使靈長類多能干細胞分化成心肌細胞系細胞的制作方法

專利名稱：：使靈長類多能干細胞分化成心肌細胞系細胞的制作方法使靈長類多能干細胞分化成心肌細胞系細胞相關申請的參考本申請要求2005年6月22日提交的USSN60/693,141的優先權。發明領域本發明涉及在體外使靈長類多能干細胞分化成心肌細胞系細胞領域。發明背景再生醫學(regenerativemedicine)研究中主要的挑戰在于開發出可有助于重建心臟功能的細胞組合物。據估計5名男性和女性中將近一人會患有某種形式的心血管疾病(《國家健康和營養檢査調査III》(NationalHealthandNutritionExaminationSurveyIII)，1988-94，疾病控制中心和美國心臟聯合會(CenterofDiseaseControlandtheAmericanHeartAssociation))。普遍的病癥包括冠心病(占人口的5%)、先天性心血管缺陷(0.5%)以及充血性心力衰竭(3%)。制藥領域已生產出有助于限制心臟病所致損傷的小分子藥物和生物化合物，但尚沒有任何有助于再生受損組織的市售產品。為了開發出能進行心臟再生的細胞群，對數種不同的前沿課題進行了研究。在數個中心中正在進行采用自體骨髓衍生細胞進行心肌梗塞后治療的臨床試驗(Perin等，Circulation107:2294，2003;Strauer等，Circulation106:1913，2002;Zeiher等，Circulation106:3009，2002;Tse等，Lancet36h47，2003;Stamm等，Lancet3661:45，2003)。推測這類細胞具有清除功能而改善心臟組織的血液灌注。還進行了測試利用自體骨骼肌肌原細胞治療心臟的臨床試驗(Menasche等，J.Am.Coll.Cardiol.41:1078，2003;Pagani等，J.Am.Coll.Cardiol.41:879，2003;Hagege等，Lancet361:491，2003)。然而，尚不清楚橫紋肌細胞的收縮是否能與心律充分協調。一種更直接的方法是采用功能已定型為心肌細胞的細胞。已在動物模型中采用了同系基因型的新生或出生后心臟細胞以修復因持久性冠狀動脈閉塞而引起的損傷(Reffelmann等，J.Mol.CellCardiol.35:607，2003;Yao等，J.Molec.Cell.Cardiol.35:607，2003)。因此，如果可將此類細胞用于人體治療，它們可對局部缺血性心臟病進行十分有效的治療。此外，心肌細胞可用來篩選諸如藥物的化合物。發明概述本發明提供了從靈長類多能干細胞獲得心肌細胞系細胞的方法。心肌細胞系細胞具有許多用途，其中包括但不限于篩選潛在藥物，篩選細胞毒性化學物質，以及治療應用如在體外修復受損或患病的心臟。在本發明的某些實施方式中，從靈長類多能干細胞獲得心肌細胞系細胞的方法依次包括以下步驟在存在活化素但不存在BMP時培養靈長類多能干細胞；然后在存在BMP時培養所述細胞；以及從培養物收獲所得收獲的細胞。本發明還提供了獲得富集的心肌細胞系細胞群的方法。某些實施方式中，那些方法依次包括以下步驟在存在活化素但不存在BMP時培養靈長類多能干細胞；然后在存在BMP時培養該細胞；從培養基中收獲所述細胞；以及富集收獲的細胞群中的心肌細胞系細胞。某些實施方式中，那些方法依次包括以下步驟在存在活化素A但不存在BMP時將靈長類多能干細胞在無血清培養基中培養約1天；然后在存在BMP-4或BMP-2但不存在活化素時將所述細胞在無血清培養基中培養約4天；從培養基中收獲所述細胞；以及富集收獲的細胞群中的心肌細胞系細胞。在本發明的某些實施方式中，所述細胞在培養步驟中附于固體表面。某些實施方式中，所述細胞在使用BMP的培養步驟中能形成胚狀體(embryoidbody)。某些實施方式中，所述細胞在活化素和/或BMP培養步驟中以單細胞懸浮培養。某些實施方式中，所述細胞在存在活化素時培養1天或多天。某些實施方式中，所述細胞在存在BMP時培養4天或多天。某些實施方式中，所述活化素是活化素A。某些實施方式中，所述BMP是BMP-4或BMP-2。某些實施方式中，所述細胞在BMP培養步驟之后在不存在活化素或BMP時再額外培養一段時間。在那些實施方式中的一些，這種額外的培養步驟為2周或更長時間。在那些實施方式中的一些，該培養步驟包含IGF。在那些實施方式中的一些，所述IGF是IGF-I。在本發明的某些實施方式中，從分化處理后得到的細胞群中富集心肌細胞系細胞。在那些實施方式中的一些，用珀可梯度來富集心肌細胞系細胞。在本發明的某些實施方式中，所述收獲的細胞有至少10%為a-肌球蛋白重鏈(aMHC)陽性。在本發明的某些實施方式中，所述收獲的細胞有至少10%為心肌鈣蛋白I(cTnI)陽性)。在本發明的某些實施方式中，所述收獲的細胞有至少25%為心肌鈣蛋白I(cTnI)陽性)。在本發明的某些實施方式中，形成心臟小體(cardiacbody)以富集和/或擴增心肌細胞系細胞群。在那些實施方式中的一些，該方法還包括將富集細胞群中成簇存在的細胞分成單個細胞提供；將成簇存在的細胞重懸于營養培養基；在營養培養基中重培養重懸的細胞；以及收集和洗滌重培養的細胞。本發明還提供了按照本發明的方法從靈長類多能干細胞分化的心肌細胞系細胞群。本發明還提供了許多在從人胚泡細胞制造心肌細胞系細胞過程中培養的細胞群，包括從人胚泡獲得的未分化的靈長類多能干細胞系的細胞；以及按照本發明的方法從所述靈長類多能干細胞系分化的心肌細胞系細胞群。在本發明的某些實施方式中，靈長類多能干細胞向心肌細胞系細胞的分化發生于無血清培養基中。在本發明的某些實施方式中，靈長類多能干細胞向心肌細胞系細胞的分化發生于含有少于0.5%血清的培養基中。在本發明的某些實施方式中，靈長類多能干細胞向心肌細胞系細胞的分化發生于含有少于1%血清的培養基中。在本發明的某些實施方式中，靈長類多能干細胞向心肌細胞系細胞的分化發生于含有少于5%血清的培養基中。在本發明的某些實施方式中，在靈長類多能干細胞向心肌細胞系細胞分化的過程中所述細胞附于含有明膠、基質膠、層粘連蛋白、纖連蛋白和/或玻連蛋白中一種或多種的基材。在本發明的某些實施方式中，將靈長類多能干細胞在MEM-CM+bFGF中培養1-7天，然后進行活化素培養步驟。某些實施方式中，將靈長類多能干細胞在MEM-CM+50中培養約6天，然后進行活化素培養步驟。某些實施方式中，當在存在活化素時培養細胞時采用培養基RPMI+IXB27。某些實施方式中，當在存在BMP時培養細胞時采用培養基RPMI+IXB27。某些實施方式中，當在存在活化素時培養細胞時采用培養基RPMI+N2。某些實施方式中，當在存在BMP時培養細胞時采用培養基RPMI+N2。附圖簡述圖1:將H7細胞接種在涂有明膠和FBS的孔中，隨后按照實施例1描述的方法進行分化。