專利名稱::表達異源蛋白酶的方法和組合物的制作方法表達異源蛋白酶的方法和組合物1.發明領域在一個方面,本發明提供了在天然不表達蛋白酶或蛋白酶原(pro-protease)的細胞內表達蛋白酶或蛋白酶原的方法和組合物。在其他方面,本發明提供了在這種細胞內生產病毒如流感病毒的方法。在其他方面,本發明提供了提高生長在表達這種異源蛋白酶或蛋白酶原的細胞內的流感病毒的效價的方法。再在另一方面,本發明提供了用于所述方法和組合物的來自灰色鏈霉菌OS^e;^om;;c"gn&w力的異源蛋白酶。2.
背景技術:
:流感大流行的定義是因流感疾病而導致的全球性發病率和死亡率迅猛增加。有幾種因素影響疾病流行的嚴重程度和范圍,其中包括人群的免疫程度低以及病毒在人群中的傳染效率。通常來說,后者不僅受病毒本身的影響,而且受人群的密度和進出該地區的難易的影響。導致大流行的病毒通常都是最近出現的抗原性突變株,人群中的大多數以前未接觸過這種突變株,因而未產生或很少產生對該突變株的免疫。另外,人與人之間的有效傳播是快速流行的先決條件,在動物性病毒向人群傳播的情況下,病毒必須適應在人體內復制,并且能夠有效傳播。流行性感冒傳播速度很快,會造成破壞性的影響。二十世紀最嚴重的大流行是1918年的大流行,在美國有500,000公民死亡,而全球范圍內的死亡人數在2到4千萬之間。大流行流感相對快速地啟動和傳播為應對這種程度的全球性發作提出了幾個問題,給急性應答者和健康工作者施加了極大的負擔。快速鑒定并對出現的大流行作出反應很明顯是解決問題的必要條件;目前在全球范圍內已經建立了幾套程序用于監測正在出現的流感病毒,其中包括很少導致人患病的禽流感病毒。這些監測數據結合預先定義的大流行預警水平可以確定威脅的可能性并為有效應對提供指導。免疫接種是預防流感年度流行所引起的疾病的最重要公共衛生措施。潛在大流行的確定與患病水平開始明顯升高之間短暫的間隔對于制備有效疫苗以保護大部分人群來說是一個大的挑戰。在下一次大流行出現之前儲備疫苗制備技術和生產基礎設施對于減少大量疾病和死亡的出現是十分關鍵的。制備"大流行疫苗"所需要的較短的反應時間將不允許有過長的研究或處理開發時間以提供有效的反應。到目前為止,在美國針對非大流行株的所有商用流感疫苗都是在含胚雞蛋內繁殖的。雖然流感病毒可在雞蛋內良好生長,但是疫苗的生產要依賴雞蛋的可用性。雞蛋供應必須是有組織的,用于疫苗生產的病毒株要在下一次流感季節到來前幾個月篩選出來,這會限制這種方法的靈活性,因此常常會導致疫苗生產和分配的延遲和短缺。不幸的是,某些流感疫苗病毒株,如2003-04季流行的A/Fujian/411/02原型株,在含胚雞蛋內不能很好地復制,因此不得不利用細胞培養分離該病毒株,這種方法不僅昂貴而且生產過程耗時很長。最近幾年已經開發出了在細胞培養物內生產流感病毒的系統(參見,如,Furminger,f^cc/"e尸rat/w"/o",Nicholson等編,TextbookofInfluenza324-332頁;Merten等(1996),尸rat/wc"owo//"/7we"zav/rws/"ce〃cw/Zwms1,vac"力e;,ara"o",Cohen&Shafferman(編),NovelStrategiesinDesignandProductionofVaccines第141-151頁)。一般來說,這些方法都包括用篩選出的病毒株感染合適的永生宿主細胞。雖然相對于在雞蛋內生產疫苗來說可以克服許多困難,但是并不是所有的流感病毒致病株都可以按照已有的組織培養方法良好生長和制備。另外,許多具有理想特征,例如,減毒特性、溫度敏感性和冷適應性,的適于制備減毒活疫苗的病毒株利用已有的方法不能在組織培養物內生長。因此需要l)從細胞培養物生產流感疫苗所需的制造設備和方法和2)開發從細胞培養物制造疫苗的有效技術以預防由季節性流感流行造成的疾病。這些方法和技術可迅速應用于在即將到來的流感大流行時制造和分配流行病疫苗。為使基于細胞培養物的流感疫苗獲得批準必須克服的諸多障礙之一是需要蛋白水解切除血凝素(HA)蛋白以使新形成的病毒有效感染新細胞。在動物感染期間,通過動物的內源性胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶切除HA蛋白。在培養時,內肽酶活性通常不足以使流感病毒有力復制。因此,在用感興趣的流感病毒感染培養細胞后通常在培養基中加入蛋白酶如胰蛋白酶以提高病毒產量。參見,例如,美國專利號5,698,433。然而,在細胞培養基中加入外源蛋白酶會在培養基中引入額外成分、增加復雜性并需要接受額外的管理。此外,加入外源胰蛋白酶(trypin)增加了用細胞培養法制造疫苗的花費。因此,需要不需要添加外源蛋白酶的在培養物中生長流感病毒的新方法和組合物。此外,這種方法和組合物必須克服在細胞內表達活性蛋白酶的固有毒性。本發明能滿足這些及其他未滿足的需求。本文所引用或討論的參考文獻并不等于承認這些是本發明的現有技術。另外,專利的引用也不等于承認其有效性。3.發明概述本發明提供了在本文中稱為"本發明細胞"的細胞,其包含編碼蛋白酶或蛋白酶原的核酸,從而該細胞表達該蛋白酶或蛋白酶原的水平將高于缺乏該核酸的細胞的通常表達水平。在某些實施方式中,所述細胞正常情況下不表達該蛋白酶或蛋白酶原。在某些實施方式中,所述細胞以較低水平,例如以低于最佳或所需特定生物活性的水平表達該蛋白酶或蛋白酶原,所述特定生物活性例如培養諸如流感病毒的病毒。在某些方面,本發明提供了一種包含編碼蛋白酶或蛋白酶原的核酸的細胞,其中所述編碼蛋白酶或蛋白酶原的核酸被穩定整合入該細胞的基因組中。在其他方面,本發明提供了一種包含編碼蛋白酶或蛋白酶原的核酸的細胞,其中所述編碼蛋白酶或蛋白酶原的核酸存在于染色體外。在其他方面,本發明提供了一種包含編碼蛋白酶或蛋白酶原的核酸的細胞,其中所述編碼蛋白酶或蛋白酶原的核酸在該細胞內瞬時表達。在某些實施方式中,所述細胞表達該蛋白酶或蛋白酶原。在某些實施方式中,所述細胞組成型表達該蛋白酶或蛋白酶原。在某些實施方式中,所述細胞誘導型表達該蛋白酶或蛋白酶原。在某些實施方式中,所述細胞分泌該蛋白酶或蛋白酶原。在某些實施方式中,所述細胞在細胞的胞質溶膠中表達該蛋白酶或蛋白酶原。在某些實施方式中,所述蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。在某些實施方式中,所述絲氨酸蛋白酶是S1家族蛋白酶。在某些實施方式中,所述蛋白酶是胰蛋白酶。在某些實施方式中,所述絲氨酸蛋白酶是細菌枯草桿菌蛋白酶。在某些實施方式中,所述蛋白酶是灰色鏈霉菌的SPRT。在某些實施方式中,所述蛋白酶是表l所列的蛋白酶。在某些實施方式中,所述蛋白酶是蛋白酶原。在某些實施方式中,所述蛋白酶原是胰蛋白酶原。在某些實施方式中,所述蛋白酶原被加工成活性蛋白酶。在某些實施方式中,所述蛋白酶或蛋白酶原在誘導型啟動子控制之下表達。在某些實施方式中,所述誘導型啟動子受干擾素或干擾素誘導的下游信號分子誘導。在某些實施方式中,所述誘導型啟動子受四環素-調控的表達系統誘導。在某些實施方式中,所述蛋白酶或蛋白酶原在組成型活性啟動子控制之下表達。在某些實施方式中,所述編碼蛋白酶或蛋白酶原的核酸包含指導該蛋白酶或蛋白酶原分泌的分泌信號的編碼序列。在某些實施方式中,所述細胞表達約O.lng至約50嗎蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達約1ng至約50嗎蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達約10ng至約50嗎蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達約100ng至約50嗎蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達約1嗎至約50嗎蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達約0.1ng至約5嗎蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達約0.1ng至約100ng蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達約0.1ng至約10ng蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達約0.1ng至約lng蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達的蛋白酶或蛋白酶原的量足以提高在表達該蛋白酶或蛋白酶原的細胞培養物中生長的病毒的效價。在某些實施方式中,所述蛋白酶或蛋白酶原的分子量基于該酶的蛋白酶原形式計算。在某些實施方式中,所述蛋白酶或蛋白酶原的分子量基于該蛋白酶的成熟、活性形式計算。在某些實施方式中,所述細胞表達至少約O.lng蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達至少約1ng蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達至少約10ng蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達至少約100ng蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達至少約1嗎蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達至少約10嗎蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達至少約20嗎蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達至少約30嗎蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達至少約40嗎蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達至少約50嗎蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞是細菌細胞。在某些實施方式中,所述細菌細胞是大腸桿菌(Eco/Z)細胞。在某些實施方式中,所述細胞是哺乳動物細胞。在某些實施方式中,所述哺乳動物細胞是犬細胞。在某些實施方式中,所述犬細胞是MDCK細胞。在某些實施方式中,所述MDCK細胞是非致瘤的。在某些實施方式中,所述哺乳動物細胞是靈長類細胞。在某些實施方式中,所述靈長類細胞是非洲綠猴或人類細胞。在某些實施方式中,所述細胞是鳥類細胞。在某些實施方式中,所述鳥類細胞是雞細胞。在另一方面,本發明提供了一種生產病毒的方法,該方法包括用一種病毒感染本發明的細胞,在允許該病毒復制的條件下培養該細胞,以及從細胞培養物中收集病毒。在一具體實施方式中,所述病毒是流感病毒。在另一方面,本發明提供了一種生產病毒的方法,所述方法包括用包含病毒基因組的核酸轉染本發明的細胞,在允許該病毒復制的條件下培養該細胞,以及從細胞培養物中收集病毒。