專利名稱：：產生l-谷氨酸的細菌和用于產生l-谷氨酸的方法
技術領域：
：本發明涉及發酵工業，并且本發明涉及使用棒狀桿菌型細菌(coryneformbacterium)有效產生L-谷氨酸的方法。
背景技術：
：通常使用具有產生L-谷氨酸的能力的屬于短桿菌屬O^W^cfeWwm)或棒桿菌屬(Cwy"eZ^c&n'Mm)等的棒狀桿菌型細菌通過發酵來產生L-谷氨酸。為了改進這些棒狀桿菌型細菌的生產力，使用從自然界分離的細菌菌抹，或它們的人工突變菌林或它們通過基因重組修飾的菌株。作為通過基因重組技術將產生L-谷氨酸的能力改進的棒狀桿菌型細菌，迄今為止已經開發的是將谷氨酸脫氫酶活性、檸檬酸合酶活性和丙酮酸羧化酶活性增強的^f奉狀桿菌型細菌(專利文獻l)，將a-酮戊二酸脫氫酶活性、或a-酮戊二酸脫氫酶和異檸檬酸裂合酶活性降低的棒狀桿菌型細菌(專利文獻2和3)等。同時，谷氨酸才奉斥干菌(Coo^e^c&n'MWg/wtom/cww)染色體的完整核苦酸序列已經測定(非專利文獻1)。然而，其3099個推定的orf中的大約40%與功能已知的其它微生物的基因顯示低同源性，其編碼功能未知的蛋白質，并且缺失這些基因的影響至今未知。專利文獻1:InternationalPatentPublicationWO00/18935專利文獻2:InternationalPatentPublicationW095/34672專利文獻3:JapanesePatentLaid-open(KOKAI,JP畫A)No.01-296994非專利文獻1:Appl.Microbiol.Biotechnol"62(2-3),pp.99-109(2003)
發明內容本發明的目的是提供將產生L-谷氨酸的能力改進的棒狀桿菌型細菌，和提供使用這種細菌有效產生L-谷氨酸的方法。本發明的發明人為了達到上述目的進行了多方面研究。結果，他們發現如果在棒狀桿菌型細菌中將g/wX基因失活，能夠改進該細菌產生L-谷氨酸的能力，并且由此完成了本發明。即，本發明提供以下各項。(1)具有產生L-谷氨酸的能力的棒狀桿菌型細菌，對所述棒狀桿菌型細菌進行修飾以使g/wZ基因失活。(2)根據(1)的棒狀桿菌型細菌，通過將突變引入染色體上的g/wX基因或其表達調控區來修飾所述棒狀桿菌型細菌，以使g/wZ基因的表達量降低。(3)根據(1)或(2)的棒狀桿菌型細菌，其中將染色體上的g/"X基因破壞。(4)用于產生L-谷氨酸的方法，所述方法包括在培養基中培養根據(1)-(3)任一項的棒狀桿菌型細菌以產生和積累L-谷氨酸；和從所述培養基中收集L-谷氨酸。附圖簡述圖1:顯示質粒pBS3的構建方法的圖示。圖2:顯示質粒pBS4S的構建方法的圖示。圖3:顯示用于破壞g/wZ的質粒pBXGXD的構建方法的圖示。優選實施方式描述在下文中，將詳細說明本發明的實施方式。<1>本發明的棒狀桿菌型細菌用于本發明的棒狀桿菌型細菌包括棒桿菌屬細菌，和曾經歸類于短桿菌屬，但是已經重新歸類于棒桿菌屬的那些細菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1981)),并且進一步包括屬于極其接近棒桿菌屬的短桿菌屬的細菌。具體實例包括以下p者乙醜乙酉吏才奉斥干菌(CV7we6acfen.wwace^acz.<iop/n7Mm)醋谷才奉4干菌(Cor_yMe6acfer/t/wacetog7wtamz'cww)坑醇棒軒菌(Co^yweZacte"'wwa/^awo/,'cww)美棒軒菌(Cwy"e6acfen-畫ca〃ww—谷氨酸棒桿菌百合花棒軒菌(Co/^"e^c欣z'畫朋簡)棲糖蜜棒軒菌(Cc^"e6ac敏/MWme/aweco/a)p者產氛才奉^干菌(C"o^ywe6ac/gn.Mw^^7wo"mz'"oge"es)力士棒軒菌(Cc^"eZacm-廳/ze/rwfo)二:t支-豆^干菌(5;-ev/6acfen'ww(i/van'ca加w)黃色短軒菌(8rev/6ac妙/謂y/av畫)吝'L發酵4豆4干菌(5rev沾acfeWM附/actoy^附e"ftw2)(谷氨酉交才奉4干菌)玫瑰色短軒菌(&evAfl"en.畫msew附)解糖短軒菌(5rev/6ac妙/wwsacc/zara一c訓)生石克短軒菌(5reW6ac敏/謂A/oge"/tofc)產氛短桿菌(5wvz'6"c/m'w附"mmo"/age"as)白色少豆沖干菌(B;-eW6acfer/wwa/6ww)錯狀短軒菌(5rev/Z)acto^w7ce".w訓)p耆氨4敖4干菌(Af/cro6ac&n'ww"m附ow/a//w7i/m)具體而言，可包括以下菌林嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870醋谷才奉桿菌ATCC15806烷醇棒桿菌ATCC21511美棒桿菌ATCC15991谷氨酸棒桿菌ATCC13020、ATCC13032、ATCC13060、ATCC13869百合花棒桿菌ATCC15990棲糖蜜棒桿菌ATCC17965嗜熱產氨棒桿菌AJ12340(FERMBP-1539)力士棒桿菌ATCC13868二歧短桿菌ATCC14020黃色短桿菌ATCC13826、ATCC14067、AJ12418(FERMBP-2205)5rev/Zac/en'wm/7附0"'0/>/2//讓ATCC14068乳發酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13869玫3鬼色短桿菌ATCC13825解糖短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240產氨短桿菌ATCC6871、ATCC6872白色短桿菌ATCC15111蠟狀短4干菌ATCC15112嗜氨微桿菌ATCC15354這些菌株可從美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)獲得。