專利名稱：：調控植物中色素生產的組合物和方法
技術領域：
：本發明屬于植物中色素發育(development)的領域。
背景技術：
：花青素色素的積累是水果質量的重要決定因素。色素為用戶提供了基本的品種區別并涉及到蘋果的健康屬性(BoyerandLiu,2004)。花青素色素屬于遍在的統稱為黃酮類化合物的二級代謝產物的不同組。在植物中，黃酮類化合物涉及到包括防御在內的無數生物學功能，同時，被著色的花青素化合物尤其在植物/動物相互作用中作為引誘劑扮演了重要的生理學角色。包括花青素在內的全部黃酮類化合物的主要前體是丙二酸單酰輔酶A和對-香豆酰輔酶A。從這些前體查耳酮合成酶(CHS)合成出查耳酮，這是花青素生產和Ci5骨架建立的第一個關鍵步驟。査耳酮然后被査耳酮異構酶(CHI)異構化來生產查耳酮柑橘黃素，并且從那里，經由黃烷酮3[P]-羥化酶(F3H)的羥基化步驟轉化柑橘黃素到二氫黃酮醇(dihydroflavonon)。二氫黃酉同醇豐皮二氫黃酉同醇(dihydroflavonon)4-還原酶(DFR)還原，產生白花色苷，然后白花色苷被白花色苷元加雙氧酶(LDOX)轉化成有色化合物anthocyanindin，同時最終的糖基化步驟被尿嘧啶二磷酸鹽(UDP)-葡萄糖類黃酮3-鄰-葡萄糖基轉移酶(UFGT)所介導。花青素顏色的差異能歸因于包括分子結構和羥基的類型和數目以及連接的糖和酸以及諸如pH值或超微結構的細胞環境在內的大量因素。在許多的花青素色素中，主要負責蘋果皮中紅色著色的色素是花青苷3-鄰-半乳糖苷形式的花青素，并且在蘋果的這個生物合成途徑中的酶類已經被很好的描述(Kim"a/.,2003,PlantScience165,403-413;Hondaa/"2002，PlantPhysiologyandBiochemistry40,955-962)。長久以來己經觀察到，花青素類被升高來響應特定的環境、發育和病原刺激。在蘋果中的研究已經證實了花青素積累的環境和發育調控。當水果遭受白光，或更顯著地，UV光時，色素生物合成能被誘導，在其它物種中也觀察到這個現象。而且，通過將所述水果進行低溫儲存，花青素水平能被提高。存在在蘋果的發育方式中具有明顯的花青素酶活性的花青素酶的同等誘導的證據，并且，依賴于品種，相關的著色在不熟的水果中增加并在成熟時再次增加。研究顯示，在花青素途徑中，存在通過同啟動子元件復合的轉錄因子(TFs)的特定結合進行的高度特異的基因調控(HoltonandComish，1995,PlantCell7,1071-1083)。這個調控可能也擴展到諸如花青素運輸蛋白的非途徑基因。MYBTFs已經被顯示在花青素的轉錄調控中扮演重要的角色。植物MYBs已經被牽涉到像二級代謝(包括所述花青素途徑)、發育、信號傳導和疾病抵抗力一樣多樣的控制途徑(JinandMartin,1999,PlantMolBiol,41,577-585)。它們被包含單個或多個缺陷重復的結構保守DNA結合區域賦予特色；那些花青素途徑相關的區域趨向于二重復(two-repeat)(R2R3)類別。調控也能在花青素生物合成途徑早期或晚期對基因的謹慎的小組(discreetgroups)特異。在紫蘇(i^r/fe/n^mce似)葉片中，TF驅動的調控已經在從CHS到結果的花青素蛋白運輸基因的實際上所有的花青素生物合成的階段中觀察到，同時，在葡萄(Wfev/"z/era)中，被MybA進行的特定調控被限定在蛋白生產的終點(UFGT)。在擬南芥屬植物(JrahVfo;^&)中存在被分成24個亞組的大約140個R2R3MYBTFs(Stracke"a/2001,CurrentOpinioninPlantBiology,4:447-556)。花青素色素l(PAPl)MYB的生產(Borevitz"。/.，2000，PlantCell,12,2383-2394)屬于亞組10(當Strackeda/.,2001的系統發育被使用時)并證明了同其它已知花青素調控子相比高度的氨基酸保守。PAP1在轉基因擬南芥中過表達導致了花青素生物合成途徑中從PAL到CHS和DFR的大量基因的上調(Borevitzda/.，2000,PlantCell,12，2383-2394;Tohge"a/"2005,PlantJournal,42,218-235)。一般地，MYBs同基礎的螺旋環螺旋TFs(bHLH)緊密地相互作用，并且這個作用己經被廣泛地研究其與黃酮類化合物生產的關系(Mole,a/"1996;Winkel-Shirley,2001)。范例包括玉米ZmCMYB和ZmBbHLH和牽牛花AN2MYB和AN1/JAF13bHLHs(GoffWa/.，1992GenesDev,6,864-875;MolWa/"1998,TrendsinPlantScience,3,212-217)。明顯地，在不同物種中存在這個同等物的保守程度。然而，MYB-bHLH合作不總是必需的。來源于PAP1過表達的結果暗示，相似于玉米PMYB(Grotewold"a/"2000ProcNatlAcadSciUSA,97,13579-13584)和擬南芥MYB12(Mehrtens"2005PlantPhysiology,138，1083-1096)，PAP1不需要過表達的bHLH共同調節因子來驅動花青素生產的大量增加。然而，進一步的研究顯示，PAPl確實同bHLHs緊密地相互作用，這在體內實驗中導致更強啟動子(DFR)激活(ZimmermannWa/.,2004PlantJ,40，22-34)。更近期地，PAP1過表達線的整體的轉錄組學和代謝組學分析證實，PAP1上調bHLHTT8(At4g09820)18倍(Tohge&a/"2005,PlantJ，42,218-235)。這個對共同調控因子的依賴同高度保守的R2R3結合區域中的少量氨基酸改變相關，如在不依賴bHLH的玉米P和依賴bHLH的玉米CIMYBs間的對比所證明的，并足以定向不同種類的目標基因的激活(Grotewold"a/"2000,ProcNatlAcadSciUSA,97,13579-13584)。在本石開究中，從CI的R2R3區域到P1的相應位置的僅6個氨基酸的替換導致了具有同Cl相似的依賴bHLH的行為的突變。更近期地，它被暗示，這可能是目標基因間允許MYBs區別的關鍵機理(HernandezWa/.，2004，J.Biol.CHem,279，48205-48213)。這些關鍵的氨基酸在圖1中進行了標識。同PAP1相比，FaMYBl在草莓的后期發育過程中抑制了花青素的生物合成。不管這個改變的角色，FaMYBl分享了激活MYBs的同源性并能同諸如牽牛花AN1和JAF13的(激活)bHLH相互作用(Aharoni&a/.，2001，PlanU,28,319-332)。不管PAP-樣激活子和FaMYB-樣抑制子的關鍵氨基酸殘基一樣，激活子傾向于屬于亞組IO而抑制子屬于亞組17(根據Stracke"a/)。額外水平的花青素調控涉及含有同MYB和bHLH蛋白形成復合物的WD40區域蛋白的蛋白的單獨類別(如在RamsayandGlover，2005,TrendsinPlantScience,10,63-70中回顧的)。范例包括牽牛花中的a"http://(deVettenda/.，1997GenesDev,11,1422-1434)和擬南芥中的7TG7(Walker"a/.，1999,PlantCell,11,1337-1350)。花青素的轉錄控制可能被組織特異的調控(Kubo"《1999,PlantCell,11，1217-1226)和依賴于渚如冷、光和發育線索(cues)的剌激的可能不同的調控層次(DavuluriW2005,NatureBiotechnology,23,890-895)進一歩并發。盡管對蘋果花青素合成的激活和抑制的研究已經表明，截至目前，發育和環境調控，調控花青素合成的轉錄因子在這個物種或任何其它每年落葉的水果中是不同的。蘋果中的花青素積累的控制是理解和處理水果顏色的關鍵問題。對施加這個控制的因子的鑒別提供了調節水果組織中起源于花青素的著色的程度和分布的工具。因此，本發明的目標是提供調控蘋果物種中花青素生產的轉錄因子序列和/或至少提供給公眾有用的選擇。
發明內容在第一方面，本發明提供分離的多聚核苷酸，包括a)編碼具有SEQIDNO:1-4和9-21或其變種的任何一種氨基酸序列的多肽的序列，其中的多肽或其變種是能調控植物中花青素生產的轉錄因子；b)具有長度至少為a)的序列的15個核苷酸的片段；c)a)的序列的互補序列；d)b)的序列的互補序列；e)在嚴格條件下能同a)的序列雜交的至少長15個核苷酸的序列。在一個實施方案中，分離的多聚核苷酸包含a)編碼具有同SEQIDNO:1-4和9-21的任何一種氨基酸序列至少65%同一性的多肽的序列，其中的多肽是能調控植物中花青素生產的轉錄因子；b)具有長度至少為a)的序列的15個核苷酸的片段；c)a)的序列的互補序列；d)b)的序列的互補序列；e)在嚴格條件下能同a)的序列雜交的至少長15個核苷酸的序列。在進一歩的實施方案中，所述多肽具有同SEQIDNO:1的氨基酸序列至少65%的同一性。優選地，所述多肽具有SEQIDNO:l的氨基酸序列。在進一步的實施方案中，所述多肽具有同SEQIDNO:2的氨基酸序列至少65%的同一性。優選地，所述多肽具有SEQIDNO:2的氨基酸序列。在進一步的實施方案中，所述多肽具有同SEQIDNO:3的氨基酸序列至少65%的同一性。優選地，所述多肽具有SEQIDNO:3的氨基酸序列。在進一步的實施方案中，所述多肽具有同SEQIDNO:4的氨基酸序列至少65%的同一性。優選地，所述多肽具有SEQIDNO:4的氨基酸序列。在進一步的實施方案中，在a)中的序列具有同SEQIDNO:5-8、22-47和102的任何一種的序列至少70%的同一性。優選地，在a)中的序列具有同SEQIDNO:5-8、22-47和102的任何一種的編碼序列至少70%的同一性。在進一步的實施方案中，在a)中的序列具有同SEQIDNO:5的序列至少70%的同一性。優選地，在a)中的序列具有同SEQIDNO:5的編碼序列至少70%的同一性。更優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:5的序列。更優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:5的編碼序列。在進一步的實施方案中，在a)中的序列具有同SEQIDNO:6的序列至少70。/。的同一性。優選地，在a)中的序列具有同SEQIDNO:6的編碼序列至少70%的同一性。更優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:6的序列。更優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:6的編碼序列。在進一步的實施方案中，在a)中的序列具有同SEQIDNO:7的序列至少70%的同一性。優選地，在a)中的序列具有同SEQIDNO:7的編碼序列至少70%的同一性。更優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:7的序列。更優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:7的編碼序列。在進一步的實施方案中，在a)中的序列具有同SEQIDNO:8的序列至少70%的同一性。優選地，在a)中的序列具有同SEQIDNO:8的編碼序列至少70%的同一性。更優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:8的序列。更優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:8的編碼序列。在進一歩的方面，本發明提供分離的多聚核苷酸，其包含a)具有同SEQIDNO:5-8、22-47和102的任何一種核苷酸序列至少70%同一性的序列，其中所述序列編碼能調控植物中花青素生產的轉錄因子；b)具有長度至少為a)的序列的15個核苷酸的片段；c)a)的序列的互補序列；d)b)的序列的互補序列；e)在嚴格條件下能同a)的序列雜交的至少長15個核苷酸的序列。在一個實施方案中，在a)中的序列具有同SEQIDNO:5的序列至少70%的同一性。優選地，在a)中的序列具有同SEQIDNO:5的編碼序列至少70%的同一性。更優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:5的序列。更優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:5的編碼序列。在一個實施方案中，在a)中的序列具有同SEQIDNO:6的序列至少70%的同一性。優選地，在a)中的序列具有同SEQIDNO:6的編碼序列至少70%的同一性。更優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:6的序列。更優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:6的編碼序列。在一個實施方案中，在a)中的序列具有同SEQIDNO:7的序列至少70%的同一性。優選地，在a)中的序列具有同SEQIDNO:7的編碼序列至少70%的同一性。更優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:7的序列。更優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:7的編碼序列。在一個實施方案中，在a)中的序列具有同SEQIDNO:8的序列至少70%的同一性。優選地，在a)中的序列具有同SEQIDNO:8的編碼序列至少70%的同一性。更優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:8的序列。更優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:8的編碼序列。在進一步的方面，本發明提供具有同編碼含有選自SEQIDNO:1到4和9到21的任何一種的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列至少70%序列同一性的分離多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸編碼能調控植物中花青素生產的轉錄因子。在-一個實施方案中，分離多聚核苷酸具有同編碼包含SEQI:DNO:1的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列至少70%的序列同一性。在進一歩的實施方案中，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:5的核苷酸序列。優選地，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:5的編碼序列。在進一步的方面，本發明提供分離多聚核苷酸，其包含a)編碼具有同SEQIDNO:1-4和9-21的任何一種氨基酸序列至少65%同一性的多肽的序列，其中所述多肽是能調控在花青素生物合成途徑中的基因的啟動子的轉錄因子；b)具有長度至少為a)的序列的15個核苷酸的片段；c)a)的序列的互補序列；d)b)的序列的互補序列；'e)在嚴格條件下能同a)的序列雜交的至少長15個核苷酸的序列。在進一步的方面，本發明提供了分離多聚核苷酸，其包含a)具有同SEQIDNO:5-8、22-47和102的任何一種核苷酸序歹lj至少70%同一性的序列，其中所述序列編碼能調控在花青素生物合成途徑中的基因的啟動子的轉錄因子；b)具有長度至少為a)的序列的15個核苷酸的片段；c)a)的序列的互補序列；d)b)的序列的互補序列；e)在嚴格條件下能同a)的序列雜交的至少長15個核苷酸的序列。在一個實施方案中，被調控的基因編碼二氫黃酮醇(dihydroflavolon)4-還原酶(DFR)。在另一個實施方案中，被調控的基因編碼查耳酮合成酶(CHS)。在進一步的方面，本發明提供分離多聚核苷酸，其包含a)編碼SEQIDNO:1-4和9-21的任何一種氨基酸序列的多肽變種的序列，其中所述多肽是能調控植物中花青素生產的轉錄因子，并且其中所述多肽包含SEQIDNO:101的序列；b)具有長度至少為a)的序列的15個核苷酸的片段；c)a)的序列的互補序列；d)b)的序列的互補序列；e)在嚴格條件下能同a)的序列雜交的至少長15個核苷酸的序列。優選地，所述變種多肽衍生自薔薇科物種。在進一步的方面，本發明提供分離多肽，其包含a)具有同選自SEQIDNO:1-4和9-21任何之一的氨基酸序列至少65%同一性的序列，其中所述多肽是能調控植物中花青素生產的轉錄因子；或b)具有長度至少為a)的序列的15個氨基酸的片段。