒，其中所述移除雜質的試劑為消化蛋白質的試劑。31.根據權利要求30所述的試劑盒，其中所述消化蛋白質的試劑為蛋白酶K。32.根據權利要求27所述的試劑盒，其中所述洗滌緩沖液包含聚乙二醇和尿素。33.—種試劑盒，其包含a)溶解緩沖液，其包含十二烷基硫酸鈉、TritonX-lOO、EDTA和Tris;b)結合緩沖液，其包含磁性微粒、聚乙二醇和碘化鈉；c)蛋白酶K;和d)洗滌緩沖液，其包含聚乙二醇和尿素。全文摘要本發明描述了一種方法，其中細胞的基因組核酸可直接從細胞生長培養物與細胞中分子量低于基因組核酸分子量的核酸(例如質粒DNA)分離。本發明也描述了一種方法，其中在細胞溶解產物中基因組核酸可與分子量低于基因組核酸分子量的核酸分離，而無需制備澄清溶解產物。本發明也涉及一種分離細胞或有機體的基因組核酸(例如RNA、DNA)的方法。文檔編號C12N15/10GK101268189SQ200680034578公開日2008年9月17日申請日期2006年9月19日優先權日2003年4月2日發明者凱文·麥克納,裘奈德·席奧汀申請人:亞鈞闊特生命科學公司