在最初加入活化素后的第24天用胰蛋白酶-EDTA解離培養物、固定、滲透、并用抗心肌f丐蛋白I抗體染色。固定前，將細胞與EMA—起培育以區別活細胞(排斥EMA的細胞)和死細胞(摻入EMA的細胞)。用FACScalibur儀分析樣品，不對死細胞進行分析。在該實驗中，約54%的細胞在胰蛋白酶解離中存活下來；這些活細胞中，24-27%用心肌鈣蛋白I特異性抗體標記測定為心肌細胞。在2張圖中采用兩種不同的門控方法(圖1A:基于直方圖，圖1B:基于散射繪圖)；這兩種方法得到的心肌細胞百分比類似。圖2:將H7細胞接種在涂有基質膠的孔中，隨后按照實施例2描述的方法進行分化。在最初加入活化素后的第21天用胰蛋白酶-EDTA解離培養物、固定、滲透、并用抗心肌I丐蛋白I抗體染色。固定前，將細胞與EMA—起培育以區別活細胞(排斥EMA的細胞)和死細胞(摻入EMA的細胞)。用FACScalibur儀分析樣品，不對死細胞進行分析。在該實驗中，約69%的細胞在胰蛋白酶解離中存活下來；這些活細胞中，8.9%用心肌鈣蛋白I特異性抗體標記測定為心肌細胞。圖3顯示了在由四種珀可組分中每一種形成的心臟小體中測得的cTnl的表達。未分化的hES細胞被用作陰性對照。培養作為富集的心臟小體的組分IV的細胞，其aMHC或cTnl的表達提高了100至500倍。圖4顯示了采用不同濃度的BMP-2和BMP-4時hES細胞分化得到的細胞群中aMHC的表達。定義術語"心肌細胞系細胞"通常指心肌細胞的前體細胞和成熟的心肌細胞。在本文中所提及的心肌細胞系細胞、前體細胞或心肌細胞可等同于處于心肌細胞個體發育任何階段的細胞，如上文所定義并無限制，除非另有說明。如下文所述，心肌細胞系細胞可具有選自下組的一種或多種標記(有時至少具有3-5種標記)心肌鈣蛋白I(cTnI)、心肌鈣蛋白T(cTnT)、肌節肌球蛋白重鏈(MHC)、GATA-4、Nkx2.5、N-,丐粘蛋白、卩l-腎上腺素受體((5i-AR)、ANF、MEF-2家族轉錄因子、肌酸激酶MB(CK-MB)、肌紅蛋白或心房鈉尿素(ANF)。術語"胚狀體"是指靈長類多能干細胞的懸浮培養物或聚集物以非特定方式分化時產生的包含分化和部分分化細胞的異質細胞集落。文中，"靈長類多能干細胞"指衍生自任何種類胚胎組織(胎兒或胎前組織)、且在適宜的條件下具有產生不同細胞類型后代(即衍生自所有三種胚層內胚層、中胚層和外胚層)的能力的細胞，所述能力的鑒定可按照本領域所接受的標準測試進行，例如在8-12周齡的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力或在組織培養中形成所有三種胚層的能力。各種類型的胚胎細胞包括在靈長類多能干細胞定義中，其例子為人胚胎干(hES)細胞(參見，例如，Thomson等(Science282:1145，1998))和人胚胎生殖(hEG)細胞(參見，例如，Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13726，1998);其它靈長類的胚胎干細胞，如恒河猴干細胞(參見，例如，Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844，1995)、狨猴干細胞(參見，例如，Thomson等，Biol.Reprod.55:254，1996)。文中，"未分化的靈長類多能干細胞"指群體中的大部分靈長類多能干細胞及其衍生物顯示出未分化細胞的形態學特征的細胞培養物。應理解，該群體中未分化細胞的集落將通常被周圍部分分化的細胞包圍文中，"胚胎干細胞"指衍生自胚泡階段或者在細胞徹底分化成三個胚層之前的人胚胎的多能干細胞。除了明顯有其它要求，該術語包括初生組織和已經形成的帶有hES細胞表型特征的細胞系，以及仍舊能夠產生三個胚層中每一種的后代的這種細胞系的后代。原型"人胚胎干細胞"(hES細胞)由Thomson等人描述(Science282:1145，1998;美國專利6，200，806)。文中，"活化素"指一種多肽生長因子，它是轉化生長因子-(3(TGF-l3)超家族中的一元。目前有四種已知的活化素A、AB、B禾口C。文中，"骨形態發生蛋白(BMP)"指TGF-(3超家族的一種多肽生長因子。目前已知BMP家族約有20名成員。出于本申請的目的，術語"BMP"不包括BMP-1。文中，"富集"指提高某組分在混合物中的水平。例如，在本發明的某些實施方式中，可通過提高某給定細胞群中心肌細胞系細胞的比例來富集該細胞群。文中，"心臟小體"指懸浮液中的靈長類多能干細胞衍生細胞的集落，其具有人心肌細胞系細胞的兩個或多個特征。文中，"直接分化"指靈長類多能干細胞不形成作為中間體的胚狀體而分化成富含特定組織類型細胞的后代細胞的過程。為了澄清，術語"直接分化"包括由于疏忽形成小量細胞聚集體的過程。文中，"基因改變的"、"轉染的"或"基因轉化的"指通過任何合適的人工操作方法將多核苷酸轉移到細胞內的過程，或者其中的細胞是最初改變的細胞的后代并繼承了該多核苷酸。該多核苷酸將通常包含編碼感興趣蛋白質的可轉錄序列，這樣能使細胞以升高的水平表達該蛋白質，或者可包含編碼能影響蛋白質的表達(由未修飾的細胞表達或者作為引入另一種多核苷酸序列的結果)但本身不編碼蛋白質的分子(如siRNA或反義RNA)的序列。如果改變的細胞的后代具有相同的改變則這種基因改變被稱作是"可繼承的"。文中，"無血清"指所述組合物不含添加的血清的條件。文中，"飼養細胞"指不同組織類型的并通常有不同基因組的細胞，它們可促進和/或控制與它們一起培養的細胞的增殖和/或分化。例如，未分化的靈長類多能干細胞可與幫助維持未分化狀態的飼養細胞共培養，而該過程中的未分化的靈長類多能干細胞可與弓i導向特定組織類型(例如，心肌細胞系細胞)分化的飼養物(feeder)共培養。文中，"無飼養物的"指所述組合物不含添加的飼養細胞的條件。為了澄清，術語"無詞養物的"中包括這種情況，即將靈長類多能干細胞從含有飼養物的培養物中傳代到未添加飼養物的培養物中，即便所述第二種培養物中含有一些第一種培養物的飼養物。文中，"培養"指在體外維持和/或擴增細胞的過程。文中，"相同基因組"指靈長類多能干細胞的基因組和衍生自靈長類多能干細胞的分化細胞的基因組，并表示通過限制性片段長度多態性("RFLP")或SNP分析測得的靈長類多能干細胞和衍生細胞之間的染色體DNA相同性將超過90%。即便靈長類多能干細胞或衍生細胞已經發生了基因改變，那些細胞將被認為與衍生出它們的細胞或它們所衍生的細胞具有相同基因組，這是由于所有不可操作的基因元件都是保守的。文中，"基質膠"指BD基質膠TM基膜基質，這是一種用Engelbreth-Holm-Swarm腫瘤細胞制造的并含有胞外基質組分如層粘連蛋白的商品化基礎膜產品。基質膠購自BD公司(Becton，DickinsonandCompany)(富蘭克林湖(FranklinLakes),紐約州)。