即，給予每個菌抹登記號。使用該登記號能夠訂購菌抹。對應于各菌抹的登記號列于ATCC的目錄。根據布達佩斯條約(BudapestTreaty)的規定，將AJ12340菌抹于1989年10月27日保藏在通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(NationalInstituteofBioscienceandHumanTechnology,AgencyofIndustrialScienceandTechnology,MinistryofinternationalTradeandIndustry)(目前為，獨立行政法人產業技術綜合研究所特許微生物保藏中心(InternationalPatentOrganismDepositary,NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology),^f立于TsukubaCentral6，1-1，Higashil-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305-5466，Japan),并給予登錄號FERMBP-1539。根據布達佩斯條約的規定，將AJ12418菌株于1989年1月5日保藏在通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所，并給予登錄號FERMBP-2205。在本發明中，"產生L-谷氨酸的能力"的意思是當在培養基中培養本發明的棒狀桿菌型細菌時，在培養基中積累L-谷氨酸的能力。本發明的細菌可能具有這種產生L-谷氨酸的能力作為所述棒狀桿菌型細菌野生菌抹的特性，或所述能力可能是通過培育賦予的性質。此外，可以通過下文描述的方式來修飾細菌以使g/wX失活來賦予產生L-谷氨酸的能力。為了通過培育來賦予產生L-谷氨酸的能力，可以使用通常用于培育棒狀桿菌型細菌的方法，例如，用于獲得代謝調節突變菌抹、構建將目標物質生物合成系統中的酶增強的重組菌林(參考"AminoAcidFermentation",theJapanScientificSocietiesPress[GakkaiShuppanCenter],1stEdition,publishedonMay30,1986，pp.77-100)等的那些方法。在那些方法中，有待賦予的代謝調節突變，或目標物質合成系統酶的增強等可以單獨賦予或進行，或者可以將它們中的兩個或更多個組合賦予。可以將代謝調節突變的賦予和生物合成系統酶的增強進行組合。在下文中，將描述用于賦予產生L-谷氨酸的能力的方法。用于通過培育來賦予產生L-谷氨酸能力的方法的實例包括增強基因的表達，所述基因編碼涉及L-谷氨酸生物合成的酶。涉及L-谷氨酸生物合成的酶的實例包括谷氨酸脫氬酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、異檸檬酸脫氫酶、烏頭酸水合酶、檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構酶、果糖二磷酸醛縮酶、磷酸果糖激酶、葡糖磷酸異構酶等。增強這些基因的表達能夠通過以下方法完成引入擴增質粒，通過在適合的質粒中引入含有這些基因中任一的DNA片段來獲得所述質粒，例如，含有至少負責質粒在棒狀桿菌型細菌中復制的基因的質粒載體；通過接合、基因轉移等增加這些基因在染色體中的拷貝數；將突變引入這些基因的啟動子區；或將啟動子用更強的啟動子替代(參考InternationalPatentPublicationWO00/18935)。當擴增質粒或染色體中的基因時，用于基因表達的啟動子可以是任何啟動子，只要選擇在棒狀桿菌型細菌中發揮功能的啟動子，而且可為所使用的基因的固有啟動子。還能夠通過適當地選擇啟動子來控制基因的表達量。經修飾以使檸檬S吏合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、谷氨酸脫氫酶基因和/或異檸檬酸脫氫酶基因的表達增強的棒狀桿菌型細菌的實例包括InternationalPatentPublicationWO00/18935和EuropeanPatentPublicationNo.1010755中描述的微生物。此外，也可以通過降低或缺失下述酶的活性來獲得賦予產生L-谷氨酸的能力的修飾，所述酶催化從L-谷氨酸生物合成途徑分支的反應以產生另外的化合物。催化合成除L-谷氨酸以外化合物的反應的酶的實例包括異檸檬酸裂合酶、a-酮戊二酸脫氫酶、乙酰磷酸轉移酶、乙酸激酶、乙酰羥酸合酶、乙酰乳酸合酶、乙酰曱酸轉移酶、乳酸脫氫酶、谷氨酸脫羧酶、l-吡咯啉脫氫酶(l-pyrrolinedehydrogenase)等。為了降低或缺失上述酶中任一種的活性，可以通過常規誘變方法，將降低或缺失所述酶胞內活性的突變引入染色體上前述酶的基因中。例如，其能夠通過缺失染色體上編碼所述酶的基因，或通過基因重組修飾表達調控序列如啟動子、Shine-Dalgamo(SD)序列、操縱基因、終止子和弱化子來實現。此外，其能夠通過引入氨基酸取代的突變ei晉義突變)、終止密碼子(無義突變)或在染色體上的酶編碼區中添加或缺失一個或兩個核苷酸的移碼突變來實現，或通過將基因部分或整體地缺失來實現(JoumalofBiologicalChemistry,272:8611-8617(1997))。