減毒的sars以及作為疫苗的用途的制作方法

文檔序號：432398閱讀：775來源：國知局

專利名稱：減毒的sars以及作為疫苗的用途的制作方法
減毒的SARS以及作為疫苗的用途本發明涉及編碼減毒的SARS-CoV病毒的核酸，當與相同細胞培養物中的野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比時，所述減毒的 SARS-CoV病毒能夠在細胞培養物中產生的最大病毒滴度降低。技術背景涉及功能基因向細胞中的插入以實現治療效果的治療方法也被稱為基因治療方法，因為基因充當藥物。基因治療是一種主要用于矯正對疾病發展負責的缺陷基因的技術。也稱為載體的運載分子被用于遞送治療基因到患者的目標細胞。當前，最常見的載體是病毒，其已經被遺傳地改變來攜帶人類或動物a,、病毒是天然地進:的。然而r與此同時科i家利用了這種能力并操作病毒基因組來除去致病基因并插入治療基因。用病毒栽體感染目標細胞例如患者的肝臟或肺細胞。然后載體將它含有治療基因的遺傳物質卸載到目標細胞內。來自治療基因的功能性蛋白產物的產生使目標細胞恢復到標準狀態。在可選擇的方法中，這些病毒載體被用于表達異源基因，所述異源基因在接受該載體的受試者中引起免疫原性反應并因而免疫該受試者。在這種情況下，病毒載體充當疫苗。自從引起SARS的致病病原體被鑒定為新的冠狀病毒以來 (SARS-CoV;參見Drosten et al., 2003; Holmes and Enjuanes， 2003; Marraetal.，2003; Rota et al., 2003 )，冠狀病毒分子生物學的研究已經被給予了非常高的優先級，以開發預防和控制冠狀病毒感染的有效策略。冠狀病毒是ssRNA ( + )病毒，其具有迄今為止在RNA病毒中中發現的最大基因組，長度在25和31千堿基之間(kb,參見Siddell S.G., 1995, The Coronavindae )。當冠狀病毒感染細胞時，基因組RNA( gRNA ) 在細胞質中復制，產生正極性和負極性的一組亞基因組RNA ( sgRNA ) (Sethna et al., 1989; Sawicki & Sawicki, 1990s Van der Most & Spaan，1995;和Enjuanes, 2005 )。由于冠狀病毒在細胞質中復制的事實，暗示了冠狀病毒作為栽體用于基因治療和疫苗接種的用途。特別地，可以產生冠狀病毒的缺陷性干擾(DI)基因組。這些DI基因組是缺失突變，其需要補充病毒或輔助病毒的存在用于復制和/或轉錄(參見Chang et al., 1994; WO97/34008;西班牙專利申請P9600620; Izeta et al., 1999;和S 4 nchez etal., 1999 )。本領域使用各種系統來在接受組合物的動物中產生免疫反應，所述組合物含有DI基因組，所述基因組除其他之外含有編碼異源報告基因或來自不同傳染原的基因的序列(豬生殖和呼吸道疾病病毒， PRRSV;參見，Alonsoetal.，2002a，2002b)。冠狀病毒全長cDNA克隆的構建(Almaz d n et al.， 2000; Casais et al.,2001; Thiel et al.， 2001; Yount et al., 2000; Yount et al., 2002; Yount et al.， 2003 )提供了基因操作冠狀病毒基因組來研究基本病毒過程和開發表達栽體的機會。雖然SARS-CoV僅在2002年才出現，SARS-CoV分離物的基因組序列近來已經公開，并提供了關于SARS-CoV基因組的結構、系統發育和變異性的重要信息(Marraetal.,2003; Rota et al., 2003 ) 。 29.7-kb Urbam抹基因組的約三分之二編碼復制酶基因，其包含開放閱讀框Rep la和Rep lb,后一個通過核糖體的移碼來表達(Thiel et al., 2003 )。兩個ORF的翻譯引起兩個大的聚合蛋白的合成，其由病毒蛋白酶加工來產生復制酶-轉錄酶復合物(Ziebuhretal.， 2000)。另三分之一基因組包括編碼結構和非結構蛋白的基因組，順序是 5'-S-3a-3b-E-M-6-7a-7b-8a-8b-9b-N-3'。這些蛋白由不連續的轉錄過程來表達，其最可能在負鏈的合成期間發生，引起亞基因組mRNA的3' 共末端嵌套集的產生，每一個mRNA在其5'末端具有來自基因組5'端的脫帽的前導序列(Sawicki and Sawicki， 1998; Z她ga et al.， 2004 )。亞基因組反義RNA物質的合成由轉錄調節序列(TRS)來調節，轉錄調節序列包括在每個基因之前以及在前導序列的3'末端發現的高度保守的核心序列(Thieleta1.,2003 )。早先已經描述了 SARS-CoV Urbani抹的全長cDNA的制備(Yount et al.， 2003 ),其中它顯示了重組病毒復制與野生型病毒一樣有效。還描述了在桿狀病毒系統中通過病毒結構蛋白質M、 E和S的表達， SARS-CoV樣粒子的產生(Mortola & Roy， 2004)。顯示的是，S、 E 和M由單個重組病毒的高水平表達容許病毒顆粒樣粒子(VLP)的組裝和釋放。在SARS-CoV病毒顆粒包膜中，四種結構蛋白質，S、 E、 M和3a 被包埋到膜中。M和E蛋白是病毒組裝和發芽的關鍵因素(Fischer et al., 1998 )。實際上，這些蛋白在細胞系中的表達引起病毒樣粒子的產生(Baudoux et al., 1998; Ho et al., 2004; Huang et al.， 2004; Mortola & Roy， 2004; Vennema et al., 1996 )。早先已經研究了在不同的冠狀病毒中刪除群特定基因的效果。使用鼠肝炎病毒(MHV)作為模型的報告顯示了， ORF4、 5a、 2a和HE 的刪除在天然宿主中是減毒性的(de Haan et al., 2002 )。類似地，刪除TGEV的ORF 7 ( Ortego et al.， 2002 )以及貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)的ORF3abc和7ab (Haijemaeta1.,2004 )的研究引起病毒減毒。然而，其中一次一個地刪除ORF 3a、3b、6、7a和7b的其他SARS-CoV 缺失突變林不顯示體外復制(在組織培養中滴度不降低)和小鼠模型中的體內復制(沒有病毒的減毒)效力的顯著改變(Yount et 2005 )。這些缺失突變抹還沒有在其他動物模型中關于減毒表型的存在進行評估。KUOET AL. ( 2003 )報道了，缺乏整個基因4、 5a和E的4小鼠肝炎病毒(MHV)的E基因突變能夠組裝冠狀病毒樣粒子。然而，突變體中病毒顆粒組裝以比野生型中的病毒顆粒組裝數量級上更低的效率發生，結論是這種病毒突變體不是作為疫苗有用的。另一個團隊， Huang et al. ( 2004 ),通過檢查僅由少數SARS-CoV病毒基因但沒有遺傳物質構成的非傳染性VLP的形成，檢查了特定SARS-CoV基因對于病毒組裝的作用。根據他們的實驗，作者斷定，只要存在M和N蛋白，基因E對于VLP形成不是必需的。WO 04/092360公開了來自SARS冠狀病毒的核酸和蛋白，其可以用于疫苗制劑、診斷試劑和試劑盒的設備和制造。SARS-CoV在2002年晚期在人類中爆發，并在數月內從其在廣東 (中國)的起源傳播到超過30個國家。快速傳播和高死亡率使得 SARS-CoV成為全球性威脅，對于它沒有有效的治療。因而本發明的難題在于提供具有良好安全性和免疫原性的用于保護對抗SARS-CoV 的疫苗。發明概述這個難題現在通過編碼減毒SARS-CoV病毒的核酸解決了。根據本發明的一個方面，當與相同細胞培養物中的野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比時，所述減毒病毒能夠在細胞培養物中產生的最大病毒滴度降Y氐至少2的因數(reduced at least by a factor of 2 )。根據本發明的進一步的方面涉及編碼SARS-CoV病毒的核酸，其是通過包括步驟的方法可獲得的，其中SARS-CoV病毒的基因組通過修改編碼SARS-CoV E蛋白的基因的序列來修飾，使得該核酸不能表達功能性E蛋白。在本發明的上下文中，功能性E蛋白是一種蛋白，其-由SEQIDNO: 6編碼，或由與SEQIDNO: 6的序列具有至少 70%、優選的至少85%或至少95%的同源性的基因編碼；和 -能夠與其他SARS-CoV蛋白締合進入病毒包膜中。編碼如上所述修飾的E蛋白的核酸將產生在其包膜中不含有E蛋白的病毒顆粒。本發明進一步涉及編碼SARS-CoV病毒的核酸，其中所述核酸不編碼如上所迷的SARS-CoV病毒的功能性蛋白E的序列。根據這個實施方式，所述核酸可以編碼減毒的SARS-CoV病毒，并包含編碼病毒蛋白復制酶和S和M和N的序列。所述核酸可以含有其他SARS衍生的蛋白，例如3a蛋白。在本發明的一個方面，如上定義的核酸不含有任何其他SARS衍生的蛋白。所迷核酸優選地不能表達蛋白，所述蛋白由以下的編碼-SEQIDNO: 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19的任一個；或-與SEQ ID NO: 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19的序列具有至少 70%、優選的至少85%或至少95%的同源性的^[壬何序列。在可選擇的實施方式中，所述核酸優選的不能表達蛋白，所述蛋白由以下的編碼-SEQIDNO: 12、 13、 14、5、 16、 17、 18、 19的任一個；或-與SEQ ID NO: 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19的序列具有至少70%、優選的至少85%或至少95%的同源性的任何序列。根據本發明的這個方面，在一個優選的實施方式中，所述核酸僅編碼病毒蛋白復制酶和S和M和N。根據進一步的方面，本發明的核酸編碼SARS-CoV病毒，其中所述核酸包含病毒蛋白復制酶和S和M和N和/或E的序列。再一次，所述核酸可以含有其他SARS衍生的蛋白，例如，病毒蛋白3a的序列，但是優選的不含有以上定義的任何其他SARS衍生的蛋白。在本發明的優選的實施方式中，所述SARS-CoV病毒的核酸不編碼病毒蛋白6、 7a、 7b、 8a、 8b和9b。所述核酸可以是RNA或DNA。本發明進一步涉及包含上述核酸之一的宿主細胞和SARS-CoV病毒顆粒。例如，SARS-CoV病毒顆粒可以通過將上述核酸之一導入宿主細胞中來獲得。本發明進一步涉及疫苗，所述疫苗包含相應的SARS-CoV病毒顆粒或相應的核酸或相應的宿主細胞。在所述疫苗中，所述病毒顆粒可以以減毒的形式存在，即，復制感受態的和傳染性的形式，但也可以以鈍化的形式存在。根據病毒鈍化的公知方法使用熱或化學物質鈍化減毒病毒將進一步提高疫苗使用的安全性。所述疫苗可以進一步包含藥學上可接受的佐劑、載體或賦形劑。所述疫苗優選的用于接種哺乳動物，優選的人類，并產生免疫反應，所述免疫反應降低或消除由 SARS-CoV病毒感染引起的疾病癥狀。在本發明的另一個方面中涉及制備SARS-CoV疫苗的方法，包括通過修改編碼SARS-CoV蛋白的核酸來修飾包含SARS-CoV病毒基因組的核酸。在優選的實施方式中，所述制備SARS-CoV疫苗的方法，包括通過修改編碼SARS-CoV E蛋白的基因的序列使得該基因不表達功能性 E蛋白來修飾包含SARS-CoV病毒基因組的核酸。在進一步優選的實施方式中，所述方法進一步包括修改SARS-CoV 基因組的序列，使得所述核酸表達病毒蛋白復制酶、S、 M和N,并進一步表達或不表達編碼蛋白3a的序列。在另一個優選的實施方式中，所述方法進一步包括修改SARS-CoV 基因組的序列，使得所述核酸不能表達與SARS-CoV基因E、 6、 7a、7b、 8a、 8b和9b (相應于SEQIDNO: 6、 14到19 )編碼的蛋白質具有至少80%的同源性、優選的至少90%的同源性或至少95%的同源性的蛋白質。在本發明的又一個實施方式中，所述方法進一步包括修改 SARS-CoV基因組的序列，使得所述核酸不能表達與SARS-CoV基因 3a、 3b、 6、 7a、 7b、 8a和8b (相應于SEQ ID NO: 12到19)編碼的蛋白質具有至少80%的同源性、優選的至少90%的同源性或至少95% 的同源性的蛋白質。在另一個優選的實施方式中，所述方法進一步包括修改SARS-CoV 基因組的序列，使得所述核酸表達病毒蛋白復制酶、S、 M、 N和E，并進一步表達或不表達編碼蛋白3a的序列。根據另一個優選的實施方式，所述方法進一步包括修改SARS-CoV 基因組的序列，使得所述核酸不能表達與SARS-CoV基因6、 7a、 7b、 8a、 8b和9b (相應于SEQ ID NO: 14到19 )編碼的蛋白質具有至少 80%的同源性、優選的至少90%的同源性或至少95%的同源性的蛋白質。在又一個實施方式中，所述方法進一步包括修改SARS-CoV的基因組的序列，使得所迷核酸不能表達除了復制酶S、 M、 N和/或E以外的任何SARS-CoV衍生的蛋白質編碼序列，并且進一步表達或不表達編碼蛋白3a的序列。