文中，"RPMI"指RPMI培養基1640(因維曲根公司(Invitrogen)，卡爾斯拜德(Carlsbad),加利福尼亞州)。發明詳述通用技術-對于實施用于本發明的通用技術的進一步細節，實施者可參考細胞生物學、組織培養、胚胎學和心臟生理學領域的標準教科書和綜述。關于組織和細胞培養以及胚胎干細胞，讀者可參考《實施方法》(Apracticalapproach)(E丄Robertson編，IRL出版社有限公司(IRLPressLtd.)1987);《小鼠發育技術指南》(GuidetoTechniquesinMouseDevelopment)(P.M.Wasserman等編，學術出版社(AcademicPress)1993);《胚胎干細胞的體外分化》(EmbryonicStemCelldifferentiationinVitro)(M.V.Wiles，Meth,Enzymol.225:900，1993);《胚胎干細胞的特性和用途用于人類生物學和基因治療的展望》(Propertiesandusesofembryonicstemcell:ProspectsforApplicationtoHumanBiologyandGeneTherapy)(RD.Rathjen等，Reprod.Fertil.Dev.10:31，1998;以及R丄Freshney，《動物細胞的培養》(CultureofAnimalCells),威利里斯公司(Wiley-Liss)，紐約，2000)。關于心臟細胞的培養，標準的參考文獻包括《培養的心臟細胞》(TheHeartCellinCulture)(A.Pinson編，CRC出版社(CRCPress)1987)、《分離的成人心肌細胞》(IsolatedAdultCardiomyocytes)(第I和II巻，Piper和Isenberg編，CRC出版社(CRCPress)1989)以及《心臟發育》(HeartDevelopment)(Harvey禾卩Rosenthal,學術出版社(AcademicPress)1998)。可在以下標準教科書中找到分子和細胞生物化學中的通用方法《精編分子生物學實驗指南》(ShortProtocolsinMolecularBiology),第4版；《免疫學方法手冊》(ImmunologyMethodsManual)(I.Lefkovits編，學術出版社(AcademicPress)1997);以及《細胞和組織培養生物技術中的實驗室操作》(CelUndTissueCulture:LaboratoryProceduresinBiotechnology)(Doyle禾卩Griffiths,約翰威利公司(JohnWiley&Sons)1998)。靈長類多能干細胞本發明提供了使靈長類多能干細胞分化成心肌細胞系細胞的方法。可用于本發明方法的靈長類多能干細胞包括但不限于胚胎干細胞。可從靈長動物物種的胚泡中分離得到胚胎干細胞(美國專利5,843,780;Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844，1995)。例如，可用Thomson等(美國專利6,200,806;Science282:1145，1998;Curr.Top.Dev.Biol.38:133及以后，1998)和Reubinoff等(NatureBiotech.18:399，2000)描述的技術從人胚泡細胞中制備人胚胎干細胞(hES細胞)。其它靈長類多能干細胞類型包括但不限于WO01/51610(Bresagen)中提到的初級外胚層樣(EPL)細胞和人胚胎生殖(hEG)細胞(Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13726，1998)。用于本發明的胚胎干細胞可選自胚胎干細胞系或者可直接獲自靈長類胚胎組織。已知大量胚胎干細胞系，其中包括但不限于Hl、H7、H9、H13或H14(參見Thompson);hESBGN-Ol、hESBGN-02、hESBGN-03(希臘雅典的BG公司(BresaGen，Inc.));HES隱1、HES-2、HES-3、HES國4、HES-5、HES-6(獲自新加坡的國際胚胎干細胞有限公司(ESCellInternational,Inc.));HSF-1，HSF-6(獲自加州大學舊金山分校(UniversityofCaliforniaatSanFrancisco));13、13.2、13.3、14、16、16.2、J3、J3.2(獲自以色列海法的臺科寧-以色列技術學院(Technion-IsraelInstituteofTechnology));UCSF-1和UCSF-2(Genbacev等，Fertil.Steril.83(5):1517-29，2005);HUES1-17系(Cowan等，NEJM350(13):1353-56，2004);以及ACT-14系(Klimanskaya等，Lancet,365(9471):1636-41，2005)。某些實施方式中，用于本發明的靈長類多能干細胞是以無飼養物的方式衍生出的(參見，例如，Klimanskaya等，Lancet,365(9471):1636-41(2005》。靈長類多能干細胞的培養可采用各種基材、培養基和本領域已知的其它添加物和因子來培養靈長類多能干細胞。采用能促進增殖同時抑制分化的培養條件，可使靈長類多能干細胞在培養物中連續繁殖。示例性的培養基的組成如下80。/。DMEM(例如吉比科公司(Gibco)的Knock-OutDMEM)、20。/。成分明確的胎牛血清(FBS，Hyclone)或血清替代物(US2002/0076747Al，生命技術有限公司(LifeTechnologiesInc.))、1%非必需氨基酸、ImML-谷胺酰胺和O.lmMP-巰基乙醇。某些實施方式中，在詞養細胞一通常是衍生自胚胎組織或胎兒組織的成纖維細胞一層上培養靈長類多能干細胞(Thomson等，Science282:1145，1998)。某些實施方式中，那些飼養細胞來自人或小鼠。人飼養細胞可分離自各種人組織或通過使人胚胎干細胞分化為成纖維細胞細胞而衍生得到(參見，例如，WO01/51616)。某些實施方式中，可采用的人飼養細胞包括但不限于胎盤成纖維細胞(參見，例如，Genbacev等，Fertil.Steril.83(5):1517-29，2005)、輸卵管上皮細胞(參見，例如，Richards等，Nat.Biotechnol.，20:933-36，2002)、包皮成纖維細胞(參見，例如，Amit等，Biol.Reprod.68:2150-56，2003)、子宮內膜細胞(參見，例如，Lee等，Biol.Reprod.72(1):42-49，2005)。