此外，還能夠通過構建編碼突變酶的基因來使酶活性降低或缺失，其中將編碼區缺失，并且通過同源重組等用構建的基因取代染色體上的正常基因。a-酮戊二酸脫氫酶活性降低的棒狀桿菌型細菌的實例包括以下菌才朱，其在JapanesePatentLaid-openNos.07-834672、06-237779、01-296994等中描述。乳發酵短桿菌AS菌抹(W095/34672)乳發酵短桿菌AJ12821菌抹(FERMBP-4172;參見FR9401748)黃色短桿菌AJ12822菌林(FERMBP-4173;參見FR9401748)谷氨酸棒桿菌AJ12823菌株(FERMBP-4174;參見FR9401748)賦予產生L-谷氨酸的能力的其它方法包括賦予對有機酸類似物或呼吸抑制劑的抗性，或賦予對細胞壁合成抑制劑的敏感性。這些方法的實例包括，例如賦予只于苯并p比喃酮(benzopirone)或萘醌類(naphtoquinones)的抗性(JP56-1889A)，賦予對HOQNO的抗性(JP56-140895A),賦予對a-酮丙二酸的抗性(JP57-2689A),賦予對胍的抗性(JP56-35981A)，賦予對青霉素的敏感性(JP04國88994A)等。這些細菌的實例包括以下菌抹黃色短桿菌AJ11355(FERMP-5007;JP56-1889A)谷氨酸棒桿菌AJ11368(FE函P-5020;JP56-1889A)黃色短桿菌AJ11217(FERMP-4318;JP57-2689A)谷氨酸棒桿菌AJ11218(FERMP-4319;JP57-2689A)黃色短桿菌AJ11564(FERMP-5472;JP56-140895A)黃色短桿菌AJ11439(FERMP-5136;JP56-35981A)谷氨酸棒桿菌H7684(FERMBP-3004;JP04-88994A)本發明的棒狀桿菌型細菌獲得自親本菌抹，所述親本菌抹也可以是在誘導L-谷氨酸產生的條件下產生L-谷氨酸的棒狀桿菌型細菌，所述條件如限制生物素的條件、添加表面活性劑的條件和添加青霉素的條件(為了方便，在下文中稱作"產生L-谷氨酸的條件")。"產生L-谷氨酸的條件"意指將誘導L-谷氨酸產生的物質添加至培養基的條件，所述培養基含有碳源、氮源、無機鹽和痕量有機營養物，例如氨基酸和維生素(如有需要)；和對培養基中抑制L-谷氨酸產生的物質的量進行限制的條件。誘導L-谷氨酸產生的物質包括抗生素如青霉素G和包括飽和脂肪酸的表面活性劑如Tween40、60等。抑制L-谷氛酸產生的物質包括生物素(AminoAcidFermentation,JapanScientificSocietiesPress1986)。在本文中，在產生L-谷氨酸的條件下培養基中以上物質的濃度如下。生物素的濃度少于30(xg/L，優選少于20[ig/L,更優選少于10jig/L，并且所述培養基可以完全不含生物素。培養基中青霉素的濃度不少于0.1U/ml，優選不少于0.2U/ml,更優選不少于0.4U/ml。培養基中表面活性劑的濃度不少于0.5g/L，優選不少于lg/L,更優選不少f2g/L。然而，只要誘導L-谷氨酸的產生，這些物質的任何濃度均可以應用。此外，當培養基含有抗生素或表面活性劑時，優選所述培養基含有高濃度的生物素。在這種情況下，優選所述培養基含有多于50jig/L，優選多于100pg/L,更優選多于200嗎/L的生物素。本發明中使用的親本菌林的實例包括上述的棒狀桿菌型細菌的野生型菌才朱，或以下菌才朱黃色短桿菌AJ11217(FERMP-4318;JP57-2689A)谷氨酸棒桿菌AJ11218(FERMP國4319;JP57-2689A)乳發酵短桿菌AJ11426(FERMP-5123JP56-048890A)谷氨酸棒桿菌AJ11440(FERMP-5137JP56-048890A)乳發酵短桿菌AJ11796(FERMP-6402JP58-158192A)本發明的棒狀桿菌型細菌是具有前文所述的產生L-谷氨酸的能力的棒狀桿菌型細菌，并且經修飾以使g/wZ基因失活。能夠通過修飾具有產生L-谷氨酸的能力的棒狀桿菌型細菌以使g/wX基因失活來獲得本發明的棒狀桿菌型細菌。在本發明的棒狀桿菌型細菌的培育中，既可以首先進行產生L-谷氨酸能力的賦予，也可以首先進行使g/wX基因失活的修飾。表述"修飾以使g/MX基因失活"相應于下述情況與親本菌抹或野生型菌抹相比，由g/^Z基因編碼的GluX蛋白的每細胞分子數降低；每分子GluX蛋白的活性降低；完全不再產生GluX蛋白分子等。例如，該表述意指與未修飾的菌抹或野生型菌抹相比，由g/wZ基因編碼的蛋白質的量降低；g/wl基因的表達量降低；對所述蛋白質的三維結構進行修飾，并且由此不能產生正常的GluX蛋白；或完全不能產生棒狀桿菌型細菌的野生型菌抹或未修飾菌林能夠產生的GluX蛋白。作為參照用于比較的野生型棒狀桿菌型細菌是例如谷氨酸棒桿菌(乳發酵短桿菌)ATCC13869或ATCC13032。能夠通過與野生型或未經修飾的菌抹比較g/wX的mRNA量來確認g/wX基因表達量的降低。用于確認表達量的方法的實例包括Northem雜交和RT-PCR(MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(USA)2001)。只要與野生型菌株或未修飾菌林相比有所降低，不對表達量的降低程度作具體限制。然而，期望與野生菌株或未修飾菌林相比降低例如至少75%、50%、25%或10%或更少，或可以將表達完全消除。能夠通過基于使用抗體的Western印跡的檢測來確認由g/wJT基因編碼的蛋白質的量的P爭j氐(MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(USA)，2001)。