在一個實施方案中，在a)中的序列具有同SEQIDNO:1的氨基酸序列至少65%的同一性。優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:1的序列。在一個實施方案中，在a)中的序列具有同SEQIDNO:2的氨基酸序列至少65%的同一性。優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:'2的序列。在一個實施方案中，在a)中的序列具有同SEQIDNO:3的氨基酸序列至少65%的同一性。優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:3的序列。在一個實施方案中，在a)中的序列具有同SEQIDNO:4的氨基酸序列至少65%的同一性。優選地，在a)中的序列具有SEQIDNO:4的序列。在進一歩的方面，本發明提供了編碼本發明多肽的多聚核苷酸。在進一步的方面，本發明提供了抗本發明的多肽的抗體。在進一步的方面，本發明提供了包含本發明的任何一種多聚核苷酸的遺傳學構建物。在進一歩的方面，本發明提供了包含本發明的遺傳學構建物的宿主細胞。在進一步的方面，本發明提供了被遺傳修飾來表達本發明的任何一種多聚核苷酸的宿主細胞。在進一步的方面，本發明提供了包含本發明的遺傳學構建物的植物細胞。在進一歩的方面，本發明提供了被遺傳修飾來表達本發明的多聚核苷酸的植物細胞。在進一步的方面，本發明提供了包含本發明的植物細胞的植物。在進一步的方面，本發明提供了生產本發明的多肽的方法，所述方法包括培養包含本發明的遺傳學構建物的宿主細胞的歩驟。在進一步的方面，本發明提供了具有改變的花青素生產的植物細胞或植物，所述方法包含用遺傳學構建物轉化植物細胞或植物的歩驟，所用的遺傳學構建物包括a)至少一'條編碼本發明的多肽的多聚核苷酸；b)至少一條包含具有長度至少為a)的多聚核苷酸的15個核苷酸的片段的多聚核苷酸；或c)至少一條包含具有長度至少為a)的多聚核苷酸的15個核苷酸的互補序列的多聚核苷酸。在進一步的方面，本發明提供了生產具有改變的花青素生產的植物細胞或植物的方法，所述方法包含用遺傳學構建物轉化植物細胞或植物的步驟，所用的遺傳學構建物包括a)至少一條本發明的任何一個的多聚核苷酸。；b)至少一條包含具有長度至少為a)的多聚核苷酸的15個核苷酸的片段的多聚核苷酸，或c)至少一條包含具有長度至少為a)的多聚核苷酸的15個核苷酸的互補序列的多聚核苷酸d)至少一條能在嚴格條件下同a)或b)的多聚核苷酸雜交的多聚核苷酸。在所述方法的一個實施方案中，所述構建物被設計來表達一對轉錄因子，并且所述構建物包含i)編碼具有同SEQIDNO:1、2和9-21的任何一條氨基酸序列至少65%同一性的MYB轉錄因子的多聚核苷酸序列；和ii)編碼具有同SEQIDNO:1或2的氨基酸序列至少65%同一性的bHLH轉錄因子的多聚核苷酸序列。在進一步的實施方案中，在i)中的多聚核苷酸序列具有同SEQIDNO:5、6、22-27和102的任何一條核苷酸序列至少70%的序列同一性；并且在ii)中的多聚核苷酸序列具有同SEQIDNO:7或8的核苷酸序列至少70%的序列同一性。在進一步的實施方案中，在i)中的多聚核苷酸序列具有同SEQIDNO:5、6、22-27和102的任何一條核苷酸序列至少70%的序列同一性；并且在ii)中的編碼序列具有同SEQIDNO:7或8的編碼序列至少70%的序列同一性。在進一步的方面，本發明提供了用本發明的方法生產的植物。在進一步的方面，本發明提供了選擇花青素生產被改變的植物的方法，所述方法包含檢測植物中的本發明的多聚核苷酸的改變的表達。在進一步的方面，本發明提供了選擇花青素生產被改變的植物的方法，所述方法包含檢測植物中的本發明的多肽的改變的表達。在進一歩的方面，本發明提供了用本發明的方法選擇的植物。在進一步的方面，本發明提供了選擇被轉化的植物細胞或植物的方法，所述方法包含下述步驟a)用本發明的能調控植物中花青素生產的多聚核苷酸或多肽轉化植物細胞或植物；b)在所述植物細胞或植物中表達所述多聚核苷酸或多肽；和c)選擇具有相對于其它植物細胞或植物而言增加了的花青素著色的植物細胞或植物，所述增加了的花青素著色表明所述植物細胞或植物己經被轉化。優選地，本發明的能調控植物中花青素生產的轉錄因子和變種能調控選自但不限于花青素-3-葡糖苷、花青素—3-鄰-蕓香糖苷、cyanadin-3-葡糖苷或cyanadin-3-戊糖苷的花青素的生產。優選地，通過本發明的方法生產或選擇的具有改變的花青素生產的植物或植物細胞在選自但不限于cyanadin-3-葡糖苷酶、cyaniding-3-鄰-蕓香糖苷、cyanadin-3-葡糖苷或cyanadin-3-戊糖苷的花青素的生產中發生改變。本發明的多聚核苷酸和多聚核苷酸變種能衍生自任何物種或能通過重組或合成方法進行生產。在一個實施方案中，所述多聚核苷酸或變種衍生自植物物種。在進一步的實施方案中，所述多聚核苷酸或變種衍生自裸子植物物種。在進一步的實施方案中，所述多聚核苷酸或變種衍生自被子植物物種。在進一步的實施方案中，所述多聚核苷酸或變種衍生自雙子葉植本發明的多肽和多肽變種能衍生自任何物種，或能通過重組或合成方法進行生產。在一個實施方案中，本發明的多肽或變種衍生自植物物種。在進一歩的實施方案中，本發明的多肽或變種衍生自裸子植物。在進一歩的實施方案中，本發明的多肽或變種衍生自被子植物。在進一歩的實施方案中，本發明的多肽或變種衍生自雙子葉植物。在進一步的實施方案中，本發明的多肽或變種衍生自單子葉植物。本發明的植物細胞或植物能衍生自任何物種。在一個實施方案中，本發明的植物細胞和植物衍生自裸子植物物種。在進一步的實施方案中，本發明的植物細胞和植物衍生自被子植在進一步的實施方案中，本發明的植物細胞和植物衍生自雙子葉在進一步的實施方案中，本發明的植物細胞和植物衍生自單子葉植物物種。優選的植物物種(對于本發明的多聚核苷酸和變種、多肽和變種以及植物細胞和植物)包括選自包含但不限定于下述屬的水果植物物種蘋果屬(Ma/ws)、梨屬(戶戸)、李屬(尸nm^)、懸鉤子屬(iw』)、薔薇屬(iOM)、草莓屬(Fragar/a)、獼猴桃屬(J"/"W/a)、榲梓屬(Cy<iom'a)、相橘屬(CzYn/s)禾口越橘屬(Kcc/m'wm)。特別優選的水果植物物種是家蘋果(7Wa/附Aw2eWca)、美味獼猴桃"c//<i/m'<3^//c/o^)、中華獼猴桃c/n'"em&)、毛花獼猴桃".eh/zfl)、軟棗獼猴桃(Aflrgwto)和上述四種獼猴桃物種的雜交品種、桃(尸層/，ra/ca)、嶺南梨(尸ymy丄.)、懸鉤子屬(歸w)、薔薇屬(Wora)和草莓屬(Fragw/a)。優選的植物(對于本發明的多聚核苷酸和變種、多肽和變種以及植物細胞和植物)也包括選自包含但不限定于下述屬的蔬菜植物品種蕓苔屬(ira^c")、番茄屬(Z_yco/ens7.coM)禾卩茄屬(6b/朋w附)，特別優選的蔬菜植物品種為西紅柿(丄yccpera/cw7escw/e"似m)禾口馬!令薯'(5b/am冊fw6erasw/w)優選的植物(對于本發明的多聚核苷酸和變種、多肽和變種以及植物細胞和植物)也包括選自包含但不限定于下述屬的農作物植物品禾中大旦屬(G/)'c,'"e)、玉米屬)、大麥屬(//07xfeww)禾口稻屬(O,;yzfl)。特別優選的農作物植物物種包括大豆(G/_yc/"emax)、玉米(Zeamqys)禾口7K禾g((9r>2(3sariv(3)。優選的植物(對于本發明的多聚核苷酸和變種、多肽和變種以及植物細胞和植物)也包括那些薔薇科的物種。優選的薔薇科的屬包括白鵑梅屬(￡x0C/20^fo)、臭櫻屬(Ma必em'a)、0綴/er/a、O扁araw'a、扁核木屬(尸n.raep/a)、李屬(尸ra歷s)、蘋果亞科(她/o/(ieae)、唐棣屬(j膨/朋c/z/er)、石灰樹屬(j"'(3)、月7曳月力花揪屬(Jraw'a)、木瓜屬(C7zaewo附e/ey)、CTwmaewew'/ws、榛屬(Cbr附M)、枸子屬(C。towecwfer)、山楂屬(Cratoeg附)Qswawm'a、扁核木屬(尸nVwep/a)、李屬(尸n,ra")、蘋果亞科(ikfo;/o/cfe"e)、唐棣屬(爿we/awc/z/er)、爿r/a、月泉月力花楸屬(Jraw'a)、木瓜屬(CTzaewcwe/es)、C7zawaem&sp//us、禾秦屬(Cbrmws)、豐旬子屬(CV^oeosfer)、山f查屬(CratoegM-O、媼梓屬(Qycfow'o)、牛筋條屬(Z)〖c/70tomcf/7^2es1)、移屬(Doc_ym'a)、Doqy"/o/2S7J、禾比杷屬(EWo/w^ya)、￡Wo/o6ws、//e/erame/ay、KagewecAia、丄/"(i/e戸、Ma/acome/es、蘋果屬(Ma/i"')、歐植屬(Me，7ws)、小石積屬(Qyteome/&0、酸果木屬(戶erap/5y〃Mw)、石楠屬(尸/7ori"/a)、假揾梓屬(/^eM<i。<qy(iow/<2)、火棘屬(/yraca涵a)、梨屬(尸y簡)、石斑木屬(i/7(3p/7/o/—s)、花楸屬(SorZ)ws)、紅果樹屬(浙朋raes7.fl)、7brw/"afc、P^呵wWm'a、薔薇亞禾斗(i。TO/(iefle)、芒束lj果屬(JcaeM<3)、習習口十花屬(v4cowfls/y&)、龍牙草屬(v4gn'wowVz)、羽衣草屬(爿/c/2e冊7/a)、v4p/zfirwe5、yiremom'a、5ewco脂'a、C72a附ae6加'a、C/i^Wa、無尾果屬(Co/wn'a)、Ccw朋/a、Z)a//Za/r/。、Z)朋(ir/opofen.M附、仙女木屬(Z>'_yos)、蛇莓屬(Dwc/2as7ea)、i^j^racow^Fa〃wg/a、紋子蟲草屬(Fz7—w/w/a)、草莓屬(Fragar/a)、路邊青屬(G^鵬)、i/agew,a、7/or/:e//a、/vas"/a、様棠花屬(Xe/r/a)、i^Mcas/cfea、M2/-cefe〃<3、Afargyn'carpz."、7Vovo57.evera/a(9"ca(y/Ms、戶o(y/ep/s、委P麥菜屬(戶ote/ft.〃a)、薔薇屬(ios"a)、葛、'l勾子屬(iwZ^)、地偷屬(5b"gw/sor6a)、6brcopoten'w,w、山毒草屬(貓ZflW")、五辦蓮屬(ySVewra/a)、太行花屬(Kn7/ag7'a)、7^,rag/oc/z/w、林石草屬(恥/Ate/m'a)、薔蔽禾斗地位未定(ioraceae/wce由e化(i/51)、y4(iewoyto附a、假升麻屬(^n,wcas)、紫衫屬(Ce廠coc戸5)、C7w附aeZ)arian.a、i也薔薇屬(C/Mfwaer/zot/ay)、美吐豐艮屬(GW/era'a)、Z/o/otfccz^、丄少two決am做5、繡線梅屬(iVe/〃/a)、iVevzYm.a、風箱果屬(尸/2j^ocar/7MY)、尸t"'《/7/G、X鳥麻屬(i/z<9<i<9/^/ay)、珍珠豐每屬(^SbrZ)"r/")、屬(>§/rae(3)禾口小米空木屬(5yep/7G朋w6ra)。優選的薔薇科物種包括紅柄白鵑梅(五xoc/zoniag/raW//)、Exoc/zo廠(i"racemosa、Go5c/2wrfa、紅柄白昌鳥梅(五:x:oc/wni"g/ra/<i//)、E"xoc/zoniaracemosa、齒葉白昌鳥梅(Scoc/zoniaserranyb/Za)、臭櫻東北扁核木(7V/m'e戸-(3s/wem^)、齒口十扁核木(/V/m"e//(3wmy/ora)、阿禾J根尼李子(iV網wsa〃eg/zam'em7's)、美洲李(/V朋msawer/cawa)、iVwwws朋(iersom7、奇克索李(/Vw聰5a"gz^^/b/,a)、尸ra聽s"戶ta/a、argewto3、山杏(/Vwra"armew'aca)、歐洲舌甘樓杉t(尸nmws(3v/wm)、ZVMm.AsZ^(9/M、布里揚松杏(/V朋M5Zr/ga油'憩)、Zwc/7fl/-/ca、憐木樓(尸r調ws6wefger/awa)、山櫻花(/V朋wcampamz/ato)、力口羅林桂櫻)、酸櫻桃(iV飄"cerosm)、7V朋wsc/ore/朋a、另卩不勒斯李(/V朋wcocow///a)、7Vw7wsc_yc/am/a、山杉^((i"W(iz'朋a)、iV腦us(ie6/to、歐洲李(ZV朋ws(iomeWc")、扁杉t(/V腦ms<iw/c/5)、苦櫻杉^(/V朋船emarg/w(3ta)、/Vwm"并e附cwf//、灌木櫻杉^(/V朋MS^h/ft.cosa)、Prw/wsgew/cw/ato、麥李(iVwwi^<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>屬'dentata，"膨/awc/z.er乎Wewtoto')、唐棣屬"erecta，(Amelanchiersp.'erccta')、唐棣屬"erecta，x光滑唐棣(v4附e/朋c/z/er平xJ/認/朋c/w'er/aev/s)、唐様屬'serotina，(Jwe/awc/z/e/-5/7.Sera/^m')、a/m》//a、紫果月泉月力花楸(Jram'")、毛葉木瓜(C7aew函e/es)、芻皮皮木瓜(C72(3ewo附e/as1-spec/oyfl)、CAamaewaspz'/wsa/p/腦、家棒(Cb簡ws(iomas'Z/c")、細尖枸子(Cbtowemter—cw/a加)、團花枸子(Cotoweos/er/actew^)、超毛拘子(Coto認aWer戸朋asw)、Cratoegi^a加ra/w"Cratoegwsco/m附6,朋a、白玉山楂(Cratoegm*cms-ga〃/)、Cratoegmcwn^epa/"、彩葉山植(Cratoegws/aev/gato)、Crataegtwwo〃/s、單子山楂(Cratoegws777cwo^"a)、歐洲黑山楂(Cratoegww'gra)、Cratoegt^"viz/an.^、Cratoegiws/wa/ca、媼梓(Q^/ow/aoWcwga)、光葉牛筋條(D/c/wto附朋決esWstow7cafp")、云南移(Z)oc，/a(ie/av—)、Docjw'o/w"'toc/zowo^z'z'、批把(EWoZofr;yfl乂apcw/ca)、棟葉批把(五r/oZ)O^ya/W;7o/6fes0、五r/o/o6ws/n7o6a加、i/etera膨/as<3/^w"yb//a、Xagewech.aa"gMsti/b//a、^"agewecA:/ao厶/cwg"、丄/wti/e少amasp//o/<ies、山并仔(M3/ws6"ccato)、Ma/wscwcwan'a、臺灣林擒(Ma/wdo讓m')、Ma/wsy7ore油'wa、M"/wsy7o"'6wM(ia、Ma/船^kca、垂絲海棠(M"/ws/2a〃/:cwa)、^可南每棠(Afa/附/70wwem7j)、t胡l匕》每棠(Ma/ws/2wpe/^m^)、^Ma/z^/oem7.5、光葉隴東海棠(7Vfa/us1Aarawera/s)、毛山并!j子(A/a/附附fl"(i9/7wn'ca)、西府f每棠(A/"/m《附/croma/ws)、會工肉蘋果(Afo/ws剛Wzwete^y朋a)、滄江海棠(Mia/wsow6ra/>////(3)、東方蘋果(Ma/usw/etoto)、西蜀海棠(M3/ws/ra船)、楸子(Afa/附,廳yb//(3)、蘋果(她/ws戶冊7fl)、撒氏海棠(她/wS(3，油7)、三卩十海棠(她/wss7.eZw/<i//)、新疆里予蘋果(Ma/w"/everaz)')、里予蘋果(Ma/ussy/w血S)、變葉海棠(Afa/uston'"go/cfey)、長圓果花葉海棠(7kfct/mfrara/toHa)、二裂口十海-棠(7kfa/w5^7'/o6ato)、ilfa/wstac/zowwh7、7Wia/us1x<iomes*/v'ca、c麵扁m、，、小金海棠(Afa/wsx/ao力'"era/i1)、滇池海棠(她/ws戸朋朋erazi)、蘋果屬、西洋木瓜(她，7ws伊r顧m'ca)、小石禾只(C^teome/esaw//2_y〃/tii/b//<3)、華西小石禾只((9Weo/we/as"sc/zwen.朋e)、紅葉石楠(尸/W/m'a西洋梨(尸y尸m'ccw7wwm^)、i^yms1e/aeagri/b//(3、雜交梨品禾中(/y廠ws/y^nf(icw/rivar)、沙梨(尸yn^/^nyo/,'a)、賴口口十梨(尸,wsra//cf/o//fl)、秋子梨(尸fusws5鵬'em7V)、白梨(戶少myxZ>retoc/zwe/<im')、石斑木(i/^/2/0/e/^/"t/z'c<3)、美洲花杯大(Swhwfl"犯n'cfiwa)、白花花杯大(Sor6wan'a)、歐洲花杯大(Sw力^flMCM戸r/a)、S。