對于制備SARS-CoV疫苗，所述方法進一步包括向宿主細胞中導入所述修飾的核酸，并分離編碼所述修改的基因組的核酸或包含所述修飾的核酸的SARS-CoV病毒顆粒。所述制備SARS-CoV疫苗的方法進一步包括與藥學上可接受的佐劑、載體或賦形劑混合所述核酸的混合物或所迷SARS-CoV病毒顆粒的混合物在以下的詳細說明中，在實施例中和在權利要求中描述了本發明的進一步優選的實施方式。發明的詳細說明本發明涉及編碼減毒的SARS-CoV病毒的核酸和相應的病毒以及它們的醫學用途。所迷減毒病毒優選的能夠在細胞培養物中產生最大病毒滴度，當與相同細胞培養物中的野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比時，所述最大病毒滴度降低至少2的因數。在優選的實施方式中，所述減毒病毒能夠在細胞培養物中產生最大病毒滴度，所述最大病毒滴度降低至少5的因數、優選的至少10或20的因數。在進一步的實施方式中，所述減毒的SARS-CoV病毒能夠在細胞培養物中產生最大病毒滴度，所述最大病毒滴度優選的降低2到100 之間的因數、更優選的5到50之間的因數、以及最優選的10到25之間的因數。根椐本發明的最優選的實施方式，所迷核酸不編碼SARS-CoV病毒的功能性蛋白E的序列。所述核酸例如可通過包括步驟的方法獲得，其中SARS-CoV病毒的基因組通過修改編碼SARS-CoV E蛋白的基因的序列來修飾，使得該核酸不能表達功能性E蛋白。所述修飾可以包括編碼序列的刪除和/或替換，或調節序列的刪除和/或替換。例如可能的是，但非必需的是除去E蛋白的整個編碼序列。術語"修改序列"被用于指出使用本領域公知的技術修飾核酸序列。當"修改序列"時，通過應用包括但不限于核苷酸或序列刪除、核苷酸替換或核苷酸添加的技術，所述序列被修飾，使得它不同于野生型序列。Sambrook & Russel ( 2001 )描迷了這些和進一步的技術。術語"E-"或"AE"將在本申請中可互換地使用，來指代(至少) 缺少基因E的減毒的SARS-CoV病毒，或指代編碼(至少)缺少基因 E的減毒的SARS-CoV病毒的核酸等等。根據本發明的優選的方面，E基因的修飾包括在BAC中SARS-CoV 復制子或SARS-CoV的全長cDNA克隆的制備和隨后該BAC的修飾。這具有特別的益處，SARS-CoV基因組的修飾可以非常方便地進行。本發明人令人驚訝地發現，包含本發明的核酸的疫苗是安全的，并且可以啟動對抗SARS-CoV病毒的免疫反應。所迷疫苗包^l舌核酸或減毒病毒顆粒，其含有感染人類或動物細胞必需的所有元件并且其可以是鈍化或非鈍化的。 .使用減毒病毒作為疫苗，細胞的感染將導致病毒的復制和進一步的傳染性病毒顆粒的產生。然而，與野生型SARS病毒相比，減毒病毒的滴度將顯著更低。換句話說，所述疫苗菌抹將僅能在接種的宿主中生長到降低的最大滴度。宿主的免疫系統將產生針對病毒的免疫反應，其降低或消除了由野生型SARS-CoV感染引起的疾病癥狀。已經產生了能夠在培養的細胞中和在體內復制和增殖的、基于 SARS-CoV缺陷性病毒的許多重組疫苗。核酸編碼SARS-CoV復制酶和某些、但不是全部的結構和非結構蛋白質。SARS-CoV工程化疫苗病毒的一個主要特征是它們在體內是傳染性的但是高度減毒的。在可選擇的實施方式中，通過表達本發明的核酸以及隨后使用病毒鈍化的公知方法例如化學或熱處理來鈍化，獲得減毒的病毒。這個實施方式具有特別的益處，病毒被解除武裝兩次，并因而比本領域中早先提示的疫苗更安全。在本申請中，術語"減毒的"被用于指代復制感受態的和傳染性的病毒，在哺乳動物或在細胞培養物中，與在相同條件下在哺乳動物中或在相同細胞的培養物中野生型SARS-CoV病毒產生的最大病毒滴度相比，所述病毒產生降低的最大病毒滴度。因而這種評估步驟可以基于細胞培養物或非人類哺乳動物，優選的鳥類或倉鼠(例如，實施例15中使用的Golden Syrian倉鼠)。在減毒病毒在細胞培養物中的生長速度太低的情況下，細胞培養物中減毒的SARS-CoV病毒用于疫苗生產的用途是受限的或甚至不可能的。然而，通過使病毒與培養基適應，減毒的SARS-CoV病毒在細的丄大滴度甚至更高的i大病毒^度。由于病^毒能夠適應改變的環境，病毒重復傳代的長期培養將改善減毒病毒在細胞培養物中的生長速度。然而，這種方法是非常費時的。改善減毒病毒的體外生長的另一種方法是使用用于感染的宿主細胞，其反過來提供了不由減毒的SARS-CoV的核酸編碼的必需 SARS-CoV蛋白。進一步的，在反過來提供這種因子的稍微不同的方法中，宿主細胞可以被減毒的SARS-CoV病毒和輔助病毒感染、或表達必需的SARS-CoV蛋白的其他核酸。明顯地，這方法可以產生能在細胞培養物中生長到最大病毒滴度的SARS-CoV病毒，其超過相同培養物中野生型病毒的最大病毒滴度，但仍然是在體內以最大滴度生長的減毒病毒，該最大滴度與野生型 SARS相比顯著降低，但仍足以誘導針對SARS-CoV的全身性免疫反應和粘液性免疫反應。術^吾"復制感受態病毒斗亥酸(replication competent viral nucleic acid)"被用于指代一種核酸，其包含編碼病毒復制酶的序列和代表復制起點的序列，即，觸發復制酶的核酸復制的序列。術語"傳染性"被用于指代一種病毒，其能夠通過感染細胞、復制病毒核酸、表病毒蛋白、將病毒核酸與病毒蛋白組裝成病毒顆粒并通過新產生的病毒顆粒感染進一步的細胞來生長。術語"編碼減毒的病毒的核酸"被用于指代編碼減毒病毒的所有序列的核酸。相應的核酸可以用于通過轉染細胞培養物獲得病毒顆粒，其將引起減毒病毒在所迷培養物中的生長。所述核酸也可以用作疫苗。SARS-CoV外殼蛋白是一些蛋白，例如SARS-CoVE、 M或S(刺突)蛋白。這些蛋白可以具有SARS-CoV分離物中觀察到的序列，或可以通過本領域已知的方法衍生自這些序列。使用重組表達方法，例如可能的是，通過添加、刪除或替換一個或幾個氨基酸來修飾蛋白序列。因而本發明覆蓋了包含或編碼外殼蛋白的病毒，所述外殼蛋白與野生型SARS-CoV蛋白具有至少60%、優選的至少75%、最優選的至少95%的序列同源性。在所包括的序列表和附圖中，提供了一些SARS-CoV的序列SARS-CoV Repla:SEQ ID NO:lSARS-CoVReplb:SEQ ID N〇:2SARS-CoV N:SEQ ID NO:3SARS-CoV S:SEQ ID NO:4SARS-CoV M:SEQ ID NO:5SARS-CoV E:SEQ ID NO:6SARS-CoV全長克隆SEQ ID NO11Fig. 18SARS-CoV ORF 3a:SEQ ID NO12Fig. 19基因3b的ORF:SEQ ID NO13Fig. 20基因6的ORF:SEQ ID NOMFig. 21基因7a的ORF:SEQ ID NO15Fig. 22基因7b的ORF:SEQ ID NO16Fig. 23基因8a的ORF:SEQ ID NO17Fig. 24基因8b的0RF: SEQIDNO:18 Fig. 25基因9b的ORF: SEQ ID NO: 19 Fig. 26N蛋白的序列也稱為序列9a。 9b序列通過讀碼框移動被包括在9a 序列中。應當優選地進行9b序列的任何修該，從而9a的序列基本上不被修改，即，以仍然容許功能性9a或N蛋白的表達的方式。SARS-CoV序列可以基于Urbam林基因組(Genebank，登記號碼 AY278741 )。在全長cDNA中，在位置10338 (C〉T)和11163 ( T>A ) 引入兩個沉默遺傳標志。以上列出的基因的命名不同于GeneBank中保藏的序列中使用的命名。對等物是基因3a等同于XI基因3b等同于X2基因6等同于X3基因7a等同于X4基因8b等同于X5SARS基因的序列和SARS-CoV的特征 5' UTR 1-264 RF la (Rep la) 264-13413 ORF lb (Rep lb) 13398-214855 (刺突蛋白)21492-25259 3a 25268-260923b 25689-26153E (包膜蛋白)261 17-26347M (膜蛋白)26398-270636 27074-27265 7a 27273-27641 7b 27638-27772 8a 27779-27898 8b 27864-281 18 9b 28130-28426N (核蛋白)28120-293883' UTR 29389-29727;其中UTR是指"非翻譯序列"。為了當前應用的目的，除非另有說明，使用可從歐洲生物信息學學會(EBI)獲得的Clustal計算機程序確定序列同源性。在本發明的進一步的實施方式中，由SARS-CoV是上述序列編碼的以下蛋白特征在于功能性特征。Repla和lb序列編碼病毒復制酶，其特征在于它容許病毒RNA的復制。M蛋白是膜蛋白，特征在于它與其他蛋白締合到病毒顆粒的包膜上。N蛋白是核殼蛋白，特征在于它與病毒RNA締合到病毒顆粒的核殼上。S或刺突蛋白特征在于它與細胞受體結合。3a的蛋白特征在于它也在病毒膜上存在。在本發明進一步可選擇的實施方式中，編碼減毒的SARS-CoV的核酸可以進一步包括不來自SARS-CoV的核酸序列，例如外源基因所述外源基因可以是任何來源的。例如，本發明的核酸可以用作栽體用于其他病原微生物，例如病毒、細菌、支原體等等的外源基因的表達。具有由此編碼的相應核酸或SARS-CoV的疫苗接種因而可以提供針對 SARS-CoV和進一步的病原微生物的保護。本發明的疫苗中的病毒顆粒優選的從SARS-CoV復制子開始制備。制備本發明的核酸和病毒顆粒的方法可以包4舌在細菌人工染色體 (BAC)中SARS-CoV衍生的復制子的制備。基于這種含SARS病毒復制子的BAC， SARS-CoV核酸的基因組序列的全長拷貝可以如實施例中描述的制備。然后全長克隆可以用于引入點突變、刪除或替換，其將鈍化某些結構或非結構基因。做為選擇，人們也可以從保藏的復制子開始，通過引入希望在核酸中具有的那些序列并刪除不應被包括的序列來相同地修改。換句話說，不必制備全長克隆來作為制備編碼減毒病毒的核酸的中間產物。根據本發明，提供了疫苗，其優選的能夠誘導針對SARS-CoV的全身性免疫反應和粘液性免疫反應。與其他冠狀病毒類似，病毒的刺突蛋白與細胞受體相互作用并介導膜融合以容許病毒進入易感的目標細胞。因而，刺突蛋白在病毒感染周期中起到重要作用，并且是中和抗體的主要目標。在本發明的另一個實施方式中，所述核酸進一步編碼共刺激分子，例如CD80或CD86或免疫刺激性細胞因子，例如TNF-ct 、 IFN-Y 、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素-2( IL-2)、IL-12或IL-18。本發明的疫苗可以施用給哺乳動物以獲得免疫反應，所述免疫反應降低或消除由SARS-CoV病毒的感染引起的疾病癥狀。所述疫苗優選的用于接種哺乳動物，特別是人類、環尾貓熊(a civet cat)、浣熊或白鼬(aferret)。所有這些動物已知充當了 SARS-CoV的宿主。疫苗可以根據本領域中通常使用的方法來施用。特別地，疫苗可以通過口服、肌肉內、靜脈內、皮下或鼻內的施用來施用。口月l施用是特別優選的。所述疫苗也可以包含藥學上可接受的栽體、賦形劑和/或佐劑。適合于經由粘膜途徑施用遺傳疫苗和免疫原的佐劑和栽體是本領域已知的。例如在Kiyono et al., 1996中綜述了常規的載體和佐劑。用于條件免疫反應的趨化因子的添加也被本發明涵蓋。在Toka et al.， 2004中綜述了相應的化合物和它們的醫學用途。特別有益的是使用粒細胞/巨噬細胞集集落刺激因子、白細胞介素-2 (IL-2) 、 IL-12、 IL-18 之一。也可以應用利用幾種細胞因子和趨化因子的組合方法。此外，隨著關于T細胞的記憶發育的需求發現更多，涉及關鍵細胞因子例如 IL-15和IL-23的激發劑可能證明有益于記憶庫的長期維持。使用跨越基因組的非翻譯的5'和3'末端、整個復制酶基因和核蛋白 (N)基因的一組重疊cDNA，可以產生復制子。構建SARS-CoV復制子作為細菌人工染色體(BAC)的策略可以如下4既述(i) 鑒定復制子的工程化中要使用的病毒基因組中的合適的限制性位點。(ii) 產生中間質粒作為構建SARS-CoV復制子的基礎。(iii) 通過RT-PCR產生疊蓋SARS-CoVcDNA亞克隆，使用選擇的限制性位點的復制子組裝 SARS-CoV復制子cDNA的構建在實施例1中更多細節地說明。制備本發明的疫苗中使用的病毒顆粒的方法可以使用以上描述的復制子。根據本發明的優選的方面，這些方法基于質粒 pBAC-SARS-CoV-REP的使用。含有這種質粒的細菌于2004年9月1 日保藏于 Colecci6n Espafiola de Cultivos ( Tipo, CECT in Valencia, Spain)。保藏物被給予了臨時登記號碼7020。質粒pBAC-SARS-CoV-REP包含編碼SARS-CoV復制酶和 SARS-CoV N蛋白的復制感受態的、非傳染性SARS-CoV基因組的序列。這種載體提供了穩定的、安全的和易于操作的基礎，用于產生本發明的病毒顆粒和疫苗。通過克隆至少一個進一步的SARS-CoV基因到復制子中，可以產生病毒顆粒和疫苗。基因組病毒RNA可以用作起始材料來獲得編碼進一步的 SARS-CoV蛋白質的序列。SARS-CoV Urbani林的基因組RNA可以從美國亞特蘭大的疾病控制中心獲得。根據本領域已知的方法從病毒 RNA制備cDNA庫。可以從cDNA庫重建全長基因。