只要與野生型菌抹或未修飾菌林相比有所降低，不對產量的降低程度作具體限制。然而，期望與野生菌株或未修飾菌林相比降低例如至少75%、50%、25%或10%或更少，或可以將活性完全消除，其意味著完全不產生所述蛋白質。由g/wX基因編碼的本發明所指的蛋白質(GluX蛋白)是通過失活染色體上的g/MZ基因而具有改進L-谷氨酸產量的功能的蛋白質。在本文中，棒狀桿菌型細菌的GluX蛋白的實例包括由谷氨酸棒桿菌(乳發酵短桿菌)ATCC13869或谷氨酸棒桿菌ATCC13032的g/wZ基因(SEQIDNO:16的核苷酸號1001至1279)編碼的蛋白質(SEQIDNO:17)。谷氨酸棒桿菌ATCC13032的g/wX基因由登記為GenbankAccessionNo.NC—003450的基因組序列的核香酸2475838至2476119編碼，并且登記為NCg12252。此外，因為g/^X基因的核苷酸序列可能依賴于棒狀桿菌型細菌的菌種或菌林而有差異，g/wZ基因可以是SEQIDNO:16的核苷酸號1001至1279的核香酸序列的變體。參照SEQIDNO:16的核苷酸號1001至1279的核苷酸序列，4吏用BLAST或類似方法(http://blast.genome.jp/),能夠搜索g/wX基因的變體。此外，g/wX基因的變體包括g/wZ基因同源物(homologue)，例如，能夠使用棒狀桿菌型細菌的染色體作為模板和SEQIDNOS:13和14的合成寡核苷酸通過PCR擴增的基因。GluX蛋白的實例包括具有SEQIDNO:17的氨基酸序列的那些。然而，因為使用的密碼子可能依賴于棒狀桿菌型的菌種或菌抹而有差異，并且所述編碼GluX的基因的核苷酸序列可能有差異，g/wZ可以編碼包括取代、缺失、插入或添加一個或幾個氨基酸殘基的如上所述的氨基S臾序列，只要不改變GluX蛋白的功能。在本文中，術語"幾個"所指的數目是例如2至20，優選2至10，更優選2至5。前述取代、缺失、插入或添加一個或幾個氨基酸殘基是保守突變，所述保守突變允許正常產生GluX蛋白。保守突變包括在芳族氨基酸的情況下Phe、Trp和Tyr的相互取代；在疏水氨基酸的情況下Leu、Ile和Val的相互取代；在極性氨基酸的情況下Gln和Asn的相互取代；在堿性氨基酸的情況下Arg、Lys和His的相互取代；在酸性氨基酸的情況下Asp和Glu的相互取代；和在含羥基氨基酸的情況下Ser和Thr的相互取代。典型的保守突變是保守取代，所述保守取代包括以Ser或Thr取代Ala,以Gln、His或Lys取代Arg，以Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn,以Asn、Glu或Gln耳又代Asp，以Ser或Ala取代Cys,以Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg耳又代Gln，以Gly、Asn、Gln、Lys或Asp耳又代Glu,以Pro耳又代Gly，以Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr耳又代His,以Leu、Met、Val或Phe取代Ile，以Ile、Met、Val、Phe取代Leu,以Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，以Ile、Leu、Val或Phe取代Met，以Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，以Thr或Ala耳又代Ser，以Ser或Ala取代Thr，以Phe或Tyr取代Trp，以His、Phe或Trp取代Tyr和以Met、Ile或Leu取代Val。g/wZ基因的變體還可以是能夠與由SEQIDNO:16的1001至1279組成的核苷酸序列或能夠從所述核芬酸序列制備的探針在嚴緊條件下雜交的DNA。所述"嚴緊條件"是形成所謂的特異性雜合體(hybrid),而不形成非特異性雜合體的條件。嚴緊條件的實例包括那些條件，在該條件下高度同源的DNA互相雜交，例如，不少于80、90、95或97。/。同源的DNA相互雜交，并且比以上所述同源性^^的DNA不相互雜交；或在相應于常^見Southem雜交洗滌的鹽濃度和溫度下，即lxSSC、0.10/。SDS在60。C,優選O.lxSSC、0.1%SDS在60。C，更優選0.1xSSC、0.1%SDS在68。C洗滌一次或優選2或3次。4笨針的長度可以依賴于雜交條件任意地選擇。但是，所述長度通常是100bps至lkbps。表述"修飾以使g/wZ基因失活"的意思是進行修飾以使GluX蛋白不發揮正常功能。以這種方式修飾的細菌能夠通過培育以下細菌獲得使用試劑等將突變引入GluX蛋白中以使所述蛋白質不正常發揮功能的細菌；通過基因工程技術等將突變引入g/MZ基因中以使GluX蛋白的量降低的細菌；或不再產生GluX蛋白的細菌等。這可以通過例如缺失染色體上的g/wZ基因，或通過修飾表達調控序列例如啟動子、ShineDargarno(SD)序列等來完成。此外，所述修飾還可以通過引入氨基酸取代(錯義突變)、終止密碼子(無義突變)或在編碼區添加或缺失一個或兩個核苷酸的移碼突變，或通過缺失部分或完整的基因來完成(JoumalofbiologicalChemistry272:8611-8617(1997)，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,USA955511-5515(1998),JournalofBiologicalChemistry266,20833-20839(1991》。