r6附ca/i/br"/c"、克什米爾花揪(6br6船co附/w.xto)、湖北花揪(5b^船/zw/e/7em7'力、5"or6wsscc^w/z'"(3、西伯禾ll亞花揪(5brZtws/6zWcfl)、5br6usto，/wa//s、紅果樹(!SVrawva&S7'a(iavW朋a)、7^環/"<3&c/廳7、Kw，e/Zw/flca/z》rm'C(3、j^w《we//m'flcof7w60sa、Jcae腦(ms^nVzi/b/ZflJcaewaarge她"、灰藍芒朿lj果(^cae朋caas7'/g/flMca)、y4caeM(3c7/zW廠&toc/iy(3、」caewac/z^7'toto、Jcae朋ec/n'朋to、」cae朋e/owgata、Jcae朋ewpaton.a、/Iw7'5/^w/a、無朿(j芒朿lj果(jciaewa/werm/力、Jca^w/aev7'gato、Jcaewa/afe6msa、Jcaewa/節'(ia、Jcagwamacrace_p/w/a、vlcaewawage/Zaw/ca、Jca6腦masa/w6ra腦、Jca6腦附owtowa、Jcaewaw//^<ia、新西蘭芒刺果(Jcae;7(3mvaeze/""(i/ae)、Jcaeraova/^/b//"、Jcae<2//朋油y(ia、^caewas//e"(iem1、^4cae腦ra6z'wc/5a、Jcaewax"raeravfwa、習習葉花(y4co附os^/^e/ato)、v4cowoy(y/Zsrow/z'、Jcomos^&w'M:/me似^、區欠洲龍牙草(jgr/wcw/flewpator/a)、曰本龍牙草(^4gr/mow/flw一om'ca)、々/-/wom'"戶rvi/7ora、龍牙草(y4gn'附ow/a///051(3)、尚山習習衣草(爿/c/zem/〃(3)、J/c/zewzY/ae/y/Zzrapo(ia、習習衣草(J/cZ/em/〃a乂a/om'ca)、j/c/ze/w'〃awo〃/s、j/c/ze/m'〃<3vw/gar/s、J//zflwesarvera/s、y4re附ow'aag廠/mow'o/(ies"、Se/7co服.a6rac/y^/ac/^a、jBewcom/acawc/ato、Bewco附/aexs^^pw/ato、5ecom/i3■s^/zaeracarpa、C7麵ae6a/7'a》/fo/aa、C7^bWa6wr膨a憩、C7^brf/aceato、C7z,W/a(iewtoto、C7z,r//<3graw/wea、C7^7力'fl/7eferap/y〃a、C7斷WawY油/a、C7參r/toocforato、C7^/bWar附"yb/Za、C7^WaseWcea、CV/wn'ae/eg"ra、Cb/,'agew.cfes、CV觸m.astom^鵬'awa、中華假榲槨(尸化z^ocj^ow'a火棘(尸yraca尸"/za如'"膨aw")、豆梨(尸:德拉蒙德仙女木(D,yosc/ra附mowA/)、仙女木(Z>ycwoctopeto/a)、芻皮果蛇莓(Z)wc/es77eoc/7，朋f/za)、蛇毒(Z^c/zeweazW,ca)、￡>>^/racowafny/ora、i^〃Mg/a/arat/ax:(3、多葉蛟子草(Fz7ipew(iw/(3ww//7).wga)豐庫口十紋子草M(iw/a/w戸7'柳)、方定果岐子草(河/pew(iw/aw/wflrz'(3)、六辦繡線菊(Fz7z)ew(iM/avw/gfln、')、智禾l(草萄(Fragar/ac/n7oem^)、裂萼草莓(Fra伊n.acia/tow.a腦)、細梗草莓(Frag"〃'agrac/7/s)、Fra伊r/agra<i'y/ora、尸ragan.a///wmae、廣香草莓(Fragar/awoyc/zato)、黃毛草萄(Fraw"/(3m7gwms7:0、_Fragar/am>/o"/cr/、西藏草萄(Fra伊r/a肌^'co/a)、東方草萄(Fragan.aoWewtoto)、五葉草莓-(Fragor/a戸wto//z少〃a)、野草-莓(Fragar/avesca)、弗州草每(Fragflr/aWfg/w/a腦)、荷蘭草莓(Frag"廠/av/r/tfe)、草莓(Frag譜'a"聰"owfl)、草莓屬CFRA538(Fragar/"5/7.CFi^453S)、草毒屬(Fragan'a平)、Gew附a<i/co/fl、(7ewm6on's/、保力口禾U亞路邊青(Gewm6w/gan.ciW7)、Gewmcfit/f/2i/b//w、智禾ll路邊青(Cewmc/w./oem"e)、Gw/wge附'CM/a,w附、Gfeww/zeferacarpwm、Ge國wacro//7_y〃wm、(7eww附o"to"w附、Gew附re/9/<my、紫粵路邊青(Cg"wr/va/e)、Gew附sc/o/e/(i//、s/ecz'osww、區欠亞足各邊青(wrZ朋w附)、ver"w附、路邊青屬'Chase2507K，(Ge調平'C7zoye2507f)、//agew'aaZ)_yM/m'ca、i/orfe/zVc麗eato、i/orfe/Za/ksc^/va/agoniom'、重辦様棠花dm^7'opow.ca)、丄ewcas/t/easm'cea、7Warc她〃awofifemwi5、wo《wiw.朋a、Af"/^"'c戸sp/w朋/ws、Margyr/carpz^setose、7Vovos7'ewra/ag/ac/afo、(9"co砂/t^cocA:qy"e/、0coszy/us/e/o5permws、Po(y/epz^aw^tra/Z^^P0/3;/e//5Z)e^en.、尸o/y/ep/sc/7.5^fl-gfl〃/、尸o/jv/e//s/z/ercw>7w/、戶o(y/ep/s/"cawa、尸0/少/ep/5/flwwg/oy"、尸o/少'/e/H'smw/")'wga、尸o(y/e/^weg/ecto、/e//spawto、尸o(y/ep/spepe/、Po(y/e/^gwfl(in)'wgfl、尸o(y/e//snacemcM'a、戶o/y/ep/sre"ci//a^3、尸o(y/ep/srwgw/cwa、戶o/少/e//s5en'cea、Po/少/e//sswZwen.caws、尸o(y/ep/sfara/x3cawa、Po(y/—stome"te〃a、尸o/y/e//swZ^rZawer/、無毛蔵麻(尸她""〃"(3"ser/"a)、戶otewri〃aargz^a、二裂委陵菜(尸ofew^7/a^ywrc(3)、委卩安菜(Potewf,7/ac/n.wem7's)、薄卩十芻皮葉委陵菜(Pofewf〖〃a(i〖ch'm/0、Potewfz7/aerecto、毒口十委陵菜(Poe油7/ayhagan'ozVfes*)、白毛金露梅(Pote""〃(3yh^/cofl)、戶otew^7/a/w(i/C(3、Potewft7/amfcraw^M!、多裂委陵菜(戶otewft'〃(3"n,/ay(ia)、雪白委陵菜(尸otewf/〃aw'vefl)、擁P威委陵菜(Potewf,7/a)、沼生委陵菜(Pofe""〃apa/MWn;s)、總梗委陵菜(尸ote7W〃ape(iwwcw/m'/s)、匍匍委陵菜(Pote油'〃a)、尸ote油7/aM/esoWa朋、狹葉委陵菜(戶ofe"ri〃(3stewop/2y〃a)、三齒委陵菜(Potew/v'〃flfr/(iewtoto)、Wora(36/W"fl、7oy"a6jAw/w'ca、束lj舊蔽(7osaa"'cw/flr￡s"入草地攻瑰(/ayaagm&)、白薔薇(Rosaalba)、白薔薇x并lj朿lj薔薇(ioaa/kz:rWoracoz-ymZ^/^ra)、大花密朿ll薔薇(7cwaa/to/ca)、阿少1、|薔薇(Wosaonfemsw7")、野地攻瑰(ios"awvms7'《)、本香花(7ora6朋^s7'ae)、芎刺玫瑰(WcwaZ)eggen'awa)、哈德遜灣玫瑰(iraaWaw&)、碩苞薔薇(iasa6racteafa)、復傘房蓄蔽(7osa^7，m"om7)、iayacaes/a、力口州蓄藻(7ora)、卡羅萊納薔薇(A應CWz力a)、月季(7os(3c//'wms/s)、iosflc/朋amo騰(3、ios'c/！co/wmmy^ra、笄!j棘舊藻(ioracw，Zi/^ra)、山木香(Aosac戸osa)、山刺攻(iosa(iavwn'ca)、馬爾密迪I夂瑰(Way"Jww"to)、Wo"e〃—'ca、月泉果薔蔽(iasx^(3toc/7ewA:oa憩)、異味舊蔽(Wosaybe/油)、_/b//o/osa、法國蓄蔽ga〃/c<a)、7omga〃/<%zx(iw附etorwm、巨花薔薇(io"g/g""fe")、瑞道特玫瑰(Worag/m/ca)、卵果薔薇(7o似/efe憩e)、軟條七薔薇(iosa/zewj/)、黃薔薇(7osa/mg謹:s)、薔薇雜交品禾中(Aosa/7_yZ)n'(icM/ft'var)、Wara/wocfora、_/麗&/〃//、金樓子/"ev扭to)、疏花舊藻/"x")、光葉蓄藻(iora//ae)、重瓣五月玫瑰(iosamq/a&)、深山薔薇(iOMw"rrWZ)、傘花薔薇(AoMW(Xd附ow/cz/awa)、m/cra加/za、毛口十廣東薔蔽(iora附o〃/s)、iosa附owtowfl、身寸香攻瑰(i仍"wasc/2。/")、華西舊蔽(iosfl附cyas77)、多複蓄蔽(Woramw/"6rac加to)、多花攻瑰(Wosa附w/Z7y/ora)、""/t/a、香tK月季(ioraoJorato)、沼澤i夂王鬼(ioMpa/MWni)、高山i女王鬼(icwa寬刺薔薇(Aorap/,<aca"f/a)、樓草薔蔽(iora/n'mw/a)、ios"sew(iasraZ^/wscw/a、綴絲花(ios1(3rox6wrg/n7)、舌甘石南(Wosan^/g/wwa)、攻瑰(iosarwgosa)、山薔薇(io9fls"w^wc/"")、長青玫瑰(7os"se附/erv/"e;w)、纟昌毛薔薇)、剛毛玫瑰(iosa化rigera)、ios'as/2erara^7、iosas〖cw/a、密束lj薔薇(iosaw."os/M/w(3)、iosaWe〃ota、平花山地攻瑰砂/osa)、iosaswZcam,朋、iosaa'wZco〃,憩、iosa、to附ew/e〃"、被續毛攻瑰(7ora/owew/osw)、ioya論—"em"/s、蘋果薔薇v/〃ora)、維吉尼亞玫瑰(icwav/rg/m.awa)、光口十薔薇(ioraw'c/mra腦)、小葉薔薇(iora術'〃膨加,ae)、伍茲氏薔蔽();7omx、xyb他卵.a朋、iovaxmacra"f/z(3、黃朿ll玫(iosflX(3wW"a)、薔薇屬(7ora粗葉懸鉤子a/cez》//n美國黑毒-(7wZ^a〃eg/zew/em7》)、Ww6wsa//^'""^周毛懸鉤子(iw6usfir"7p//(ia，)、北懸鉤子arc"c'")、7wZz""rgw加、西南懸鉤子(7MZw《a5"ra附m^)、7MZ^awWrato、勘6船'Zi/9ww、歐洲木莓(iwh")、歐洲木莓x復盆子(iw&"油ews)、無束lj小黑莓(iw6wsca腦(ie服.s)、iw6iM1c朋escem'、iw6wscawcos/cws、興安懸鉤子(iw6w^c/zamaewoms)、山萄(co/'c/7onyb/z'W5)、牛疊月土(iwZwscratoegzyb//i/5")、妙、黑萄(iz^wsc麗ezyb/^)、美味懸鉤子(7m/ms<ie//"'asr")、iwZt"(i/rar/ca加、摘圓懸鉤子(ii/6t"e〃妙'c船)、iw6船y/(3ge〃an's、黑萄(iw6wsyh^/cosTAs0、/z(3而/em75、/2(3而/em7SxiwZ)mrosvyb/^、硬毛黑毒(iwZws/7/wWi/s)、iw6m/20c/wfe"erorM/w、萚草卩十懸鉤子(7w6us/2WW7w/i/b//us)、白皮糙莓(尺w6m/ewcO(ier附&)、纟昌毛懸鉤子(iw6w)、western1/s、雪露尊(7w6wsw/rato)、紅泡朿廿藤w/veus)、勘6tw歷Wge冊s、黑樹毒(iw6w^occ/<ietofe)、香毒(WmZjrs*odora加)、iw&"戸/wa加、茅萄(勘Z7Wi"戶n^/7omsO、茅萄(7z^"戸rw》/^)、iw&"戸rw"、黃泡(iMZm5/ecri"e〃船)、iw^wspetia加、iw6wspe(iew6wtoWMS、iwZ)ws/^m77raw.c船、多月泉懸鉤子(iwZws//we"/co/as7Y*)、iw6i"http://c"cawto、柔毛黑毒(iwZ)"5戸6e5cm)、iw厶船"'gi(it"、iw6wsra6ws加、iw6wsrose"s、空心泡(ii/Zmsra>s7yb//uy)、iwZuss朋c加、iw6wssop油s、石生懸鉤子sa:ra/7'fe)、iw6ussetosw、美萄(iM&M5印ectoM/V)、勘Z)wsra/ca加、灰白毛毒(iw&"'嘩/zra(ias')、三花懸鉤子(Wm6wx,r/aw/Zzz^)、三色莓(iM6w"/""/co/or)、iMZw""y^niw6zisf"7oZrn南露莓(7w6w"廠/v/(3//5)、榆葉黑莓(7w6ww/脂/o/z'ws)、黑草毒(Wm6wMm'"w)、7w&"'MW"yb/fw、7m6ws"WgomsMs、懸鉤子屬JPM-2004(i^M5/尸M"20似)、&z"gw/r&a仿i/7ora、高山地榆美洲地榆(iSawgw/5or6aca"(3(iera7W)、矮地榆(6b"gM/TOrZ"http://i/bm^)、白山地偷(Sawgw/sor/wZaA:w紹we服j)、j.apowe服^、小地愉(&"，/507^"m/wor)、(Sa"gw/so/^a、地偷(&"gw/so^<3(^"'"afo)、小白花地偷(Sa"gM/靡Aa戸rv/^/7ora)、大白花地榆(s印w/ato)、細卩十地愉(iS朋gw/iwZ)a)、&rc，ofer/ww、山萄草(5V￡6<3/<i/<3/racw附6em1)、6Vevera,a尸ewtopeto/a、/SVevers/a/ms7'〃a、緣毛太斤亍花(T^/Zzawg/arwpast,'")、7fefrag/oc/z/wcn,加rt而、,Ais"ta>z/ayag"r/o/(iey、歐洲淋石草(船/fifeto'w'ad麗cwsWo/c附)、CeracarpM5Z由/wV/es、CercocarpMS/e<^yb//ws、C7zamaeZ^/ia廠/a、直立i也蓄蔽(C72awaer/z(x/as1er6cfa)、G7〃em.as/7》w/ato、美吐根(G/〃ew.an》//ato)、i7o/otfccMscfoco/or、Z/o/W^cws冊.cra//zy〃m1、Z^cwo決"附"w^_/7<9/7'6朋<^、川康繡線梅(7Ve/〃/ami)、矮生繡線梅(扁/Z"grac/fo)、中華繡線梅(淑//"腦^)、疏花繡線梅(A^'〃/as/flraz)7ora)、西康繡線梅(Afe'肌aAAefea)、毛果繡線梅(臉/〃/a^7戸W固)、東北繡線梅(臉,〃/aweh7)、臉v/觀'afl/fl6amewA'/s、/Vzj^0C(3廠pz^fl/terwfl/M、尸/7j^ocarpz^flrwMrews/s、太平f羊風ff果(尸/73^0ca/7w51ca//faft")、戶/zj^ocar/Msma/vaceus*、山風ff果(P/7y5(Xwpwswcwogywus)、美國風箱果(_P—opM/yb//w>s)、Pwra//aWde幽to、X鳥麻(i/0(io妙aysc朋(iera1)、高叢珍珠梅(5br6ar/aarZ)orea)、東北珍珠梅(5br/)臘'(35。^》//)、S//raea6eft//zyb//a、麻葉繡線菊";/raea乂，cra.ca)、/S^/raeaw一om'c"、菱葉繡線菊(kS//raeaxva//zow"e/)、繡線菊屬(S//raec取)、中國小米空木(5^ep/朋朋(irac/7/"ms/s)、小米空木(iS嘩/7(3腦W(ira/c/sa)禾口曰本小米空木(Ste//z朋aW(ira細afe2e)。特別優選的薔薇科的屬包括蘋果屬、梨屬、榲槨屬、李屬、枇杷屬和歐楂屬。特別優選的薔薇科物種包括家蘋果、野蘋果、西洋梨、沙梨、白梨、榲槨、中國李、紅葉李、碧桃、枇杷、扁桃、歐洲甜櫻桃、西更特別優選的薔薇科的屬包括蘋果屬和李屬特別優選的薔薇科物種包括家蘋果和紅葉李。術語"植物"包括整株植物、植物的任何部分、植物的繁殖體和后代。