在一具體實施方式中,所述病毒基因組是流感基因組,而所述病毒是流感病毒。一些實施方式中,所述流感病毒對應于乙型流感病毒。一些實施方式中,所述流感病毒對應于甲型流感病毒。在某些實施方式中,所述病毒包括減毒流感病毒、冷適應性流感病毒、溫敏流感病毒、或具有這些所需特性的任意組合的病毒。一實施方式中,所述流感病毒是B/AnnArbor/1/66流感病毒株,例如B/AnnArbor/1/66的冷適應性、溫敏、減毒毒株。在另一個實施方式中,所述流感病毒是A/AnnArbor/6/60流感病毒株,例如,A/AnnArbor/6/60的冷適應性、溫敏、減毒毒株。在某些實施方式中,所述方法包括回收流感病毒并用該病毒來制備諸如疫苗等免疫原性組合物。一實施方式中,所述病毒在施用于例如鼻內給予對象后能夠引發免疫應答。一些實施方式中,用于制備疫苗的病毒在施用前經滅活,在其他實施方式中,用活的減毒病毒來制備疫苗。在某些實施方式中,按照本發明的方法制造甲型和乙型流感病毒的重組體和重配體(reassortant)。一實施方式中,制備的疫苗包含從通過本發明方法制造的病毒衍生的活的、滅活的、或殺死的病毒。一實施方式中,通過本發明方法制造的病毒被用來在細胞培養物或蛋中復制其他病毒。一實施方式中,提供的疫苗包含從通過本發明方法制造的病毒衍生的免疫原性多肽。在某些實施方式中,所述細胞表達蛋白酶原,且所述方法還包括在培養基中添加外源蛋白酶。在某些實施方式中,所述外源蛋白酶的最大添加濃度約O.lug/ml。在某些實施方式中,所述外源蛋白酶是胰蛋白酶。在某些實施方式中,所述病毒是DNA病毒。在某些實施方式中,所述病毒是RNA病毒。在某些實施方式中,所述病毒是單鏈DNA病毒。在某些實施方式中,所述病毒是雙鏈DNA病毒。在某些實施方式中,所述病毒是正義單鏈RNA病毒。在某些實施方式中,所述病毒是負義單鏈RNA病毒。在某些實施方式中,所述病毒是雙鏈RNA病毒。在某些實施方式中,所述病毒是逆轉錄病毒。在另一方面,本發明提供了一種復制流感病毒的方法,該方法包括用流感病毒感染本發明的細胞,在允許該流感病毒復制的條件下培養該細胞,以及從細胞培養物收集流感病毒。在某些實施方式中,這種條件不包括外源添加的蛋白酶或蛋白酶原,例如,胰蛋白酶或胰蛋白酶原。再在另一個方面,本發明提供了一種復制流感病毒的方法,該方法包括用編碼流感基因組的核酸轉染細胞,在允許該流感病毒復制的條件下培養該細胞,以及從細胞培養物收集流感病毒。在某些實施方式中,這種條件不包括外源添加的蛋白酶或蛋白酶原,例如,胰蛋白酶或胰蛋白酶原。在某些實施方式中,所述細胞表達正常情況下該細胞不表達的蛋白酶原或酶活性蛋白酶。在某些實施方式中,所述細胞是哺乳動物細胞。在某些實施方式中,所述細胞是鳥類細胞。在某些實施方式中,所述細胞是靈長類細胞、犬細胞、倉鼠細胞、小鼠細胞或大鼠細胞。在某些實施方式中,所述細胞是MDCK細胞。在某些實施方式中,所述細胞是Vero細胞。在某些實施方式中,所述細胞是雞細胞。再在另一個方面,本發明提供了一種提高生長在細胞培養物中的流感病毒效價的方法,該方法包括在細胞培養物中培養所述流感病毒,其中所述細胞培養物中的細胞表達蛋白酶或蛋白酶原,該蛋白酶或蛋白酶原i)對所述細胞異源,和ii)切除了所述流感病毒的血凝素,從而,相對于通過在不表達異源蛋白酶或蛋白酶原的細胞中培養流感病毒獲得的效價而言,提高了生長在所述細胞培養物中的流感病毒效價。在某些實施方式中,所述細胞穩定表達該異源蛋白酶。在某些實施方式中,所述細胞組成型表達該異源蛋白酶。在某些實施方式中,所述細胞誘導型表達該異源蛋白酶。在某些實施方式中,所述異源蛋白酶是胰蛋白酶。在某些實施方式中,所述細胞組成型表達該異源蛋白酶原。在某些實施方式中,所述細胞誘導型表達該異源蛋白酶原。在某些實施方式中,所述蛋白酶原是胰蛋白酶原。在某些實施方式中,所述蛋白酶是灰色鏈霉菌的SPRT蛋白酶。在某些實施方式中,所述蛋白酶原是灰色鏈霉菌的前-SPRT蛋白酶原(prepro-SPRTprotease)。細胞能夠支持病毒復制的一個證據是能夠從感染的細胞培養物獲得病毒。可通過許多本領域技術人員已知的方法測定病毒產量。例如,可按照測量感染性病毒體的半數組織培養感染量(TCID5。)試驗測定樣品中存在的病毒的濃度從而量化病毒產量。TCID5o值通常表示為logu)TCID5Q/mL。一實施方式中,所述表達異源蛋白酶的細胞支持流感病毒(例如,co^株)復制到下述logK)TCID5o/mL:至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在一具體實施方式中,所述表達異源蛋白酶的細胞支持流感病毒(例如,ca/to株)復制到商業化合理的效價(〉107LogTCID50/mL)。在某些實施方式中,在表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物中產生的流感病毒的效價與在不表達異源蛋白酶的相應細胞且未加入外源蛋白酶如胰蛋白酶的培養物中產生的流感病毒的效價相比,其log,oTCID5()/mL提高至少約0.1,或至少約0.2,或至少約0.3,或至少約0.4,或至少約0.5,或至少約0.6,或至少約0.7,或至少約0.8,或至少約0.9,或至少約l.O,或至少約1.2,或至少約1.4,或至少約1.6,或至少約1.8,或至少約2.0,或至少約2.2,或至少約2.4,或至少約2.6,或至少約2.6,或至少約2.8,或至少約3.0,或至少約3.2,或至少約3.4,或至少約3.6,或至少約3.8,或至少約4.0,或至少約4.2,或至少約4.4,或至少約4.6,或至少約4.8,或至少約5.0。在某些實施方式中,在表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物中產生的流感病毒的效價與在不表達異源蛋白酶的相應細胞且未加入外源蛋白酶如胰蛋白酶的培養物中產生的流感病毒的效價相比提高至少約10%。在某些實施方式中,在表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物中產生的流感病毒的效價提高至少約25%。在某些實施方式中,在表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物中產生的流感病毒的效價提高至少約50%。在某些實施方式中,在表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物中產生的流感病毒的效價提高至少約100%。在某些實施方式中,在表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物中產生的流感病毒的效價提高至少約500%。在某些實施方式中,在表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物中產生的流感病毒的效價提高至少約1000%。在某些實施方式中,在表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物中產生的流感病毒的效價提高至少約5000%。在某些實施方式中,在表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物中產生的流感病毒的效價提高至少約10,000%。在某些實施方式中,在表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物中產生的流感病毒的效價提高至少約30,000%。在某些實施方式中,在表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物中產生的流感病毒的效價提高至少約50,000%。在某些實施方式中,在表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物中產生的流感病毒的效價提高至少約70,000%。在某些實施方式中,在表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物中產生的流感病毒的效價提高至少約100,000%。在某些實施方式中,可以培養本發明細胞的細胞培養基是無血清的。在某些實施方式中,可以培養本發明細胞的細胞培養基含有血清(例如,胎牛血清)。在某些實施方式中,可以培養本發明細胞的細胞培養基不含外源添加的動物蛋白質,這種培養基通常被稱為"無動物蛋白"或"APF"培養基。在某些實施方式中,可以培養本發明細胞的細胞培養基含有外源蛋白酶(例如,豬胰蛋白酶)。再在另一個方面,本發明提供了一種在細胞中制造異源蛋白酶或蛋白酶原的方法,其中所述細胞能夠支持流感病毒復制,所述方法包括在允許所述蛋白酶或蛋白酶原表達的條件下培養包含正常情況下不在細胞內表達的蛋白酶或蛋白酶原的編碼核酸的細胞,從而在所述細胞內制造該蛋白酶或蛋白酶原。在某些實施方式中,所述細胞表達蛋白酶。在某些實施方式中,所述細胞穩定表達蛋白酶。在某些實施方式中,所述細胞表達蛋白酶原。在某些實施方式中,所述細胞穩定表達蛋白酶原。在某些實施方式中,所述細胞將蛋白酶或蛋白酶原分泌入細胞培養基。在某些實施方式中,所述細胞表達約0.1ng至約50嗎蛋白酶或蛋白酶原/ml細胞培養物。在某些實施方式中,所述細胞表達的蛋白酶或蛋白酶原的量足以提高生長在表達該蛋白酶或蛋白酶原的細胞培養物中的病毒的效價。在某些實施方式中,所述蛋白酶或蛋白酶原的表達是誘導型的。在某些實施方式中,所述蛋白酶或蛋白酶原的表達是組成型的。再在另一個方面,本發明提供了一種制造表達該細胞正常情況下不表達的蛋白酶或蛋白酶原的細胞的方法,該方法包括將操作性連接于影響蛋白酶或蛋白酶原表達的調控元件的編碼該蛋白酶或蛋白酶原的核酸引入細胞(該細胞能或不能分泌或釋放該蛋白酶或蛋白酶原),從而使得細胞表達正常情況下該細胞不表達的蛋白酶或蛋白酶原。可采用本領域技術人員已知的任何合適技術和/或載體將核酸引入細胞,對此沒有限制。在某些實施方式中,所述核酸以質粒、粘粒、病毒載體、噬菌體、噬菌粒、轉座子或人工染色體形式引入細胞。在某些實施方式中,所述核酸以逆轉錄病毒載體形式引入細胞。在某些實施方式中,所述核酸穩定維持在細胞中。在其他實施方式中,所述核酸是暫時維持的。在某些實施方式中,所述編碼蛋白酶或蛋白酶原的核酸還包含可選標記。利用可選標記來選擇那些穩定表達編碼蛋白酶或蛋白酶原的核酸的細胞的方法是本領域技術人員已知的。本領域技術人員已知的在引入了該核酸的細胞中會受到影響的任何可選標記都可用于該實施方式。因此,在某些實施方式中,所述可選標記是抗生素抗性基因。在某些實施方式中,所述可選標記是彌補該細胞缺陷的合成代謝途徑中的基因。例如,可將所述編碼蛋白酶或蛋白酶原的核酸引入例如氨基酸合成有缺陷的細胞。該核酸可包含彌補該細胞缺陷的基因。通過在不含該氨基酸的培養基中培養該細胞便可選出包含該合成基因的核酸。本領域技術人員己知的任何此類基因都可用于本發明,對此沒有限制。再在另一個方面,本發明提供了與SEQIDNO.:1至少約90%相同的分離核酸。在某些實施方式中,所述分離核酸包含SEQIDNO.:1或者由SEQIDNO.:1構成。在某些實施方式中,所述分離核酸在雜交條件下與編碼SEQIDNO.:1的核酸(或其互補鏈)雜交。