這些基因然后可以與轉錄調節序列(TRS)和/或翻譯調節序列(例如，內部核糖體進入位點，IRES)組合，并可以插入到復制子的克隆位點中。如在實施例中所示，按這種方式，可以制備編碼SARS-CoV的基因組核酸的全長拷貝的全長克隆，可以隨后修改來產生編碼減毒病毒的核酸。然后所述核酸可以用于轉染輔助細胞系。如果使用復制子，需要使用表達不由所述核酸編碼的必需SARS-CoV蛋白的細胞系(例如，包裝細胞系)。做為選擇，宿主細胞可以使用如上所述的復制子核酸和輔助病毒、或表達必需的SARS-CoV蛋白的其他核酸轉染。按這種方式，編碼SARS-CoV復制酶、SARS-CoV N蛋白和至少一種進一步的SARS-CoV蛋白的核酸(即，復制子)與進一步的必需的SARS-CoV 蛋白締合來形成本發明的疫苗的病毒顆粒。通過產生以上列出的病毒顆粒，并將它配制到疫苗中，例如，通過混合病毒顆粒與載體、佐劑和/或賦形劑，可以獲得疫苗。疫苗的測試優選的包括按順序的幾個步驟。例如，減毒的 SARS-CoV的免疫原性可以通過在Vero E6細月包的組織培養物中產生它們來測試。獲得的抗原可以通過包括離心的常規過程來部分純化，可以測試這些抗原是否在小鼠和兔中誘導SARS-CoV中和抗體。選擇的疫苗可以進一步測試動物系統，例如BALB/c小鼠、白鼬和恒河猴中的保護(使用例如在Enserink， 2003; Yang et al., 2004; ter Meulen et al., 2004; Martina et al., 2003; and Kuiken et al., 2004中甘葛述的方便的方法)。動物模型系統可以連續地用于疫苗效力測試和初步安全性測試。首先，疫苗候選物可以在小鼠模型中測試，然后在白鼬SARS-CoV模型中測試 (Martina et al.， 2003 )。進一步的判斷可以基于針對 SARS-CoV攻擊的保護，選擇的疫苗候選物然后可以在恒河猴中測試。19為了實現這個目標，病毒儲庫可以在青年食蟹猴中滴定。在首先的實驗中，這種病毒儲庫的提高的對數稀釋物(10"、 101、 102、 103、 104、 105和106 TCID50)用于氣管內地感染恒河猴(每個稀釋度n-2)。根據早先已經建立的方案，從這些SARS-CoV感染的動物中系統性地收集臨床的、病毒學的、gross病理學和免疫學的(中和抗體、血漿中的 W "方；系a mT MA A拚^眙、粉棍^ et ai.， 2004 ).附圖的簡要說明附

圖1顯示了 SARS-CoV Urbani林的遺傳結構。方框內的字母和數字代表病毒基因。L，前導序列；UTR，非翻譯區。標明了相關的限制性位點。附圖2顯示了中間質粒pBAC-SARS-CoV 5， 3，的構建。含有 SARS-CoV Urbani林的基因組5'末端678 nt和3'末端973 nt的PCR片段，其左側末端側翼是巨細胞病毒(CMV)即時早期啟動子，右側末端側翼是poly ( A)尾部和隨后的肝炎厶病毒核酶(Rz)和牛生長激素 (BGH)終止子和多聚腺苷酸序列，克隆到BAC中。為了便于 SARS-CoV復制子的組裝，含有限制性位點C7"/、 M/w/、尸we/和5"w/// 的單克隆位點克隆到5'末端病毒序列的下游。附圖3顯示了 SARS-CoV衍生的復制子pBAC-SARS-CoV-REP的產生。說明了構建SARS-CoV復制子的策略。通過連續克隆由RT-PCR 產生的亞基因組疊蓋cDNA片段到附圖2的質粒pBAC-SARS-CoV 5， 3，中，組裝SARS-CoV復制子。在底部顯示了 SARS-CoV復制子的遺傳圖譜。說明了克隆步驟中使用的相關的限制性位點。Repla、 Rep lb 和N代表病毒基因。CMV, CMV即時早期啟動子；TRSN， N基因的天然TRS; pA， 25個A殘基的尾部；Rz，肝炎A病毒核酶；BGH, 牛生長激素終止子和多聚腺苷酸序列。附圖4顯示了附圖3的SARS-CoV衍生的復制子的功能分析。在頂部說明了 SARS-CoV復制子的遺傳結構。標明了 N基因TRS、核心序列(斜體字字母)和相關的限制性位點。L，前導序列；UTR,非翻譯區。BHK-21和人類293T細胞用SARS-CoV復制子(SARS-CoV-REP ) 或非復制性cDNA克隆(GFP-NR)利用Lipofect細ne 2000模擬轉染 (MOCK )或轉染。在24 hpt分離總RNA，用特定寡核苷酸通過RT-PCR分析來檢測基因NmRNA。平行擴增的雙份RT-PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳來分辨。附圖5顯示了從SARS-CoV復制子的SARS-CoV全長cDNA克隆的構建。從克隆在BAC中的SARS-CoV復制子(參見上文附圖3)開始，通過在兩個步驟中導入剩余的SARS-CoV序列來組裝全長克隆。在第一個步驟中，&//7///-^^/片段插入到包括以下基因的復制子中 3a的部分、3b、 E、 M、 7a、 7b、 8a、 8b和N的部分。在第二個步驟中，通過克隆包括Replb的3'末端、基因S和3a的5'末端的Pme/Wam/// 片段到前述質粒中，來完成全長cDNA克隆。標明了克隆步驟中使用的相關的限制性位點。使用以下縮寫CMV,巨細胞病毒即時早期啟動子；pA， 25個A殘基的尾部；Rz，肝炎A病毒核酶；BGH,牛生長激素終止子和多聚腺苷酸序列。附圖6顯示了用于產生編碼SARS-CoV-E-的cDNA的策略。顯示了核心序列和基因E開放閱讀框。以粗體和斜體顯示了改變初始ATG 到GTG的點突變。在方框中顯示了基因E核心序列(CS,在TRS中部的高度保守的序列)。以斜體字顯示了導入基因ECS中的兩個點突變(ACGAAC到ACCAAT )。基因E ORF內刪除的序列是下劃線的。附圖7顯示了在用rSARS-CoV-AE或重組野生型病毒以0.5的moi 感染的Vero E6 ( A ) 、 Huh-7 ( B )和CaCo-2 ( C )細胞中SARS-CoV 和SARS-CoV-AE病毒產生的動力學。在感染后的不同時間，通過在 VeroE6細胞上的斑塊分析來測定病毒滴度。誤差柱代表三個實驗的平均值的標準偏差。這個附圖顯示了 E衍生物在它的生長方面降低并因而被減毒。附圖8顯示了 ( A)在感染后24小時在Vero E6細胞中缺陷的和親本病毒產生的細胞病變效應(上部的正方形)；和(B)在感染后72 小時在VeroE6細胞上標明的病毒的斑塊形態(中間的圓圏)；(C) 使用SARS-CoV特異性多價抗體的標明的病毒的免疫焚光顯微(底部正方形)。附圖的左半邊顯示了使用SARS-CoV野生型的感染，右邊部分顯示了 SARS-CoV-AE。親本和E-兩種病毒產生了 Vero E6細胞中顯著的細胞病變效應(附圖8A)。較早使用全長病毒觀察到效果， SARS-CoV-AE病毒斑塊也小于野生型病毒產生的斑塊(附圖8B)。重組E-病毒的援救的其他演示是使用SARS-CoV特異性抗體在免疫熒光中對感染的細胞染色(附圖8C)。附圖9顯示了受感染細胞的RT-PCR分析。使用在病毒前導序列中雜交的病毒正向引物和分別在基因S、 E、 M和N的開放閱讀框中雜交的反向引物進行RT-PCR。 M,模擬感染的細胞；AE， SARS-CoV-△ E; FL， SARS-CoV野生型。附圖IO顯示了在用SARS-CoV (FL)或SARS-CoV-AE ( AE) 感染后在VeroE6細胞中SARS-CoV蛋白表達的分析。S, N和E病毒蛋白；M,模擬感染的細胞。附圖11顯示了溫度和pH值變化對rSARS-CoV-AE病毒傳染性的影響。含有重組SARS-CoV和SARS-CoV-厶E病毒的上清液在標明的溫度(附圖11A)或pH (附圖11B)下孵育30分鐘，通過在VeroE6 細胞上培養物上清液的滴定來評估病毒傳染性。誤差柱代表三個實驗的平均值的標準偏差。附圖12顯示了感染后24小時rSARS-CoV-AE感染的Vero E6細胞在電子顯微鏡超薄切片處理之后的超結構分析。(A )充滿病毒顆粒的受感染細胞的細胞質。(B )核殼進入腫脹的高爾基體的腔的發芽位置。在SARS-CoV-AE感染的細胞的細胞質中致密材料用箭頭表示。在表現為大的空泡的腫脹高爾基體中發現的成熟病毒顆粒。表現 rSARS-CoV感染的細胞或rSARS-CoV- △ E感染的細胞的突變分別在左側和右側顯示。條形，畫面A中2 ium，畫面B和C中200 nm。附圖13顯示了從感染的Vero E6細胞釋放的rSARS-CoV- △ E病毒顆粒的形態。(A ) 顯示細胞表面內層的細胞外病毒的超薄切片的電子顯微照片。(B) rSARS-CoV和rSARS-CoV-AE感染的細胞的上清液在空氣離心機中濃縮，在用磷鎢酸鈉負染色之后通過電子顯微鏡檢查來分析。左側的圖片代表rSARS-CoV感染的細胞，而右側的代表 rSARS-CoV-AE感染的細胞。條形，畫面A中200 nm，畫面B中IOO nm。附圖M顯示了在用103 TCIDso的rSARS-CoV或rSARS-CoV-AE接種后在倉鼠中缺陷性病毒的體內生長動力學。肺(A)和鼻甲(B) 中的病毒滴度在Vero E6細胞單層上測定。非參數的Mann-Whitney U 統計方法被用于確定觀察的差異的顯著性。統計顯著性由*( p值<0.05 ) 表明。點線表明檢測的下限。附圖15顯示了用103 TCID50的rSARS-CoV或rSARS-CoV- △ E接種之后在倉鼠中rSARS-CoV-AE的病理。(A)感染后2天的肺的免疫組織學染色的切片。(B)感染后2天的肺的蘇木色素&伊紅染色的切片。(C)感染后5天的肺的免疫組織學染色的切片。(D)感染后5天的肺的蘇木色素&伊紅染色的切片。左側圖片代表rSARS-CoV 感染的肺，而右側圖片代表rSARS-CoV-厶E感染的肺。條形，所有畫面中100 nm。附圖16顯示了被導入以消除9b基因的表達的突變。顯示了基因 9bORF的前96個核苷酸。三個ATG密碼子突變成ACG,以粗體字符顯示。以粗體和斜體字顯示了突變的C。引入的終止密碼子TAA以粗體顯示。附圖17顯示了被導入以消除3b基因的表達的突變。顯示了基因 3b ORF的前75個核苷酸。同相地突變成ACG的三個密碼子ATG以粗體顯示，突變的C以粗體和斜體顯示。通過改變密碼子TCA到TAA 引入的終止密碼子以粗體顯示。附圖18到26顯示了全長SARS-CoVUrbanis菌抹的序列和其選擇的基因的序列。以下實施例說明、但不限制本發明的實施方式。實施例使用以下的細胞、病毒、質粒和細菌菌抹細胞。非洲綠猴腎臟衍生的Vero E6細胞由Eric Snijder ( Medical Center, University of Leiden， The Netherlands )好意地提供。人類結腸癌衍生的CaCo-2細胞從歐洲細胞培養物保藏所獲得。人類肝臟衍生的 Huh-7細月包由R. Bartenschlager ( Dept. of Molecular Virology, University of Heidelberg, Germany)好意地提供，Gillim-Ross et al.， 2003; Hatte隠nnetal.,2005; Mossel et al., 2005中提及。嬰兒倉鼠腎臟細胞 (BHK-21 )和人類293T細胞購自美國細胞培養物保藏所(ATCC )。所有細胞在37。C在C02孵化器中維持在補充有25mM HEPES和10% 胎兒牛血清和抗生素的DMEM中。病毒。Urbani抹的基因組RNA在材料轉移協議的簽署之后從美國喬治亞州亞特蘭大的疾病控制和預防(CDC)中心獲得。質粒和細菌菌林。質粒pBeloBACll (Wang et al., 1997)由H. Shizuya和M. Simon ( California Institute of Technology, Pasadena, Ca ) 好意地提供。Escherichia coli DH10B菌抹從GIBCO/BRL獲得。通過根據廠家的說明書在25|aF、 2.5 kV和200 Q使用Gene Pulser單元 (Bio-Rad)電穿孔來轉化DH10B細胞。根據廠家的說明使用Qiagen (Chats worth, CA ) Large Construct Kit分離質粒DNA。實施例1SARS-CoV復制子cDNA的構建含有Urbani基因組的非翻譯5'和3'末端以及復制酶和N基因的 cDNA ^皮克隆作為BAC處在CMV啟動子的控制下。另外，含有獨特的限制性位點尸ac/、 Ac/和Saw/7/的多克隆位點被克隆到復制酶基因的下游以允許異源基因的克隆(附圖3)。這種方法使用兩步擴增系統，其聯結了核中從CMV啟動子的復制子RNA轉錄與細胞質中由病毒聚合酶驅動的第二擴增步驟。如通過限制性內切酶分析所測定的，在DH10B細胞中的增殖期間，編碼SARS-CoV復制子的質粒pBAC-SARS-CoV-REP至少180代是穩定的。在第一步中，鑒定了可以用于工程化SARS-CoV的復制子和全長 cDNA克隆的病毒基因組中合適的限制性位點(附圖1)。在第二步中，產生中間質粒pBAC-SARS-CoV 5， 3'作為構建 SARS-CoV復制子以及全長cDNA構建體的基礎(附圖2 )。這個質粒含有處在巨細胞病毒(CMV)即時早期啟動子的控制下的Urbani抹基因組的5'末端的前678 nt,和基因組的后973 nt，隨后是25-bp合成的 poly (A)、肝炎A病毒核酶、和牛生長激素終止子和多聚腺苷酸序列以產生精確的3'末端。