某些實施方式中，胚胎干細胞在不添加飼養細胞時可維持在未分化狀態(參見，例如，Rosier等，Dev.Dynam.229:259-274，2004)。無飼養物的培養物通常由含有促進細胞增殖但不發生分化的因子的營養培養基支持(參見，例如，美國專利No.6,800,480)。某些實施方式中，可將培養基與分泌這種因子的細胞一起培養從而在該培養基中引入這種因子，所述細胞如經過照射的(約4000拉德)原代小鼠胚胎成纖維細胞、端粒化的(telomerized)小鼠成纖維細胞、或衍生自靈長類多能干細胞的成纖維細胞樣細胞(美國專利6,642,048)。可將飼養物接種于無血清培養基如添加有20%血清替代物和4ng/mLbFGF的KODMEM中以條件化培養基。再添加bFGF1-2天進一步條件化此培養基，用于支持培養靈長類多能干細胞1-2天(參見，例如，WO01/51616;Xu等，NatBiotechnol.19:971，2001)。或者，可采用新鮮或未經條件化的培養基，該培養基己補充有能促進未分化形式細胞增殖的附加因子(例如成纖維細胞生長因子或毛喉素)。例子為基礎培養基，如X-VIVO10(拜維塔可公司(Biowhittaker))或QBSF-60(高級生物公司(QualityBiologicallnc.))，添加了40-80ng/mLbFGF，并任選含有干細胞因子(15ng/mL)或Flt3配體(75ng/mL)(參見，例如，Xu等，干細胞23(3):315-23，2005)。這些培養基制劑的優點是所支持的細胞生長速率比其它系統快2-3倍(WO03/020920)。例如，以>15,000個細胞/cn^(優選90,000-170，000/cm勺接種pPS。通常，在細胞完全分散前終止酶消化(S卩，用膠原蛋白酶IV處理約5分鐘)。然后將含有約10到2,000個細胞的團塊不經進一步分散直接種到基材上。或者，可在培養平板細胞生長達到鋪滿前，不用酶而通過在含有0.5mMEDTA的PBS溶液中孵育約5分鐘來收獲細胞，或者可通過機械方式例如用細移液管刮或分離從板上簡單取出所需細胞。從培養容器中洗出后，不作進一步分散將細胞接種入新的培養基中。在其它例子中，在0.05%(重量/體積)胰蛋白酶(吉比科公司)和0.053mMEDTA的溶液中37。C孵育5-15分鐘，從平板上取得無飼養細胞培養的鋪滿的人胚胎干細胞。然后取得板上殘留的細胞，將細胞分散成含有單個細胞和小細胞集落的懸液，然后以50,000-200,000個細胞/cm2的密度進行接種以促進存活和限制分化。在顯微鏡下，靈長類多能干細胞顯示出高核/胞質比、凸起的核仁和緊湊的集落與難于辨認的細胞連接。靈長類靈長類多能干細胞通常表達階段特異性胚胎抗原(SSEA)3和4，以及可用命名為Tra-l-60和Tra-l-81的抗體檢測的標記。未分化的人胚胎干細胞通常也表達轉錄因子Oct-3/4、Cripto、胃泌素釋放肽(GRP)受體、足萼蛋白樣蛋白(PODXL)、以及人端粒末端轉移酶的逆轉錄酶(hTERT)(US2003/0224411Al)，均以RT-PCR檢測。靈長類多能干細胞向心肌細胞系細胞的分化尤其，本發明提供了通過首先在存在活化素時然后在存在BMP時培養靈長類多能干細胞而使靈長類多能干細胞分化成心肌細胞系細胞的方法。盡管含有活化素的培養步驟中不包括BMP，但隨后含有BMP的培養步驟中可任選包含活化素。某些實施方式中，活化素在培養基中的濃度為10-200ng/ml，或25-100ng/ml，或50-100ng/ml。某些實施方式中，活化素在培養基中的濃度低于10ng/ml或高于200ng/ml。某些實施方式中，BMP在培養基中的濃度為10-200ng/ml，或25-100ng/ml，或50-100ng/ml。某些實施方式中，BMP在培養基中的濃度低于10ng/ml或高于200ng/ml。某些實施方式中，用于分化的活化素是活化素A、活化素B、活化素AB或活化素C。某些實施方式中，可采用一種以上的活化素。某些實施方式中，其它TGF卩超家族成員如TGF(3、結節(nodal)或左撇子(lefty)可代替本發明方法中的活化素或作為其補充。某些實施方式中，用于分化的BMP是BMP-2、BMP-4或BMP-7。某些實施方式中，所述BMP是除BMP-2、BMP-4或BMP-7之外的BMP(BMP-1除外)。某些實施方式中，可使用一種以上的BMP。某些實施方式中，在BMP步驟之后在不存在活化素和BMP時培養正在分化的細胞。在那些實施方式中的一些，該培養步驟包含IGF。在那些實施方式中的一些，IGF在培養基中的濃度為10-500ng/ml;或25-100ng/ml;或50-100ng/ml。某些實施方式中，所含IGF的濃度低于10ng/ml或高于500ng/ml。所述IGF可以是IGF-1或IGF-2。某些實施方式中，在本發明的方法中可用胰島素代替IGF。在靈長類多能干細胞向心肌細胞系細胞分化的過程中，細胞在存在活化素、BMP或IGF時培養不同的指定時間。某些實施方式中，采用活化素的培養步驟的長度為12-36小時，或12小時-2天，或6小時-4天，或4小時-5天。某些實施方式中，采用活化素的培養步驟長于5天。某些實施方式中，采用BMP的培養步驟的長度為3-5天，或2-8天，或1-14天。某些實施方式中，采用BMP的培養步驟長于14天。某些實施方式中，采用IGF的培養步驟的長度為3-5天，或2-8天，或l天-4周。某些實施方式中，采用IGF的培養步驟長于4周。例如，某些實施方式中，接種到基質膠上的人胚胎干細胞可首先在不存在BMP時與50ng/ml活化素A—起培育約1天，然后在不存在活化素時與50ng/mlBMP-4一起培育約4天，然后在不存在活化素和BMP時與50ng/mlIGF-I—起培育2周。在那些實施方式中的一些，如實施例3所述通過珀可梯度收獲并富集所得心肌細胞系細胞。某些實施方式中，靈長類多能干細胞可直接分化成心肌細胞系細胞。靈長類多能干細胞分化的范例傳統上包括形成胚狀體，使不同類型細胞之間串話(cross-talk)，認為這可以使人聯想到胚胎形成的方式促進組織形成。然而，不需要形成胚狀體常具有優點，可使分化過程受到更好的控制，所得的細胞群傾向于更為均一(WO01/51616;US2002/0151053Al)。直接分化技術的一個優點是無需用血清或血清替代物來啟動或支持心肌細胞分化過程，而這在其它方法中是常用的。相反，可配制含有人工營養補充物的培養基以支持分化細胞(如心肌細胞或神經元)的。例子為B27補充物、N2補充物和G5補充物(生命技術有限公司(LifeTechnologiesInc.)/吉比科公司(Gibco))。某些實施方式中，補充物包含營養素和輔助因子，如人胰島素(500嗎/L)、人轉鐵蛋白(5-10mg/mL)和硒(0.5pg/mL)，還可含四甲烯二胺(1.5mg/L)、生物素(l嗎/L)、氫化可的松(0.4|ig/L)或孕酮(0.6pg/L)和/或低水平的促分裂原如EGF或FGF(lpg/L)。