在某些實施方式中,所述雜交條件為嚴格雜交條件。在某些實施方式中,所述雜交條件為高度嚴格的雜交條件。再在另一個方面,本發明提供了一種包含氨基酸序列SEQIDNO.:2或者由氨基酸序列SEQIDNO.:2構成的分離多肽。再在另一個方面,本發明提供了一種編碼包含氨基酸序列SEQIDNO.:2或者由氨基酸序列SEQIDNO.:2構成的多肽的分離核酸。再在另一個方面,本發明提供了一種包含本發明核酸的表達載體。再在另一個方面,本發明提供了一種用本發明的表達載體轉染的細胞。4.附圖簡述圖1表示了caA/Vietnam/1203/2004(H5N1)在MDCK細胞中的復制。圖2為在用不同逆轉錄病毒載體轉染的細胞中觀察到的螢光素酶活性的量的表格。圖3圖示在MDCK細胞中觀察到的螢光素酶活性與用來感染MDCK細胞的逆轉錄病毒顆粒濃度的比較。圖4為顯示12種不同單個MDCK克隆和兩種不同MDCK克隆混合物中的螢光素酶表達的表格。圖5中的表格總結了從在兩種不同包裝細胞系中制造并用三種不同載體轉染的病毒顆粒獲得的MDCK克隆。圖6A-6C為通過用MDV-A或caA/NC流感毒株感染不同MDCK克隆(圖A為對照克隆,圖B為Ampho胰蛋白酶原克隆,圖C為GP2胰蛋白酶原克隆)獲得的流感病毒效價圖示。加入的外源胰蛋白酶0.0昭/ml,空心三角形;第l天O.l嗎/ml,實心圓形;第l-5天1.0pg/ml,空心方形。圖7A-7B為顯示16種MDCK克隆中12個克隆的6xHis-標記的胰蛋白酶原表達的western印跡。圖8為顯示15種不同MDCK克隆中可誘導的螢光素酶表達的表格。圖9為編碼灰色鏈霉菌絲氨酸蛋白酶的^^r基因的核苷酸序列(SEQIDNO:1)。圖10為wrr基因編碼的灰色鏈霉菌絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。圖11為編碼胰蛋白酶原的核苷酸序列(SEQIDNO:3)。圖12為用于克隆^^T基因的正向引物和反向引物(分別為SEQIDNO:5和5)。圖13為轉染入R3/7克隆的pT-Rex-DEST30/螢光素酶和pT-Rex-DEST30/胰蛋白酶質粒的示意圖。5.發明詳述5.1定義除非另外定義,所有科學和技術術語的含義都與其相關領域所通常使用的含義相同。為了本發明的目的,將下列術語定義如下。術語"核酸"、"多核苷酸"、"多核苷酸序列"和"核酸序列"是指單鏈或雙鏈脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物或其嵌合物或類似物。在本文中,術語還可以包括具有天然核苷酸基本特性的天然核苷酸類似物的聚合物,其中它們可以與天然核苷酸相似的方式與單鏈核酸雜交(例如,肽核酸)。除非另外說明,本發明特定核酸序列除了包括明確描述的序列以外還包括互補序列。術語"基因"的應用范圍很廣,是指與生物功能有關的任何核酸。因此,基因包括編碼序列和/或其表達所需要的調節序列。術語"基因"適用于具體的基因組序列以及該基因組序列所編碼的cDNA和mRNA。基因還包括非表達的核酸片段,例如,形成其他蛋白的識別序列的核酸片段。非表達的調節序列包括"啟動子"和"增強子",調節蛋白如轉錄因子與之結合可導致臨近的或附近的序列轉錄。"組織特異性的"啟動子或增強子是指只能在一種或多種特定組織類型或細胞類型內調節轉錄的啟動子或增強子。術語"載體"是指質粒、病毒載體、重組核酸或cDNA。載體還可以是不能自主復制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由同一條鏈內的DNA和RNA組成的多核苷酸、多聚賴氨酸結合的DNA或RNA、肽結合的DNA或RNA、脂質體結合的DNA等。最常見的是,本發明的載體是質粒。"表達載體"是能夠驅動其所包含的核酸表達和復制的載體,如質粒。一般來說,要表達的核酸"操作性連接于"啟動子和/或增強子,并受啟動子和/或增強子的轉錄調節控制。"雙向表達載體"的特征通常是含有兩個啟動子,二者相對于兩個啟動子之間核酸而言方向相反,這樣在兩個方向上都能啟動表達,導致,例如,正(+)或正義鏈和負(-)或反義鏈RNA的轉錄。另外,雙向表達載體可以是雙義載體,其中病毒mRNA和病毒基因組RNA(cRNA)從同一條鏈上表達。在本發明的上下文中,術語"分離的"是指基本不包含在其天然環境中與其結合或相互作用的組分的生物材料,如核酸或蛋白質。分離材料還可以包含在其天然環境,例如,細胞,中未發現的材料。例如,如果材料處于其天然環境中,例如細胞內,那么材料在細胞內所處的位置(例如,基因組或遺傳元件)對于該環境中的材料來說是非天然的。例如,天然核酸(例如,編碼序列、啟動子、增強子等)如果通過非天然方式被導入到對該核酸來說是非天然的基因組位點(例如,載體如質粒或病毒載體,或擴增子)中,那么這種天然核酸就變成分離的了。這種核酸也被稱為"異源"核酸。術語"重組體"是指通過人為干涉發生人工改變或合成改變(非天然的)的材料(例如,核酸或蛋白質)。改變可在其天然環境或狀態內的材料上完成,也可以在從其天然環境或狀態中分離出來的材料上完成。特別地,如果指的是病毒,例如,流感病毒,當病毒是通過表達重組核酸來制備的時候,病毒是重組體。術語"重配體"用于病毒時是指病毒包含來源于多個親本病毒株或資源的基因和/或多肽組分。例如,7:1重配體包括來源于第一親本病毒的7個病毒基因組片段(或基因片段)和來源于第二親本病毒的一個互補病毒基因組片段,例如,編碼血凝素或神經氨酸苷酶。6:2重配體包含來源于第一親本病毒的6個基因組片段,最常見的6個內部基因,以及來源于不同親本病毒的兩個互補片段,例如,血凝素和神經氨酸苷酶。術語"引入"用于指異源核酸或分離核酸時是指核酸被插入到真核或原核細胞內,其中核酸可以被插入到細胞的基因組中(例如,染色體、質粒、質體或線粒體DNA)、轉化成自主復制子、或者瞬時表達(例如,轉染的mRNA)。該術語包括這些方法如"感染"、"轉染"、"轉化"和"轉導"。在本發明的上下文中,各種方法都可用于將核酸引入到原核細胞內,其中包括電穿孔、鈣磷酸鹽沉淀、脂質介導的轉染(脂質轉染法)等o術語"宿主細胞"是指含有載體等異源核酸、支持該核酸復制和/或表達、并任選能制造包括多肽和/或病毒在內的一種或多種編碼產物的細胞。宿主細胞可以是原核細胞如大腸桿菌,或真核細胞如酵母、昆蟲、兩棲動物、鳥類或哺乳動物細胞,其中包括人細胞。在本發明的上下文中,典型的宿主細胞包括Vero(非洲綠猴腎)細胞、Per.C6細胞(人胚胎視網膜細胞)、BHK(幼倉鼠腎)細胞、原代雞腎(PCK)細胞、馬-達氏犬腎(MDCK)細胞、馬-達氏牛腎(MDBK)細胞、293細胞(例如,293T細胞)和COS細胞(例如,COSl、COS7細胞)。術語宿主細胞包括細胞的組合或混合物,其中包括,例如,不同細胞類型或細胞系(例女口,Vero和CEK細胞)的混合培養物。電穿孔的sfVero細胞的共培養在,例如,2004年12月22日提交的PCT/US04/42669中有描述,本文已完整納入作為參考。術語"人工改造的"用于本文中是指病毒、病毒核酸或病毒編碼產物,例如,多肽、疫苗,包含至少一個通過重組方法引入的突變,例如,定向誘變、PCR誘變等。術語"人工改造的"用于指包含一個或多個核苷酸突變和/或氨基酸替代的病毒(或病毒組分或產物)時是指編碼病毒(或病毒組分或產物)的病毒基因組或基因組片段不是來源于天然資源,例如通過非重組方法(例如在25'C累進傳代)制備的天然病毒株或以前就存在的實驗室病毒株,例如,野生型或冷適應性的A/AnnArbor/6/60或B/AnnArbor/1/66株。術語"%序列相同性"在本文中可與術語"%相同性"交互使用,是指利用序列比對程序進行比對時,兩個或多個肽序列之間的氨基酸序列相同性的水平,或者兩個或多個核苷酸序列之間的核苷酸序列相同性的水平。例如,在本文中,80%的相同性是指通過確定的算法所確定的與80%序列相同性同樣的事情,是指一個給定的序列與另一長度的另一序列至少有80%是一致的。典型的序列相同性水平包括而不限于與給定序列有60、70、80、85、90、95、98%或更高的序列相同性。術語"%序列同源性"在本文中可與術語"%同源性"交互使用,是指利用序列比對程序進行比對時,兩個或多個肽序列之間的氨基酸序列同源性的水平,或者兩個或多個核苷酸序列之間的核苷酸序列同源性的水平。例如,在本文中,80%的同源性是指通過確定的算法所確定的與80%序列同源性同樣的事情,相應的給定序列的同源物在給定序列的長度上有超過80%的序列同源性。典型的序列同源性水平包括而不限于與給定序列有60、70、80、85、90、95、98%或更高的序列同源性。可用于確定兩個序列之間相同性的典型計算機程度包括而不限于一套BLAST程序,例如,BLASTN、BLASTX、禾卩TBLASTX、BLASTP禾卩TBLASTN,在NCBI網站上已經公開,可以在互聯網上找到。還可參見Altschul等,1990,/Mo/.說'o/.215:403-10(可特別參考公開的默認設置,艮卩,參數w:4,1=17)和Altschul等,1997,A^c/e/d油i^.,25:3389-3402。如果要評價一個給定的氨基酸序列相對于GenBank蛋白序列數據庫和其他公共數據庫中的氨基酸序列的相同性時,一般利用BLASTP程序進行序列檢索。BLASTX程序優選用于檢索已將所有閱讀框架翻譯成GenBank蛋白序列數據庫和其他公共數據庫中的氨基酸序列的核酸序列。BLASTP和BLASTX都可采用默認參數運行,即開放缺口罰分為11.0,延伸缺口罰分為1.0,并利用BLOSUM-62矩陣。同上。為了確定兩個或多個序列之間的"%相同性"所進行的所選擇序列的優選比對可利用MacVector6.5版本的CLUSTAL-W程序完成,其中包括10.0的開放缺口罰分,0.1的延伸缺口罰分,和BLOSUM30相似性矩陣。"特異地雜交"或"特異性雜交"或"選擇性地雜交"是指復雜混合物(例如,總細胞的)DNA或RNA中存在特定核苷酸序列時,在嚴格條件下核酸分子優先與該核苷酸序列結合、形成雙鏈或雜交。術語"嚴格條件"是指探針與其靶序列優先雜交、與其他序列雜交程度低或根本不雜交的條件。"嚴格雜交"和"嚴格雜交洗滌條件"用于核酸雜交試驗如DNA印跡雜交和RNA印跡雜交時是序列依賴性的,在不同的環境參數下是有區別的。對核酸雜交的較廣泛的指導見于Tijssen,1993,《生物化學和分子生物學實驗室技術-用核酸探針雜交》丄fl6orato^Tec/z—wesS/oc/zem/Wrya"c/Mo/ecw/ar說'o/ogy-外6〃'cfea"o"w/AA^c/e/c尸ra6^,第I部分,第2章,"雜交原則和核酸探針分析策略概述"(Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays),紐約艾斯維爾(Elsevier,NY);Sambrook等,2001,《分子克隆實驗室手冊》(Mo/ecw/arC7om'"g:爿/^oratoryMaww/),冷泉港實驗室(ColdSpringHarborLaboratory),第三版,紐約;以及Ausubel等編的最新版本的《當代分子生物學操作手冊》(a^re"/VWoco&Mo/ecw/ar所o/ogy),紐約格里恩出版合作和威利國際科學出版社(GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience,NY)。