術語"繁殖體"指能用在有性或無性生殖或繁殖中的植物的任何部分，包括種子和插穗。本發明參照附圖將能被更好的理解圖h顯示了MdMYBlO(SEQIDNO:1)禾卩MdMYB9(SEQIDNO:2)同已知的來源于各種物種的花青素MYB調控因子在R2R3結合區域的比較。箭頭標明有助于在擬南芥bHLH共同因子相互作用中涉及的基序的特定氨基酸殘基(Zimmeraianne/a/.，2000);這些相同的殘基是MdMYBlO和MdMYB9中暗示相似的蛋白質-蛋白質相互作用的證據。圖2:顯示了顯示擬南芥和蘋果MYBTFs間關系的系統發育分析。箭頭顯示了在花青素MYB調控因子亞組10中位于AtPAPl的下一個的MdMYB10的位置。已知的花青素調控因子用灰點表示，圖中包括的用黑點表示的其它基因是顯示MdMYBlO作用是對該MYB進化枝特異和不是對整體MYBs特異的陰性對照。圖3(A):顯示了紅地(RedField)蘋果和太平洋玫瑰(PacificRose)蘋果的皮層、果皮和葉片中的如列在圖右手側的從CHS到UFGT的蘋果花青素生物合成基因的qPCR分析數據。X軸數字指如下內容；1、40DAFB,2、67DAFB，3、102DAFB，4、130DAFB，5、146DAFB，6、紅地蘋果OP葉片和7、太平洋玫瑰蘋果葉片。圖3(B):顯示了貫通在如圖3(A)中顯示的發育階段1到5的蘋果果實(紅地OP在上列，太平洋玫瑰蘋果在下列)的切片。同太平洋玫瑰蘋果相比，紅地OP蘋果的增加的著色明顯可見。圖4:顯示了MdMYBlO、MdbHLH3和MdbHLH33的表達分析。(A)在紅地蘋果(皮層、果皮和葉片)和太平洋玫瑰蘋果(皮層、果皮和葉片)屮的MdMYB10的RT-PCR分析和(B)MdMYB10、MdbHLH3和MdbHLH33的相應的qPCR數據。凝膠泳道和X軸數字如下1、40DAFB，2、67DAFB，3、102DAFB，4、130DAFB，5、146DAFB，6、紅地蘋果葉片和7、太平洋玫瑰蘋果葉片。圖5:顯示了雙重熒光素酶實驗顯示了以LUC比REN的比率表示的啟動子活性，其中，活性的增加同MYBTFs同/不同bHLHTFs組合的相對于REN的LUC的增加進行平均；(A)擬南芥TT4(CHS)-Luc啟動子，(B)擬南芥7T3(DiW)-Luc啟動子。0:單獨的MYB，1:MYB+AtTT8，2:MYB+MdbHLH3，3:MYB+MdbHLH33。圖6:顯示了煙草中短暫實驗的數據。(A)顯示了以^/b葉匕率顯示的用Minolta比色計測量的顏色測量數據。朝向正值的轉變表明了從綠色到紅色的顏色變化。(i)MdMYB10+MdbHLH3，(ii)單獨的MdMYB10。(B)顯示了顯示用20x(左)和40x(右)的MdMyblO+MdbHLH3浸潤的煙草葉片組織中花青素(更黑的灰色)積累模式的顯微影像。比例尺代表50微米。圖7:顯示了顯示用MdMYB10+MdbHLH3浸潤的(A)煙草花瓣和(B)煙草葉片的HPLC痕量(traces)。1、花青苷-3-葡糖苷，2、矮牽牛素-3-半乳糖苷，3、花青苷-3-鄰-蕓香糖苷。在對照的煙草葉片中沒有觀測到峰(數據未顯示)。圖8:顯示了MdMyb10多肽序列和MdMYB10的多肽變種以及參考的AtPAP1(也稱為AtMYB75)的蛋白序列比對。J^n^75在GenBank數據庫中的登入號是CAB09230。所述比對使用ClustalW算法進行創立(Thompsonetal"1994)。圖9:顯示了MdMyblO多肽序列、MdMYBlO的多肽變種和參考的AtPAPl間的％序列同一性。所述表格顯示了包括在圖8中的序列的所有可能的序列組合的％同一性值。圖10:顯示了在煙草短暫轉化實驗中At-DFR基因啟動子被同蘋果bHLHTFs組合的MdM7S川和PcMYBlO(PcfMYB10的變種)的激活影響了At-DFR基因啟動子的活性。雙重熒光素酶實驗顯示了以DFR啟動子熒光素酶(LUC)比35S海腎(REN)的比率表達的啟動子活性，其中活性的增加同相對于REN的LUC的增加相平均。MYB轉錄因子(MdMYB10、PcfMYB10和MdMYB8(-ve對照)同bHLH轉錄因子MdbHLH3和MdbHLH33的組合的效應被顯示。顯示的誤差條是6個重復反應的均值土S.E.。圖ll:顯示，MdMYB10在蘋果細胞和/或植物中的過表達提高了花青素生產。(A)(i)顯示了著色的愈傷組織細胞。A(ii)顯示了用35S-MdMYB10轉化的蘋果植物(左)和空載體對照植物(右)。與空載體對照相比，用35-MdMYB10(左)轉化的植物清楚地顯示了強烈的著色。(B)顯示了35S-MdMYB10蘋果葉片(頂部的線條)和空載體對照(底部的線條)的抽提物的花青素輪廓。在520nm波長處由HPLC痕量鑒定的峰；cy-gal，花青苷-3-半乳糖苷，具有更低痕量的cy-glu，花青苷-3-葡糖苷和cy-pent，花青苷-3-戊糖苷。具體實施方式在本說明書中作出的針對專利說明書、其它外部文檔或信息的其它來源的參考，其通常的目的是為討論本發明的特點提供背景知識。除非特別指明，否則對這樣的外部文檔的參考不被解釋為承認，這樣的文檔或信息的這樣的來源，在任何權限內，是已有技術，或形成本領域公知常識的部分。術語包含和其語法上的同義詞是指"至少部分由……組成"。多微微抓皮如本文所用，術語"多聚核苷酸"指任何長度但優選為至少15個核苷酸的單鏈或雙鏈脫氧核苷酸或核苷酸多聚體，并且包括，作為非限制性的范例，基因的編碼和非編碼序列、正義和反義序列互補序列、外顯子、內含子、基因組DNA、cDNA、mRNA前體、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重組多肽、分離和純化的自然出現的DNA或RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探針、引物和片段。本文提供的多聚核苷酸序列的"片段"是能同目標靶子特異雜交的連續核苷酸的子序列，例如，至少15個核苷酸長的序列。本發明的片段包含本發明的多聚核苷酸的連續核苷酸的15個核苷酸，優選地至少20個核苷酸，更優選地至少30個核苷酸，更優選地至少50個核苷酸，更優選地至少50個核苷酸和最優選地至少60個核苷酸。多聚核苷酸的片段能以反義、沉默基因、三螺旋或核酶技術或以包括在微陣中的引物、探針進行使用，或用于本發明的基于多聚核苷酸的選擇方法。術語"引物"指通常具有游離3'OH基的同模板雜交并用于引發同目標互補的多聚核苷酸的聚合的短多聚核苷酸。術語"探針"指在基于雜交的實驗中用來檢測同所述探針互補的多聚核苷酸序列的短多聚核苷酸。所述探針可能包含如本文定義的多聚核苷酸的"片段"。如本文所用，術語"多肽"包含氨基酸殘基被共價肽鍵連接的包括全長蛋白質的任何長度的但優選地至少5個氨基酸的氨基酸鏈。本發明的多肽可能是被純化的天然產物，或可能部分或完全通過使用重組或合成技術進行生產。所述術語可能指多肽、諸如二聚體或其它多聚體的多肽的聚集物、融合肽、多肽片段、多肽變種或其衍生物。多肽的"片段"是指執行生物活性所需的和/或提供所述多肽三維結構的功能的多肽的子序列。所述術語可能指能執行上述酶活性的多肽、諸如二聚體或其它多聚體的多肽聚集物、融合肽、多肽片段、多肽變種或其衍生物。如本文公開的，用于所述多聚核苷酸或多肽序列的術語"分離的"是用來指從它們的天然細胞環境中移去的序列。分離的分子可能通過包括生物化學、重組和合成技術在內的任何方法或方法的組合而獲得。術語"重組的"指從在它的天然環境中包圍它的序列移去和/或同在它的天然環境中不存在的序列重組的多聚核苷酸序列。"重組的"多肽序列通過從"重組的"的多聚核苷酸序列的翻譯而生產。關于本發明的衍生自具體屬或種的多聚核苷酸或多肽的術語"衍生自"指，所述多聚核苷酸或多肽具有同在所述屬或種中天然發現的多聚核苷酸或多肽相同的序列。衍生自具體屬或種的所述多聚核苷酸或多肽因此可能被合成地或重組地生產。如本文中所用，術語"變種"指不同于具體鑒定的序列的多聚核苷酸或多肽序列，其中一個或多個核苷酸或氨基酸殘基被刪除、取代或加入。變種可能是自然發生的等位變種或非自然發生的變種。變種可能來源于相同的種或來源于其它種并且可能包括同源物、類似物和直系同源物。在某些實施方案中，本發明的多肽變種和多肽具有同本發明的多肽或多肽的生物活性相同或相似的活性。關于多肽和多肽的術語"變種"包括如本文定義的所有形式的多肽和多肽。多覆滯廢辦變種多聚核苷酸序列優選地顯示至少50%、更優選地至少51%、更優選地至少52%、更優選地至少53%、更優選地至少54%、更優選地至少55%、更優選地至少56%、更優選地至少57%、更優選地至少58%、更優選地至少59%、更優選地至少60%、更優選地至少61%、更優選地至少62%、更優選地至少63%、更優選地至少64%、更優選地至少65%、更優選地至少66%、更優選地至少67%、更優選地至少68%、更優選地至少69%、更優選地至少70%、更優選地至少71%、更優選地至少72%、更優選地至少73%、更優選地至少74%、更優選地至少75%、更優選地至少76%、更優選地至少77%、更優選地至少78%、更優選地至少79%、更優選地至少80%、更優選地至少81%、更優選地至少82%、更優選地至少83%、更優選地至少84%、更優選地至少85%、更優選地至少86%、更優選地至少87%、更優選地至少88%、更優選地至少89%、更優選地至少90%、更優選地至少91%、更優選地至少92%、更優選地至少93%、更優選地至少94%、更優選地至少95%、更優選地至少96%、更優選地至少97%、更優選地至少98%和最優選地至少99%的同本發明的序列的同一性。同一性通過具有至少20個核苷酸位置、優選地至少50個核苷酸位置、更優選地至少100個核苷酸位置和最優選地通過本發明的全長多聚核苷酸的對比窗而發現。多聚核苷酸序列同一性能以下述方法進行測定。使用bl2seq中的BLASTN(來自BLAST套件程序，版本2.2.5[2002年11月])將所述目標多聚核苷酸序列同候選多聚核苷酸序列進行比較(TatianaA.Tatusova,ThomasL.Madden(1999),"Blast2sequences-anewtoolforcomparingproteinandnucleotidesequences",FEMSMicrobiolLett.174:247-250)，公眾可從NCBI(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blast/)獲得所述程序。除了低復雜度部分過濾(filteringoflowcomplexityparts)應當被關閉外，bl2seq的默認參數被使用。多聚核苷酸序列的同一性通過使用下述unk命令行參數進行檢査bl2seq-inucleotideseql-jnucleotideseq2-FF-pblastn參數-FF關閉了低復雜度部分過濾。參數-P選擇合適的序列配對算法。所述bl2seq程序在命令行"Identities="中以相同核苷酸的數目和百分比報告序列同一性。多聚核苷酸同一性也能通過使用通用序列比對程序測定候選和目標多聚核苷酸序列間的重疊的全部長度而進行計算(例如，Needleman,S.B.andWunsch，C.D.(1970)J.MoLBiol.48，443-453)。Needleman-Wunsch通用比對算法的完整工具可在EMBOSS程序包中的針(needle)程序中發現(Rice,P.Longden,I.andBleasby，A.EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,TrendsinGeneticsJune2000，vol16,No6.pp.276-277)，所述程序包可從h加:〃www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/)獲得。歐洲生物信息學研究所服務器也提供執行兩個序列間的EMBOSS-針(needle)通用比對的在線工具，網址為http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/。可選地，計算兩個序列間的最佳通用比對而沒有末端空位罰分的GAP序列能被使用。GAP在下述文章中進行了描述Huang,X.(1994)OnGlobalSequenceAlignment.Computer'ApplicationsintheBiosciences]0,227-235。本發明的多聚核苷酸變種也包括那些顯示了同一種或更多種明確鑒定的序列的相似性的序列，該序列可能保留那些序列的功能等價物并且，該序列不能被適當地認為已經隨機發生。關于多肽的這樣的序列相似性可能通過使用公開可得的W2seq程序進行測定，所述程序可從NCBI的BLAST程序套件(版本2.2.5[2002年11月])(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blast/)中獲得。多聚核苷酸序列的相似性可能通過使用下述imix命令行參數進行檢查bl2seq-inucleotideseql-jnucleotideseq2-FF-ptblastx參數-FF關閉了低復雜度部分過濾。參數-P選擇合適的序列配對算法。該程序發現序列間具有相似性的區域并為每一個這樣的區域報告"E值"，所述"E值"是預期的一個人可以期望在含有隨機序列的固定參考大小的數據庫中看到的這樣的偶然匹配的次數的數目。該數據庫的大小在bl2seq程序中通過默認進行設定。對于比一小的多的小的E值，所述E值近似于這樣的隨機匹配的幾率。當同任何一種具體鑒定的序列比較時，變種多聚核苷酸序列優選地顯示小于1X10—6、更優選地小于1X10—9、更優選地小于IXIO.12、更優選地小于1X10"s、更優選地小于lX10-，更優選地小于IXIO.21、更優選地小于1X10—3<)、更優選地小于1X10—4()、更優選地小于1X10—5Q、更優選地小于1X10—，更優選地小于1X10—，更優選地小于1X10，、更優選地小于1X10—9()和最優選地小于1X10—1QQ的E值。可選地，本發明的變種多聚核苷酸在嚴格條件下同特定多聚核苷酸序列或其互補序列雜交。術語"在嚴格條件下雜交"和其語法上的同義詞指多聚核苷酸在確定的溫度和鹽濃度條件下同目標多聚核苷酸分子(諸如固定在諸如Southerblot或Northernblot等DNA或RNA印記上的目標多聚核苷酸分子)雜交的能力。在嚴格條件下雜交的能力能通過在較低嚴格條件下初始雜交然后增加嚴格條件到期望的嚴格條件下的雜交進行測定。關于長度大于大約100個堿基的多聚核苷酸分子，典型的嚴格的雜交條件是低于天然雙鏈的解鏈溫度(Tm)不超過25-3(TC(例如，10°C)(通常參見，Sambrookd"/.，Eds,1987,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress;Ausubele/1a/"1987,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishing,)。超過100個堿基的多聚核苷酸分子的Tm能通過公式Tm=81.5+0.41%(G+C-log(Na+)進行計算(Sambrook&a/"Eds，1987,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress;BoltonandMcCarthy,1962,PNAS84:1390)。對于長度超過大約100個堿基的多聚核苷酸的典型的嚴格條件將是諸如在6XSSC、0.2%SDS的溶液中預洗；在65°C、6XSSC、0.2%SDS過夜雜交；然后在IXSSC、0.1%SDS的溶液中在65"C下洗滌30分鐘，洗滌兩次，和在0.2XSSC、0.1%SDS的溶液中在65。C下洗漆30分鐘，洗滌兩次。關于具有少于100個堿基的多聚核苷酸分子，范例性的嚴格的雜交條件是低于Tm5-l(TC。平均而言，長度低于100個堿基對的多聚核苷酸分子的Tm被降低大約(500/寡核苷酸長度)°C。關于稱為肽核酸(PNAs)的DNA模擬物(Nielsen"a/.，Science.1991Dec6;254(5037):1497-500)，其Tm值高于那些DNA-DNA或DNA-RNA雜交物的Tm值，并能通過使用在Giesen"a/.,NucleicAcidsRes.1998Novl;26(21):5004-6中描述的公式進行計算。具有少于100個堿基的DNA-PNA雜交物的范例性的嚴格的雜交條件是低于Tm值5-10°C。本發明的變種多聚核苷酸也包括不同于本發明的序列但，作為遺傳密碼簡并性的結果，編碼具有同被本發明的多聚核苷酸編碼的多肽相似活性的多肽的多聚核苷酸。不改變所述多肽的氨基酸序列的序列改變是"沉默突變"。除了ATG(甲硫氨酸)和TGG(色氨酸)夕卜，相同氨基酸的其它的密碼子可能通過人工識別技術進行改變，例如，優化密碼子在特定宿主生物中的表達。