作為待缺失的區域，可以將N-末端側的區域或C-末端側的區域缺失，只要產生不正常發揮功能的GluX蛋白。此外，還能夠通過將轉座子引入g/wZ的編碼區來獲得g/wX基因的失活，所述轉座子攜帶抗生素抗性基因或對L-谷氨酸的產生有用的基因。能夠通過例如以下方法實現將如上所述的這些突變引入g/Ml基因制備通過修飾獲得的缺失型基因，所述修飾使基因包括部分g/^Z序列的缺失并且不產生正常發揮功能的GluX蛋白；和用含有所述基因的DNA轉化棒狀桿菌型細菌，以引起缺失型基因和染色體上基因的同源重組，并且因此破壞染色體上的g/wX基因。已經確定了這種基于同源重組使用基因取代的基因破壞，并且這種方法的實例包4舌DatsenkoandWanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000，Vol.97，No.12,pp.6640-6645)開發的稱為"Red-driven整合"的使用線性DNA的方法，或使用含有溫度每文感復制起點的質粒的方法(U.S.PatentNo.6,303,383，JapanesePatentLaid-openNo.05-007491)等。此外，這種如上所述使用同源重組基于基因取代的基因破壞還能夠使用質粒進行，所述質粒在宿主中不顯示復制能力，或所述質粒能夠接合轉移至棒狀桿菌型細菌。用于^f奉狀桿菌型細菌的溫度專丈感質粒的實例包括p48K和pSFKT2(對于這些參見JapanesePatentLaid-openNo.2000-262288),pHSC4(參見FrenchPatentLaid-openNo.2667875,1992andJapanesePatentLaid-openNo.5-7491)等。在棒狀桿菌型細菌中，這些質粒能夠在至少25。C自主復制，但是不能在37。C自主復制。將含有pHSC4的大腸桿菌AJ12571于1990年10月11日保藏在國立生命科學和人體技術研究所(theNationalInstituteofBioscienceandHuman-Technology,theAgencyofIndustrialScienceandTechnology,theMinistryofInternationalTradeandIndustry)(目前為，獨立行政法人產業技術綜合研究所特許《鼓生物保藏中心(TsukubaCentral6,1-1,Higashi1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,Japan,郵編305-5466))，并得到保藏號FERMP-ll763。然后根據布達佩斯條約的規定，在1991年8月26日將所述保藏轉化為國際保藏，并得到保藏號FERMBP-3524。作為不在棒狀桿菌型細菌中復制的質粒，優選在大腸桿菌中能夠復制的質粒，實例包括pHSG299(TakaraBioInc.)、pHSG399(TakaraBioInc.)等。能夠接合轉移的質粒的實例包括pK19mobsacB(J.Bacteriology,174:5462-65(1992))。經修飾而不產生GluX蛋白的缺失型基因的實例包括包括SEQIDNO:16的整體或部分區域缺失的基因；引入錯義突變的基因；插入轉座子或標記基因的基因；引入無義突變的基因；和引入移碼突變的基因；但是實例不限于這些基因。g/wX基因的失活可以通過以下方法進行。g/wZ基因的缺失型基因能夠通過以下方法獲得。g/t/X基因能夠如下獲得通過SaitoandMiura(參見H.SaitoandK.Miura，Biochem.Biophys.Acta,72,619(1963》TextforBioengineeringExperiments,EditedbytheSocietyforBioscienceandBioengineering,Japan,pp.97-98,Baifukan，1992)的方法，從棒狀桿菌型細菌制備染色體DNA;和使用寡核苷酸用所述染色體DNA進行PCR，所述寡核苷酸基于已知數據庫如Genbank的序列構建，并且能夠使用SEQIDNOS:13和14的合成寡核苦酸克隆基因。能夠通過如下獲得缺失型基因用PCR擴增全長g/wZ基因，并且用切割內部位點的限制酶消化PCR產物；或用PCR擴增g/wZ基因的編碼區部分。隨后，將缺失型基因引入棒狀桿菌型細菌中溫度敏感的質粒，或在棒狀桿菌型細菌中不能復制的質粒；并且用所述重組質粒轉化棒狀桿菌型細菌。轉化可以根據至今已經報導的方法進行。轉化方法的實例包括用氯化4丐處理受體細胞以增加DNA透過性，已有報導將該方法用于大腸桿菌K-12(Mandel，MandHiga,A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970》；和/人處于生長期的細月包制備感受態細胞，接著用DNA轉化，已有報導將該方法用于枯草芽孢桿菌C6adssw6"嗣(Duncan,C.H.,Wilson,GA.andYoung,F.E.,Gene,1,153(1977))。或者，也可以采用將重組DNA引入受體細胞，已有報導可將這種方法用于枯草芽孢桿菌、放線菌類和酵母的受體細胞(Chang,S.andChoen，S.N.,Molec.Gen.Genet.，168，111(1979);Bibb,M丄，Ward,J.M.andHopwood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hi畫n,A.,Hicks，J.B.andFink,GR.,Proc.Natl.Sci"USA,75，1929(1978))。