一般來說,高嚴格雜交和洗滌條件所選擇的溫度比特異性序列在特定離子強度和pH下的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C。Tm是50%的靶序列與完全匹配的探針雜交時的溫度(在特定的離子強度和pH下)。十分嚴格的條件是指等于特定探針的Tm。對于DNA印跡或RNA印跡中含有約100個以上互補殘基的互補核酸在濾膜上的雜交來說,嚴格雜交條件的一個例子是在42'C、含1mg肝素的50%甲醛,雜交過夜。高嚴格洗滌條件的一個例子是在72'C、0.15MNaCl中雜交約15分鐘。嚴格洗滌條件的一個例子是在65°C、0.2xSSC中洗滌15分鐘。參見Sambrook等對SSC緩沖液的描述。在高嚴格洗滌之前可先進行低嚴格洗滌以去除背景探針信號。對于,例如約100個以上核苷酸的雙鏈核酸來說,一種典型的中等嚴格洗滌條件是在45°C、lxSSC中洗滌15分鐘。對于,例如約100個以上核苷酸的雙鏈核酸來說,一種典型的低嚴格洗滌條件是在40'C、4-6xSSC中洗滌15分鐘。一般來說,在特定雜交試驗中信-噪比高于不相關探針所具有的信-噪比的2倍(或更高)說明檢測到的是特異性雜父。在本文中,除非特別指明,術語"約"是指一個數值不大于或小于該術語所修飾的數值的10%。例如,術語"約5嗎/kg"是指從4.5昭/kg到5.5嗎/kg的范圍。另一個例子,"約1小時"是指從48分鐘到72分鐘的范圍。文中,當提及核酸時,術語"穩定整合的"是指核酸已經與宿主細胞的基因組核酸重組并因此變為了細胞基因組的一部分。穩定整合的核酸可包含可選標記以確保穩定整合的核酸持續成為細胞基因組的一部分。穩定整合的核酸不必在單一位置持續整合入基因組;核酸可在一個以上的位置整合并可以在基因組內從一個位置移動到另一個位置。5.2表達異源蛋白酶或蛋白酶原的細胞表面含有前體血凝素分子(HAO)的流感病毒不能夠與細胞融合和造成感染。必需對HAO進行蛋白水解切割分離HA1和HA2亞基,以獲得其活性形式。表面具有成熟HA的病毒體可與宿主細胞積極融合并造成感染。體內的一些細胞類型,包括氣道中的細胞,含有能激活HA的蛋白酶;然而,許多體外使用的細胞類型,包括MDCK,不含能有效切割HA的活性蛋白酶。對于這些細胞而言,在培養時加入的外源胰蛋白酶的濃度不會對細胞造成負面影響但能夠將HA切割并活化。參見,例如,美國專利號5,698,433和5,756,341。豬胰蛋白酶己顯示能有效激活HA并且是一些流感研究者為達到該目的所通常使用的。在下述實施例中,評價了表達例如豬胰蛋白酶或胰蛋白酶原的重組細胞并對它們在例如MDCK細胞中支持流感病毒復制的能力進行了篩選。因此,在某些實施方式中,預計重組系統或細胞自身表達的活性蛋白酶或蛋白酶原與本發明有關。從重組細胞系表達克隆的蛋白酶或蛋白酶原能夠減少或除去動物衍生產品,而原位提供蛋白酶或蛋白酶原能夠最有效地切割HA分子。或者,通過改變對蛋白酶或蛋白酶原表達的調控能夠表達細胞在正常情況下不表達的由細胞基因組編碼的蛋白酶或蛋白酶原。例如,可通過例如調節蛋白酶或蛋白酶原表達的細胞基因組區域的同源重組而引入指導蛋白酶或蛋白酶原翻譯和轉錄的啟動子,如誘導型啟動子。通過選擇在所選細胞類型中有活性的啟動子(和/或其他調節序列)能夠在正常情況下不表達蛋白酶或蛋白酶原的細胞中表達該蛋白酶或蛋白酶原。本領域技術人員己知的任何已知用來培養流感病毒的細胞可用于產生本發明的細胞,對此沒有限制。例如,用于復制流感病毒的合適的宿主細胞包括,例如,Vero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞以及COS細胞,其中包括293T細胞、COS7細胞。此外,含有兩種或多種上述細胞系的共培養物可提髙復制效率,例如可以1:1的比例使用MDCK細胞和293T或COS細胞。在這種實施方式中,共培養的細胞之一或兩者都可表達該異源蛋白酶。5.2.1細胞表達的蛋白酶本發明所述的細胞可表達本領域技術人員己知的用于切割HA0流感病毒蛋白的任何蛋白酶。能夠評價重組系統制造若干蛋白酶的能力以及將若干蛋白酶工程構建入細胞如MDCK細胞本身的能力。合適的蛋白酶和蛋白酶原包括,但不限于,胰蛋白酶、胰蛋白酶原和SPRT。可以使用的其他示例性蛋白酶列于下面的表l。此外,所述蛋白酶的活性片段也可用于本發明的細胞和方法。熟練的技術人員可按照常規確定某特定蛋白酶是否適用于本發明的細胞和方法。通常,這種試驗包括評價病毒蛋白的切割,這種切割是病毒生命周期中的一個重要步驟。可直接或間接評價這種切割,直接評價例如通過監測較大蛋白質到兩個較小蛋白質的產生,間接評價例如通過監測該蛋白酶存在時產生的病毒效價。例如,可通過例如評價HA0蛋白的切割或通過監測包含該蛋白酶的細胞培養物中的病毒效價來鑒定適用于培養流感病毒的細胞和/或方法的蛋白酶。表1:蛋白酶<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>5.2.2編碼蛋白瞎的載體除了,本領域技術人員已知的用來在細胞內表達異源基因的任何合適方法均可用來表達異源蛋白酶或蛋白酶原。通常,含有編碼蛋白酶或蛋白酶原的核酸的重組核酸構建物是釆用常規的分子生物學技術構建的,然后將該構建物引入感興趣的宿主細胞系。鑒定包含所需構建物的細胞,然后進行篩選以鑒定以所需濃度表達異源蛋白的細胞。進行這些操作中每一步的方法非常多。適用于該目的的許多載體是公眾可以獲得的,其中包括但不限于質粒、噬菌體、病毒載體、逆轉錄病毒載體、人工染色體和附加型(episomal)載體。選擇構建物和使用這種載體的方法是本領域技術人員熟知的。這種載體可用于簡單的克隆和誘變;然而,當將編碼蛋白酶或蛋白酶原的核酸引入合適的細胞時應采用基因表達載體。可對載體進行選擇以容納長度通常從0.25千堿基(kb)到40kb或者更大的任何所需大小的蛋白酶或蛋白酶原編碼序列。載體通常含有各種功能組分,包括克隆(或"多接頭")位點、復制起點和至少一個可選標記基因。此外,為表達該蛋白酶或蛋白酶原,載體通常具有一個或多個以下元件增強子元件、啟動子、轉錄終止和信號序列,它們各自位于克隆位點附近,從而操作性連接于編碼蛋白酶或蛋白酶原的核酸。本領域已知的任何啟動子或增強子元件都可控制蛋白酶或蛋白酶原蛋白質的表達。可采用的合適啟動子包括但不限于SV40早期啟動子區域(Bemoist和Chambon,1981,Nature290:304-310)、Rous肉瘤病毒3'長末端重復序列中所含的啟動子(Yamamoto等,1980,Cell22:787-797)、皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441-1445)、金屬硫蛋白基因的調節序列(Brinster等,1982,Nature296:39-42)、四環素(Tet)啟動子(Gossen等,1995,Proc.Nat.Acad.Sci.USA89:5547-5551)或CMV啟動子(如人立即早期CMV啟動子)。此外,如果需要暫時控制蛋白酶或蛋白酶原的表達,根據本發明可采用本領域技術人員已知的任何誘導型啟動子,對此沒有限制。例如,所述調控元件可以是干擾素-反應性誘導型啟動子或調控元件。參見,例如,Levy等,1988,Ge腦2:383-393,Reich等,1987,尸AO!S.t/&484:6394-6398,和Pellegrini等,1989,7kfo/CW/說'o/.9:4605-4612。載體也可由于含有激素反應元件如糖皮質激素反應元件(GRE)和雌激素反應元件(ERE)而具有可誘導性,當載體被用于在含有對應的激素受體的細胞內表達時所述激素反應元件可提供激素可誘導性。為降低表達的背景水平,可使用對蛻皮激素(一種昆蟲激素)有反應的元件作為替代,與蛻皮激素受體共表達。載體通常含有能使載體在一種或多種所選宿主細胞內復制的核酸序列。然而,當載體試圖整合入宿主細胞的基因組時則載體不需要能夠自主復制,且實際上也不希望它們能自主復制。通常,該序列使得載體能夠獨立于宿主的染色體DNA復制并包含復制起點或自主復制序列。各種細菌、酵母、病毒和哺乳動物細胞的這種序列是熟知的。質粒pBR322的復制起點適合大多數革蘭氏陰性菌,這種2微米的質粒起點適合酵母,各種病毒起點(例如SV40、腺病毒)可用于哺乳動物中的克隆載體。通常,哺乳動物表達載體不需要復制起點,除非將它們用于能夠復制高水平DNA的哺乳動物細胞,如COS細胞。有利地,載體可含有被稱為可選標記的選擇基因。該基因編碼生長在選擇培養基中的轉化的宿主細胞存活或生長所必需的蛋白質。因此未被含選擇基因的載體轉化的宿主細胞將不能在該培養基中存活。典型的選擇基因編碼的蛋白質能夠賦予對抗生素或其他毒素如氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環素的抗性,彌補營養缺陷型缺陷,或提供生長培養基中不能獲得的關鍵營養素。盡管最常見的是將編碼蛋白酶或蛋白酶原的載體引入哺乳動物細胞,但也可有利地釆用哺乳動物可選標記,例如G418抗性基因。許多篩選系統都可以使用,其中包括而不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等,1977,Cell11:223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska&Szybalski,1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:2026)以及腺嘌呤核酸核糖轉移酶(Lowy等,1980,Cell22:817)基因,這些基因可分別用于tk-、hgprt-或aprt-細胞中。另外,抗代謝物耐受性也可用作篩選下列基因的基礎dhfr基因,賦予細胞對氨甲碟呤的耐受性(Wigler等,1980,Natl.Acad.Sci.USA77:3567;O'Hare等,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1527);gpt基因,賦予細胞對霉酚酸的耐受性(Mulligan&Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072);neo基因,賦予細胞對氨基糖甙G-418的耐受性(Colberre-Garapin等,1981,J,Mol.Biol.150:1);以及hygro基因,賦予細胞對潮霉素的耐受性(Santerre等,1984,Gene30:147)。其他抗生素-抗性基因,如賦予對氨芐青霉素、頭孢噻肟、慶大霉素、G41S、潮霉素、利福平、卡那霉素、新霉素、大觀霉素或四環素抗性的基因也可用作可選標記。表達載體通常含有被宿主生物識別并操作性連接于感興趣編碼序列的啟動子。這種啟動子可以是誘導型或組成型的。術語"操作性連接的"指所述組分的排列方式允許它們以它們預期的方式發揮作用。控制序列"操作性連接于"編碼序列是以這種方式相互連接從而可在與該控制序列相匹配的條件下表達該編碼序列。采用常規的連接技術構建編碼蛋白酶或蛋白酶原的載體。以要產生所需載體的方式切割、裁剪和重連接分離的載體或DNA片段。需要的話可以已知方式進行分析以證實構建的載體中存在的是正確的序列。