導致在被編碼的多肽序列中的一個或多個氨基酸保守替換而沒有顯著改變其生物活性的多聚核苷酸序列改變也包括在本發明中。技術人員將知道制備表型沉默的氨基酸替換的方法(參見例如，Bowie1990,Science247,1306)。歸因于被編碼的多肽序列中的沉默突變和保守替換的變種多聚核苷酸可能通過使用公眾可得的bl2seq程序經由如前面所述的tblastx算法進行測定，所述程序來自NCBI的BLAST程序套件(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast)(版本2.2.5[2002年11月])。多厳#關于多肽的術語"變種"包括天然發生地、重組地和合成地生產的多肽。變種多肽序列優選地顯示至少50%、更優選地至少51%、更優選地至少52%、更優選地至少53%、更優選地至少54%、更優選地至少55%、更優選地至少56%、更優選地至少57%、更優選地至少58%、更優選地至少59%、更優選地至少60%、更優選地至少61%、更優選地至少62%、更優選地至少63%、更優選地至少64%、更優選地至少65%、更優選地至少66%、更優選地至少67%、更優選地至少68%、更優選地至少69%、更優選地至少70%、更優選地至少71%、更優選地至少72%、更優選地至少73%、更優選地至少74%、更優選地至少75%、更優選地至少76%、更優選地至少77%、更優選地至少78%、更優選地至少79%、更優選地至少80%、更優選地至少81%、更優選地至少82%、更優選地至少83%、更優選地至少84%、更優選地至少85%、更優選地至少86%、更優選地至少87%、更優選地至少88%、更優選地至少89%、更優選地至少90%、更優選地至少91%、更優選地至少92%、更優選地至少93%、更優選地至少94%、更優選地至少95%、更優選地至少96%、更優選地至少97%、更優選地至少98%和最優選地至少99%的同本發明的序列的同一性。同一性通過具有至少20個氨基酸位置、優選地至少50個氨基酸位置、更優選地至少100個氨基酸位置和最優選地通過本發明的全長多肽的對比窗而發現。多肽序列同一性能以下述方法進行測定。使用W2seq中的BLASTP(來自BLAST套件程序，版本2.2.5[2002年11月])將所述目標多肽序列同候選多肽序列進行比較，公眾可從NCBI(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blast/)獲得所述程序。除了低復雜度部分過濾(filteringoflowcomplexityparts)應當被關閉夕卜，W2seq的默認參數被利用。多肽序列同一性也可能通過使用通用序列比對程序比對候選和目標多肽序列間的重疊的全部長度而計算。如上面所討論的，EMBOSS-needle(來自http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/)和GAP(Huang.X.(1994)OnGlobalSequenceAlignment.ComputerApplicationsintheBiosciences10,227-235.)也是計算多肽序列同一性的合適的通用序列比對程序。優選的計算多肽序列同一性的方法基于通過使用ClustalW比對待比較序列(Thompson""/1994,NucleicAcidRes11(22)4673-4680)。本發明的多肽變種也包括那些顯示了同一種或更多種明確鑒定的序列的相似性的序列，該序列可能保留那些序列的功能等價物并且，該序列不能被適當地認為已經隨機發生。關于多肽的這樣的序列相似性可能通過使用公開可得的bl2seq程序進行測定，所述程序可從NCBI的BLAST程序套件(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blast/)(版本2.2.5[2002年11月])中獲得。多肽序列的相似性能通過使用下述unix命令行參數進行測定bl2seq-ipeptideseql-jpeptideseq2-FF—pblastp當同任何一種具體鑒定的序列比較時，變種多肽序列優選地顯示小于1X10—6、更優選地小于1X10—9、更優選地小于1X10'12、更優選地小于1X10—15、更優選地小于1X10—18、更優選地小于1X10—21、更優選地小于1X10—3Q、更優選地小于ixio—4Q、更優選地小于ixio—5Q、更優選地小于1X10—6Q、更優選地小于1X10—7Q、更優選地小于1x10—8G、更優選地小于1X10—9()和最優選地小于1X10—1(K)的E值。參數-FF關閉了低復雜度部分過濾。參數-P選擇合適的序列配對算法。該程序發現序列間具有相似性的區域并為每一個這樣的區域報告"E值"，所述"E值"是預期的一個人可以期望在含有隨機序列的固定參考大小的數據庫中看到的這樣的偶然匹配的次數的數目。對于比一小的多的小的E值，所述E值近似于這樣的隨機匹配的幾率。沒有明顯改變其生物活性的所述多肽序列的一個或多個保守替換也被包括在本發明中。技術人員將知曉制備表型沉默氨基酸替換的方法(參見例如，Bowie""/,1990,Science247,1306)。凝激、載沐H就術語"遺傳構建物"指通常是雙鏈DNA的多聚核苷酸分子，其可能已經被插入另外的諸如但不限于cDNA分子的多聚核苷酸分子(插入物多聚核苷酸分子)。遺傳構建物可能包含支持轉錄所述插入物多聚核苷酸分子并且可選地翻譯所述轉錄物到多肽的必需元件。所述插入物多聚核苷酸分子可能衍生自宿主細胞，或可能衍生自不同的細胞或生物體和/或可能是重組的多聚核苷酸。一旦處于宿主細胞內，所述遺傳構建物可能會整合入宿主染色體DNA。所述遺傳構建物可能被連接到載體。術語"載體"指通常是雙鏈DNA的多聚核苷酸分子，其被用來運輸所述遺傳構建物到宿主細胞。所述載體可能能在諸如的至少一種另外的宿主系統中復制。術語"表達構建物"指包括支持轉錄所述插入物多聚核苷酸分子并且可選地翻譯所述轉錄物到多肽的必需元件的遺傳構建物。表達構建物典型地包含(5'到3'方向)a)在所述構建物將被轉化入的宿主細胞內起作用的啟動子，b)待表達的多聚核苷酸，和c)在所述構建物將被轉化入的宿主細胞內起作用的終止子。術語"編碼區"或"開放閱讀框"(ORF)指能在適當調控序列的控制下生產轉錄產物和/或多肽的基因組DNA序列或cDNA序列的正義鏈。所述編碼序列被5'翻譯起始密碼子和3'翻譯終止密碼子的存在而鑒定。當"編碼序列"被插入到遺傳構建物中時并且當"編碼序列"被可操作地連接到啟動子和終止子序列時，"編碼序列"能被表達。"可操作地連接"指，所述待表達的序列(sequenced)被置于包括啟動子、組織特異性調控元件、時間調控元件、增強子、抑制子和終止子的調控元件的控制下。術語"非編碼區"指處于翻譯起始位點上游和翻譯終止位點下游的非翻譯序列。這些序列也分別以5'UTR和3'UTR指代。這些區域包括轉錄起始和終止以及調控翻譯效率所必需的元件。終止子是終止轉錄并在被翻譯序列下游的基因的3'非翻譯末端發現的序列。終止子是mRNA穩定性的重要決定因素并在某些情況下被發現具有空間調控功能。術語"啟動子"指位于所述編碼區上游的調控基因轉錄的非轉錄順式調控元件。啟動子包含指定轉錄起始位點和諸如TATA框的保守框以及被轉錄因子結合的基序的順式起始元件。"轉基因"是從一種生物體獲取并通過轉化被引入到不同生物體的多聚核苷酸。所述轉基因可能衍生自相同物種或同所述轉基因被引入的生物體所屬的物種不同的物種。"轉基因植物"指含有作為遺傳操作或轉化結果的新遺傳物質的植物。所述新遺傳物質可能衍生自與產生轉基因植物的物種相同或與之不同的植物。"反向重復"是被重復的、其中所述重復的第二個一半是互補鏈的序列，例如(5，)GATCTA......TAGATC(3，)(5，)CTAGAT......ATCTAG(3,)只要在所述重復區域間具有3-5堿基對的間隔區，通讀轉錄將產生經歷互補堿基配對來形成發卡結構的轉錄物。術語"調控花青素生產"要包括增加和減少花青素生產。優選地，該術語指增加花青素生產。可能被調控的花青素包括但不限于cyanindin-3-葡糖苷、cyaniding-3-鄰-蕓香糖苷、cyanadin-3-半乳糖苷和cyanadin-3-戊糖苷。術語"改變本發明的多聚核苷酸或多肽的表達"或"改變的本發明的多聚核苷酸或多肽的表達"要包括相應于本發明的多聚核苷酸的基因組DNA被修飾從而導致本發明的多聚核苷酸或多肽的改變的表達的情況。所述基因組DNA的修飾可能是通過遺傳轉化或其他的本領域已知的誘導突變的方法而進行。所述"改變的表達"能與信使RNA和/或產生的多肽的量的增加或減少有關，并可能由于多聚核苷酸或產生的多肽的序列的改變而產生多肽的改變的活性。申請人已經鑒定了來源于蘋果分別編碼多肽(SEQIDNO:1到4)的多聚核苷酸序列(SEQIDNO:5到8)，這些序列是能調控植物中花青素生產的轉錄因子。申請人還鑒定了編碼SEQIDNO:l的多肽變種(SEQIDNO:9至lj21)的SEQIDNO:5的多聚核苷酸變種(SEQIDNO:22到47)。所述多聚核苷酸和多肽間關系的概要可在表3(序列概要)中發現。本發明提供了包含所述多聚核苷酸序列的遺傳構建物、載體和植物。本發明也提供了包含本發明所述遺傳構建物和載體的植物。本發明提供了相對于合適的對照植物其花青素色素生產發生改變的植物。本發明提供了具有增加的和減少的花青素色素生產的植物。本發明也提供了生產所述植物的方法和選擇所述植物的方法。合適的對照植物可能包括相同物種和變種的未轉化植物或用對照構建物轉化的相同物種和變種的植物。本發明組合物的用途包括具有增加的花青素著色水平的水果或其它植物部分的生產，例如，具有紅色果皮和或紅色果肉的蘋果的生產。本發明也提供通過選擇具有增加的花青素色素的植物細胞和植物選擇轉化的植物細胞和植物的方法，所述增加的花青素色素指明所述植物被轉化來表達本發明的多聚核苷酸或多肽。分蓐救產多微,游誠本發明的多聚核苷酸分子能通過使用本領域普通技術人員所知的各種技術進行分離。用例子進行說明，這樣的多肽能通過使用在Mullisefa/.,Eds.1994ThePolymeraseChainReaction,Birkhauser中描述的聚合酶鏈反應(PCR)(將其引入本文作為參考)進行分離。如本文定義的，本發明的多肽能使用衍生自本發明的多聚核苷酸序列的引物進行擴增。分離本發明的多聚核苷酸的進一步的方法包括具有本文創立的作為雜交探針的序列的多肽的全部或部分的使用。將標記的多聚核苷酸探針同固定在諸如硝酸纖維素濾紙或尼龍膜的固體支持介質上的多聚核苷酸進行雜交的技術能用來篩選基因組或cDNA文庫。范例性的雜交和洗滌條件是在5.0XSSC、0.5%十二烷基磺酸鈉、lXDenhardt，s溶液中于65t:雜交20小時；在1.0XSSC、1%(w/v)十二烷基磺酸鈉溶液中洗滌(于55。C洗滌三次，每次20分鐘)，和在0.5XSSC、1%(w/v)十二烷基磺酸鈉溶液中于6(TC可選地洗滌一次(20分鐘)。可選的進一步的洗滌(20分鐘)能在0.1XSSC、1%(w/v)十二烷基磺酸鈉溶液中于6(TC的條件下進行。本發明的多聚核苷酸片段可能通過諸如限制性內切酶消化、寡核苷酸合成和PCR擴增等本領域著名的技術進行生產。部分的多聚核苷酸序列可能以本領域著名的方法使用來鑒定相應的全長多聚核苷酸序列。這樣的方法包括基于PCR的方法、5'RACE(FrohmanMA，1993,MethodsEnzymol.218:340-56)和基于雜交的方法、基于計算機/數據庫的方法。進一歩地，用例子進行說明，使用基于已知區域的引物的反向PCR支持獲得位于本文公開的多聚核苷酸序列的兩端的未知序列(TrigliaWa/.，1998,7Vwcfe'c^c/Aies16,8186，引入本文作為參考)。所述方法使用多個限制性酶來在基因的已知區域中產生合適的片段。所述片段然后通過分子內連接進行環化并用作PCR模板。分歧引物(divergentprimers)從已知區域設計而來。為了完全地組裝成全長的克隆，標準的分子生物學方法能被使用(SambrookWa/"MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress，1987)。當從特定物種生產轉基因植物時，用衍生自該物種的序列轉化這樣的植物可能是有益地。所述的益處可能是改善公眾對在產生轉基因生物中的物種間轉化的關注。此外，當基因的下調是所期望的結果時，利用同所述植物中的序列相同(或至少是高度相似的)的序列可能是必需的，對該基因而言，降低的表達是所期望的。因為這些以及其它的原因，能鑒定和分離在多個不同植物物種中的特定基因的直系同源物是可期望的。變種(包括直系同源物)可能通過所描述的方法進行鑒定。鑒定,鵬誠激默茲變種多肽可能通過使用基于PCR的方法進行鑒定(Mullisefa/.，Eds.1994ThePolymeraseChainReaction,Birkhauser)。典型地，用來通過PCR擴增本發明的多聚核苷酸分子變種的引物的多聚核苷酸序列可能基于編碼相應的氨基酸序列的保守區域的序列。可選地，本領域技術人員所熟知的庫篩選方法可能被使用(Sambrookefa/.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd-ColdSpringHarborPress,1987)。當鑒定所述探針序列的變種時，相對于當精確無誤的序列匹配被尋找時所需的條件，其雜交和/或洗滌的嚴格條件將典型地被降低。多肽變種也可能通過物理方法進行鑒定，例如，通過使用抗本發明的多肽的抗體篩選表達文庫(Sambrook"a/.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987)或在這樣的抗體的幫助下將多肽從天然來源中鑒定出。基f體細誠包括多聚核苷酸和多肽變種的本發明的變種序列也可能通過本領域技術人員所熟知的基于計算機的方法通過使用公眾域序列比對算法和序列相似性搜索工具來搜索序列數據庫(公眾域數據庫包括Genbank、EMBL、Swiss-Prot、PIR和其它)而進行鑒定。參見例如，NucleicAcidsRes.29:1-10and11-16，2001中在線資源的例子。相似性搜索檢索和比對針對同待分析序列相比較的序列(即查詢序列)。序列比較算法使用打分矩陣來為每一條比對序列賦予總體的分數。用于鑒定序列數據庫中變種的范例性的程序族是包括BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN和tBLASTX的BLAST程序套件(版本2.2.5[2002年11月])，公眾可從(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blast/)或從美國馬里蘭州貝塞斯達市38A棟8N805房間的國家醫學圖書館國家生物技術信息中心(NCBI)獲取。NCBI服務器也提供使用所述程序來篩選大量公眾可得的序列數據庫的工具。BLASTN比較核苷酸査詢序列和核苷酸序列數據庫。BLASTP比較氨基酸查詢序列和蛋白序列數據庫。BLASTX比較在所有閱讀框中被翻譯的核苷酸查詢序列和蛋白序列數據庫。tBLASTN比較蛋白查詢序列和在所有閱讀框中動態翻譯的核苷酸序列數據庫。tBLASTX比較核苷酸查詢序列的六讀碼框翻譯和核苷酸序列數據庫的六讀碼框翻譯。所述BLAST程序可能以默認參數使用或所述參數可能按改進篩選所需而改變。包括BLASTN、BLASTP和BLASTX的BLAST算法族的使用在出版物Altschul"a/"NucleicAcidsRes.25:3389-3402,1997中進行了描述。被BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN、tBLASTX或相似算法產生的被被査詢序列產生的對一個或多個數據庫序列的"擊中序列數"(hits)比對和鑒定了序列的相似部分。擊中序列數以相似性的程度和序列重疊的長度的順序排列。對數據庫序列的擊中序列數通常代表了僅是被查詢序列的序列長度的部分的重疊。BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN和tBLASTX算法也為比對產生"期望"(Expect)值。期望值(E)表明當搜索含有隨機連續序列的相同大小的數據庫時人們能"期望"隨機看到的擊中的數目。期望值用作決定所述對數據庫的擊中是否表明真的相似性的顯著性閾值。例如，指定到多聚核苷酸擊中數的O.l的E值被解釋為意味著，在被篩選的數據庫大小的數據庫中，人們可能期望看到具有簡單隨機地相似分值的序列的被比對部分的0.1匹配。對于被比對和匹配部分具有0.01或更低的E值的序歹lJ，通過使用所述BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN或tBLASTX算法在那個數據庫中發現隨機匹配的可能性是1%或更低。