對于商品化規模生產和治療人體的目的，去除非人動物衍生的成分尤為有利。某些實施方式中，分化步驟中使用的培養基是無血清的。某些實施方式中，分化步驟中使用的培養基含有少于0.25%血清，或少于0.5%血清，或少于1.0%血清，或少于2.0°/。血清，或少于5.0%血清，或少于10%血清。盡管直接分化方法有諸多優點，在本發明的某些實施方式中，可采用本發明的方法使靈長類多能干細胞在除了活化素培養步驟之外的分化過程中的某些點形成胚狀體進而分化成心肌細胞系細胞。可通過本領域已知的各種方法形成胚狀體。某些實施方式中，在本發明的方法中，分化中的細胞被培養在基材上。可用于本發明的基材包括但不限于膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、透明質酸聚-L-賴氨酸-涂布的組織培養塑料，或者基質膠。在本發明的實踐中，在培養細胞時可采用各種固體表面。那些固體表面包括但不限于標準細胞培養平板如6孔、24孔、96孔或144孔平板。其它固體表面包括但不限于微載體和平皿。某些實施方式中，所述微載體是珠。那些珠可采取各種形式，如帶有正電荷基團以提高細胞附著的Cytodex葡聚糖微載體珠、涂布有明膠/膠原以便與細胞附著的珠、以及具有不同孔隙率以便與細胞附著的大孔微載體珠。Cytodex葡聚糖微載體珠、明膠涂布的微載體珠和大孔微載體珠是通過商業獲得的(密蘇里州州圣路易斯(St.Loius)的西格馬-奧爾德利希公司(Sigma-Aldrich)或明尼蘇達州安阿伯(AnnArbor)的孤山工程有限公司(SoloMlEngineeringInc.))。某些實施方式中，所述珠的大小為90-200pm、面積為350-500cm2。珠可由諸如但不限于玻璃或塑料的各種材料構成。某些實施方式中，可在攪拌釜生物反應器中使用平皿以便與細胞附著。平皿由例如新不倫瑞克科學有限公司(NewBrunswickScientificCo，Inc.)(愛迪遜(Edison)，紐約州)出售。某些實施方式中，所述平皿是Fibra-cel平皿，其為聚酯/聚丙烯平皿。每克這些平皿可提供的表面積為1200cm2。固體表面可由各種基材制成，其中包括但不限于玻璃或塑料，如聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、聚酯薄膜或thermanox，在本發明的某些實施方式中，所述固體表面的形狀可以是三維的。示例性的三維固體表面描述于，例如，US20050031598。某些實施方式中，所述細胞在本發明方法中處于單細胞懸液中。所述單細胞懸液可用各種方法形成，其中包括但不限于旋轉燒瓶培養，搖瓶培養，或發酵罐培養。可使用的發酵罐包括但不限于CelligenPlus(新不倫瑞克科學有限公司(NewBrunswickScientificCo，Inc.),愛迪遜(Edison)，紐約州)，以及STR或攪拌釜反應器(Stirred-TankReactor)(埃普利肯公司(ApplikonInc.),福斯特城(FosterCity)，加州)。某些實施方式中，所述生物反應器可用培養基連續灌注或以分批給料方式使用。生物反應器有不同大小，如2.2L、5L、7.5L、14L或20L。富集和擴增心肌細胞系細胞本發明提供了不經富集步驟而獲得高純度心肌細胞系細胞群的方法。然而，加入一個或多個富集步驟可產生純度更加高的心肌細胞系細胞群。因此，本發明的方法可包括對通過本發明的分化步驟獲得的心肌細胞系細胞進行富集和/或擴增的步驟。富集特定細胞類型的各種方法是本領域已知的，其中包括但不限于機械分離、密度分離、細胞分選、磁力分選以及遺傳選擇技術(為了解細胞分離的全面討論可參見Freshney，《動物細胞培養》(CultureofAnimalCells),威利李斯公司(Wiley-Liss)，紐約，2000，第14章)。那些方法中的一些的例子在下面討論。密度梯度某些實施方式中，心肌細胞系細胞是采用密度梯度介質通過密度梯度分離富集的，所述介質諸如但不限于珀可(參見，例如，本文的實施例3和Xu等，Circ.Res.91(6):501-08，2002)，菲可(法瑪西亞公司(Pharmacia))，甲泛葡胺(Nygaard)，RediGrad(GE健康護理公司(GEHealthcare))和葡聚糖。細胞分選技術已有許多分選心肌細胞系細胞與非心肌細胞系細胞的細胞分選技術。那些細胞分選技術包括但不限于負免疫選擇和正免疫選擇。免疫選擇是一類術語，其中包括許多由抗體或抗體樣分子如凝集素或半抗原賦予選擇系統特異性的技術。這種特異性的一個例子是抗體對特異性細胞表面抗原的親和力。實踐了兩種常規類型的免疫選擇技術。負免疫選擇涉及消除異質群體中特定的組分亞群，如消除按照本文所述方法分化靈長類多能干細胞得到的細胞群中的非心肌細胞系細胞。相反，正免疫選擇指直接選擇并回收特定組分，如直接選擇并回收按照本文所述方法分化的靈長類多能干細胞中的心肌細胞系細胞。各種類型的免疫選擇可用于本發明的實踐，其中包括但不限于流式細胞術(FACS)、免疫磁性技術、抗體柱、免疫沉淀和免疫淘選。心臟小體一某些實施方式中，可使心肌細胞系細胞生長成被稱為心臟小體的細胞集落以進一步擴增或富集。首先，產生含有心肌細胞系細胞表型特征的細胞的細胞群，并任選地通過密度分離或其它技術對其進行富集。然后使細胞形成集落，去除懸液中的單細胞。通過使細胞集落沉降并吸出含有單細胞的上清液來完成這一步驟。在處理前，將細胞集落分開有時是有利的(例如，通過短時的胰蛋白酶消化和/或機械分散)。然后將細胞懸浮培養在低粘附性培養板中的新鮮培養基中(例子為如前所述的含有胎牛血清、血清替代物或CCT的培養基)，使其重新聚集為"次級"心臟小體。然后在繼續進行的培養中，可按照需要定期補充心肌細胞系細胞，使其保持大小為10-5000個細胞(通常50-1000個細胞)的細胞集落。經適宜的時間后(通常1-7天)，收集培養細胞進行特征鑒定或用于藥物篩選或藥物制備。如果使細胞經歷多輪去除單細胞和重培養細胞集落超過8天或更久，純化效果會提高。每輪可任選地加入如下步驟將細胞集落分散成單細胞或較小的細胞集落，以進一步擴增。可通過聚集懸浮細胞或通過在細胞集落內增殖或采用這兩種方法來形成較大的細胞集落。本發明的一個假設是在適宜的條件下心肌細胞系細胞傾向于形成這種細胞集落，而去除單細胞有助于去除其它細胞類型而提高同質性。可在分化過程中的任何時間，用心臟小體技術來擴增和/或富集細胞群中的心肌細胞。如下文中所示范的，可在密度分離預先富集步驟之后采用此技術。在完成本發明之前，沒有預想到完成該技術具有如此好處。具體而言，當細胞培養7天后，通過實時PCR測得肌球蛋白重鏈表達提高了10-100倍。組合物中大部分的細胞集落顯示出自發性收縮的活性，通常超過50%，當以所述的方式處理時，可能達到約80%和100%。