另外，含有第一步驟中選擇的限制性位點C/"/、 A//w/、尸we/和8"/w///的多克隆位點被克隆到SARS-CoV序列之間以容許SARS-CoV復制子的組裝。在第三個步驟中，通過RT-PCR產生疊蓋SARS-CoV cDNA亞克隆，使用選擇的限制性位點組裝復制子。使用pBAC-SARS-CoV5， 3，作為起始點，根據附圖3中描述的策略工程化SARS-CoV復制子。質粒pBAC-SARS-CoV-REP含有Urbani基因組的非翻譯5'和3，末端、復制酶基因，隨后是含有獨特限制性位點Pw/、和j5"w///的多克隆位點，以容許異源基因的克隆和表達，以及處在其天然TRS的控制下的核蛋白(N)基因。實施例2 克隆的dDNA穩定性的分析通過研究不同傳代下的限制性內切酶圖型，分析克隆到 pBeloBACll中的病毒序列的穩定性。用重組質粒轉化的細菌在37°C 在含有12.5 pg/ml氯霉素的10 ml LB中生長。來自這些原代培養物 (考慮傳代0)的細胞通過每天稀釋106倍來連續增殖。每個傳代被認為代表約20代。實施例3 序列分析使用熒光染料標記的雙脫氧核苷酸和溫度抗性DNA聚合酶 (Perkin Elmer)利用自動373 DNA測序儀(Applied Biosystem )來對DNA測序。實施例4 SARS-CoV復制子cDNA的轉染 BHK-21和293T細胞在35 mm直徑平板上生長到95%匯合，并根據廠家說明書使用6 jug Lipofectamine 2000 ( Invitrogen),用5 m gSARS-CoV復制子轉染。實施例5 RNA分離和RT-PCR分析在轉染后24h ( hpt)用RNeasy Mini試劑盒(Qiagen )提取總細胞內RNA，用作基因NmRNA轉錄的RT-PCR分析的模板。用Moloney 鼠白血病病毒逆轉錄酶(Ambion)和與基因N的核苷酸510到531互補的反義引物 URB-28630RS ( 5 ' -TGCTTCCCTCTGCGTAGAAGCC-3' ) ( SEQ ID NO: 7)進行RT 反應。使用反向引物URB-28630RS和;凈越Urbani前導序列的核苷酸 29 到 50 的正向引物 URB-29VS ( 5 ，-GCCAACCAACCTCGATCTCTTG-3' ) ( SEQ ID NO: 8 )來擴增產生的cDNA。對于通過基因N mRNA的實時RT-PCR的定量分析，使用 Primer Express軟件(Applied Biosystems )設計用于 RT (URB-28163RS， 5' -TGGGTCCACCAAATGTAATGC-3' ( SEQ ID NO: 9)，與基因N的核普酸43到63互補)和PCR (反向引物 URB-28163RS 和正向引物 URB-27VS, 5 ， -AAGCCAACCAACCTCGATCTC-3， ( SEQ ID NO: 10 ),跨越Urbani 前導序列的核苷酸27到47)的引物。根據廠家的說明(Applied Biosystems )將SYBR Green PCR主混合物用于PCR步驟中。實施例6 SARS-CoV衍生的復制子的分析SARS-CoV衍生的復制子在幾個細胞系中是功能性的。基因N mRNA的表達被用于通過RT-PCR分析研究復制子活性。用SARS-CoV 復制子或非復制型cDNA克隆使用Lipofectamine 2000轉染BHK-21和人類293T細胞。在24 hpt提取總細胞內RNA，用作使用特定寡核苷酸的基因N mRNA轉錄RT-PCR分析的模板。在用SARS-CoV復制子轉染的BHK-21和293T細胞中都檢測到高水平的基因NmRNA，顯示了復制子在這些細胞系中是活性的。在轉染的293T和BHK-21細胞中基因N mRNA的定量分析使用實施例5中描述的引物通過實時 RT-PCR進行。在293T細胞中SARS-CoV復制子活性是在BHK-21細胞中的8倍高。這種活性提高可以通過在人類293T細胞中SARS-CoV 復制子的更高復制水平來解釋，或僅僅由于293T細胞的轉染效率兩倍高于BHK-2細胞的。分析了 N蛋白在SARS-CoV復制子活性中的作用。為了實現這個目標，構建缺少N基因的SARS-CoV復制子，與表達N基因的復制子比較復制子活性。檢測缺少N基因的復制子的基礎活性，但當存在N 蛋白時，復制子活性提高超過100倍。這些數據表明，N蛋白起到了冠狀病毒復制子活性的增強子的重要作用。含有質粒pBAC-SARS-CoV-REP的細菌于2004年9月1日保藏在 Colecci6n Espafiola de Cultivos ( Tipo, CECT in Valencia, Spain )，所述質粒pBAC-SARS-CoV-REP包含編碼SARS-CoV復制酶和SARS-CoVN蛋白的復制感受態的、非傳染性的SARS-CoV基因組。保藏物被給予了臨時登記號碼7020。實施例7 制備全長克隆根據附圖5中列出的克隆策略來制備SARS-CoV全長cDNA克隆 (pBAC-SARS-CoVFL )。從克隆到BAC中的SARS-CoV復制子開始(上述附圖3;和實施例1到6)，通過在兩個步驟中添加其余基因來組裝全長克隆。在第一個步驟中，包括以下基因的^w ///-A^e/片段被插入到含有復制子的 BAC中3a的一部分、3b、 E、 M、 7a、 7b、 8a、 8b和N的一部分。在第二個步驟中，通過克隆包括Rep lb的3'末端、基因S和3a的5' 末端的/^e/-5"w///片段到前述質粒中，來完成全長cDNA克隆。通過獲自亞特蘭大的疾病控制中心的RNA片段的RT-PCR克隆，獲得這兩個片段的cDNA。該RNA相應于SARS-CoV的Urbani林的基因組序列。克隆步驟中使用的基因和相關的限制性位點在附圖5中示出。產生的全長cDNA克隆的功能分析顯示，當在E.coli中增殖時該克隆是完全穩定的。在Vero細胞的轉染之后，從cDNA克隆回收傳染性的病毒，就噬菌斑形態學、生長動力學以及mRNA和蛋白圖譜來說，發現與親本病毒是相同的。實施例8制備含有除了編碼結構蛋白蛋白E的基因以外的所有 SARS-CoV基因的減毒病毒蛋白E被認為是冠狀病毒必需的。為了消除基因E表達，將三種不同的修飾導入實施例7的SARS-CoV全長cDNA克隆中，來獲得作為BAC的編碼SARS-CoV的cDNA，其中E基因被刪除(SARS-CoV-△ E)。(a) 已經在基因E核心序列(CS)(圖6)中引入了兩個點突變。這個部分是調節基因轉錄的序列(TRS)的中心，突變的引入將阻止基因E的表達。原始的TRS序歹'J ACGAAC被ACCAAT替代。(b) 在E基因開放閱讀框的起始密碼子中引入了點突變。起始密碼子ATG變為GTG。(c) 引入了 ORF基因E內的142個核苷酸刪除。通過在E基因的編碼序列的起始密碼子內引入點突變，取消了 E 蛋白的表達。引入的突變對于部分地與E基因重疊的基因3b是沉默的。此外，為了避免重組病毒的基因回復的可能性，刪除覆蓋大部分E基因的142nt。為了維持M基因的野生型轉錄水平，不改變E基因的3' 末端的M基因的公開的轉錄調節序列(TRS )的上游48 nt( Thiel et al.， 2003 )。使用含有 SARS-CoV全長cDNA的實施例 7的質粒 pBAC-SARS-CoVFL，通過重疊延伸PCR引入E基因刪除。寡核苷酸SARS-16501-VS ( 5'-GGCTCATGTGGTTTATCATTAGTATTGTACAAATGGCACC-3,)和SARS-16973-AE-RS(5' -CCTTCAGAAGAGTTCAGATTTTTAACACGCTTAACGTACCTGTTT-CTTCCGAAACGAATGAGTACACAATGGTACTCACTTTCTTGTGCTTAC-3 ')被用于從SARS-CoV基因組的nt 25170和26326產生PCR產物，所述 SARS-16973-AE-RS包括SARS-CoV基因組的核苷酸(nt) 26153和 26295之間的刪除、E基因的核心序列(CS)中的兩個點突變和取消這個基因的起始ATG密碼子的一個點突變。寡核苷酸SARS-16943-VS( 5'-GCGTGTTAAAAATCTGAACCTCTGAA-GG-3' ) 和 SARS-N733-RS (5'-GGCCTTGTTGTTGTTGGCC-3')被用于產生跨越SARS-CoV基因組的nt26296到28852的PCR產物。兩個疊蓋產物都被用作使用引物 SARS-16501-VS和SARS-N733-RS的PCR擴增的模板。用酶^m2/// 和M e/消化最終的PCR產物，克隆到中間質粒pBAC-SARS-5， -3， -DN中來產生質粒pBAC-SARS需5， -3，醫DN-AE。質粒pBAC-SARS-5， -3， -DN和pBAC-SARS-5， -3， -DN-△ E都含有巨細胞病毒(CMV ) 啟動子之下的SARS-CoV基因組的前7452 nt，和最后的3683 nt,隨后是25-bp合成的poly A、肝炎A病毒核酶(Rz )和牛生長激素(BGH ) 終止子和多聚腺苷酸序列以產生精確的3，末端。最后，含有SARS-CoV 全長cDNA的pBAC-SARS-CoVFL的片段，相應于nt 26045 到29783,通過質粒pBAC-SARS-5， -3， -DN-△ E的片段來交換，以產生缺少E基因的質粒pBAC-SARS-CoV-AE。為了援救工程化的病毒，在12.5 crr^燒瓶中生長到90%匯合的Vero E6細胞使用12 m g Lipofectamine 2000 (Invitrogen )根據廠家的i兌明書用6 Mg質粒pBAC-SARS-CoV-AE或用親本質粒pBAC-SARS-CoVFL 作為對照來轉染。在37。C 6h的溫育期之后，替換轉染培養基，在37 。C孵育72小時。收獲細胞上清液，在新鮮的VeroE6細胞上傳代兩次，乂人兩種質#立收獲的增殖感受態病毒(propagation-competent viruses ) (rSARS-CoV-AE和重組野生型rSARS-CoV )通過三輪的斑塊純化來克隆。援救了AE病毒，表明基因E不是病毒周期所必需的。缺陷性病毒rSARS-CoV-AE的滴度是親本病毒(重組野生型rSARS-CoV )的滴度20到50分之一。病毒滴度是親本病毒約5 x 107 pfu/ml和缺陷性病毒3 x io6 pfu/ml，如Vero E6細胞上的斑塊分析中測定的(附圖7A )。兩種病毒，親本(SARS-CoV )和E- ( SARS-CoV- △ E )在Vero E6 細胞中產生了顯著的細胞病變效應(附圖8A),然而對于親本病毒，這種效果比E-病毒更早觀察到。SARS-CoV-AE病毒斑塊(plaques) 小于野生型病毒產生的斑塊(附圖8B)。重組E—病毒的援救的其他證明是使用SARS-CoV特異性抗體在免疫熒光中對感染的細胞染色(附圖8C)。實施例9pBAC-SARS-CoV- △ E的RNA分離和RT-PCR分析來自VeroE6感染的細胞的總RNA根據廠家的說明書使用Qmgen RNeasy試劑盒提取，用于S、 E和N基因mRNA轉錄產物的RT-PCR 分析。使用莫洛尼氏白血病毒逆轉錄酶(Ambion)和與S基因的nt 594 到613互補的反義引物SARS-S613-RS ( 5'-ctactataggttgatagccc-3'); 與E 基因的nt 208到231互補的 SARS-E231-(5' - TTAGACCAGAAGATCAGGAACTCC-3')和與N基因的nt 5 1 1到532互#卜的URB-28630-RS ( 5'習tgcttccctctgcgtagaagcc-3')在42。C進行反應lh。使用跨越SARS-CoV前導序列的核普酸29到50的病毒有義引物URB-29-VS ( s'- gccaaccaacctcgatctcttg-3')和對RT反應所描述的反向引物通過PCR擴增cDNA。 RT-PCR產物在0.8%瓊脂糖凝膠中通過電泳來分辨。E—病毒的身份通過使用RT-PCR分析來分析病毒sg mRNAs的合成來確認(附圖9)。如預計的，來自E基因sgmRNA的250 bpPCR產物在rSARS-CoV-AE感染的細胞中沒有檢測到。結果顯示，雖然基因 EmRNA由親本病毒產生，這種mRNA在E-病毒中沒有觀察到。此外，鑒定了在rSARS-CoV-AE病毒的情況下1050 bp的PCR產物以及在重組野生型病毒的情況下的1200 bp產物。這些PCR產物的序列匹配在基因3的TRS開始的sg mRNA的序列，確認了 rSARS-CoV-AE病毒維持了被導入以防止E基因表達的突變和刪除。相比之下，來自編碼S 和N蛋白的mRNA的PCR產物中沒有^f企測到差異。實施例10 Western印跡分析通過使用E特異性抗體的Western印跡分析，與在用親本病毒感染的細胞中E蛋白的存在相對比，由E基因表達的破壞引起的E蛋白產生的缺乏，在用E-病毒感染的細胞中進一步顯示。通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析細胞溶胞產物。在含有20%甲醇的25mMTris-192mM甘氨酸緩沖液pH 8.3中，使用Bio-Rad mini protean II電印跡設備在150 mA 2h,將蛋白轉移到硝化纖維素膜上。