此外，也能夠通過電脈沖方法進行棒狀桿菌型細菌的轉化(JP2-207791A)。當使用在棒狀桿菌型細菌中不復制的質粒進行轉化時，在如上所述獲得的轉化體中質粒上的g/wI基因和染色體上的g/^X基因進行重組。當使用溫度敏感質粒時，將轉化體在溫度敏感復制起點不發揮功能的溫度(25。C)培養以獲得引入所述質粒的菌林。將引入所述質粒的菌抹在高溫培養以消除溫度敏感質粒，并且將這種菌抹涂布在含有抗生素的平板上。由于溫度敏感質粒不能在高溫增殖，將質粒消除的菌林無法在含有抗生素的平板上生長，但是質粒上的g/wZ基因和染色體上的g/wZ基因重組的菌抹將出現，盡管這種菌株出現的概率極低。在如上所述染色體中引入了重組DNA的菌株中，引起與原先存在于染色體上的g/wJT基因序列的重組，并且因此在染色體中插入染色體g/wX基因和缺失型g/wZ基因的兩種融合基因，和所述融合基因之間的重組DNA的其它部分(載體部分、溫度每文感復制起點和藥物抗性標記)。然后為了在染色體DNA上只保留缺失型g/wX基因，將g/^Z基因與載體部分(包括溫度敏感復制起點和藥物抗性標記)一起從染色體DNA上消除。在這種情況下，將正常g/wZ基因保留在染色體DNA上，并且將缺失型g/wZ基因切除；或與之相反，將缺失型g/wZ基因保留在染色體DNA上，并且將正常g/wX基因切除。通過用PCR或Southem雜交來選擇將缺失型g/wX基因保留在染色體上的菌抹，能夠獲得將g/wZ基因破壞的菌抹。此外，在棒狀桿菌型細菌中發揮致死功能的編碼果聚糖蔗糖酶的MC^基因，也可以用作同源重組的標記(Schafer,A.etal.，Gene,145,pp.69-73(1994》。即，如果果聚糖蔗糖酶在棒狀桿菌型細菌中表達，由蔗糖同化產生的果聚糖發揮致死功能，因而所述細菌不能生長。因此，如果將編碼果聚糖蔗糖酶的載體保留在染色體上的菌林在含有蔗糖的平板中培養，所述菌抹不能生長，因此只有消除所述載體的菌林能夠在含有蔗糖的平板上選出。作為^cS基因或其同源基因，可以使用以下序列。枯草芽孢桿菌^c5GenBankAccessionNumberX02730(SEQIDNO:7)解5定4分芽孑包^干菌(5flc/〃wsam_y/o//《we々c/em):sacSGenBankAccessionNumberX52988運動發酵單胞菌(Z，owo"osmoM/力sacBGenBankAccessionNumberL33402嗜熱月旨肪芽孑包桿菌(5腦7/wsWewo/ZzemopM"":swr萬GenBankAccessionNumberU34874丄acto6腦7/wsa腦、ce服S:GenBankAccessionNumberAJ508391Jceto&"erxy/zV2紅/sx4GenBankAccessionNumberAB03415214G7wcowaceto6ac^d/azo/ra//z/c紅Zs<iv4GenBankAccessionNumberL41732除了前文所述的將染色體上編碼g/wX的基因缺失之外，還能夠通過引入通過修飾表達調控序列如啟動子、Shine-Dalgamo(SD)序列、操縱基因、終止Genetix,或用于表達分析的載體如啟動子探針載體，或基于已知信息如獲得自Genbank等的信息，能夠確定染色體上的表達調控序列。使g/^Z失活的突變是例如用較弱啟動子取代g/wZ啟動子區的突變，或使啟動子遠離共有序列的突變。使用溫度敏感質粒或不具有復制能力的質粒能夠實現這些突變的引入，如前文所述的情況。除了前文所述的基因操作方法之外，用于使g/wl失活的方法的實例包括，例如，用紫外照射或用于常規誘變的誘變劑如N-曱基-N，-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸處理棒狀桿菌型細菌，并且選擇g/wZ失活的菌抹。此外，還能夠通過用基于易錯PCR、DNA改組或SffiP-PCR(FirthAE,PatrickWM，Bioinformatics,2005Jun2,Statisticsofproteinlibraryconstruction)的基因重纟且人工將突變引入g/wX來獲得失活的g/wX基因。<3>使用本發明的棒狀桿菌型細菌產生L-谷氨酸能夠通過如下方法有效地產生L-谷氨酸在培養基中培養如上所述獲得的棒狀桿菌型細菌，以在培養基中產生和積累L-谷氨酸；和從所述培養基中收集L-谷氨酸。為了使用本發明的棒狀桿菌型細菌產生L-谷氨酸，可以通過常規方法使用普通培養基進行培養，所述普通培養基含有碳源、氮源、無機鹽和任選地有機微量營養物(micronutrients)如氨基酸和維生素。可以使用合成培養基或天然培養基。可以使用任何種類的碳源和氮源，只要它們能夠被所培養的菌林利用。糖類例如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物、糖蜜等可以用作碳源。另外，有機酸例如乙酸和檸檬酸，和醇例如乙醇也可以單獨使用或與其它碳源組合使用。氨、銨鹽例如硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨和醋酸銨、硝酸鹽等可以用作氮源。可將氨基酸、維生素、脂肪酸、核酸，和含有這些物質的胨、酪蛋白氨基酸(casaminoacid)、酵母提取物和大豆蛋白分解物用作有機樣i量營養物。當使用生長需要氨基酸等的營養缺陷型突變菌林時，優選加入這樣的所需的營養物。磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳鹽等可以用作無機鹽。通過將發酵溫度控制在20至45。C并且將培養基的pH調節至5-9來進行需氧培養。