一組相關序列的多序列比對能用CLUSTALW(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.andGibson,T丄(1994)CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,positions-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.NucleicAcidsResearch,22:4673-4680,http:〃www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html)或T-COFFEE(CedricNotredame,DesmondG.Higgins,JaapHeringa,T-Coffee:Anovelmethodforfastandaccuratemultiplesequencealignment,J.Mol.Biol.(2000)302:205-217))或PILEUP進行，這些算法使用漸進(progressive)酉己X寸比X寸。(FengandDoolittle,1987,J.Mol.Evol.25,351)。模式識別軟件應用可用于發現基序或標記序列。例如，MEME(用于基序引出的多重Em，MultipleEmforMotifElicitation)在一組序列中發現基序標記序列，和MAST(基序比對和搜索工具，MotifAlignmentandSearchTool)使用這些基序來鑒定查詢序列中的相似或相同基序。MAST結果以具有適當統計數據和發現的基序的可視概觀的系列比對的形式提供。MEME和MAST在圣地亞哥的加利福尼亞大學開發。PROS1TE(BairochandBucher,1994,NucleicAcidsRes.22,3583;HofmannWo/.，1999,NucleicAcidsRes.27,215)是鑒定從基因組或cDNA翻譯而來的未鑒定蛋白的功能的方法。PROSITE數據庫(www.expasy.org/prosite)含有生物學上重要的模式和輪廓并被設計以便它能同適當的計算機工具共同使用來指定新的序列到已知的蛋白家族或來測定己知的結構域在所述序列中存在(Falquet""/.，2002,NucleicAcidsRes.30,235)。Prosearch是能用給定序列模式或標記搜索SWISS-PROT和EMBL數據庫的工具。因為編碼能調控植物中色素生產的轉錄因子的本發明的變種多聚核苷酸的功能，轉錄因子能被檢測調控已知花青素生物合成基因的表達(例如實施例4)的這個能力或能被檢測它們的調控色素生產的能力(例如實施例5和6)。分駭嚴游方茲包括變種多肽的本發明的多肽可能通過使用本領域著名的肽合成方法進行制備，例如使用固相合成技術的定向肽合成(例如Stewart"a/"1969,inSolid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo,加利福尼亞圣弗朗西斯科)或自動化合成，例如使用應用生物系統431A肽合成儀(加利福尼亞，福斯特市)。所述多肽的突變形式也可能在這樣的合成過程中生產。本發明的多肽和變種多肽也可能通過使用本領域著名的各種技術從天然來源中純化而來(例如，Deutscher,1990,Ed,MethodsinEnzymology,Vol.182，Gw/<iefc>iVo/e/w/^rzy^cGWcw,)。可選地，本發明的多肽和變種多肽可能在合適的宿主細胞中重組表達并按下面討論的方法從所述細胞中分離而來。主產辦激滅鵬膽本發明的遺傳構建物包含一條或多條本發明的多聚核苷酸序列和/或編碼本發明的多肽的多聚核苷酸，并可能是對轉化有用的，例如，細菌、真菌、昆蟲、哺乳動物或植物生物體。本發明的遺傳構建物要包括如本文定義的表達構建物。生產和使用遺傳構建物和載體的方法在本領域中是公知的并通常在Sambrookefa/"MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987;AusubelWa/,,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishing,1987)中進行了描述。f產舒多微艦辦激或載鄉嫁主鄉緒膽本發明提供了包含本發明的遺傳構建物或載體的宿主細胞。宿主細胞可能衍生自，例如，細菌、真菌、昆蟲、哺乳動物或植物生物體。包含本發明的諸如表達構建物的遺傳構建物的宿主細胞在本領域著名的方法中對重組生產本發明的多肽的是有用的(例如，Sambrook"a/"MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987;Ausubel"/.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishing,1987)。這樣的方法可能涉及在適當的培養基中在適于或有助于本發明的多肽的表達的條件下培養宿主細胞。可能會可選地分泌到培養物中的表達的重組多肽可能然后被從培養基、宿主細胞或培養物培養基中用本領域著名的方法分離(例如，Deutscher,Ed,1990，MethodsinEnzymology，Vol182,GuidetoProteinPurification)。主產包舒鍵餘載沐離激雄鵬激游滅本發明進一步提供包含本發明的遺傳構建物的植物細胞和被修飾來改變本發明的多聚核苷酸或多肽的表達的植物細胞。包含這樣的細胞的植物也形成了本發明的一個方面。在色素生產上發生改變的植物的生產可能通過本發明的方法而獲得。這樣的方法可能涉及用被設計來改變能調控在這樣的植物細胞和植物中的色素生產的的多聚核苷酸或多肽的表達的本發明的構建物來轉化植物細胞和植物。這樣的方法也包括用本發明的構建物和一個或多個其它的設計來改變一個或更多個多肽或能調控在這樣的植物細胞和植物中的色素生產的多肽的表達的構建物的組合來轉化植物細胞和植物。用多肽轉化植物細胞、植物和其部分的方法在下述文獻中進行了描述Drapera/"1988,PlantGeneticTransformationandGeneExpression.ALaboratoryManualBlackwellSci.Pub.Oxford,p.365;PotrykusandSpangenburg,1995,GeneTransfertoPlants.Springer-Verlag:Berlin.;禾卩Gelvinda/.,1993,PlantMolecularBiol.Manual.KluwerAcad.Pub.Dordrecht。包括轉化技術的轉基因植物的綜述在GalunandBreiman,1997，TransgenicPlants.ImperialCollegePress,London中提供。潛激遺/衞柳減大量植物轉化策略是可獲得的(例如，Birch,1997,AnnRevPlantPhysPlantMolBiol,48，297)。例如，在多聚核苷酸/多肽被正常表達時，策略可能被設計來增加多聚核苷酸/多肽在植物細胞、器官中和/或在特定發育階段的表達，或在多聚核苷酸/多肽不能正常被表達時，策略被設計來在細胞、組織、器官中和/或特定發育階段異常表達多聚核苷酸/多肽。表達的多聚核苷酸/多肽可能衍生自將被轉化的植物物種或可能衍生自不同的植物物種。轉化策略可能被設計來降低多聚核苷酸/多肽在被正常表達時在植物細胞、組織、器官或在特定發育階段的表達。這樣的策略稱為基因沉默策略。在轉基因植物中用于基因表達的遺傳構建物典型地包括驅動一條或更多條克隆的多聚核苷酸表達的啟動子、終止子和檢測(detest)遺傳構建物在被轉化植物中存在的選擇性標記序列。適用于本發明構建物的啟動子在單子葉植物或雙子葉植物的細胞、組織或器官中是有作用的并包括細胞-、組織-和器官-特異的啟動子、細胞周期特異的啟動子、時間啟動子、誘導型啟動子、在大多數植物組織中有活性的組成型啟動子和重組啟動子。啟動子的選擇將依賴于所期望的克隆的多聚核苷酸在時間和空間上的表達。所述啟動子可能是那些同目標轉基因正常相關的啟動子，或衍生自其它植物、病毒和植物病原性細菌和真菌的基因的啟動子。在沒有不恰當的實驗下，本領域的技術人員將能通過使用包含本發明的多聚核苷酸序列的遺傳構建物選擇適用于修飾和調控植物特性的啟動子。組成型植物啟動子的例子包括CaMV35S啟動子、膽脂堿合成酶啟動子和章魚堿合成酶啟動子和來自于玉米的Ubi1啟動子。在特定組織中有效并應對內部發育信號或外部無生命或有生命的應激的植物啟動子在科學文獻中進行了描述。范例性的啟動子被進行了描述，例如在WO02/00894中，將其引入本文作為參考。在植物轉化遺傳構建物中普遍使用的范例性的終止子包括，例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)35S終止子、根癌農桿菌Ugra6ac^^附"脂e/ac/era)胭脂堿合成酶或章魚肉堿合成酶終止子、玉米(Zeflma，)醇溶蛋白基因終止子、水稻(C^加M"ra)ADP葡糖焦磷酸化酶終止子和馬鈴薯(5b/am/wft^e,rm/m)PI-n終止子。在植物轉化中普遍使用的選擇性標記包括賦予卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉移酶(phophotransferase)II基因(NPTII)、賦予壯觀霉素和鏈霉素抗性的aadA基因、賦予Ignite(AgrEvo)禾BBasta(Hoechst)抗性的phosphinothricin乙酰基轉移酶(6w基因)和賦予潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)。包含可能用于植物和植物組織中啟動子表達分析的報告基因(表達對于宿主而言是外來的、通常是酶活性和/或可視信號(例如熒光素酶、GUS、GFP)的活性的編碼序列)的遺傳構建物的使用也是被考慮的。報告基因的文獻在Herrera-Estrella"a/"1993,Nature303,209，和Schrott,1995，In:GeneTransfertoPlants(Potrykus,T.,Spangenberg.Eds)SpringerVerlag.Berline，pp.325-336中進行了綜述。基因沉默策略可能會聚焦于所述基因本身或影響被編碼的多肽的表達的調控元件。"調控元件"在本文中以其最廣泛可能的意思使用并包括同目標基因相互作用的其它基因。設計來降低或沉默本發明的多聚核苷酸/多肽的表達的遺傳構建物可能包括本發明多聚核苷酸的反義拷貝。在這樣的構建物中，所述多聚核苷酸被以與啟動子和終止子相關的反義方向進行放置。"反義"多聚核苷酸通過逆變所述多聚核苷酸的多聚核苷酸或片段以使產生的轉錄物將對所述基因的mRNA轉錄物互補而獲得，例如，5'GATCTA3'(編碼鏈)3'CTAGAT5'(反義鏈)3'CUAGAU5'mRNA5'GAUCUCG3'反義RNA為基因沉默設計的遺傳構建物可能也包括反向重復序列。'反向重復序列'是所述重復序列的第二個一半是在互補鏈內重復的序列，例如，5'-GATCTA......TAGATC-3'3'-CTAGAT……ATCTAG-5'形成的轉錄物可能經歷互補堿基配對來形成發卡結構。通常在所述重復區域間的至少3-5堿基對的間隔區是允許發卡形成所必需的。另一種沉默方法涉及耙向miRNA的轉錄等價物的小反義RNA的使用(Llave"a/.,2002,Science297,2053)。這樣的相應于本發明的多聚核苷酸的小反義RNA的使用是特別考慮的。如本文中所用，術語遺傳構建物也包括小反義RNA和其它影響基因沉默的這樣的多肽。如本文定義的，用表達構建物進行的轉化可能也通過名為正義抑制的過程產生基因沉默(例如，Napoli"a/.，1990，PlantCell2,279;deCarvalhoNiebelWa/"1995,PlantCell,7,347)。在某些情況下，正義抑制可能涉及全部或部分編碼序列的過表達但也可能涉及所述基因的諸如內含子或5'或3'非翻譯區(UTR)的非編碼區的表達。嵌合的部分正義構建物能用來協調沉默多個基因(Abbott""/.,2002,PlantPhysiol.128(3):844-53;Jones"a/.，1998,Planta204:499-505)。這樣的用來沉默本發明的多聚核苷酸的表達的正義抑制的使用也是被考慮的。遺傳構建物中為基因沉默設計的多聚核苷酸插入物可能對應于諸如啟動子和/或內含子和/或5'或3'UTR序列或相應基因的編碼序列和/或非編碼序列。其它的基因沉默策略包括顯性負向途徑和核酶構建物的使用(Mclntyre,1996,TransgenicRes,5，257)。轉錄前沉默可能通過所述基因本身或它的調控元件的突變而帶來。這樣的突變可能包括點突變、移碼、插入、刪除和替換。下述文獻是披露能用來遺傳轉化下述植物物種的遺傳轉化方案的代表性出版物水稻(Alame"/"1999，PlantCellRep.18,572)、蘋果(Yaoda/.,1995,PlantCellReports14,407-412)、玉米(美國專利序列號Nos.5,177,010和5,981，840)、小麥(OrtizWa/"1996，PlantCellRep.15:1996，877)、番茄(美國專利序列號No.5,159,135)、馬鈴薯(Kumar""/.，1996PlantJ.9,:821)、木薯(Li"a/.,1996Nat.Biotechnology14,736)、萵苣(Michelmore"a/.，1987,PlantCellRep.6,439)、煙草(Horsche/1"/.，1985,Science227,1229)、棉花(美國專利序列號Nos.5,846,797和5,004,863)、草(美國專利Nos.5，187，073和6，020,539)、薄荷(Niu1998,PlantCellRep.17,165)、柑橘植物(PenaWa/.,1995,PlantSci.104,183);葛縷子(KrensW"/.，1997,PlantCellRep,17,39)、香蕉(美國專利序列號No.5,792,935)、大豆(美國專利Nos.5,416，011、5，569，834、5，824,877、5,563,04455和5,968,830)、菠蘿(美國專利序列號No.5,952,543)、白楊(美國專利No.4,795,855)、普通單子葉植物(美國專利Nos.5,591,616和6,037,522)、蕓苔(美國專利Nos.5,188，958、5,463,174和5,750,871)、谷物(美國專利No.6,074，877)、梨(Matsuda&a/.,2005)、李子(Ramesh"a/"2006、SongandSink2005、GonzalezPadillada/.,2003)、草毒(Oosumida/.,2006、FoltaWa/.,2006)、3E女王鬼(Li&o/.，2003)和懸鉤子(Graham"a/.,1995)。其它物種的轉化也被本發明所考慮。合適的方法和方案在科學文獻中可以獲得。本領域已知的多個進一步的方法可能被用來改變本發明的核苷酸和/或多聚核苷酸的表達。這樣的方法包括但不限于Tilling(TillWfl/.,2003,MethodsMolBiol,2%，205)、所謂的"Deletagene"技術(Lia/"2001,PlantJournal27(3),235)和諸如合成的鋅指轉錄因子的人工轉錄因子的使用(例如，Jouvenot"a/.，2003,GeneTherapy10,513)。此外，靶向特定多肽的抗體或其片段也可能在植物中表達來調控該多肽的活性(Joblinga/.,2003,NatBiotechnol，21(1),35)。轉座子標簽途徑也可能被應用。此外，同本發明的多肽相互作用的多肽可能通過諸如相位展示的技術(DyaxCorporation)進行鑒定。這樣的相互作用的多肽可能在植物中表達或應用到植物來影響本發明的多肽的活性。上述改變本發明的核苷酸和/或多肽的表達的每一種方法的使用都是被特別考慮的。遂賺激游膽也提供了選擇具有改變的色素生產的植物的方法。這樣的方法涉及檢測植物中的本發明的多聚核苷酸或多肽的改變的表達。為了提高花青素含量，這樣的方法可能在改變的色素生產可能不必是可視的幼齡或早期發育階段來應用來加快培育程序。諸如信使RNA的多聚核苷酸的表達被經常用作相應多肽表達的指示物。測定多聚核苷酸的表達的范例性的方法包括但不限于Northern分析、RT-PCR和斑點印記分析(Sambrookda/.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987)。