構建表達載體、準備體外轉錄物、將DNA引入宿主細胞、以及進行分析以評價表達和功能的合適方法是本領域技術人員已知的。通過以下常規技術檢測樣品中是否存在基因序列或者對其擴增和/或表達進行定量Southern或Northern分析,Western印跡,DNA、RNA或蛋白質斑點印跡,原位雜交,免疫細胞化學或核酸或蛋白質分子的序列分析。本領域技術人員將容易了解如果需要如何對這些方法進行改進。當將腺病毒用作表達載體時,可使感興趣的蛋白酶或蛋白酶原編碼序列連接腺病毒轉錄/翻譯控制復合物如晚期啟動子和三聯前導序列。然后可通過體外或體內重組將這種嵌合基因插入腺病毒基因組。插入病毒基因組的非必需區域(例如,El或E3區)將導致能夠存活并能夠在受感染宿主內表達蛋白酶或蛋白酶原的重組病毒(例如,參見Logan&Shenk,1984,Proc.Natl.Acad,Sci.USA81:355-359)。或者可采用逆轉錄病毒表達載體,其包含Harvey鼠肉瘤病毒(Ha-MSV)長末端重復序列(LTR),該長末端重復序列側接啟動子和編碼修飾的ABC轉運多肽的核酸。逆轉錄病毒載體可以是復制感受態或復制缺陷型的。后一種情況下,病毒傳代通常將僅發生在互補宿主細胞內。人工染色體也可用于運送比質粒或逆轉錄病毒載體可包含并表達的DNA片段長的DNA片段。可構建約6kb到10Mb的人工染色體并通過常規運送方法(脂質體、聚陽離子氨基聚合物、或囊泡)運送以用于治療目的。(參見,例如,Harrington,J.J.等(1997)Nat.Genet.15:345-355。)為有效翻譯插入的蛋白酶或蛋白酶原編碼序列還可能需要特定的起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和相鄰序列。此外,起始密碼子應位于所需編碼序列的閱讀框內以確保翻譯完整的插入片段。這些外源翻譯控制信號和起始密碼子可來自各種天然和合成來源。包含合適的轉錄增強子元件、轉錄終止子等可提高表達效率(參見,例如,Bittner等,1987,MethodsinEnzymol.153:516-544)。在某些實施方式中,提供了穩定表達蛋白酶或蛋白酶原的細胞。為制造這種細胞系但不采用含有病毒復制起點的表達載體,可用受合適表達控制元件(例如,啟動子、增強子、序列、轉錄終止子、聚酰苷酸化位點等)和可選標記控制的DNA轉化宿主細胞。引入外源DNA之后,可使工程化的細胞在滋養培養基中生長l-2天,然后轉移到選擇培養基。重組質粒中的可選標記賦予選擇抗性并允許細胞將質粒穩定整合入它們的染色體組內和生長形成集落,然后可克隆集落并將其擴展成細胞系。5.2.3制造表達異源蛋白酶的細胞的方法所選用于將編碼蛋白酶或蛋白酶原的載體引入所需細胞的方法將通常依賴于載體和細胞。轉化和將核酸引入宿主細胞的其他方法(例如,結合、原生質體轉化或融合、轉染、電穿孔、脂質體運送、膜融合技術、高速DNA包被顆粒、病毒感染和原生質體融合)可通過本領域熟知的各種方法實現(參見,例如,Ausubel,同上,和Sambrook等,同上)。可用質粒、粘粒等表達載體轉化或轉染細菌、酵母、植物或哺乳動物細胞,如上所述,其中所述表達載體包含感興趣的核酸。或者,可用包含感興趣核酸的病毒表達載體感染細胞。根據宿主細胞、載體和采用的轉化方法,多肽的瞬時表達或穩定表達將是組成型或誘導型的。如上所述,本領域的一般技術人員將能夠決定是瞬時表達還是穩定表達多肽,以及是組成型表達還是誘導型表達蛋白質。哺乳動物細胞可被包裝的病毒載體直接感染或通過化學或電學方法轉染。為進行化學轉染,可用CaP04共沉淀DNA或用基于脂質體脂質或非脂質體脂質的試劑引入DNA。可獲得進行CaP04轉染的市售試劑盒(CalPhosTM哺乳動物轉染試劑,美國加州帕羅阿托的克隆科技實驗室公司(ClontechLaboratories,PaloAlto,Calif.,USA)),并可用市售試劑進行脂質介導的轉染,所述試劑如LIPOFECTAMIN2000、LIPOFECTAMINETM試劑、CELLFECTIN⑧試齊U、LIPOFECTIN⑧試劑(美國加州卡爾斯拜德的因維曲根公司(Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)),DOTAP脂質體轉染試劑、FuGENE6、X-tremeGENEQ2、DOSPER(美國印第安納州印第安納波利斯的羅氏分子生物化學公司(RocheMolecularBiochemicals,Indianapolis,Ind.USA)),Effectene、PolyFect⑧和Superfect(美國加州巴倫西亞的恰根公司(Qiagen,Inc.,Valencia,Calif.,USA))。電穿孔哺乳動物細胞的方法可在例如以下文獻中找至U:Norton等(編),GeneTransferMethods:IntroducingDNAintoLivingCellsandOrganisms,BioTechniquesBooks,伊頓出版公司(EatonPublishingCo.)(2000)。其他轉染技術包括顆粒轟擊轉染和微注射。參見,例如,Cheng等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(10):4455-9(1993);Yang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(24):9568-72(1990)。5.2.4培養表達異源蛋白酶的細胞表達異源蛋白酶的細胞可在本領域技術人員已知的任何合適的培養基中培養,對此沒有限制。一般來說,細胞在標準的商用培養基中培養,例如添加血清(例如,10%胎牛血清)的Dulbecco改進的Eagle培養基,或者在無血清培養基中培養,培養條件為適于維持中性緩沖pH(例如,pH在7.0至IJ7.2之間)的可控濕度和CO2濃度。可選的是,培養基可以包含抗生素以防止細菌生長,例如,青霉素、鏈霉素等,和/或其他營養物,例如L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、促使產生良好生長特性的其他添加物,例如,胰蛋白酶、(5-巰基乙醇等。在培養物中培養哺乳動物細胞的方法已有很多報道,也是本領域技術人員所熟知的。下列書籍提供了通用方法,例如,Freshney(1983)CultureofAnimalCells:ManualofBasicTechnique,紐約艾倫阿利斯(AlanR.Liss,NewYork);Paul(1975)CellandTissueCulture,第5版,愛丁堡里維斯頓(Livingston,Edinburgh);Adams(1980)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-CellCultureforBiochemists,Work和Burdon(編),阿姆斯特丹艾斯維爾(Elsevier,Amsterdam)。在流感病毒的體外制備過程中,與為了特定目的的組織培養方法有關的其他細節包括,例如,Merten等,(1996),尸ra由c"'o"o//",e"zflWrws/"ce〃cw/Zwmsybrv"c"'"epw/ara,/o",選自Cohen禾卩Shafferman(編)NovelStrategiesinDesignandProductionofVaccines,本文已完整納入作為參考。另外,通過常規試驗可以很容易地確定適合本發明的這種方法的變化。一實施方式中,本發明的細胞被作為貼壁細胞在它們所附著的表面培養。組織培養物細胞可在上面生長的貼壁表面是本領域熟知的。貼壁表面包括但不限于表面修飾的聚苯乙烯塑料、蛋白質涂布表面(例如,纖連蛋白和/或膠原涂布的玻璃/塑料)以及大量巿售微載體(例如,DEAE-Dextran微載體珠,如Dormacell,Pfeifer&Langen;Superbead,FlowLaboratories;苯乙烯共聚物-三-甲胺珠,如Hillex,SoloHill,AnnArbor)。一實施方式中,本發明的細胞被作為懸浮細胞培養,不需要載體。使細胞適應不需要載體的懸浮生長的方法是本領域已知的(參見,例如,美國專利號6,825036和6,455,298)。可選或任選地,可調節本發明細胞表達的蛋白酶或蛋白酶原的水平以使無需任何適應便可使細胞懸浮生長。在某些實施方式中,本發明細胞表達充足水平的蛋白酶或蛋白酶原從而無需適應便可懸浮生長。在其他實施方式中,無需適應作為懸浮細胞生長的本發明的細胞被用于復制病毒。在一具體實施方式中,無需適應作為懸浮細胞生長的本發明的細胞被用于復制流感病毒。一實施方式中,由于能表達蛋白酶或蛋白酶原,因此本發明的細胞無需適應便可作為懸浮細胞生長。在某些實施方式中,所述蛋白酶或蛋白酶原是絲氨酸蛋白酶。在其他實施方式中,所述蛋白酶或蛋白酶原是胰蛋白酶或胰蛋白酶原。再在其他實施方式中,所述蛋白酶或蛋白酶原是哺乳動物胰蛋白酶或胰蛋白酶原。再在另一個實施方式中,所述蛋白酶或蛋白酶原是細菌胰蛋白酶或胰蛋白酶原。一些實施方式中,由懸浮生長的本發明細胞表達的蛋白酶或蛋白酶原的水平為約0.1ng至約50嗎/ml細胞培養物。在其他實施方式中,由懸浮生長的本發明細胞表達的蛋白酶或蛋白酶原的水平為至少0.1ng、或至少0.5ng、或至少1.0ng、或至少5.0ng、或至少10ng、或至少20ng、或至少30ng、或至少40ng、或至少50ng、或至少60ng、或至少70ng、或至少80ng、或至少90ng、或至少1昭、或至少2嗎、或至少5嗎、或至少10|ig、或至少20(ig、或至少30itig、或至少40嗎、或至少50嗎/ml細胞培養物。用于制造流感病毒的細胞可培養在含血清或無血清培養基中。一些情況下,例如為制造純化的病毒,需要使宿主細胞生長在無血清條件下。合適的無血清培養基描述于2004年12月23日提交的美國臨時申請號60/638,166,2005年1月5日提交的美國臨時申請號60/641,139以及2005年12月16日提交的美國專利申請號11/304,589,各申請通過引用全文納入本文。本領域技術人員將了解,在組織培養時采用血清或動物提取物可能會有缺點(Lambert,K丄等,選自AnimalCellBiotechnology,第1巻,Spier,R.E.等,編,學術出版社,紐約(AcademicPresNewYork),第85-122頁(1985))。例如,這些添加物的化學組成在各批次之間可能存在差異,即便來自同一制造商亦是如此。此外,動物或人來源的添加物也可能被外來物質污染(例如,支原體、病毒和朊病毒)。當細胞培養基培養中含有這些被污染的添加物時,這些試劑可嚴重破壞培養細胞的健康。此外,當在被外來試劑污染的培養物中產生的物質被用于細胞治療和其他臨床應用時,這些試劑可能帶來健康風險。最擔心的是存在會造成動物的海綿狀腦病和人的克-雅(Creutzfeld-Jakob)病的朊病毒。因此,在某些實施方式中,所述培養基完全不含血清。有利地,所述培養基可以完全不含動物產品。因此,在某些實施方式中,所述培養基是無動物蛋白培養基(APF)。在某些實施方式中,未在培養基中添加外源動物衍生的蛋白酶。在某些實施方式中,未在培養基中添加動物衍生產品。具體的培養基配方描述于,例如,2005年12月16日提交的美國專利申請號11/304,589。