在培養期間當pH降低時，通過添加堿例如碳酸4丐或氨氣來中和培養基。培養大約10至大約120小時導致在培養基中積累可觀量的L-谷氨酸，其通過利用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產生。當用于本發明的棒狀桿菌型細菌是在誘導L-谷氨酸產生的條件如限制生物素的條件、添加表面活性劑的條件和添加青霉素的條件下產生L-谷氨酸的棒狀桿菌型細菌時，優選將培養基調節至這些L-谷氨酸產生條件中的任一。在本文中，以上物質在培養基中的濃度如下。生物素的濃度少于30嗎/L,優選少于20嗎/L，更優選少于10pg/L,并且所述培養基可以完全不含生物素。培養基中青霉素的濃度不少于O.lU/ml，優選不少于0.2U/ml，并且更優選不少于0.4U/ml。培養基中表面活性劑的濃度不少于0.5g/L，優選不少于lg/L，更優選不少于2g/L。然而，只要誘導L-谷氨酸的產生，這些物質的任何濃度均可應用。將抗生素或表面活性劑加入培養基時，優選所述培養基含有足夠量的生物素。在這種情況下，優選所述培養基含有多于50嗎/L,優選多于IOO嗎/L，并且更優選多于200嗎/L的生物素。此外，還能夠使用液體培養基以在培養基中使L-谷氨酸析出的方式進行培養，將所述液體培養基調節至L-谷氨酸在培養基中析出的條件。L-谷氨酸析出的條件的實例包括pH5.0-4.0，優選pH4.5至4.0,更優選pH4.3至4.0,特別優選pH4.0。在培養之后可以通過已知方法從培養基中收集L-谷氨酸。例如，通過從培養基中去除細胞，和通過濃縮引起結晶，通過離子交換層析等來完成收集。當在L-谷氨酸析出的條件下進行培養時，可通過離心或過濾來收集培養基中析出的L-谷氨酸。在這種情況下，可以將溶解在培養基中的L-谷氨酸析出然后一起分離。實施例在下文中，將參考以下實施例對本發明進行具體說明。然而，本發明不限于所述實施例。實施例l:用于破壞^c5基因的載體的構建(A)pBS3的構建使用枯草芽孢桿菌的染色體DNA作為模板和SEQIDNOS:l和2的寡核苦酸作為引物通過PCR獲得^W基因(SEQIDNO:7)。使用LATaq(TaKaRa)進行PCR,在94。C溫育5分鐘，并且將94。C變性30秒、49。C退火30秒和72。C延伸2分鐘的循環重復25次。將PCR產物以常規方式純化，然后通過用Sg/II和5amHI的消化來平端化。將這種片^a插入已經用爿vall切割并且平端化的pHSG299。使用這種DNA轉化大腸桿菌JM109的感受態細胞(TakamBioInc.)，并且將所述細胞涂布在含有25嗎/ml卡那霉素(以下簡寫為Km)的LB培養基上，培養過夜。其后，收集出現的菌落，并且分離獨立的單菌落以獲得轉化體。從所得轉化體提取質粒，并且將插入了目標PCR產物的質粒命名為pBS3。pBS3的構建方案示于圖l。(B)pBS4S的構建由于pBS3中存在的卡那霉素抗性基因中含有限制酶Smal的識別位點，通過交換PCR獲得攜帶6Vwal位點被破壞的卡那霉素抗性基因的質粒，所述破壞通過不引起氨基酸取代的核普酸取代進行。首先，使用pBS3作為模板和SEQIDNOS:3和4的合成DNA作為引物進行PCR以獲得卡那霉素抗性基因N末端側序列的擴增產物。然后，為了獲得Km抗性基因C末端側序列的擴增產物，使用pBS3作為模板和SEQIDNOS:5和6的合成DNA作為引物進行PCR。目標PCR產物能夠通過使用PyrobestDNA聚合酶(TakaraBioInc.)如下進行PCR來獲得在98。C溫育5分鐘，并且將98。C變性10秒、57。C退火30秒和72。C延伸1分鐘的循環重復25次。SEQIDNOS:4和5的序列彼此部分互補，并且曾經存在于這些序列中的5V^I位點已通過不引起氨基酸取代的核香酸取代破壞。其后，為了獲得將Smd位點破壞的突變卡那霉素抗性基因片段，將前述卡那霉素抗性基因的N末端側序列和C末端側序列的基因產物以基本上等摩爾地混合，并且使用這種混合物作為模板和SEQIDNOS:3和6的合成DNA作為引物進行PCR，以獲得引入了突變的Km抗性基因的擴增產物。能夠通過使用PyrobestDNAPolymerase(TakaraBioInc.)如下進行PCR來獲得PCR產物在98。C溫育5分鐘，并且將98。C變性10秒、57。C退火30秒和72。C延伸1.5分鐘的循環重復25次。將PCR產物以常規方式純化，然后用萬fl"II消化，并且插入上述pBS3的5a"II位點。用獲得的DNA轉化大腸桿菌JM109的感受態細胞(TakaraBioInc.),并且將細胞涂布在含有25嗎/ml卡那霉素的LB培養基上，并培養過夜。其后，將單菌落從出現的菌落中分離以獲得轉化體。從獲得的轉化體中提取質粒，并且將插入了目標PCR產物的質粒命名為pBS4S。pBS4S的構建方案示于圖2。實施例2:谷氨酸棒桿菌ATCC13869的g/wX缺陷型菌抹的制備制備用于缺失g/wX基因的質粒。使用BacterialGenomicDNAPurif.Kit(MSTechnoSystems)從谷氨酸棒桿菌ATCC13869提取染色體，并且使用這種染色體作為模板，以及SEQIDNOS:9和10的引物組合，和SEQIDNOS:11和12的引物組合，分別擴增大約650bp的片段。使用ExTaq(TakaraBioInc.)進行PCR，其中將94。C變性30秒、55。C退火30秒和72。C延伸1分鐘的循環重復25次。設計引物SEQIDNOS:9和10以擴增SEQIDNO:16的核香酸號401至1040的區域，并且設計引物SEQIDNOS:11和12以擴增SEQIDNO:16的核香酸號1241至1920的區域。其后，將這兩種片段混合制成溶液，使用這種溶液作為模板和SEQIDNOS:13和14的引物進行PCR以擴增大約1.3kb的片段。