使用TBS (20mMTris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl)中的5%脫脂奶粉封閉膜1 h,用特異于N、 S (Imgenex; 1:500 稀釋)和E蛋白(由Shen Shuo， Institute of Molecular and Cellular Biology, Singapore好意地提供，1:2000稀釋)的多克隆抗體孵育。使用辣根過氧化酶結合的山羊抗兔抗體(Cappel)和ECL檢測系統(Amersham Pharmacia Biotech )檢測結合的抗體。用rSARS-CoV-AE病毒感染的Vero E6細胞的蛋白提取物含有S 和N蛋白，但沒有E蛋白。使用針對S和N蛋白的抗體的western分析分別揭示了 170 kDa條帶和大約46 kDa的雙帶。相比之下，使用特異性E蛋白抗體的Western印跡分析未能檢測到大約10 kDa的條帶，相應于rSARS-CoV感染的Vero E6細胞提取物的Western印跡分析中觀察到的E蛋白(附圖10)。30實施例11rSARS-CoV- △ E的生長動力學Vero E6、 Huh-7和CaCo-2細胞的亞匯合單層(90%匯合)以0.5 的感染復數(moi)用病毒rSARS-CoV-AE和rSARS-CoV感染。在感染后不同時間收集培養物上清液，使用密閉燒瓶或密封平板根據標準方法測定病毒滴度。rSARS-CoV-AE和重組野生型病毒在Vero E6細胞中的生長動力學顯示了相似的分布(附圖7A)。在感染后24h檢測Vero E6細胞中的細胞病變效應。相比之下，在Huh-7和CaCo-2細胞中，沒有檢測到細胞病變效應，即使在感染后72h。在VeroE6感染的細胞中，在感染后24-48h達到最大病毒滴度(重組野生型病毒的峰值滴度是-8x 106 pfu/ml) 。 rSARS-CoV-AE病毒的滴度是重組野生型病毒的~ 20分之 —。在Huh-7細胞中，感染后48小時達到最大滴度(對于重組野生型病毒-5x l05pfu/ml)(附圖7B)，而在CaCo-2細胞中，感染后~ 72 小時達到最大滴度(對于重組野生型病毒~4>< l05pfu/ml)。在Huh-7 和CaCo-2細胞系中，rSARS-CoV-厶E病毒生長到重組野生型病毒~ 200分之一的滴度。這些數據表明，E蛋白對于SARS-CoV生長有重要作用，它對于細胞培養物中的SARS-CoV復制不是關鍵的。在紹(mink) 肺細胞系MvlLu中確認了相同結果。實施例12 間接免疫熒光顯微鏡檢查在9 cm2載玻片燒瓶中生長的亞匯合Vero E6細胞以1的moi (感染復數)感染。在24 hpi (感染后小時數)，細胞在冰冷的PBS中洗涂，在室溫下用8%多聚甲醛固定30分鐘。細胞然后用0.2%皂角苷在封閉溶液(磷酸鹽緩沖鹽水[PBS]， pH 7.4,含有10。/。胎兒牛血清[FBS]) 中在室溫下預滲透lh,在室溫下與Anlong Xu ( Zhongshan Uninersity, Guangzhou, China)好意地提供的多克隆SARS-CoV特異性抗體孵育 90分鐘。然后用PBS洗滌細胞三次，與在封閉溶液中1:200稀釋的Cy5 結合的抗人免疫球蛋白G (Jackson Immunoresearch)在室溫下孵育30 分鐘，并用PBS洗滌五次。移除載玻片，裝上玻璃蓋玻片，用Zeiss Axiophot熒光顯微鏡分析。在兩種情況下，免疫焚光的圖形對于兩種病毒是類似的，細胞膜和細胞質嚢泡被顯著地染色(附圖8C)。實施例13 rSARS-CoV-厶E的穩定性為了分析E蛋白是否影響SARS-CoV的穩定性，分析了溫度和pH 值對于病毒傳染性的影響(附圖11)。為此，在從4。C到80'C的溫度范圍內孵育重組野生型病毒和rSARS-CoV-AE病毒30分鐘。兩種病毒都顯示了相似的鈍化分布型，在6(TC下脬育后103倍的降低。80°C 或更高溫度的熱度引起殘余的病毒感染性(附圖11A)。重組野生型病毒和rSARS-CoV-AE病毒在不同的pH值孵育30分鐘顯示了兩種病毒從pH 5到9都是穩定的(附圖11B)。這些結果表明，在測試的不同溫度和pH值下，E蛋白對于病毒顆粒的穩定性有4艮少的影響。實施例14 電子顯微鏡檢查E蛋白已經與病毒形態發生相聯系(Fischer et al.， 1998; Kuo and Masters, 2003 )。因此，通過電子顯微鏡檢查研究了 rSARS-CoV和 rSARS-CoV-AE病毒的組裝(附圖12)。對于常^L的電子顯微鏡4企查，以1的moi用rSARS-CoV和 rSARS-CoV- △ E病毒感染Vero E6細胞單層。用磷酸鹽Na/K緩沖液(pH 7.4)中的2%戊二醛在20 hpi原位固定細胞在室溫下lh。在固定液中從平皿上移除細胞，轉移到eppendorf管中。在離心之后，在磷酸鹽 Na/K緩沖液(pH 7.4 )中洗滌細胞三次，根據標準步驟處理包膜入Epoxy， TAAB 812樹脂(TAAB Laboratories, Berkshire, England )中。在4。C使用蒸餾水中的1%四氧化鋨和0.8%鐵氰化鉀的混合物進行細胞的后固定lh。在用蒸餾水洗滌五次之后，用水中的2%醋酸鈾孵育樣品lh, 洗滌三次，在室溫下用提高濃度的丙酮(50、 70、 90和100%)脫水兩次各10分鐘。在提高濃度的丙酮/環氧樹脂(3:1、 1:1、 1:3和100%環氧樹脂)中進行樹脂的浸潤。浸潤的樣品的聚合化在2天期間在60°C 進行。用飽和的醋酸鈾和檸檬酸鉛染色樣品的超薄切片，在JeolJEM-1010 ( Tokyo, Japan )電子顯微鏡中在80 kV檢查。對于負染色電子顯微鏡檢查，感染20h的Vero E6細胞的上清液用 10%甲醛固定，使用Electron Microscopy Rotor ( EM-90, Beckman)以 21 psi在Beckman airfuge中濃縮物到碳包被的電離銅網上。篩網用2% 磷鴒酸pH 7染色1分鐘。在Jeol JEM-1010 (Tokyo, Japan)電子顯微鏡中檢查樣品。在使用rSARS-CoV-AE感染的細胞中，細胞質中存在的細胞內成熟病毒的數量低于用重組野生型病毒感染的細胞中的數量(附圖12A)。這種觀察與缺陷性病毒的更低的病毒滴度一致。冠狀病毒通過出芽到高爾基復合體的腔中來組裝(Ng et al.， 2003 )。因而，分析了高爾基復合體的腔內核殼內陷的位置。在rSARS-CoV-AE的情況下，在這些位置上成熟病毒的數目低于重組野生型病毒感染的細胞中的，在 rSARS-CoV- △ E病毒感染的細胞的細胞質中觀察到致密材料的增加，可能相應于異常的病毒顆粒(附圖12B)。在泡嚢中作為單個顆粒(數據未顯示)或作為擴大的泡囊中病毒的群組見到病毒顆粒(附圖12C)。在這種情況下，在rSARS-CoV感染的細胞中成熟病毒的數量顯著地高于rSARS-CoV-AE感染的細胞中的。此外，在rSARS-CoV-AE感染的細胞中觀察到的泡嚢含有散布在病毒顆粒之間的致密的、粒狀材料，其可能相應于取消的病毒組裝過程。總的說來，這些數據表明，E蛋白在病毒運輸和組裝中具有重要作用。通過感染細胞的超薄切片以及濃縮的負染色病毒的電子顯微鏡評估，研究了 E蛋白刪除對SARS-CoV病毒顆粒形態的潛在影響。對于負染色電子顯微鏡檢查，感染20h的Vero E6細胞的上清液用 10%甲醛固定，使用Electron Microscopy Rotor (EM-90, Beckman)以 21psi在Beckman airfuge中濃縮物到碳包被的電離銅網上。篩網用2% 磷鴒酸pH 7染色1分鐘。在Jeol JEM-1010 ( Tokyo, Japan )電子顯微鏡中在80kV檢查樣品(附圖13)。通過電子顯微鏡檢查在超薄切片中觀察到的細胞外的病毒顆粒形態對于rSARS-CoV-AE和重組野生型病毒是類似的，沒有見到異常結構(附圖13A)。純化的重組野生型病毒和rSARS-CoV-AE病毒的負染色顯示了由棒狀突出物圍繞的顆粒，表明E蛋白表達表面上對病毒顆粒形態具有很小的影響(附圖13B)。盡管如此，與野生型病毒相比，純化的 rSARS-CoV-AE病毒顯示了高頻率的病毒聚集和無定形結構，表明缺陷性病毒對機械剪切力更敏感。實施例15 倉鼠中的病毒復制通過感染Golden Syran倉鼠來測定rSARS-CoV和rSARS-CoV-厶 E病毒的體內生長(Roberts et al, 2005 )。這個實施例中采用的動物方案由過敏和傳染疾病國家協會動物照料和使用委員會批準。雄性Golden Syrian倉鼠LVG ( SYR )從Charles River Laboratories ( Wilmington, MA )獲得，在單獨的通風的微隔離嚙齒動物籠中配對居住。在開始以下實驗前倉鼠休息至少3天。Golden Syrian倉鼠(44天齡)通過異氟烷(USP誦Baxter Healthcare, Deerfield, IL )吸入來輕輕地麻痹，用100 Ml總體積中的103 TCID50 的rSARS-CoV或rSARS-CoV-AE鼻內地接種。病毒接種后兩天、五天和八天處死倉鼠(4只倉鼠/組/天)，獲取肺和鼻甲，并冷凍保存。對于病毒滴度測定，解凍組織樣品，稱重，勻化成具有慶大霉素 (Invitrogen )和兩性霉素B ( Quality Biological, Gaithersburg, MD )的 Leibovitz， s L-l 5培養基(Invitrogen, Grand Island, NY)中的最終10。/t) (w/v)懸浮液，其分別以O.l mg/L和5 mg/L的終濃度添加到組織培養基中。通過低速離心來澄清組織勻漿，如早先Subbarao et al., 2004 描述的在24和96孔板中在Vero細胞單層中測定病毒滴度。病毒滴度表示為組織的TCIDWg,檢測下限是1015 TCID5。/g。測定了三個噬斑形成單位(pfu)相當于一個TCID50。用rSARS-CoV- △ E病毒感染的倉鼠的鼻甲和肺中病毒滴度是重組野生型病毒的100和1000分之一，表明rSARS-CoV-AE病毒在這個物種中的生長是減毒的(附圖14)。在感染后八天，在用重組野生型病毒感染的動物的肺和鼻曱中檢測到傳染性的病毒，而在這個時點缺陷性病毒已經被清除(附圖14)。實施例16 倉鼠的肺的病理組織學檢查在Golden Syrian倉鼠中比較與重組野生型病毒和rSARS-CoV- △ E 病毒的復制相關的肺部病理(附圖15)。異氟烷麻痹的Golden Syrian倉鼠(40天齡)用100 m 1總體積的 103 TCID50 rSARS-CoV ( —只倉鼠/天)或rSARS-CoV- △ E (兩只倉鼠/ 天)鼻內地接種。感染后兩天(附圖15A和15B)和五天(附圖15C 和15D)處死倉鼠，肺充氣并保存在10%福爾馬林中并處理用于組織病理學檢查(附圖15A和15C)和免疫組織化學(附圖15B和15D)。肺在10%中性緩沖的福爾馬林中固定三天，常規處理，隨后石蠟包埋。使用蘇木素伊紅染色的切片組織病理學地研究肺。與病毒滴度(參見上文實施例15) —致，免疫組織學分析揭示了在rSARS-CoV感染的動物的肺中比rSARS-CoV-AE感染的動物中更高的抗原濃度。與用rSARS-CoV-AE病毒感染的相比，用重組野生型病毒感染的動物顯示了更多的肺部疾病(更多的細支氣管炎和間隙性肺炎)(附圖15)。這表明，在倉鼠模型中在生長和伴隨的病理方面， rSARS-CoV-AE病毒是減毒的。實施例17制備缺少一個或多個結構和非結構基因的減毒病毒制備以下的進一步的突變體缺少SARS-CoV的全部非結構基因(基因3b、 6、 7a、 7b、 8a和8b)的病毒。缺少全部非結構基因(基因3b、 6、 7a、 7b、 8a和a)和一個結構基因(基因E)的病毒。缺少全部非結構基因(基因3b、 6、 7a、 7b、 8a、 8b)和結構基因 3a的病毒。缺少全部非結構基因(基因3b、 6、 7a、 7b、 8a、 8b)和兩個結構基因3a和E的病毒。缺少結構基因(E、 3a,或兩者，和非結構基因6、 7a、 7b、 8a、 8b和9b的任意組合，例如分別缺少基因6、 7a、 7b、 8a、 8b和9b的病毒，以及缺少基因6、 7a、 7b、 8a、 8b、 9b和E的組合)的病毒。基因9b刪除。為了消除基因9b的表達(a) 在這個基因的起始密碼子中引入點突變。(b) 親本病毒中存在的ATG突變成ACG以防止相應蛋白的表達。(c) 在這個突變的ACG后引入終止密碼子，ORF內的另兩個同相的ATG被改變(參見附圖16)。基因9b與基因N完全重疊；因而所有引入了 N基因的突變對于N 基因的序列是沉默的(即，不引起氨基酸改變)。基因3b刪除為了消除基因3b的表達，使用以下策略(附圖17): 在這個基因的起始密碼子中引入點突變。親本SARS-CoV中存在的起始密碼子ATG突變成ACG。在基因中同相地存在的第二和第三個ATG用ACG替代。設計所有這些突變來引入基因3a和E中的沉默改變，其與基因3b重疊。基因3a和3b的同時刪除。為取消基因3a和3b的表達，我們采用了三種策略來工程化編碼具有無功能的基因3a和3b的SARS-CoV的cDNA (附圖17):(a) 在控制基因3 mRNA表達的TRS中存在的核心序列通過改變序列ACGAAC成ACCAAT來鈍化。(b) 這些基因的部分通過在SARS-CoV序列的核苷酸25274 和26015之間引入刪除來部分地刪除。(c) 基因3a的起始密碼子ATG由ACG替代。此外，在靠近第一個的地方引入終止密碼子。