細胞可以在小規模,例如,少于25ml的培養基、培養管或培養瓶中培養,或者在振蕩的大培養瓶、旋轉瓶,或者在培養瓶、培養罐或反應器中的微載體珠(例如,二乙胺基乙基葡聚糖微載體珠,如Do謹cell,Pfeifer&Langen;Superbead,FlowLaboratories;苯乙烯共聚物-三-甲胺珠,如Hillex,SoloHill,AnnArbor)上培養。微載體珠是小球(直徑在100-200微米之間),可在單位體積的細胞培養物中提供巨大的表面積以便于粘附細胞生長。例如,l升培養基可包含超過2千萬個微載體珠,提供超過8000平方厘米的生長表面。對于病毒的商業生產來說,例如,用于疫苗生產,在生物反應器或發酵罐中培養細胞通常是比較理想的。現有的生物反應器的體積從1升以下到100升以上不等,例如,Cyto3生物反應器(明尼蘇達州明尼湯卡的奧斯莫尼克公司(Osmonics,Minnetonka,MN);NBS生物反應器(紐約麥迪遜的新布朗斯韋克科技公司(NewBrunswickScientific,Edison,N丄));布勞恩生物技術國際公司的實驗室規模和商業規模的生物反應器(德國麥遜根的布勞恩生物技術國際公司(B.B腦nBiotech,Melsungen,Germany))。無論培養體積多大,在某些實施方式中,重要的是使培養物維持在低于或等于35"C的溫度下以確保在一定程度上冷適應的重組和/或重配流感病毒的有效回收。例如,在某些實施方式中,所述細胞在約32"C到35X:之間培養,溫度一般在約32'C到約34t:之間,通常在約33"C。一般來說,可使用能感知和維持細胞培養系統溫度的調節器,例如,恒溫器,或其他裝置來確保溫度在病毒復制過程中不會超過35°C。5.3灰色鏈霉菌的SPRT蛋白酶除了上述蛋白酶,本發明提供了一種稱為SPRT的新細菌蛋白酶。如下面的實施例所述,從灰色鏈霉素克隆出了編碼該蛋白酶的基因。如上所述,SPRT蛋白酶適合在用來培養病毒的細胞內表達。^KT基因的核苷酸序列示于圖9(SEQIDN0:1),而SPRT蛋白酶的氨基酸序列示于圖IO(SEQIDNO:2)。除了編碼wrr基因的天然核酸,還按照本發明預測了與^KT基因的核酸序列同源的核酸編碼序列。因此,在某些實施方式中,本發明提供了編碼與圖9的核酸序列有約99%、約95%、約90%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約55%、或約50%相同的核苷酸序列的核酸。在另一方面,本發明提供了某多肽的編碼核酸,該多肽所具有的序列與圖9所示核酸序列編碼的多肽序列有約99%、約95%、約卯%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約55%、或約50%相同。在另一個實施方式中,本發明提供了與包含圖9所示核苷酸序列的核酸(或編碼表1所示多肽的核酸)雜交的核酸。在某些實施方式中,所述核酸在規定的雜交條件下與包含圖9所示核苷酸序列的核酸雜交。在某些實施方式中,所述雜交條件是嚴格雜交條件。在某些實施方式中,所述雜交條件是高度嚴格的雜交條件。此外,本發明的核酸還包含編碼SPRT蛋白酶的核酸的衍生形式。這種衍生物可通過本領域技術人員已知的任何方法制得,對此沒有限制。例如,可通過定點誘變來制備衍生物,其中包括核酸的l、2、3、5、IO或更多個核苷酸的替代、插入或缺失。或者,衍生物可通過隨機誘變來制備。隨機誘變核酸的一種方法包括在存在O.lmMMnCl2和不平衡的核苷酸濃度的條件下在PCR反應中擴增核酸。這些條件增加了PCR反應中聚合酶錯誤摻入的幾率,導致被擴增的核酸發生隨機誘變。在某些實施方式中,與文中所述的野生型酶相比,所述編碼SPRT蛋白酶衍生物的衍生核酸具有改進的特性。例如,一些實施方式中,所述衍生核酸編碼的衍生SPRT蛋白酶具有更強活性,例如,比活大于野生型酶。一些實施方式中,所述衍生SPRT蛋白酶具有相對于野生型蛋白酶能提高SPRT蛋白酶分泌的衍生分泌信號。一些實施方式中,所述衍生SPRT蛋白酶可具有相對于野生型蛋白酶能提高從SPRT蛋白酶剪切前肽原的衍生前肽原(prepr叩eptide)序列。一些實施方式中,所述衍生SPRT蛋白酶顯示出最大活性時的pH不同于野生型蛋白酶。在某些實施方式中,所述pH是培養病毒如流感病毒的優選pH。在其他方面,本發明提供了一種SPRT多肽。在某些實施方式中,所述SPRT多肽的氨基酸序列與圖10的氨基酸序列至少約99%、約95%、約90%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約55%、或約50%相同。在其他方面,本發明提供了一種蛋白質,其多肽的氨基酸序列與表1的氨基酸序列有至少約99%、約95%、約90%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約55%、或約50%相同。此外,本發明提供了本發明所述SPRT多肽或蛋白酶的活性片段。在某些實施方式中,所述活性片段包含圖10(或表1)所示氨基酸序列的至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、2卯、300、310、或320個毗連氨基酸,同時保留了蛋白酶活性。熟練的技術人員可通過常規方法鑒定這種活性片段,例如釆用常規技術表達該片段并檢測蛋白酶活性。因此,在另一方面,本發明涉及在SEQIDNO:2(或表l)所示成熟多肽或其同源序列中包含一個或多個氨基酸的保守性取代、缺失和/或插入的人工變體。在一具體實施方式中,所述氨基酸的改變本質上極小,即是不顯著影響蛋白質折疊和/或活性的保守性氨基酸取代或插入;小的刪除,通常為1-約30個氨基酸;小的氨基-或羧基-末端延伸,如氨基-末端甲硫氨酸殘基;至多達約20-25個殘基的小的接頭肽;或通過改變凈電荷或其他功能而有助于進行純化的小的延伸,所述其他功能如聚組氨酸通道(poly-histidinetract)、抗原表位或結合域。保守性取代的例子有下組氨基酸內的取代堿性氨基酸(精氨酸,賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活的氨基酸取代是本領域熟知的,并描述于,例如,H.Neurath和R.L.Hill,1979,《蛋白質》(TheProteins),紐約出版社(AcademicPress,NewYork)。最通常發生的改變是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu禾卩Asp/Gly。除了20種標準氨基酸,也可用非標準氨基酸(如4-羥脯氨酸、6-M-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和a-甲基絲氨酸)取代野生型多肽的氨基酸殘基。可用有限數目的非-保守性氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸以及非天然氨基酸取代氨基酸殘基。"非天然氨基酸"在蛋白質合成后被修飾,和/或在其側鏈具有不同于標準氨基酸的化學結構。非天然氨基酸可以是化學合成的并且可通過商業獲得,其中包括2-哌啶酸、四氫噻唑羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸以及3,3-二甲基脯氨酸。或者,所述氨基酸改變的性質為改變多肽的物理-化學特性。例如,氨基酸改變可提高多肽的熱穩定性,改變底物特異性、改變最佳pH等。可按照本領域己知的方法如定點誘變或丙氨酸-掃描誘變(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)來鑒定親本多肽內的必需氨基酸。在后一種技術中,在分子的每個殘基中都引入了丙氨酸突變,并檢測了所得突變分子的生物學活性(即,脂肪酶活性)以鑒定決定該分子活性的氨基酸殘基。也可參見,Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。通過對結構進行物理分析以及假定接觸位點的氨基酸突變也可確定酶或其他生物相互作用的活性位點,所述結構通過諸如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記的技術確定。參見,例如,deVos等,1992,Science255:306-312;Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver等,1992,FEBSLett.309:59-64。也可通過分析與本發明所述多肽相關多肽的相同性來鑒定必需氨基酸。可采用已知的誘變、重組和/或改組方法,然后進行相關篩選方法以制造并測試單個或多個氨基酸取代,所述篩選方法如Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57;Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625中描述的方法。可采用的其他方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如,Lowman等,1991,Biochem.30:10832-10837;美國專利號5,223,409;WO92/06204)和定區域誘變(Derbyshire等,1986,Gene46:145;Ner等,1988,DNA7:127)。誘變/改組方法可與高通量自動篩選法組合以檢測宿主細胞表達的克隆的、誘變多肽的活性(Ness等,1999,NatureBiotechnology17:893-896)。可從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子并用本領域的標準方法快速測序。這些方法能夠迅速測定各氨基酸殘基在感興趣多肽中的重要性,并能夠用于結構未知的多肽。5.4表達載體再在另一個方面,本發明提供了表達SPRT蛋白酶或本發明的其他蛋白酶的表達載體(參見,例如,表l)。通常,表達載體是包含操作性連接于編碼多肽的核苷酸序列的表達控制序列的重組多核苷酸分子。通過包含合適的啟動子、復制序列、可選標記等,表達載體可方便地在原核生物或真核生物中發揮功能,從而導致穩定轉錄和翻譯mRNA。構建表達載體以及在包含該表達載體的細胞內表達基因的技術是本領域熟知的。參見,例如,Sambrook等,2001,《分子克隆實驗室手冊》,第三版,冷泉港實驗室,紐約冷泉港,和Ausubel等編的最新版本的《當代分子生物學操作手冊》,紐約格里恩出版合作和威利國際科學出版社。用于表達載體的有用啟動子包括但不限于金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松可誘導的MMTV啟動子、SV40啟動子、MRPpolIII啟動子、組成型MPSV啟動子、四環素可誘導的CMV啟動子(如人立即早期CMV啟動子)、組成型CMV啟動子和干擾素反應型啟動子。表達載體應包含與表達SPRT蛋白酶的細胞相容的表達和復制信號。合適的表達載體包括但不限于病毒載體如逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒,質粒載體,粘粒等。