ES-分化的心肌細胞系細胞的特征鑒定可按照許多表型標準對用本發明技術得到的心肌細胞系細胞進行特征鑒定。靈長類多能干細胞系衍生的心肌細胞和前體細胞通常具有其它來源心肌細胞的形態學特征。它們可為紡錘形、圓形、三角形或多角形，且用免疫染色法檢測可顯示出肌節結構的橫紋特征(圖1)。它們可形成粘附于基材或漂浮在懸液中的扁平細胞層或聚集物，用電鏡觀察時顯示典型的肌節和心房顆粒(atrialgranule)。在適宜的條件下，靈長類多能干細胞衍生的心肌細胞常顯示出自發性周期收縮活性。這是指將這些細胞培養在具有適當<^++濃度和電解質平衡的適宜組織培養基中時，可觀察到它們沿細胞的一條軸線收縮，然后從收縮中放松，而無需在培養基中加入任何其它成分。這種收縮是周期性的，即在規律性或不規律性的基礎上反復收縮，其頻率為約6到200次收縮/分鐘，在普通緩沖液中常為約20到約90次收縮/分鐘(圖2)。單個細胞自身即可顯示出自發性周期收縮活性，或它們可與存在于同一組織、細胞聚集物或培養的細胞團中的相鄰細胞一致的自發性周期收縮。可按照培養條件對收縮性質和頻率的影響來特征鑒定細胞的收縮活性。降低可利用的(^++濃度或干擾0^++跨膜轉運的化合物通常會影響收縮活性。例如，L型,丐離子通道阻滯劑地爾硫卓以劑量依賴性方式抑制收縮活性。另一方面，腎上腺素受體激動齊U(如異丙腎上腺素和苯福林)具有正性變時性(positivechronotropic)作用。對細胞功能特性的進一步特征分析可涉及到對Na+、K+和(^++通道的特征分析。可通過對心肌細胞樣活動電位的膜片鉗分析來進行電生理研究。參見Igelmund等，PflugersArch.437:669，1999;Wobus等，Ann.N.Y.Acad.Sci.27:752，1995;和Doevendans等，J.Mol.CellCardiol.32:839，2000。心肌細胞系細胞通常具有至少一種如下的心肌細胞特異性標記，心肌鈣蛋白I(cTnI)，肌鈣蛋白復合物的亞單位，該復合物提供了調節橫紋肌收縮的鈣敏感性分子開關心肌鈣蛋白T(cTnT)Nkx2.5，一種在小鼠早期胚胎發育中心臟中胚層表達的心臟轉錄因子，在發育中的心臟中仍存在通常，該細胞還將表達至少一種(通常至少3、5或更多種)如下的標記.心房鈉尿素(ANF)，一種在發育的心臟中和胎兒心肌細胞中表達，但在成人中下調的激素。由于其以高度特異性的方式在心臟細胞而不在骨骼肌細胞中表達，從而被認為是心肌細胞的一種良好標記肌球蛋白重鏈(MHC)，具體為心臟特異性的p鏈*肌聯蛋白、原肌球蛋白、ct-肌節輔肌動蛋白和結蛋白GATA-4，一種在心臟中胚層中高度表達且在發育的心臟中持續存在的轉錄因子。其能調節許多心臟基因并在心臟發生中起一定作用MEF-2A、MEF-2B、MEF-2C、MEF-2D;在心臟中胚層中表達并在發育心臟中持續存在的轉錄因子N-鈣粘蛋白，其能介導心臟細胞間的附著，連接蛋白43，其能在心肌細胞間形成縫隙連接卩1-腎上腺素受體(P1-AR)肌酸激酶MB(CK-MB)和肌紅蛋白，心肌梗塞后它們的血清水平提高a-心臟肌動蛋白、早期生長應答素-I和細胞周期蛋白D2。可用任何適宜的免疫學技術來檢測組織特異性標記一例如對細胞表面標記進行流式免疫細胞計數或親和吸附、對胞內或細胞表面標記使用免疫細胞化學法(例如，對固定的細胞或組織切片)、對細胞提取物進行蛋白質印跡分析、對細胞提取物或分泌入培養基的產物進行酶聯免疫試驗。可從諸如Sigma和SpectralDiagnostics供應商處購得能鑒別其它同種型的心臟標記(如cTnl和cTnT)的抗體。如果任選在固定該細胞后以及任選使用標記的二抗，在標準的免疫細胞化學或流式細胞計數試驗中，可檢測到明顯數量的抗體與抗原結合，則說由細胞表達的抗原是可用抗體檢測的。也可在mRNA水平通過Norther印跡分析法、斑點雜交分析法或用序列特異性引物、以標準的擴增方法、用公眾可獲得的序列數據(GenBank)進行由逆轉錄酶引發的聚合酶鏈式反應(RT-PCR)來檢測組織特異性基因產物的表達。如果蛋白質或mRNA水平上檢測到組織特異性標記表達水平為未分化的靈長類多能干細胞的至少2倍，優選高于10倍或50倍以上，則認為是該表達為陽性。也可在mRNA水平通過Norther印跡分析法、斑點雜交分析法或用序列特異性引物以標準擴增方法進行由逆轉錄酶引發的聚合酶鏈式反應(RT-PCR)來檢測組織特異性基因產物的表達。參見美國專利No.5,843,780以了解進一步的細節。該公開中列出的具體序列數據可從公共數據庫如GenBank((URLwww.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez)獲得。根據該公開中描述的一個試驗，如果在一典型的受控實驗中根據標準過程對細胞樣品進行的試驗導致可明確辨別的雜交或擴增產物，則mRNA水平的表達被認為是"可檢測的"。如果蛋白質或mRNA水平上檢測到組織特異性標記表達水平為未分化的靈長類多能干細胞的至少2倍，優選高于10倍或50倍以上，則認為是該表達為陽性。一旦在細胞表面上鑒定到了具有所需表型的標記，就可將這些細胞用于免疫選擇以通過諸如免疫淘選或抗體介導的熒光活化細胞分選的技術來進一步富集該細胞群。當從已建立的靈長類多能干細胞系中產生時，可將本發明的細胞群以及分離的細胞特征鑒定為具有與產生它們的細胞系相同的基因組。這是指靈長類多能干細胞和心臟細胞之間染色體DNA將會有90%以上的相同性，如果通過正常的有絲分裂過程從未分化的細胞系中獲得心臟細胞，則可推論出該相同性。心肌細胞系細胞衍生自親代細胞群這一特征在多個方面是很重要的。具體而言，可用未分化的細胞群來產生具有共享基因組的其它細胞一無論是另一批心臟細胞，還是可用于治療的另一種類型的細胞一例如可使患者對組織相容類型的心臟同種異體移植物產生預耐受性的細胞群(US2002/0086005A1;WO03/050251)。分化細胞的遺傳改變可在分化前或分化后對本發明的細胞進行遺傳工程改造，使其包含一種或多種遺傳改變(US2002/0168766Al)。例如，可通過遺傳性改變細胞以使其表達端粒酶逆轉錄酶，以提高細胞的復制能力，無論是在它們發展為發育受限的細胞系(restricteddevelopmentallineagecell)或是終末分化細胞之前或之后(US2003/0022367Al)。也可遺傳改變本發明的細胞以增強它們參與組織再生或將治療基因遞送到給藥部位的能力。用所需基因的已知編碼序列設計了載體，使其操作性連接于在分化的細胞類型中具有泛特異性或特異性活性的啟動子。特別感興趣的是經遺傳改變表達一種或多種各種類型的生長因子的細胞，所述生長因子為例如FGF，親心性因子，例如心房鈉尿素、cripto(—種新的表皮生長因子族成員)和心臟轉錄調節因子，例如GATA-4,Nkx2.5和MEF2-C。