參考書目AlmazSn, F., J. M. GonzSlez, Z. Prizes, A, Izeta, E. Calvo, J. Plana-Dur&n, and Ii. Enjuanes (2000) . Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc. Wa", Acad. Sci, C7SA 97:5516-5521,Alonso, S., Izeta A., Sola I., and Enjuanes L. (2002a). Transcription regulatory sequences and mRNA expression levels in the coronavirus transmissible gastroenteritis virus. J. ViroJ. 76:1293-1308Alonso, S., Sola, I., Teifke, J., Reimann, I,, Izeta, A，, Balach, M., Plana-Dur各n, J，, Moorrnann, R. J. M., and Enjuanes, Ij. (2002b) , In vitro and in vivo expression of foreign genes by transmissible gastroenteritis coronavirus-derived minigeno-mes. J. Gen, ViroJ. 83, 567-573.Baudoux P, Carrat C, Besnardeau Charley B, and Liaude H (l"8) . Coronavirus pseudoparticles formed with reconOainant M and E proteins induce alpha interferon synthesis by leukocytes, J, ViroJ， 72:8636-8643.Casais, R., V. Thiel, S. G. Siddell, D. Cavanagh, and P. Brit-ton (2001). Reverse genetics system for the avian coronavirus infectious bronchitis virus. J, ViroJ. 75:12359-12363,Chang, K.-Y., and Tinoco, I. (1934). Characterization of a "kissing" hairpin complex derived from the human immunodeficiency virus genome. Proc, Wa". Acad, Sci. C/SA 91, 8705-8709.de Haan CAM, Masters PS, Shen S, Weisa S, and Rottier PJM (2002). The group-specific murine coronavirus genes are notessential, but their deletion, by reverse genetics, is attenuating in the natural host. ViroJogy 296:177-189,Drosten, C., S. Gunther, W. Preiser, S. van der Werf, H. R, Brodt, S, Becker, H. Rabenau, M. Panning, Kolesnikova, R. A, Fouchier, A. Berger, A. M. Burguiere, J. Cinatl, M. Eick-mann, N. Escriou, K, Grywna, S. Kramme, J. C, Manuguen:a, S, Muller, V. Rickerts, M. Sturmejr, S. Vieth, H， D. Klenk, A. D. Osterhaus, H. Schmitz, and H. W, Doerr (2003). Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome. W. Eng2, <J. Med, 348:1967-1976.Enjuanes, Li, (Ed.) (2005). Coronavirus replication and reverse genetics. Springer, Berlin.Enserink M. (2003) Infectious diseases, SARS-CoV researchers report new animal models. Science 302(5643):213,Fischer, F,, Stegen, C. P., Masters, P. S,, and Samsonoff, W. A, (l"8) . Analysis of constructed E gene mutants of mouse hepatitis virus confirms a pivotal role for E protein in coro-rxavirus assembly. J. ViroJ. 72, 7885-7894.Gillim-Ross Taylor J, Scholl DR, Ridenour J, Masters PS, and Wentworth DE (2004). Discovery of novel human and animal cells infected by the severe acute respiratory syndrome coro-navirus by replication-specific multiplex reverse transcrip-tion-PCR. J. CJin, MicroJbica, 42:3196-3206.GonzSlez, J. M,, Z. P§r es, F. AlmazAn, E. Calvo, and L. En-juanes (2002〉. Stabilization of a full-length infectious cDNA clone of transmissible gastroenteritis coronavirus by insertion of an intron, <J. Virol. 76:4655-4661.Haijema BJ, volders H, and Rottier PJ (2004) , Live, attenuated coronavirus vaccines through the directed deletion of group-specific genes provide protection against feline infectious peritonitis. J. ViroJ. 78:3863-3871.Hattermann K, Muller MA, Nitsche A, Wendt S, Donoso Mantke o, and Niedrig M (2005). Susceptibility of different eukaryotic cell lines to SARS-corcmavirus. Arch. ViroJ. 150:1023-1031.Ho Y, Lin PH, Liu CY, Lee SP, and Chao YC (2004) . Assembly of human severe acute respiratory syndrome coronavirus-like particles. Bioc/ie;n. Biophys, i es. Co廳un. 318:833-838.Holmes, K. V., and Enjuanes (2003). Virology. The SARS-CoV coronavirus: a postgrenomic era. Science 300:1377-1378.Huang Y, Yang ZY, Kong WP, and Nabel GJ (2004) . Generation of synthetic severe acute respiratory syndrome coronavirus pseu-doparticles: implications for assembly and vaccine production. J. ViroL 78:12557-12565.Izeta, A., Smerdou, C., Alonso, S., Penzes, Z., Mendez, A., Plana-Dur各n, J., and Enjuanes, (1333), Replication andpackaging of transmissible gastroenteritis coronavirus-derived synthetic minigenomes. J. ViroJ. 73, 153S-1545.Kiyono et al. (1336), Mucosal Vaccines. Academic Press, New York.Kuiken T, van den Hoogerx BG, van Riel DA, Laman JD, van Amerongen G, Sprong Li, Fouchier RA, Osterhaus AD. (2004) Experimental human metapneumovirus infection of cynomolgus macaques (Macaca fascicularis) results in virus replication inciliated epithelial cells and pneumocytes with associated lesions throughout the respiratory tract. An J PathoJ. 164:1893.Kuo, Li., Hurst, R., and Masters, P. S. (2002). 21st Annual Meeting, Lexington, Kentucky.Kuo, Li,, and Masters, P. S. (2003). The small envelope protein E is not essential for murine coronavirus replication. J. Vi-ro_I. 77:4597-4608.Marra, M. A., S. J, Jones, C. R. Astell, R. A. Holt, A. Brooks-Wilson, Y. S. Butterfield, J. Khattra, J. K. Asano, S. A. Barber, S. Y. Chan, A. Cloutier, S. M. Coughlin, !〕. Freeman, N. Gim, 0. Ij. Griffith, S. R. I>each, M, Mayo, H. McDonald, S, B. Montgomery, P. K, Pandoh, A. S, Petrescu, A. G, Robertson, J. E, Schein, A. Siddiqui, D. E. Stnailus, J, M. Stott, G. S. Yang, F. Plu,er, A. Andonov, H. Artsob, N. Bas-tien, K. Bernard, T, F. Booth, D. Bowness, M. Czub, M. Drebot, L. Fernando, R, Flick, M. Garbutt, M. Gray, A, Grolla, S. Jones, H. Feldmann, A. Meyers, A, Kabani, Y. Li, S. Normand, U. Stroher, G. A. Tipples, S. Tyler, R. Vogrig, D. Ward, B. Watson, R. C. Brunham, M. Krajden, M. Petrie, D. M. Skowron-ski, C. Upton, and R. Roper (2003) . The genome sequence of the SARS-CoV-associated coronavirus. Science 300:1333-1404,Martina BE, Haagmans BU, Kuiken T, Fouchier RA, Ri醒elzwaan GF, Van Amerongen G, Peiris JS, Liirn W, Osterhaus AD. (2003). Virology: SARS-CoV virus infection of cats and ferrets. Wature 425:915.Mortola E, and Roy P, Efficient assembly and release of SARS coronavirus-like particles by a heterologous expression system. reSS ietters 2004; 576:174-178.Mossel EC, Huang C, Narayanan K, Makino S, Tesh RB, and Peters CJ (2005). Exogenous ACE2 expression allows refractory cell lines to support severe acute respiratory syndrome coronavirus replication. J. Virol. 