將表達載體轉染入哺乳動物細胞時優選病毒和質粒載體。例如,表達控制序列中包含CMV啟動子的表達載體pcDNAl(加州圣地亞哥因維曲根公司(Invitrogen,SanDiego,CA))能提供良好的轉染和表達入這種細胞的速率(rate)。可使用的表達載體的其他例子提供在下面的實施例中。可通過本領域技術人員已知的任何方法將表達載體引入細胞,對此沒有限制。這種方法包括但不限于例如,由細胞從溶液中直接攝取該分子;采用例如脂質體或免疫脂質體通過脂轉染以幫助攝取;顆粒介導的轉染;等等。參見,例如,美國專利號5,272,065;Goeddel等編,1990,Af"/wc&/"£wz_ymo/ogy,第185巻,加州學術出版社有限公司(AcademicPress,Inc.,CA);Krieger,1990,GeweTra"—r£x/7myi"/cw—J丄a/70rato7A/arn^/,紐約斯圖克通出版社(StocktonPress,NY);Sambrook等,1989,《分子克隆實驗室手冊》,紐約冷泉港實驗室;和Ausubel等編的最新版本的《當代分子生物學操作手冊》,紐約格里恩出版合作和威利國際科學出版社表達載體也可含有能簡化遞送構建物的分離的純化部分。例如,包含諸如6個組氨酸殘基的聚組胺部分可被摻入蛋白質的氨基末端。該聚組胺部分允許通過鎳螯合層析在一個步驟中方便地分離蛋白質。在某些實施方式中,在純化之后可從遞送構建物的剩余部分上切除所述純化部分。在其他實施方式中,所述部分不會妨礙遞送構建物功能結構域的功能因此無需切除。5.5操作核酸和蛋白質的其他方法在本發明文中,可按照熟知的分子生物學技術操作包括病毒核酸、編碼蛋白酶或蛋白酶原的核酸等在內的核酸。包括擴增、克隆、誘變、轉化等在內的眾多這種方法的詳細過程描述于,例如,Ausubel等,《當代分子生物學操作手冊》(在2006年增補),約翰威利出版公司(JohnWiley&Sons),紐約("Ausubel");Sambrook等,《分子克隆實驗室手冊》(第三版),第1-3巻,冷泉港實驗室,冷泉港,紐約,2001("Sambrook"),以及Berger和Kimmel的《分子克隆技術指南,酶學方法》(GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymology.),第152巻,力口州圣地亞哥學術出版社有限公司(AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA)("Berger")。除了上述參考文獻,可在以下文獻中找到諸如聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應(LCR)、QP-復制酶擴增和其他RNA聚合酶介導的技術(例如,NASBA)等用于例如擴增本發明的cDNA探針的體外擴增技術方法Mullis等(1987)美國專利號4,683,202;PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications(Innis等編)力口州圣地亞哥學術出版社有限公司(AcademicPressInc.SanDiego,CA)(l卿)("Innis");Arnheim和Levinson(19%)C&EN36;TheJournalOfNIHResearch(1991)3:81;Kwoh等(1989)ProcNatlAcadSciUSA86,1173;Guatelli等(1990)ProcNatlAcadSciUSA87:1874;Lomell等(1989)JCUnChem35:1826;Landegren等(1988)Science241:1077;VanBrunt(1990)Biotechnology8:291;Wu和Wallace(1989)Gene4:560;Barringer等(1990)Gene89:117,以及Sooknanan和Malek(1995)Biotechnology13:563。在本發明文中,用于克隆核酸的其他方法包括Wallace等的美國專利號5,426,039。通過PCR擴增巨大核酸的改進方法總結于Cheng等(1994)Nature369:684及其中的參考資料。本發明的某些多核苷酸如寡核苷酸可利用包括基于單核苷酸和/或三核苷酸的亞磷酰胺偶聯化學在內的各種固相策略合成。例如,可通過在正在延伸的多核苷酸鏈中依次加入活化的單體活化三體來合成核酸序歹U。參見例如,Caruthers,M.H.等(1992)MethEnzymol211:3。除了合成所需序列,實質上任何核酸都可從諸多商業來源中的任何一個來源定帝ij,這些商業來源諸如內地合格試劑公司(TheMidlandCertifiedReagentCompany)、泛美基因公司(TheGreatAmericanGeneCompany)、基因表達有限公司(ExpressGen,Inc.)、操縱子技術有限公司(OperonTechnologies,Inc.),等等。此外,通過例如定點誘變可取代病毒多肽、蛋白酶或蛋白酶原中的選定氨基酸殘基。例如,為制造具有與所需表型特征如減毒表型、冷適應、溫度敏感、被特定蛋白酶剪切等功能相關的氨基酸取代的病毒多肽,可將特定突變引入編碼該多肽的病毒核酸節段。定點誘變方法是本領域熟知的并描述于,例如,Ausubel、Sambrook和Berger,同上。各種進行定點誘變的試劑盒可通過商業獲得,例如,Chameleon定點誘變試劑盒(樂朱拉的拉斯加特基因公司(Stratagene,LaJolla)),并可按照制造商的說明使用以在分別編碼甲型或乙型流感多肽的基因組節段中或在編碼蛋白酶或蛋白酶原的核酸中引入例如一個或多個氨基酸取代。5.6采用表達異源蛋白酶的細胞來培養流感病毒在細胞培養物中復制流感病毒的方法是本領域技術人員熟知的(參見上文中題為"培養表達異源蛋白酶的細胞"一節)。通常,這些方法包括用選出的病毒株感染合適的宿主細胞。或者,可采用重組方法將病毒基因組引入宿主(例如,下文中題為"表達蛋白酶或蛋白酶原的宿主細胞中的流感基因組載體"的一節中詳細描述的質粒拯救)。如上文的充分論述,通常在培養基中加入外源蛋白酶以在不表達有效切除HAO蛋白的蛋白酶的細胞的細胞培養物中有效制造流感病毒(參見,例如,Appleyard等,1974,J.GenVirol.25:351-357;美國專利5,824,536;4,500,513;和專利公開WO96/15232)。本發明的一個目的是提供表達異源蛋白酶的細胞以復制流感病毒,在一具體實施方式中,目的為提高流感病毒的感染效率以提高細胞培養物中的病毒效價。因此,在某些實施方式中,未在要復制病毒如流感病毒的細胞培養基內添加諸如豬胰蛋白酶等外源蛋白酶。在某些實施方式中,不含外源蛋白酶的表達異源蛋白酶的細胞培養物產生的流感病毒的效價等于或基本等于加入了外源蛋白酶的不表達異源蛋白酶的細胞培養物產生的效價。在其他實施方式中,不含外源蛋白酶的表達異源蛋白酶的細胞培養物產生的流感病毒的效價大于加入了外源蛋白酶的不表達異源蛋白酶的細胞培養物產生的效價。再在其他實施方式中,表達異源蛋白酶的細胞培養物能夠繁殖流感病毒達到商業上合理的效價(〉l(^LogTCID5o/mL)。再在另一個實施方式中,可在要復制病毒如流感病毒的細胞培養基內添加諸如豬胰蛋白酶或SPRT蛋白酶等外源蛋白酶。這樣的實施方式可用于,例如,在以低水平如不足以繁殖病毒達到商業上合理效價的水平表達蛋白酶的本發明細胞內培養病毒。這樣的實施方式還可用于其中本發明細胞表達通過蛋白水解切割而活化的蛋白酶原的方法。一實施方式中,提供了在培養細胞中產生負鏈RNA病毒的感染性病毒顆粒的方法,其中未在細胞培養基內添加諸如胰蛋白酶等外源蛋白酶。在一具體實施方式中,提供了能復制負鏈RNA病毒使其在細胞群中達到的效價(log,oTCIDM)/mL)為至少約6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8的方法,其中未在該細胞培養基中添加外源蛋白酶。在某些實施方式中,未添加外源蛋白酶的表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物產生的流感病毒的效價(log,oTCID5o/mL)為至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在一具體實施方式中,未添加外源蛋白酶的表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物產生的流感病毒的效價的log1QTCIDWmL比未加入諸如胰蛋白酶等外源蛋白酶的不表達異源蛋白酶的相應細胞的培養物中產生的流感病毒的效價大至少約0.1、或至少約0.2、或至少約0.3、或至少約0.4、或至少約0.5、或至少約0.6、或至少約0.7、或至少約0.8、或至少約0.9、或至少約l.O、或至少約1.2、或至少約1.4、或至少約1.6、或至少約1.8、或至少約2.0、或至少約2.2、或至少約2.4、或至少約2.6、或至少約2.6、或至少約2.8、或至少約3.0、或至少約3.2、或至少約3.4、或至少約3.6、或至少約3.8、或至少約4.0、或至少約4.2、或至少約4.4、或至少約4.6、或至少約4.8、或至少約5.0。在其他實施方式中,可在細胞培養基中加入的蛋白酶少于否則應在細胞培養基中加入的蛋白酶。因此,在某些實施方式中,提供了在培養細胞中產生負鏈RNA病毒的感染性病毒顆粒的方法,其中在所提供的細胞培養基中加入了最小量的諸如胰蛋白酶等外源蛋白酶。在一具體實施方式中,提供了能復制負鏈RNA病毒使其在細胞群中達到的效價(logK)TCID5o/mL)為至少約6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8的方法,其中在該細胞培養基中添加了約0.1ng/ml至約100嗎/ml外源蛋白酶。在另一個特定實施方式中,提供了能復制負鏈RNA病毒使其在細胞群中達到的效價(log,oTCID5o/mL)為至少約6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8的方法,其中在該細胞培養基中添加了約1mU/ml至約5000mU/ml外源蛋白酶。