在給藥部位產生這些因子可使功能性表型更易被接受、增強所給予細胞的有益作用、或提高鄰近治療部位宿主細胞的增殖或活性。某些實施方式中，需要對非人心肌細胞系細胞進行遺傳改變以降低或消除一種或多種抗原的表達從而降低那些細胞的免疫原性。例如，在將非人心肌細胞系細胞異種移植入人體時這可能是有用的。ES-分化的心肌細胞系細胞的用途本發明提供了一種生產大量心肌細胞系細胞的方法。可將這些細胞群用于許多重要的研究、開發和商業目的。篩選可將本發明的心肌細胞用于商品化篩選能影響這些細胞和它們不同后代的因素(例如溶劑、小分子藥物、肽、寡核苷酸)或環境條件(例如培養條件或操作)。在某些應用中，將靈長類多能干細胞(未分化的或已分化的)用于篩選能促進其成熟成為后期階段心肌前體細胞或終末分化細胞的因子，或在長期培養中能促進這些細胞增殖和保持的因子。例如，可按照進一步培養和應用這些細胞所期望的標準，通過將候選的成熟因子或生長因子加入到不同孔的細胞中，然后測定所導致的任何表型變化來檢測這些候選因子。本發明的其它篩選應用涉及到藥物組合物對心臟肌肉組織的維持或修復作用的檢測。可因該化合物設計為對所述細胞具有藥理學作用，或因設計的化合物對其它部位有效而可能對該組織類型的細胞有副作用而進行該篩選。可利用本發明的任何前體細胞或終末分化的細胞來進行這種篩選。一般來說，讀者可參考標準教材《藥學研究的體外方法》(/"v"raP/wrmacew"ca/ie^an^，學術出版社(AcademicPress),1997)和美國專利5,030,015。候選藥物化合物活性的評估通常包括將本發明的分化細胞與該候選化合物相混合，無論是單獨混合或是與其它藥物組合。研究者測定由該化合物所引起的細胞形態、表型標記或功能活性的變化(與未經處理的細胞或用惰性化合物處理的細胞比較)，然后將觀察到變化與該化合物的作用相關聯。可在第一種情況下通過對細胞活力、存活、形態和某些標記和受體的表達的作用來測定細胞毒性。可測定DNA合成或修復來測定藥物對染色體DNA的作用。[3H]-胸苷或BrdU摻入，尤其在細胞周期中不特定的時間中摻入，或超過細胞復制所需水平，與藥物的作用相符合。不良作用還包括通過分裂中期擴散(metaphasespread)所測定的罕見比例的姐妹染色單體交換。對于更多的細節，讀者可參考A.Vickers(《藥學研究的體外方法》(/"Wfro^M^/zocfe/"尸/zflrmacew"cfl/Wewan:A，第375-410頁，學術出版社(AcademicPress)，1997)。可采用任何標準測試觀察心肌細胞的表型或活性，例如檢測標記表達、受體結合、收縮活性或電生理一無論在細胞培養物中或在體內來評估對細胞功能的影響。也可檢測候選藥物對收縮活性的影響一例如它們是否提高或降低了收縮的程度或頻率。當觀察到有影響時，可滴定化合物的濃度以測定其半數有效劑量(ED50)。動物試驗本發明還提供為了任何可覺察到的需求，例如先天性代謝功能失調、病情的影響或明顯創傷的結果等，采用心肌細胞及其前體細胞促進心肌組織維持或修復。為了確定用于治療性給藥的細胞組合物的適宜性，可先在適宜的動物模型中測試該細胞。在某一水平上，評估細胞在體內存活和保持其表型的能力。將細胞組合物給予免疫缺陷動物(例如裸鼠或用化學方法或輻射方法使其產生免疫缺陷的動物)。經過一定階段的再生后收集組織，并評估是否仍存在多能干細胞衍生的細胞。這可通過給予能表達可檢測標記(例如綠色熒光蛋白或(3-半乳糖苷酶)的細胞來進行；這些細胞是經預先標記的(例如，用BrdU或[3司胸苷)，或通過后繼檢測組成性細胞標記(例如，利用人特異性抗體)。可使用人特異性抗體進行免疫組化或ELISA來評估所給予細胞的存在和表型，也可用能引起人多核苷酸特異性擴增的引物和雜交條件，按照公開的序列數據，通過RT-PCR分析來評估。還可通過評估用心肌細胞群治療后心臟恢復的程度來確定適宜性。已有許多動物模型可用于該測試。例如，可通過使預冷的鋁棒接觸左心室前壁表面來凍傷心臟(Murry等，J.Clin.Invest.98:2209，1996;Reinecke等，Circulation100:193,1999;美國專利6,099,832;Reinecke等，CircRes.，2004年3月電子出版)。在較大的動物中，可通過將液氮冷卻的30-50mm圓盤銅探頭放置在左心室前壁約20分鐘來凍傷(Chiu等，A皿.Thorac.Surg.60:12，1995)。可通過結扎左主冠狀動脈(Li等，J.Clin.Invest.100:1991，1997)或用逐漸膨脹而阻塞動脈的ameroid收縮裝置來誘導梗塞。用本發明的細胞制備物治療受損部位，通過組織學檢查心臟組織受損區域中所述細胞的存在。可測定以下參數來監測心功能左心室舒張末期壓、逐漸產生的壓力、壓力升高的速度以及壓力減退的速度。人體治療用途經適當測試后，可將本發明的分化細胞用于需要此類治療的病人或其它對象的組織重建或再生。給予該細胞的方式應能使細胞植入或遷移到預定的組織部位重建或再生該功能缺陷區域。可獲得能重建心臟功能的細胞將其直接給予心腔、心包或心肌內的所需部位。需要時，可治療接受同種異體移植心肌細胞的患者以降低其對植入細胞的免疫排斥。考慮的方法包括給予常規的免疫抑制藥物，如環孢霉素A(Dunn等，Drugs61:1957，2001)或采用匹配的多能干細胞衍生細胞群誘導免疫耐受(WO02/44343;美國專利6,280,718;WO03/050251)。另一方法是例如用別嘌呤醇處理心肌細胞系細胞群，移植入對象后該細胞適應而致使尿酸量產生減少。或者，可聯合給予患者別嘌呤醇或能分解代謝尿酸的酶，例如尿酸鹽氧化酶(PCT/US04/42917)。適于接受本發明再生醫學的患者包括各種類型的急慢性心臟病患者，例如冠心病、心肌病、心內膜炎、先天性心血管缺陷和充血性心力衰竭。可采用臨床上接受的標準，例如疤痕組織占據面積的減小或疤痕組織的血管再形成，以及心絞痛的頻率和嚴重程度；或擴張壓、收縮壓、舒張末期壓、A壓力/A時間、患者活動能力和生活質量來監測治療效果。可以藥物組合物的形式提供本發明的心肌細胞，該組合物包含在充分滅菌條件下制備的用于人體給藥中的等滲賦形劑。當分化過程包擴將細胞培養為心臟小體時，需用蛋白酶或柔和的機械操作將細胞分散成單細胞或較小細胞集落的懸液。為了降低植入時細胞死亡的風險，可在給予前用熱激處理細胞或將其培養在約0.5U/mL的促紅細胞生成素中約24小時。對于藥物配制中的常用方案，讀者可參考《細胞治療干細胞移植、基因治療和細胞免疫治療》(Ce〃77zera"..5VemCW/7hmsp/a"她'o",G^"e7T^rap》a"cfCe〃w/ar/mmMwo/Zzerajcy),G.Morstyn禾卩W.Sheridan編，劍橋大學出片反社(CambridgeUniversityPress),1996);禾P《造血干細胞治療》(i^matopo,",cStemCe〃T7zerap力，E.D.Ball,J.Lister禾BP.Law,ChurchillLivingstone,2000)。