73:3846-3850.Ng ML, Tan SH, See EE, Ooi EE, and Ling A.E. (2003)， Proliferative growth of SARS coronavirus in Vero E6 cells, J. Gen, ViroJ. 84:3231-3303.Ortego, J,, Escors, D., Laude, H., and Erxjuanes, L (2002), Generation of a replication-competent, propagation-deficient virus vector based on the transmissible gastroenteritis coro-navirus genome. J. WroJ, 76, 11518-11523.Ortego, J. , Sola, I., Almazan, F., Ceriani, J. E., Riquelme, C., Balasch, M., Plami-Dur5n, J,, and Enjuanes, Ij, (2003). Transmissible gastroenteritis coronavirus gene 7 is not essential but influences in vivo virus replication and virulence. ViroJogy 308, 13-22.Roberts A, . Vogel Guarner J, Hayes N, Murphy B, Zaki S, and Subbarao K (2005). Severe acute respiratory syndrome coronavi-rus infection of golden Syrian hamsters. J, ViroJl, 79:503-511.Rota, P. A., M. S. Oberste, S. S. Monroe, W. A, Nix, R. Cam-pagnoli, J. P. Icenogle, S. Penaranda, B. Bankamp, K, Maher, M. H. Chen, S. Tong, A. Tamin, L, Lowe, M, Fzrace, J. L. De-Risi, Q. Chen, D. Wang, D. D. Erdman, T. C. Peret, C. Burns, T. G. Ksiazek, P, E, Rollin, A. Sanchez, S. Liffick, B. Hollo-way, J. ]Limor, K. McCaustland, M, Olsen-Rasmussen, R. Fouch-ier, S. Gimther, A. D. Osterhaus, C. Drosten, M. A. Pallansch, L, J, Anderson, and W. J. Bellini (2003). Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Science 300:1334-1399.Sambrook, CT., and Russel D,W, (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.Sinchez, C. M,, Isseta, A., SSnchez-Morgado, J, M., Aloriso, S., Sola, i., Balasch, M,, Plana-DurSn, J, and Enjuanes, L, (1999), Targeted recombination demonstrates that the spike gene of transmissible gastroenteritis coronavirus is a determinant of its enteric tropism and virulence. J, Viro2. 73:7607-7618.Sawicki, S, G., and D. Sawicki (1998), A new model for coronavirus transcription. Adv. ￡xp,他d, Sio_i, "0:215-219.Sawicki & Sawicki (1990), Coronavirus transcription: subgenomic mouse hepatitis virus replicative intermediates function in RNA synthesis. JViroi. 64(3):1050-6.Sethna, P. B., Hung, S.-L., and Brian, D. A. (1989). Coronavirus subgenomic minus-atranci RNAs and the potential for mRNA replicons. Proc, WatJL Acad. Sci. 86, 5626-5630.Siddell, S. G. (1995). "The Coronaridae," The Viruses (H. Fraenkel-Conrat, and R. R. Wagner, Eds.) Plenum Press, New York.Subbarao K, McAuliffe J, Vogel L, Fahle G, Fischer S, Tatti K, Packard M, Shieh WJ, Zaki S, and Murphy B (2004). Prior infection and passive transfer of neutralizing antibody prevent replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus in the respiratory tract of mice. J. Viro_I. 78:3572-3577.ter Meulen J, Bakker AB, van den Brink EN, Weverling GJ, Martina BE, Haagmans BU, Kuiken T, de Kruif J, Preiser W, Spaan W, Gelderblom HR, Goudsmit J, Osterhaus AD. (2004), Human monoclonal antibody as prophylaxis for SARS-CoV coronavirus infection in ferrets. J:ancet. 26,'363 (9427) :2139-41,Thiel, V., J. Herold, B. Schelle, and S. G. Siddell (2001). Infectious RNA transcribed in vitro from a cDNA copy of the human coronavirus genome cloned in vaccinia virus, J. Ge/j, VI-ro_l, 82:1273-1281.Thiel, V., K, A. Ivanov, A. Putics, T, Hertzig, B. Schelle, S. Bayer, B. Weibrich, E. J' Snijder, H. Rabenau, H. W, Doerr, A. E. Gorbalenya and J. Ziebuhr (2003). Mechanism and enzymes involved in SARS-CoV coronavirus genome expression, J. Gen. Vi-roJ. 84: 2305-2315.Toka, F.N. et al. (2004). Molecular adjuvants for mucosal itn-nvunity. I雇unoJ i ev. 199:100-112.van der Most, R. G, , and Spaan, W. J. M. (1995). Coronavirus replication, transcription, and RNA recombination. In "The Corona viridae " (S. G. Siddell, Ed.), pp. 11-31. Plenum Press, New York.Vennema H, Godeke GJ, Rossen JWA, Voorhout WF, Horzinek MC, Opstelten Dj, and Rottier PJM (1336). Nucleocapsid-independent assembly of coronavirus-like particles by co-expression of viral envelope protein genes. E則O J, 15:2020-2028.Wang, K. , C. Boysen, H. Shizuya, M. I. Simon and Ij. Hoods (1997). Complete nucleotide sequence of two generations of a bacterial artificial chromosome cloning vector. J3iorechnigues 23: "2-"4.Yang ZY, Kong WP, Huang Y, Roberts A, Murphy BR, Subbarao K, Nabel GJ. (2004). A DNA vaccine induces SARS-CoV coronavirus neutralization and protective immunity in mice. An J Pat力oJ!. 164il893-900,Yount, B., K, M. Curtis, and R. S, Baric (2000), Strategy for systematic assembly of large RNA and DNA genomes: transmissible gastroenteritis virus model. J. Virol, 74:10600-10611.Yount, B., M. R. Denison, S. R. Weiss, and R, S. Baric (2002). Systematic assembly of a full-length infectious cDNA of mouse hepatitis virus strain A59. J. ViroJ. 76:11065-11078.Yount, B., K. M. Curtis, E. A. Fritz, L. E. Hensley, P. B. Jahrling, E. Prentice, M, R, Denison, T, W, Geisbert, and R. S. Baric (2003). Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Proc. Wa". Acacf. Sci. USA 100:12335-13000.Yount B, Roberts RS, Sims AC, Deming Frieman MB, Sparks J, Denison MR, Davis N, and Baric RS (2005). Severe acute respiratory syndrome coronavirus group-specific open reading frames encode nonessential functions for replication in cell cultures and mice. J, ViroJ, 79:14909-14922.Ziebuhr, J., E. J. Snijder, and A. E. Gorbalenya 《2000). Virus-encoded proteinases arid proteolytic processing in the Ni-dovirales, J, Gen. WroJ. 81:853-879.zafliga, S., I. Sola, S. Alonso, and l>, Enjuanes (2004). Sequence motifs involved in the regulation of discontinuous coronavirus subgenomic RNA synthesis.J.Viroi. 78:980-994.