使用ExTaq(TakaraBioInc,)進行PCR,其中將94。C變性30秒、55。C退火10秒和72。C延伸1.5分鐘的循環重復25次。設計引物SEQIDNOS:13和14以將S"mHI序列添加至5，端，并且擴增SEQIDNO:16的核苦酸號441至1870的區域(包括核苷酸號1041至1240區域的缺失)。將擴增的片段用B"wHI完全消化，并且連接至已經相似地用SamHI完全消化的實施例1中所述的pBS4S載體(使用LigationKitVer.2(TakaraBioInc.)),以構建g/wX破壞的載體pBSGXD。構建方案示于圖3。將pBSGXD通過電脈沖方法(JapanesePatentLaid-openNo.2畫207791)引入谷氨酸棒桿菌ATCC13869，并且將細胞涂布在含有25嗎/ml卡那霉素的CM-Dex瓊脂培養基(5g/l葡萄糖、10g/l聚胨、10g/l酵母提取物、1g/lKH2P04、0.4g/lMgSO4.7H2O、0.01g/lFeS04.7H20、0.01g/1MnS04.4-5H20、3g/l尿素、1.2g/l大豆蛋白水解物、20g/l瓊脂，用NaOH調節至pH7.5)上。在31.5。C進行培養，然后通過PCR確認了生長的菌林是通過同源重組將pBSGXD并入染色體中的一次重組菌抹(onetime-recombinantstrain)。能夠使用菌抹的染色體作為模板，pBS4S上的特異性序列(SEQIDNO:15)和染色體上的序列(SEQIDNO:9)作為引物通過進行PCR來筒單地確認候選菌抹是否為一次重組菌林。由于pBS4S的序列不存在于非重組菌株的染色體上，PCR擴增的任何片段都不會出現于(appearfor)非重組菌林，由此能夠進行鑒別。將獲得的一次重組菌抹在含有25嗎/ml卡那霉素的CM-Dex液體培養基中在31.5。C培養一整天，并且將這種培養液適當地稀釋，再涂布至S10平板上(具有上述CM-Dex培養基的成分，其中將5g/l葡萄糖用100g/l蔗糖替換)。選擇了幾個在S10平板上生長并且表現出卡那霉素敏感性的菌株，并且使用這些菌抹的染色體作為才莫板和SEQIDNOS:13和14的序列作為引物進4亍PCR,確認了它們之中的一個菌抹是目標的g/MX缺陷型菌林。由于在缺陷型菌抹中缺失核苷酸號1041至1240的區域，所以擴增的片段短于非缺陷型菌抹的擴增片段，因此能夠進行鑒別。將如所述獲得的缺陷型菌抹命名為ATCC13869AgluX。實施例3:ATCC13869AgluX菌林的谷氨酸產量的測量通過使用Sakaguchi搖瓶進行培養來檢驗ATCC13869AgluX菌抹的谷氨酸產生能力。將ATCC13869和ATCC13869AgluX菌林在31.5。C在CM-2B瓊脂培養基(10g/l聚胨、5g/l酵母提取物、5g/lNaCl、10jig/l生物素、20g/l瓊脂，用KOH調節至pH7.0)上培養一整天，并且接種至20ml種子培養基(50g/l葡萄糖、30g/l硫酸銨、Ig/1KH2P04、0.4g/1MgS04'7H20、0.01g/1FeSO(7H20、0.01g/lMnS04'4-5H20、200昭/l維生素Bl、0.48g/l大豆蛋白水解物、300生物素，用KOH調節至pH8.0)中。將lg事先經過干熱滅菌的碳酸釣添加至培養基，其后在31.5。C以115rpm的速度搖動進行培養。在確認了全部糖被完全消耗之后，將lml種子培養液接種至20ml主培養基中(50g/l葡萄糖、30g/l硫酸銨、1g/1KH2P04、0.4g/1MgS04'7H20、0,01g/1FeS04.7H20、0.01g/1MnS04'4-5H20、200嗎/l維生素Bl、0.48g/l大豆蛋白水解物、300pg/l生物素，用KOH調節至pH8.0)，其后添加lg事先經過干熱滅菌的碳酸4丐，然后在31.5。C以115rpm的速率搖動進行培養。在開始培養2.5小時之后，添加4g/1Tween40(Sigma)。17.5小時后的細胞量(在620nm測量吸光度)、積累的谷氨酸量和殘余的糖量示于表l。確認了ATCC13869AgluX菌株的谷氨酸積累與ATCC13869相比有增加，并且由此確認了g/^Z基因的缺失對于改進谷氨酸產生有效。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>工業實用性根據本發明，在使用棒狀桿菌型細菌通過發酵產生L-谷氨酸的方法中能夠將L-谷氨酸的發酵收率(fermentationyield)增加。此外，本發明能夠用于培育產生L-谷氨酸的細菌。權利要求1.具有產生L-谷氨酸的能力的棒狀桿菌型細菌，對所述棒狀桿菌型細菌進行修飾以使gluX失活。2.根據權利要求1的棒狀桿菌型細菌，通過在染色體上的g/wX基因或其表達調控區中引入突變來修飾所述棒狀桿菌型細菌，以使g/^r基因的表達量降低。3.根據權利要求1或2的棒狀桿菌型細菌，其中將染色體上的所述g/^基因破壞。4.用于產生L-谷氨酸的方法，所述方法包括將根據權利要求l-3任一項的棒狀桿菌型細菌在培養基中培養以產生和積累L-谷氨酸，和從所述培養基中收集L-谷氨酸。全文摘要用于產生L-谷氨酸的方法，其包括在培養基中培養具有產生L-谷氨酸的能力并且經修飾以使gluX失活的棒狀桿菌型細菌，以在培養基或細胞中產生和積累L-谷氨酸；和從所述培養基中收集L-谷氨酸。文檔編號C12N1/21GK101248169SQ20068003115公開日2008年8月20日申請日期2006年8月23日優先權日2005年8月26日發明者中村純,伊藤久生,平野圣子申請人:味之素株式會社