因此，如本文定義的，本發明的多聚核苷酸或其部分在鑒定具有改變水平的花青素的植物的方法中是有用的探針或引物。本發明的多肽可能在設計來鑒定這樣的植物的雜交實驗中用作探針或在基于PCR的實驗中用作引物。可選地，抗體可能被產生來抵抗本發明的多肽。產生和使用抗體的方法在本令頁域是標準的方法(參見例如Antibodies,ALaboratoryManual,HarlowALane,Eds，ColdSpringHarbourLaboratory,1998)。這樣的抗體可能被用在檢測調控植物花朵大小的多肽的改變的表達的方法中。這樣的方法可能包括ELISA(Kemeny,1991,APracticalGuidetoELISA,NYPergamonPress)禾口Western分析(Towbin&Gordon,1994,JImmunolMethods,72,313)。這些分析多聚核苷酸或多肽表達和選擇具有改變的表達的植物的方法在設計來生產具有改變的色素生產的變種的傳統的培育程序中是有用的。潛激本發明的植物可能被栽培并且被自交或同不同的植物植株進行雜交并且產生的具有期望的表型特征的雜交體可能被鑒定。二或更多代植物可能被栽培來確保目標表型特征是穩定保持和遺傳的。從這樣的標準培育方法產生的植物也形成本發明的一個方面。現在，本發明將參考下述非限制性實施例進行解釋。實施例1:用于編碼調控色素生產的轉錄因子的多聚核苷酸的分離的恰當蘋果組織和發育階段的鑒定層敲茲實好"潛J趙分橋蘋果在2003-2004年從春季(十月)經過夏季到(三月)的蘋果季的6個時間點從HortResearch果園的蘋果樹上(新西蘭納爾遜)進行收集十月(盛花期后7天，DAFB)、H^—月(40DAFB)、十二月(67DAFB)、一月(102DAFB)、二月(130DAFB)和三月(146DAFB)。RNA被從所述果實(分別從相同的果樹而來的6個果實、皮和皮層)和2個基因型的葉片分離而來(改自Change^/.,1993的方法)；白色果肉的商品化的家蘋果品種變種Sciros(太平洋玫瑰(PacificRose)TM，衍生自噶拉和華麗蘋果間的雜交)和紅色果肉的家蘋果品種變種紅地，品種'紅地，的自花授粉幼苗C狼河，(WolfRiver)和家蘋果變種Niedzwetzkyana的雜交)(BrooksandOlmo,1972)。對于第一個發育水果吋間點，十月(7DAFB)，從皮層成功地切除果皮是不可能的并且來源于這個樣品的數據已經被排除。在第一鏈cDNA合成(每一個樣品重復三次然后三次的結果被混合)前用DNase處理，然后按照廠商說明書使用寡dT進行合成(Transcriptor,RocheAppliedScience)。編碼蘋果花青素路徑酶和調控因子的基因通過在HortResearchEST數據庫的同源性鑒定，并且，在可能的異型體的情況下，選擇按照表達輪廓和文庫組織進行制備。相應于這些基因的基因特定引物使用VectorNTI版本9.0.0(www.invitrogen.com)按照一套嚴格的標準進行設計，從而使通用反應條件的應用成為可能。為了檢查反應的特異性，RT-PCR被按照廠商說明書進行使用(PlatinumTaq,Invitrogen)。每一對引物的序列和相關的登入號在下面的表1中補充顯示。基岡標識符基因名CN944824MdCHSCN946541MdCHICN491664MdF3HAY227729MdDFRAF117269MdLDOXAF117267MdUFGTMdMYBlOMdbHLH33CN934367MdbHLH3CN938023MdActin正向引物(S叫TDNO:)GGAGACAACTGGAGAAGGACTGGAA(81)GGGATAACCTCGCGGCCAAA(83)TGGAAGCTTGTGAGGACTGGGGT(85)GATAGGGTTTGAGTTCAAGTA(87)CCAAGTGAAGCGGGTTGTGCT(89)CCACCGCCCTTCCAAACACTCT(91)TGCCTGGACTCGAGAGGAAGACA(93)ATGTTTTTGCGACGGAGAGAGCA(95)AGGGTTCCAGAAGACCACGCCT(97)TGACCGAATGAGCAAGGAAATTACT(99)反向引物(S叫IDNO:)CGACATTGATACTGGTGTCTTCA(82)GCATCCATGCCGGAAGCTACAA(84)CTCCTCCGATGGCAAATCAAAGA(S6)TCTCCTCAGCAGCCTCAGTTTTCT(8S)CAAAGCAGGCGGACAGGAGTAGC(90)CACCCTTATGTTACGCGGCATGT(92)CCTGTTTCCCAAAAGCCTGTGAA(94)TAGGCGAGTGAACACCATACATTAAAGG(96)TTGGATGTGGAGTGCTCGGAGA(98)TACTCAGCTTTGGCAATCCACATC(IOO)DNA擴增和分析使用LightCycler系統(RocheLightCycler1.5)進行。所有的反應均按照廠商方法用LightCyclerFastStartSYBRGreenMasterMix(RocheAppliedScience)進行。反應通過使用2y15xMasterMix、0.5的每種引物、llU稀釋的cDNA和無核酶的水(RocheAppliedScience)并使終體積為10lU進行，同時進行三份反應。在每一個反應中均包括陰性水對照。下述熱循環被用于所有的qPCR反應95。C預孵育5分鐘，然后95。C(5秒)、60°C(5秒)和72°C(IO秒)進行40個循環。在每一個退火步驟的末期測量熒光。擴增后，用在65"C到95"C熔解時獲取的連續熒光數據進行熔解曲線分析。用LightCycler軟件版本4分析原始數據并且表達用具有標稱值1的作為校準的太平洋玫瑰蘋果葉片樣品來標準化到家蘋果肌動蛋白(MdActin，登入號CN938023)。對于每一個基因，標準曲線用cDNA系列稀釋產生并且產生的PCR效率計算結果(位于1.839到1.945間)被輸入到相對表達數據分析中。絲f激合威蘑游^PCi表這iA,為了鑒定水果發育中花青素合成的轉錄調控是最大的階段，主要的生物合成基因的表達分析被進行。在太平洋玫瑰蘋果和紅地蘋果間的編碼花青素生物合成基因的轉錄物水平的比較顯示了驚人的不同。在實驗的代表所述路徑中大多數酶歩驟的所有基因中，與在太平洋玫瑰蘋果中發現的轉錄水平相比，紅地蘋果的轉錄水平在水果發育的所有階段均顯示了顯著的提高(圖3)。具有指明最高的轉錄物水平是在一月的時間點的一般模式的紅地蘋果生物合成基因的轉錄物豐度在果皮和皮層的整個水果發育階段均被增強。這個格局模擬了在組織取樣時被觀測到的在發育早期(40DAFB)及然后再一次在仲夏(102DAFB)被觀測到的具有最強烈著色的的著色程度，該水平然后被保持到夏末水果成熟時(圖3b)。在水果發育過程中通常具有下降的表達的太平洋玫瑰蘋果皮層組織中，所有花青素生物合成基因的均具有相對低的轉錄物水平。中等的活性在果皮中觀察到，具有同水果成熟過程中的增強的著色水平并發的在發育中途的在102DAFB處的表達峰。在兩種變種的葉片中的表達水平是明顯的但相對的低且紅地蘋果和太平洋玫瑰蘋果間的區別不明顯。花青素生物合成酶轉錄物水平的qPCR分析結果被分析來測定相關的MYB轉錄因子分離的最適組織/時間點。我們選擇顯示了最高的花青素生物合成基因表達水平的來源于紅地蘋果皮層的組織。實施例2:編碼潛在調控蘋果中色素生產的轉錄因子的多聚核苷酸的分離PCR通過使用來源于紅地(一月時間點)皮層樣品的cDNA和在基于各種物種的花青素調控因子的序列的R2R3結合區域設計的簡并引物(具有32倍的簡并性)進行。各種編碼R2R3MYB區域的cDNAs被獲得。來源于測序數據的結果揭示，通過使用5，RACE(GeneRacer，Invitrogen)具有同花青素調控因子和全長序列的高度同一性的一種cDNA被獲得。MdMYB10cDNA的完整序列由重疊片段編譯而來。為了比較來源于紅地蘋果的轉錄物，全長的cDNAs隨后被從家蘋果變種太平洋玫瑰蘋果和史密斯袓母(GrannySmith)蘋果分離而來。MdMYBll(亞組11MYB)(DQ074463)(根據Stracke2001)也用相同的過程進行分離和測序。其它的候選轉錄因子從HortResearchEST標本分離而來擬南芥TT2的蘋果同族體MdMYB9(Nesi"a/.，2001,AJ299452)和具有同己知花青素調控因子很少序列同源性的蘋果MYBMdMYB8。先前在其它物種中的研究已經表明，亞組IOMYB可能是著色的關鍵決定因素。在公眾可得的蘋果EST數據庫中(在2005年8月時具有185,000種核苷酸序列)，經過序列同源性比較，沒有顯示出同擬南芥PAP1和來源于其它物種的亞組10MYB高度同源性的MYBTF被發現。在PCR后克隆的cDNAs的重疊序列比對顯示，最好的候選者MdMYBlO同其它MYBTFs在R2R3區域并且具體地，同來源于其它物種的花青素調控因子分享了高度的同源性(圖1)。MdMYBlO同擬南芥亞組10MYB、PAP1緊密相關，它們在R2R3結合區域具有77%的氨基酸同一性并整體具有58%的氨基酸同一性。對于擬南芥PAP2，這些氨基酸同一性百分比分別為75%和57%，同時對于其它物種，整體的同一性數字如下牽牛花AN260%,番茄ANT157%，玉米Cl58%和玉米P260/0。所有這些MYBTFs均具有同bHLHs特定相互作用的氨基酸殘基(Grotewold"2000)。因此，這些共同因子的候選者均選自HortResearchEST數據庫。在具有組成型bHLH型TF的巨大系統發育家族中，似乎被涉及到類黃酮生物合成調控中的命名為IIIf的更小的進化枝(Heim"fl/，2003)是存在的。在這個進化枝內，兩個來源于HortResearchEST數據庫的蘋果TFs集成簇(數據未顯示)。這些均被全長測序并給予識別符MdbHLH3(CN934367)(擬南芥TT8基因的假定同源物)禾nMdbHLH33(Delila的假定同源物)(來源于金魚草，Goodrich"a/"1992)。郝數蘋果EST序列用載體、接口和低質量序列區域修飾并被上傳到VectorNTI版本9.0.0(www.invitrogen.com)。EST聚簇相(ESTclusteringphase)通過使用VectorNTIAlignX程序進行。比對然后以MSF格式文檔被輸出到GeneDoc版本2.6.002(http:〃www.psc.edu/biomed/genedoc/)中。通過在CLUSTALX(vl.81)中使用默認設置重新排列輸出的文檔，進化樹被產生(Thompson^W，1997)。使用PHYLIP軟件包進行種系發生分析(Felsenstein,1993)。TreeView(v.1.6.5)被用來展示產生的進化樹(Page,1996)或通過使用MEGA版本2.1產生環狀進化樹(circulartrees)(Kumarwa/，2001)。實施例3:MdMyblO變種的鑒定從全部為薔薇科物種的家蘋果、野蘋果(Ms，歐洲山楂果)、西洋梨(Pc，梨)、沙梨(Ppy梨，Nashi)、白梨(Pb，梨，鴨梨)、榲槨(Co，榲槨)、中國李(Ps，日本李，洋李)、紅葉李(Pcf，櫻桃李)、碧桃(Ppr，桃)、枇杷(Ej，枇杷)、扁桃(Pd，杏)、歐洲甜櫻桃(Pav，甜櫻桃)、西洋木瓜(Mg,歐楂)、歐洲李(Pdm，普通李)、復盆子(Ri，紅樹莓)、山杏(par,杏)和烏荊子李(Pi，西洋李子)中收集組織。使用DNeasyPlantMini試劑盒(QIAGEN，目錄號69104)按照廠商指導從每一種物種的葉片抽提基因組DNA(gDNA)，砂梨(Ppy梨，Nashi)和白梨(Pb，梨，鴨梨)除外，它們的基因組DNA從水果果皮中分離。使用在下面的表2中顯示的引物的組合進行對來源于上述物種的gDNA的PCR(通過標準技術)。2<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>)通過標準程序進行基因組PCR產物的測序。從經測序的基因組DNA，內含子和外顯子可通過用MdMYBlOEST數據、已知的內含子/外顯子邊界和開放閱讀框的比較的已知方法進行預測。從這些推論的cDNAs，翻譯的蛋白質被產生。經鑒定的變種gDNA、預測的cDNA和預測的多肽序列的概要被包括在表X中。MdMyblO的多肽變種以SEQIDNO:9-21列在序列表中。MdMyblO的多聚核苷酸變種以SEQIDNO:22-47列在序列表中。SEQIDNO:102是MdMyblO基因組序列。變種多肽序列(以及MdMyblO和用作參考的AtPAPl)通過使用ClustalW算法的VectorNTI版本9.0進行比對(Thompsona/.,1994)。結果在圖8中顯示。比對的多肽序列間的序列同一性百分比也通過使用VectorNTI版本9.0進行計算(2003年9月2日(c)1994-2003InforMax，現在己經許可給Invitrogen)。結果在圖9中顯示。這些數據顯示，申請人已經從薔薇科物種中鑒定了不同組的MdMyblO變種。薔薇科序列分享了顯著程度的序列保守性，并且，每一種薔薇科序列與其它薔薇科序列的相似性比它與AtPAPl的相似性實施例4:在植物中通過本發明的轉錄因子多聚核苷酸的表達激活色素啟動子贈微纖實凝啟動子序列被插入到pGreen0800-LUC(Hellense^/，2005)的克隆位點并被修飾來在所述序列的3'端引入A^oI位點，這將使所述啟動子以同螢火蟲熒光素酶基因(LUC)轉錄融合的形式被克隆。這樣，結合所述啟動子并增加轉錄速率的TFs能通過發光活性的增加進行鑒定。擬南芥CHS(TT4)(AT5gl3930)和擬南芥DFR(TT3)(AT5g42800)被從基因組DNA中分離。在同一構建物中，來源于海腎(REN)且處于35S啟動子控制下的熒光素酶基因提供了短暫表達程度的估計。活性以LUC比REN活性比率的形式表達，因此，在TF(+/-bHLH)和所述啟動子間的相互作用發生時，相對于REN的LUC活性的顯著增加將被觀測到。煙草在溫室條件下使用日光長度為16小時的自然光進行培育，直到至少6片葉片(長度為2-3cm)可用于用農桿菌進行的浸潤。在實驗的過程中，所述植物均維持在溫室中。農桿菌菌株GV3101(MP90)在補充了選擇抗生素的Lennox瓊脂(Invitrogen)上培養并在28。C孵育。10nl環(loop)的匯合細菌重懸于10ml浸潤培養基(10mMMgCl2、0.5uM乙酰丁香酮)中并使OD6。。為0.2，并于浸潤前在沒有搖動的情況下在室溫下孵育2小時。浸潤按照Voinnet""/(2003)的方法進行。大約150tU的這種農桿菌混合物在六個點浸潤入煙草的幼葉并且在接種后3天進行短暫表達的實驗。在pGreenll0800-LUC中的啟動子-LUC融合物(CHS和DFR)被用在短暫轉化中，通過將lOOyl用報道基因表達框轉化的農桿菌同兩種其它的用包含在pART27(Gleave，1992)或pGreenll62-SK(Hellens"a/.，2000)二元載體中的融合到35S啟動子的MYBTF基因和bHLHTF基因的表達框轉化的農桿菌菌株(每種450tU)混合可實現上述步驟。螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶使用雙重熒光素酶實驗試劑(Promega，美國麥迪遜)進行實驗。接種后三天，2cm葉片盤(來源于每種植物的6個技術重復)被移除并在500ti1被動裂解緩沖液(PLB)中磨碎。10ix1該粗提物的1/100稀釋物在40u1的熒光素酶實驗緩沖液中進行實驗，并且化學發光被測量。40ul終止(Stop)和發光TM(Glow)緩沖液然后被加入并且第二化學發光測量被進行。絕對的相對發光單位(RLU)在Turner20/20發光計上用5s延遲和15s測量進行測量。雙厳1素蘑魏所述雙重熒光素酶系統已經被證明能提供短暫基因表達分析的快速方法(Hellens"W.，2005)。它不需要選擇性標記并且結果能用簡單的酶學實驗進行定量。在本研究中，當用假定結合所述啟動子的TFs攻擊時，所述系統被用來定量花青素生物合成基因的啟動子的活性。我們在所述雙重熒光素酶短暫實驗中使用煙草來檢測我們的候選TFs同已知被擬南芥PAP1和PAP2MYBTFs調控的兩個擬南芥花青素生物合成基因啟動子AtCHS(TT4，AT5gl3930)和AtDFR(TT3，AT5g42800)間的相互作用(Tohge"a/.，2005,Zimmermann^a/.,2004)。多個蘋果MYBTFs被選來探測MdMYB10的特異性MdMYB9、MdMYB11、MdMYB8和來源于擬南芥的AtPAPl。這些MYBs屬于分別代表亞型10、9、11和7的進化枝(圖2)。為了詳細研究MYB和bHLHTFs間的相互作用，共轉化用來源于蘋果的bHLH類假定的調控因子；MdbHLH3和MdbHLH33和來源于擬南芥的bHLH，TT8(AtbHLH042;At4g09820)進行。