再在另一個實施方式中,已經添加了約0.1ng/ml至約100ng/ml外源蛋白酶的表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物產生的流感病毒的效價(log,oTCID5(/mL)為至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在一具體實施方式中,已經添加了約0.1ng/ml至約10pg/ml外源蛋白酶的表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物產生的流感病毒的效價(log,oTCID5c/mL)為至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在另一個具體實施方式中,己經添加了約0.1ng/ml至約1.0pg/ml外源蛋白酶的表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物產生的流感病毒的效價(logK)TCID5o/mL)為至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在某些實施方式中,已經添加了約1mU/ml至約5000mU/ml外源蛋白酶的表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物產生的流感病毒的效價(log,()TCID5()/mL)為至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在一具體實施方式中,已經添加了約lmU/ml至約1000mU/ml外源蛋白酶的表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物產生的流感病毒的效價(log,oTCIDWmL)為至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在另一個具體實施方式中,已經添加了約1mU/ml至約500mU/ml外源蛋白酶的表達異源蛋白酶的細胞的細胞培養物產生的流感病毒的效價(log,oTCID5o/mL)為至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在某些實施方式中,所述病毒效價在孵育細胞約2天至約10天、或者任選約3天至約7天后獲得。在一具體實施方式中,所述病毒效價在孵育細胞2天、或3天、或4天、或5天、或6天、或7天、或8天、或9天、或10天、或12天、或14天后獲得。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度小于約0.1ng/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約0.1ng/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約0.5ng/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約1ng/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約5ng/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約10ng/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約50ng/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約100ng/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約250ng/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約500ng/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約750ng/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約1pg/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約5嗎/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約10|ig/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約25pg/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約50嗎/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約100pg/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約0.01ng/ml至約100pg/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約lng/ml至約100pg/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約10ng/ml至約100嗎/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約100ng/ml至約100嗎/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約1^g/ml至約100|Lig/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約10嗎/ml至約100嗎/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約O.Olng/ml至約10嗎/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約0.01ng/ml至約lpg/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約O.Olng/ml至約100ng/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約0.01ng/ml至約10ng/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約O.Olng/ml至約1ng/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約0.01ng/ml至約0.1ng/ml。在某些實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度為約1-5000mU/ml,或5-1000mU/ml,或100-500mU/ml。一實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度小于約1mU/ml。一實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度小于約5mU/ml。一實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度小于約10mU/ml。一實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度小于約25mU/ml。一實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度小于約50mU/ml。一實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度小于約100mU/ml。一實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度小于約250mU/ml。一實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度小于約500mU/ml。一實施方式中,添加到細胞培養基內的外源蛋白酶的終濃度小于約1000mU/ml。當培養的細胞表達蛋白酶原時,在培養基中加入比有效產生流感病毒通常所需的蛋白酶少的蛋白酶的這些實施方式特別有益。在培養基中加入外源蛋白酶可剪切被保護的前肽、將蛋白酶原轉化成其活性形式,從而"敏化(prime)"蛋白酶原。之后,活化的蛋白酶可剪切隨后由細胞表達的蛋白酶原,從而將這些新產生的蛋白酶原轉化成活性蛋白酶。這樣的實施方式因此能夠大量減少外源添加的蛋白酶如豬胰蛋白酶的用量。因此,在某些實施方式中,在細胞培養物中只添加一次外源蛋白酶。在某些實施方式中,所述外源蛋白酶與用于感染細胞的病毒同時或幾乎同時加入細胞培養物。在某些實施方式中,所述外源蛋白酶與用于感染細胞的病毒在同一天加入細胞培養物。在其他實施方式中,所述外源蛋白酶在加入用于感染細胞的病毒之前加入細胞培養物。在某些實施方式中,所述外源蛋白酶與在細胞中引入載體同時或幾乎同時加入制造病毒的細胞培養物。在某些實施方式中,所述外源蛋白酶在將載體引入細胞的同一天加入制造病毒的細胞培養物。在其他實施方式中,在加入引入細胞的載體之前將所述外源蛋白酶加入制造病毒的細胞培養物。或者,在某些實施方式中,所述細胞既表達蛋白酶又表達蛋白酶原。在某些這樣的實施方式中,可在誘導型啟動子控制之下表達所述蛋白酶以允許所述蛋白酶瞬時表達。這樣的實施方式允許蛋白酶瞬時表達,從而激活蛋白酶原。之后,活化的蛋白酶原可繼續激活隨后表達的蛋白酶原。或者,在某些實施方式中,所述細胞可表達兩種或多種蛋白酶或蛋白酶原。某些實施方式中,所述兩種或多種蛋白酶原可在相同或不同調控系統控制之下表達,如組成型或誘導型表達。對于誘導型表達的實施方式,為每種可誘導表達的蛋白酶或蛋白酶原選擇的可誘導系統可相同或不同。在某些實施方式中,在時間上控制細胞培養物中異源蛋白酶的表達是有益的。例如,在規定時間,例如用流感病毒感染細胞培養物后約1、2、3、4或5天時誘導所述蛋白酶表達被證實是有益的。在其他實施方式中,在用流感病毒感染細胞培養物之前誘導所述蛋白酶表達。再在其他實施方式中,與用流感病毒感染細胞培養物同時誘導所述蛋白酶表達。再在另一個實施方式中,在將引入細胞的載體加入制造病毒的細胞培養物之前、同時或之后誘導所述蛋白酶表達。因此,在某些實施方式中,所述異源蛋白酶可受誘導型啟動子控制或者受遺傳調控元件控制,如上所述。5.7表達蛋白酶或蛋白酶原的宿主細胞中的流感基因組載體除了依賴于用活病毒感染細胞培養物的基于細胞培養物的方法,可用重組DNA技術如質粒拯救在細胞培養物內制造全感染性流感病毒。參見,例如,Neumann等(1999)q//"y7we"z"爿v/rwsc/o"edcD7V/4s.ProcNatlAcadSciUSA96:9345-9350;Fodor等(1999)/^cweq/7"/7wewz"爿vz>w5戶頻rec函6/na"fJ.Virol73:9679-9682;Hoffmann等(2000)AZ)AC4加"^"/o"》rg^erato/7/"y/wewza^Wms1戶owe妙Z//a,油ProcNatlAcadSciUSA97:6108-6113;WO01/83794;Hoffmann禾口Webster(2000),t/m.Wre"/o"a/iA^4/o(ymera化/-polymerase77,rarac一"cw,femybrAege"era"owo/〖",e"加jv/rwsyhme/g似//fl,油,81:2843-2847;Hoffmann等(2002),7escweo/z,"http://we"zaJv/n^es々om8//flwm/ifc,99(17):11411-11416;美國專利號6,649,372和6,951,754;美國發明者G·坎寶,G·杜克,J·楊,N·哈扎瑞,莫呈鈞申請人:米迪繆尼有限公司