權利要求
1.編碼減毒的SARS-CoV病毒的核酸，當與相同細胞培養物中的野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比時，所述減毒的SARS-CoV病毒能夠在細胞培養物中產生的最大病毒滴度降低至少2的因數。
2. 編碼SARS-CoV病毒的核酸，其中所述核酸可通過包括步驟的方法獲得，其中通過修改編碼SARS-CoV E蛋白的基因的序列來修飾所迷SARS-CoV病毒的基因組，從而所迷核酸不能表達功能性的E蛋白。
3. 編碼SARS-CoV病毒的核酸，其中所述核酸不編碼 SARS-CoV病毒的功能性蛋白E的序列。
4. 編碼SARS-CoV病毒的核酸，其中所述核酸包含編碼病毒蛋白復制酶、S、 M和N的序列，并進一步包含或不包含編碼蛋白3a的序列。
5. 根據權利要求4的核酸，其中所述核酸不包含編碼病毒蛋白 E、 6、 7a、 7b、 8a、 8b和9b的序列。
6. 編碼SARS-CoV病毒的核酸，其中所述核酸包含病毒蛋白復制酶、S、 M、 N和E的序列，并進一步包含或不包含編碼蛋白3a的序列。
7. 根據權利要求6的核酸，其中所述核酸不包含編碼病毒蛋白 6、 7a、 7b、 8a、 8b和9b的序列。
8. 根據權利要求2到7的任一項的核酸，其中所述病毒在體內是減毒的，并且在體外可以是減毒的。
9. 根椐權利要求1到8之一的核酸，其中(a) 編碼復制酶的核酸序列是SEQIDNO: 1和2，或與SEQID NO: 1和2的序列具有至少70%、優選的至少85%或至少95%的同源性的序列；和/或(b) 編碼N或9a蛋白的核酸序列是SEQ IDNO:3，或與SEQ ID NO: 3的序列具有至少70%、優選的至少85%或至少95%的同源性的序列；和/或(c) 編碼S蛋白的核酸序列是SEQIDNO: 4,或與SEQ ID NO: 4的序列具有至少70%、優選的至少85%或至少95%的同源性的序列；和/或(d) 編碼M蛋白的核酸序列是SEQIDNO:5,或與SEQIDNO: 5的序列具有至少70%、優選的至少85%或至少95%的同源性的序列；和/或(e) 編碼E蛋白的核酸序列是SEQIDNO: 6,或與SEQ ID NO: 6的序列具有至少70%、優選的至少85%或至少95%的同源性的序列；和/或(f) 編碼基因3a的蛋白的核酸序列是SEQIDNO: 12,或與SEQ ID NO: 4的序列具有至少70°/。、優選的至少85%或至少95%的同源性的序列；和/或(g) 編碼基因6的蛋白的核酸序列是SEQIDNO: 14，或與SEQ ID NO: 14的序列具有至少70%、優選的至少85%或至少95%的同源性的序列；和/或(h) 編碼基因7a的蛋白的核酸序列是SEQIDNO: 15,或與SEQ ID NO: 15的序列具有至少70%、優選的至少85%或至少95%的同源性的序列；和/或(i) 編碼基因7b的蛋白的核酸序列是SEQIDNO: 16,或與SEQ ID NO: 16的序列具有至少70%、優選的至少85%或至少95%的同源性的序列；和/或(j) 編碼基因8a的蛋白的核酸序列是SEQIDNO:17,或與SEQ ID NO: 17的序列具有至少70%、優選的至少85%或至少95%的同源性的序列；和/或(k)編碼基因8b的蛋白的核酸序列是SEQIDNO:18,或與SEQ ID NO: 18的序列具有至少70%、優選的至少85%或至少95%的同源性的序列；和/或(1)編碼基因9b的蛋白的核酸序列是SEQIDNO: 19，或與SEQ ID NO: 19的序列具有至少70%、優選的至少85%或至少95%的同源性的序列。
10. 根據權利要求1到9之一的核酸，其中當與相同的細胞培養物中野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比時，所述減毒的 SARS-CoV病毒能夠在細胞培養物中產生的最大病毒滴度降低至少5 的因數，優選的至少10或20的因數。
11. 根據權利要求1到IO之一的核酸，其中當與相同細胞培養物中野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比時，所迷減毒的 SARS-CoV病毒能夠在細胞培養物中產生的最大病毒滴度降低優選的 2到100之間的因數、更優選的5到50之間的因數，以及最優選的10 到25之間的因數。
12.根據權利要求1的核酸，其中所述細胞培養物是用所述核酸轉染的Vero E6、 CaCo-2或Huh7細胞的培養物。
13. 根據權利要求1到12之一的核酸，其中所述核酸進一步包含不來自SARS-CoV的序列，優選的是外源基因。
14. 根據權利要求1到13之一的核酸，其中所述核酸進一步編碼共刺激分子，所述共刺激分子選自由CD80、 CD86、免疫刺激細胞因子如TNF-cx、 IFN-y、趨化因子、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素-2(IL-2) 、 IL-12和IL-18構成的列表。
15. 包含根據權利要求1到14的任何一項的核酸的宿主細胞。
16. 包含權利要求1到14的任何一項的核酸的SARS-CoV病毒顆粒。
17. 可通過用權利要求l到14的任何一項的核酸轉染宿主細胞獲得的SARS-CoV病毒顆粒。
18. 疫苗，包含根據權利要求16或17的SARS-CoV病毒顆粒、或根據權利要求1到14的任何一項的鈍化的SARS-CoV病毒顆粒或核酸、或根據權利要求15的宿主細胞，和藥學上可接受的佐劑、載體或賦形劑。
19. 根據權利要求18的疫苗，其中所述疫苗向哺乳動物的施用產生免疫反應，所述免疫反應降低或消除由SARS-CoV病毒感染引起的疾病癥狀。
20. 根據權利要求18或19的疫苗，其中所述疫苗將施用給人類或動物，其中所述動物優選的是環尾貓熊、浣熊或白鼬。
21. 根據權利要求18到20之一的疫苗，其中所述疫苗將口服地、肌內地、靜脈內地、皮下地或鼻內地施用。
22. 根據權利要求18到21的任一項的疫苗，其中所述佐劑選自由細胞因子、TNF-a、 IFN-y、趨化因子、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素-2 (IL-2) 、 IL-12、 IL-18、 IL-15和IL-23構成的列表。
23. 根據權利要求16或17的病毒顆粒或根據權利要求1到M的核酸用于制備疫苗的用途，所述疫苗用于接種哺乳動物、特別是人類、環尾貓熊、浣熊或白鼬對抗SARS-CoV感染。
24. 制備SARS-CoV疫苗的方法，包括通過修改根據權利要求2 到9的核酸來修飾包含SARS-CoV病毒基因組的核酸。
25. 根椐權利要求24的制備SARS-CoV疫苗的方法，包括修改編碼SARS-CoV E蛋白的基因的序列，從而所迷基因不能表達功能性的E蛋白。
26. 根據權利要求25的方法，其中所述方法進一步包括修改 SARS-CoV的基因組的序列，從而所迷核酸表達病毒蛋白復制酶、S、 M和N，并且進一步表達或不表達編碼蛋白3a的序列。
27. 根據權利要求26的方法，其中所迷方法進一步包括修改 SARS-CoV的基因組的序列，從而所述核酸不能表達與SARS-CoV基因E、 6、 7a、 7b、 8a、 8b和9b (相應于SEQ ID NO: 6、 14到19)編碼的蛋白質具有至少80%的同源性、優選的至少90%的同源性或至少 95%的同源性的蛋白。
28. 根據權利要求27的方法，其中所述方法進一步包括修改 SARS-CoV的基因組的序列，從而所述核酸不能表達與SARS-CoV基因3a、 3b、 6、 7a、 7b、 8a、和8b (相應于SEQ ID NO: 12到18)編碼的蛋白質具有至少80。/。的同源性、優選的至少90%的同源性或至少 95%的同源性的蛋白。
29. 根據權利要求24的方法，其中所述方法進一步包括修改 SARS-CoV的基因組的序列，從而所述核酸表達病毒蛋白復制酶、S、 M、 N和E,并且進一步表達或不表達編碼蛋白3a的序列。
30. 根據權利要求29的方法，其中所述方法進一步包括修改 SARS-CoV的基因組的序列，從而所述核酸不能表達與SARS-CoV基因6、 7a、 7b、 8a、 8b和9b (相應于SEQ ID NO: 14到19)編碼的蛋白質具有至少80%的同源性、優選的至少90%的同源性或至少95%的同源性的蛋白。
31. 根據權利要求24到30之一的方法，其中所述方法進一步包括修改SARS-CoV的基因組的序列，從而所述核酸不能表達除了復制酶S、 M、 N和/或E以外任何SARS-CoV衍生的蛋白編碼序列，并進一步表達或不表達編碼蛋白3a的序列。
32. 根據權利要求24或權利要求31的方法，其中所述方法進一步包括向宿主細胞中導入所述修飾的核酸，并分離編碼所述修改的基因組的核酸或包含所述修飾的核酸的SARS-CoV病毒顆粒。
33. 根據權利要求24到32之一的方法，其中所述方法進一步包括與藥學上可接受的佐劑、載體或賦形劑混合所述核酸或所迷 SARS-CoV病毒顆粒。
全文摘要
本發明涉及編碼減毒的SARS-CoV病毒的核酸，所述SARS-CoV病毒能在細胞培養物中產生最大病毒滴度，當與相同細胞培養物中野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比時，所述最大病毒滴度降低至少2的因數。根據本發明的進一步的方面，所述編碼減毒的SARS-CoV病毒的核酸可通過包括步驟的方法獲得，其中其中通過修改編碼SARS-CoV E蛋白的基因的序列來修飾所述SARS-CoV病毒的基因組，從而所述核酸不表達功能性的E蛋白。本發明進一步涉及由這些核酸編碼的病毒以及所述核酸和所述病毒的醫藥用途。
文檔編號C12N7/04GK101248174SQ200680031114
公開日2008年8月20日申請日期2006年6月23日優先權日2005年6月24日
發明者E·阿爾瓦雷茨戈梅茨, F·阿爾馬詹托拉爾, L·恩朱阿尼斯桑切斯, M·洛佩茨德迪戈申請人:康斯喬最高科學研究公司

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