來源于基于CHS啟動子的短暫分析的結果顯示，擬南芥PAP1MYB的活性在用蘋果bHLH進行的共轉化中最大，但未料到的是，它不被用擬南芥TT8bHLH進行的共轉化所影響。在對照中，MdMYBlO的結果表明，可能獨立于bHLH的僅具有MYB的活性具有最大的觀察到的活性(圖5)。MdMYBlO同擬南芥bHLH的共轉化似乎抑制活性。當同序列相似性同TT2-樣基因相符的蘋果bHLH合用時，MdMYB9也顯示增強的活性。剩余MYBs的顯著活性未被觀察到并且這個活性程度被推測代表了基底水平的活性。當MdMYB10(和AtPAPl)被同蘋果bHLH共轉化時，來源于DFR啟動子實驗的結果顯示了標明顯著活性增加的不同模式。在MdMYBlO的情況下，當用MdbHLH3浸潤時，最高的活性被觀察到。與之相比較，AtPAPl當用蘋果Delila同源物、MdbHLH33浸潤時其活性是最高的。這些結果反映了在短暫原生質體轉染系統中的先前的結果，其中在擬南芥DFR啟動子Gus中融合僅在存在bHLH時被PAP1激活(Zimmermann"a/.,2004)，盡管應該注意，當AtPAPl被用AtTT8浸潤時我們沒有看到這樣的巨大的活性增加。MdMYB9以相似但簡化的方式進行，同時MbMYBll和MdMYB8的LUC比REN比率低于所有的條件。當基因組櫻桃梅MYB10(PcfMYB10)被克隆入pGREEN質粒載體并按上述方法進行實驗時，DFR啟動子的激活產生。當PcfMYBlO被用MdbLHL3和MdbHLH33進行浸潤時，最高的活性被顯示(圖10)。這個數據顯示，來源于桃亞科或李亞科的MYB10序列也以同MdMYBlO(薔薇科的蘋果亞科的)相似的機理在驅動花青素基因活性上起作用。實施例5:植物中色素生物合成被本發明轉錄因子表達的激活廯經魏煙草變種Samsim在溫室中于22°〇使用日光長度為16小時的自然光進行培育，直至至少3片葉片(長度為10-15cm)能用于農桿菌的浸潤。植物在實驗的過程中均處于溫室中。農桿菌培養物按雙重熒光素酶實驗的方法進行孵育并且含有在pART27二元載體中的MYBTF基因和融合到35S啟動子的bHLHTF基因的分離菌株被混合(每種500lU)并按照用煙草進行實驗的方法浸潤到下部葉片表面。六個分離浸潤被進行到煙草葉片中(每組處理兩株植物)并且顏色變化使用MinoltaCR-300比色計(校正到D65光)和！^a訃系統(CIE，1986)每日測量。包含MdMYBlO和蘋果bHLH的浸潤在四天后產生可見的著色。著色水平在整個實驗過程中均增加；數碼照片和顯微圖像在浸潤后八天獲取。當煙草用在平行實驗中時，花青素著色沒有發展(數據未顯示)。朋丄C煙草葉片盤沿浸潤位點切下、冷凍干燥并在5ml甲醇和0.1%HCL中重懸前粗糙磨碎、在室溫下抽提2小時并在3500rpm下離心。lml等份在LabconcoCentrivap濃縮器中干燥到徹底。樣品重懸在20%甲醇中(250ul)。花青素在250x4.6mm、Synergi、4m粒度、Polar-RP、8A孔徑、醚聯苯柱(Phenomenex，新西蘭奧克蘭)上通過HPLC進行鑒定。這同具有柱加熱爐、自動上樣器、真空溶劑脫氣器和二極管陣列檢測器的Shimadzu分析型HPLC相符。溶劑是(A)乙腈+0.1%甲酸和(B)比例為5:92:3的乙腈/水/甲酸。流速是1.5ml/min并柱溫為45°C。溶劑A的含量在0時是0%并在第17分鐘線性增加到17%、在第20分鐘增加到20%、在第26分鐘增加到30%、在第28.5分鐘增加到50%、在第32-35分鐘間增加到95%并在第36-42分鐘間變回到0%。反應產物的定量是，在520nm對花青素定量，在280nm對其他酚類化合物定量。波譜在從240到600nm的范圍內以4nm的間隔記錄。樣品注射體積為40tU。我們已經建立了經由農桿菌浸潤來揭示煙草中花青素色素積累的簡單方法。在被浸潤的煙草葉片中的著色積累被可視檢査。當用蘋果bHLH共浸潤時，對于MdMYB10而言，著色在浸潤點在早至浸潤后4天的時間即是明顯的(圖6A)。著色程度隨實驗周期而增加(長達十天)。在包含AtPAPl和蘋果bHLH(MdbHLH3或MdbHLH33)、AtPAPl和AtTT8的浸潤的處理中，著色也能被觀察到但水平降低，并且，當單用MdMYBlO浸潤時，著色程度更低。在其他組合中沒有著色是可見的。結果證明本實驗的效率能作為研究著色過程的調控的有用的報告系統。通過用Minolta比色計和使用！^aA系統來定量顏色并確認從綠到紅的視覺變化。數據以a"M的比率顯示(圖6B)，其中從負值朝向正值的變化標明從綠色到紅色的變化。在給定處理組的重復間存在像以誤差條深度表示的明顯可變性一樣的著色程度的可變性(圖6B)。為了證實花青素化合物的細胞積累，顯微圖像從浸潤后1周的表皮獲取(圖6C)。這例證了用候選基因進行的單個細胞的轉化和液泡內花青素色素的積累的激活。肌C為了確認在選擇的MYBs的煙草短暫表達過程中合成的花青素的鑒定，樣品被抽提并且可溶的花青素被用HPLC分析。結果表明，當MdMYBlO和MdbHLH3在煙草葉片中被共同過表達時，代表花青苷-3-葡糖苷和花青苷-3-鄰-蕓香苷的兩個主要峰被觀察到(圖7)。這些化合物鑒定通過LC-MS確認(數據未顯示)。在用空載體對照轉化的煙草葉片的抽提物中沒有可觀察到的花青素的峰被發現(數據未顯示)。為了比較這個化合物和在蘋果和煙草中自然發生的化合物，來源于煙草花瓣和蘋果果皮(太平洋玫瑰蘋果，成熟果實)的花青素也被抽提，但如前面描述的，結果確證花青苷-3-半乳糖苷在蘋果果皮中占優(數據未顯示)(Tsou"a/.2003)。花青苷-3-葡糖苷和矮牽牛素-3-半乳糖苷在煙草花瓣中觀察到(圖7)。矮牽牛素-3-半乳糖苷在煙草葉片中被MdMYBlO和MdbHLH3的作用產生的輪廓中未被看到(圖7)。綠舒游,C7教:蕭關于生物合成基因轉錄物的豐度、積累模式的知識提供了關于執行分離假定的轉錄調控因子的簡并PCR的最恰當組織的信息。在這個相同的發育系列中的TFs的qPCR揭示了同太平洋玫瑰蘋果相比，在紅地蘋果的果實組織中MdMYBlO相對轉錄水平的增加。在皮層組織中，轉錄水平在太平洋玫瑰蘋果中幾乎檢測不到，同時在太平洋玫瑰蘋果果皮中，轉錄物是明顯的且MYB轉錄物的水平在一月時間點同生物合成酶具體相關并涉及UFGT。在紅地蘋果中，MdMYBlO的表達水平似乎大部分依照實驗的所述酶的轉錄模式，具有遍及水果組織的高度升高的水平，特別是在十一月時間點，然后再在一月、二月和三月時間點(圖4B)。同太平洋玫瑰蘋果相比，在紅地蘋果葉片中的轉錄物水平被相似地升高。結果同RT-PCR的結果相似(圖4A)并進一歩證實了特異性，qPCR擴增物被測序、分析并被發現編碼MdMYBlO。MdbHLH3和MdbHLH33的轉錄物水平似乎不依照在遍及發育系列和變種中的為生物合成基因或為MdBYBlO展示的具有更一致表達水平的模式(圖4B)。MdMYB8、MdMYB9和MdMYBll基因的轉錄物水平也被實驗但并未顯示同花青素酶轉錄物水平的相關模式(數據未顯示)。實施例6:MdMyblO在轉基因蘋果植物中的過表達產生升高的花青素生產稀辦論用標準技術生產的包含被花椰菜花葉病毒35S啟動子驅動的7k^My570cDNA的二元載體pSAK277-MiM7B70被通過本領域技術人員熟知的凍融法傳遞入根癌農桿菌菌株GV3101。轉基因家蘋果'皇家噶拉'植物被通過農桿菌介導的葉片碎片的轉化并通過使用先前報道的方法(Yao"a/.,1995)產生。用相等的空載體轉化的對照植物也以相同方式生產。結果被顯示在圖11中。高度著色的愈傷組織細胞在A(i)中顯示。A(ii)顯示了高度著色的35-5MymlO植物(左側)和用作對照的空載體對照植物(右側)。圖的B部分顯示了來源于35S-MdMyB10和對照植物的抽提物的花青素輪廓(按實施例5中描述的方法產生)。結果顯示，花青素色素的水平在35S-MdMYB10植物中明顯可檢測但在對照植物中檢測不到。蘋果組織在酸化甲醇中抽提并且峰在520nm從HPLC痕量中鑒定；cy-gal(cyaniding-3-半乳糖苷)、具有更痕量的cy-glu(cyaniding-3-葡糖苷)和cy-pent(cyaniding-3-戊糖苷)。上述提及的實施例不是為了限制本發明的范圍。如被本領域技術人員所理解的，在沒有離開本發明的范圍的許多變化是可能的。參考文獻AharoniA，DeVosCH，WeinM，SunZ，GrecoR，KroonA,MolJN，O，ConnellAP(2001)ThestrawberryFaMYBltranscriptionfactorsuppressesanthocyaninandflavonolaccumulationintransgenictobacco.PlantJ28:319-332BorevitzJO，XiaY,BlountJ，DixonRA，LambC(2000)ActivationtaggingidentifiesaconservedMYBregulatorofphenylpropanoidbiosynthesis.PlantCell12:2383-2394BossPK，DaviesC，RobinsonSP(1996).Expressionofanthocyaninbiosynthesispathwaygenesinredandwhitegrapes.PlantMolBiol32:565-569BoyerJ，LiuR(2004)Applephytochemicalsandtheirhealthbenefits.NutritionJournal3:5Brooks，RM,OImo,H.P,(1972).RegisterofNewFruitandNutVarieties.UniversityofCaliforniaPress,London.BroimP(2005).Transcriptionalcontrolofflavonoidbiosynthesis:acomplexnetworkofconservedregulat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酸序列至少65%的同一性。3、權利要求1所述的分離多聚核苷酸，其中所述多肽具有SEQIDNO:1的氨基酸序列。4、權利要求1所述的分離多聚核苷酸，其中在a)中的序列具有同SEQIDNO:5-8、22-47和102的任何一種序列至少70%的同一性。5、權利要求1所述的分離多聚核苷酸，其中在a)中的序列具有同SEQIDNO:5-8、22-47和102的任何一種編碼序列至少70%的同一性。6、權利要求1所述的分離多聚核苷酸，其中在a)中的序列具有同SEQIDNO:5的序列至少70%的同一性。7、權利要求1所述的分離多聚核苷酸，其中在a)中的序列具有同SEQIDNO:5的編碼序列至少70%的同一性。8、權利要求1所述的分離多聚核苷酸，其中在a)中的序列具有SEQIDNO:5的序列。9、權利要求1所述的分離多聚核苷酸，其中在a)中的序列具有SEQIDNO:5的編碼序列。10、分離的多聚核苷酸，其包含a)具有同SEQIDNO:5-8和22-47和102的任何一種核苷酸序列至少70%同一性的序列，其中所述序列編碼能調控植物中花青素生產的轉錄因子；b)具有長度至少為a)的序列的15個核苷酸的片段；c)a)的序列的互補序列d)b)的序列的互補序列e)能同a)的序列在嚴格條件下雜交的至少長15個核苷酸的序列。11、權利要求10所述的分離多聚核苷酸，其中在a)中的序列具有同SEQIDNO:5的序列至少70%的同一性。12、權利要求IO所述的分離多聚核苷酸，其中在a)中的序列具有同SEQIDNO:5的編碼序列至少70%的同一性。13、權利要求IO所述的分離多聚核苷酸，其中在a)中的序列具有SEQIDNO:5的序列。14、權利要求10所述的分離多聚核苷酸，其中在a)中的序列具有SEQIDNO:5的編碼序列。15、分離的多聚核苷酸，其包含a)編碼具有同SEQIDNO:1-4和9-21的任何一種氨基酸序列至少65%同一性的多肽的序列，其中所述多肽是能調控在花青素生物合成途徑中的基因的啟動子的轉錄因子；b)具有長度至少為a)的序列的15個核苷酸的片段；c)a)的序列的互補序列d)b)的序列的互補序列e)能同a)的序列在嚴格條件下雜交的至少長15個核苷酸的序列。16、分離的多聚核苷酸，其包含a)具有同SEQIDNO:5-8、22-47和102的任何一種核苷酸序列至少70%同一性的序列，其中所述序列編碼能調控在花青素生物合成途徑中的基因的啟動子的轉錄因子；b)具有長度至少為a)的序列的15個核苷酸的片段；c)a)的序列的互補序列d)b)的序列的互補序列e)能同a)的序列在嚴格條件下雜交的至少長15個核苷酸的序列。17、權利要求15或(of)16的多聚核苷酸，其中將被調控的基因編碼二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)。18、權利要求15或(of)16的多聚核苷酸，其中將被調控的基因編碼查耳酮合成酶(CHS)。19、分離的多聚核苷酸，其包含a)編碼SEQIDNO:1和9-21的任何一種氨基酸序列的多肽變種的序列，其中所述多肽是能調控植物中花青素生產的轉錄因子，并且其中所述多肽變種包含SEQIDNO:101的序列；b)具有長度至少為a)的序列的15個核苷酸的片段；c)a)的序列的互補序列d)b)的序列的互補序列e)能同a)的序列在嚴格條件下雜交的至少長15個核苷酸的序列。20、分離的多肽，其包含a)具有同選自SEQIDNO:1-4和9-21的任何一種的氨基酸序列至少65%同一性的序列，其中所述多肽是能調控植物中花青素生產的轉錄因子。21、權利要求20所述的分離多肽，其中在a)中的序列具有同SEQIDNO:1的氨基酸序列至少65%的序列同一性。22、權利要求20所述的分離多肽，其中在a)中的序列具有SEQIDNO:1的序列。23、編碼權利要求20到22的任何一項的多肽的分離多聚核苷酸。24、抗權利要求20到22的任何一項的多肽的抗體。25、包含權利要求1到19的任何一項的多聚核苷酸的遺傳構建物。26、包含權利要求25的遺傳構建物的載體。27、包含權利要求25的遺傳構建物的宿主細胞。28、被遺傳修飾來表達權利要求1到19的任何一項的多聚核苷酸的宿主細胞。29、包含權利要求25的遺傳構建物的植物細胞。30、被遺傳修飾來表達權利要求1到19的任何一項的多聚核苷酸的植物細胞。31、包含權利要求29或30的植物細胞的植物。32、生產權利要求20到22的任何一項的多肽的方法，所述方法包含培養包含權利要求25的遺傳構建物的宿主細胞。33、生產具有改變的花青素生產的植物細胞或植物的方法，所述方法包含用遺傳構建物轉化植物細胞或植物的歩驟，其包括a)至少一種編碼權利要求20到22的任何一項的多肽的多聚核苷酸；b)至少一種包含a)的多聚核苷酸的至少15個核苷酸長度的片段的多聚核苷酸；或c)至少一種包含a)的多聚核苷酸的至少15個核苷酸長度的互補序列的多聚核苷酸。34、生產具有改變的花青素生產的植物細胞或植物的方法，所述方法包含用遺傳構建物轉化植物細胞或植物的步驟，其包括a)至少一種權利要求1到19的任何一項的多肽；b)至少一種包含a)的多聚核苷酸的至少15個核苷酸長度的片段的多聚核苷酸，或c)至少一種包含a)的多聚核苷酸的至少15個核苷酸長度的互補序列的多聚核苷酸d)至少一種能在嚴格條件下同a)或b)的多聚核苷酸雜交的多聚核苷酸。35、通過權利要求33或34的方法生產的植物。36、選擇花青素生產發生改變的植物的方法，所述方法包含檢測植物的權利要求1到19的任何一項的多聚核苷酸改變的表達。37、選擇花青素生產發生改變的植物的方法，所述方法包含檢測植物的權利要求20到22的任何一項的多肽改變的表達。38、選擇已經被轉化的植物細胞或植物的方法，所述方法包含步驟a)用權利要求1到19的任何一項的編碼能調控植物中花青素生產的多肽的多聚核苷酸轉化植物細胞或植物；b)在植物細胞或植物中表達所述多肽；和c)選擇具有相對于其他植物細胞或植物而言增加的花青素著色的植物細胞或植物，其中所述增加的花青素著色表明所述植物細胞或植物已經被轉化。39、被權利要求36到38的任何一項的方法選擇的植物。40、權利要求38的植物的植物部分、繁殖體、后代或種子。全文摘要本發明涉及編碼能調控植物中花青素生產的新轉錄因子的多聚核苷酸和被編碼的能調控植物中花青素生產的轉錄因子。本發明也涉及包含所述多聚核苷酸的構建物和載體，和宿主細胞、植物細胞和用所述多聚核苷酸、構建物和載體轉化的植物。本發明也涉及生產具有改變的花青素生產的植物的方法和通過該方法獲得的植物。文檔編號C12N15/29GK101258245SQ200680031628公開日2008年9月3日申請日期2006年8月30日優先權日2005年8月30日發明者A·阿蘭,R·埃斯普利,R·海倫斯申請人:新西蘭園藝和食品研究院有限公司