可按照給藥所用的途徑和裝置選擇細胞賦形劑和調整組合物的伴隨成分。該組合物還可包含或伴有一種或多種有利于心肌細胞植入或功能性遷移的其它成分。適宜的成分包括基質蛋白類型，尤其是內皮細胞。本發明還包括試劑系統，其包含生產、分布或使用過程中任何時間存在的一系列細胞或細胞組合。所述細胞系列包括本文揭示中所述的兩種或多種細胞群的任何組合，例子但不限于一類分化的多能干細胞衍生的細胞(心肌細胞、心肌前體細胞、心臟小體等)與未分化的靈長類多能干細胞或其它分化的細胞類型的組合，它們通常具有相同的基因組。可將該系列的各種細胞類型包裝在一起或包裝在不同容器中，裝入在同一裝置中或不同位置中，在相同或不同時間，由同一實體或共享工作關系的不同實體控制。可任選將本發明的藥物組合物包裝在帶有用于所需目的書面說明書的適宜容器中，例如說明用于重建心肌細胞功能以改善病情或改善心肌異常。本發明的細胞可用于制備相對未被較其它細胞系在細胞中優先表達的CDNA污染的cDNA文庫。例如，1000rpm離心5分鐘以收集心肌細胞系細胞，然后制備mRNA并進行反轉錄。可通過微陣列分析將心肌細胞系細胞的表達模式與其它細胞類型進行比較，為了解微陣列分析通常可回顧Fritz等，Science288:316，2000;"MicroarrayBiochipTechnology(微陣列生物芯片技術)"，LShi，www.Gene-Chips.com。本發明的分化細胞也可用于制備特異于心肌細胞系細胞標記的抗體。可將免疫原性形式的本發明的細胞注射入脊椎動物以制備多克隆抗體。單克隆抗體的制備描述于以下標準參考資料，如Harrow&Lane(1988)，美國專利Nos.4,491,632、4,472,500和4,444,887，以及《酶學方法》(MethodsinEnzymology)73B:3(1981)。出于任何目的，本申請中提及的所有出版社和專利通過引用納入本文。實施例1明膠/FBS上的三因子分化制備明膠/FBS涂布的表面在6孔平板的每個孔中加入1ml0.5%明膠溶液并在37。C孵育過夜。除去明膠溶液，然后加入足量含20。/。FBS的培養基(例如，20%FBS(Sigma))并繼續孵育5-6小時。加入人胚胎干細胞之前除去孔中的培養基。接種未分化的人胚胎干細胞供隨后分化通過a)除去培養基；b)用PBS沖洗各孔l次；和c)加入lml0.25n/o胰蛋白酶/500mMEDTA溶液將6孔平板l個孔中的未分化的人胚胎干細胞解離。將孔在37t:孵育IO分鐘，然后用1ml移液管研磨10次。在顯微鏡下檢測該孔觀察到細胞完全解離。加入2ml含20%FBS的培養基(例如，含20%FBS的KnockoutDMEM)以滅活胰蛋白酶。對細胞計數，該數目被用來以所需密度接種衍生自其余孔的細胞。除去其余孔中的培養基。在各孔中加入20單位/毫升膠原酶溶液(1ml/L)。各孔在37'C孵育10分鐘，然后除去膠原酶溶液。在各孔中加入lmlMEF條件化培養基和8ng/mlbFGF。用5ml吸管刮擦各孔直到細胞分離(形成小的集落)；無需進行進一步的研磨。將細胞稀釋至所需密度并接種到如上所述制備的6孔平板(此時，每孔接種5ml共670,000個細胞；接種3個孔)。每天除去用過的培養基并更換成新鮮的MEF-CM+8ng/mlbFGF以重新飼養ES細胞(如在星期二接種細胞，則星期六的補料通常被跳過)。生長因子處理如上所述生長6天后，除去細胞培養基并更換成RPMI+IXB27添加物(因維曲根公司)+50ng/ml活化素A(R&D系統(R&DSystems))。18-24小時后除去培養基并更換成RPMI+IXB27添加物+50ng/mlBMP-4(R&D系統)。在含BMP-4的培養基中總共培養4天后除去培養基并更換成RPMI+IXB27添加物+50ng/mlIGF-l(R&D系統)，其中不含活化素或BMP。每2-3天除去用過的培養基并更換成不含活化素或BMP的新鮮RPMI+IXB27添加物+50ng/mlIGF-1以重新飼養培養物。加入活化素A約12天后開始出現大量搏動的細胞集落。加入活化素A后的第24天對細胞計數(6孔平板的3個孔內總共有910萬個細胞)，并通過FACS分析心肌鈣蛋白I的表達，其過程如下FACS分析一吸出培養物中的培養基。各孔用5ml不含鈣/鎂的PBS沖洗。在各孔加入1.5ml0.25%胰蛋白酶/500mMEDTA溶液，并將細胞在37。C孵育20分鐘。用移液管研磨細胞直到獲得單細胞懸液。(含20%FBS的KnockoutDMEM)。通過計數估算細胞濃度，每次染色(EMA、同種型、cTnl、cTnl+EMA;都含在15ml圓錐管中)使用約500,000個細胞。將含有細胞的試管400xg離心5分鐘。吸出培養基并將細胞團重懸于1ml染色緩沖液(PBS+P/。熱滅活的山羊血清和0.1。/o疊氮化鈉)。為進行EMA染色，在細胞中加入EMA使其終濃度為5微克/毫升。將這些樣品在黑暗中于冰上培育15分鐘，然后按上文所述離心。將經EMA處理的樣品重懸于500微升PBS并曝光10分鐘。在EMA處理的樣品中加入500微升4%低聚甲醛并在黑暗中室溫培育15分鐘。將未加入EMA但隨后用抗體染色的樣品按上文所述離心，重懸于500微升PBS，然后加入500微升4%低聚甲醛，然后在黑暗中室溫培育15分鐘。將所有樣品按上文所述離心并重懸于100微升PBS。然后在所有樣品中加入900微升冰冷的100%甲醇并在冰上培育30分鐘。在所有樣品中加入1ml染色緩沖液(PBS+1%熱滅活的山羊血清和0.1。/。疊氮化鈉)并按上文所述離心。吸出上清液并將細胞以約500,000細胞/50微升的密度重懸于封閉緩沖液(PBS+20%正常山羊血清和0.1%疊氮化鈉)。將樣品在4。C培育10-15分鐘。對于各染色樣品，取50微升等份細胞加入單獨的12x75mm聚苯乙烯管。在要染色的各份樣品中加入50微升心肌鈣蛋白I抗體(光譜診斷公司(SpectralDiagnostics))或同種型對照(各管中抗體的最終含量為1.2微克)。將樣品在4。C培育30分鐘。加入2ml染色緩沖液，然后按上文所述離心樣品。重復該洗滌步驟。除去第二次的洗滌上清液后將樣品重懸于50微升用PBS配制的含0.25微克第二抗體(分子探針公司(MolecularProbes)的山羊抗小鼠IgG，用alexa488標記)的5%正常山羊血清溶液。樣品在黑暗中于4。C培育30分鐘，再用2ml染色緩沖液洗滌并按上文所述離心。潷出上清液并將樣品重懸于300微升染色緩沖液以便在FACScalibur儀上流動獲取(flowacquisition)。24.67-27.36%的存活細胞被抗心肌細胞肌節蛋白心肌鈣蛋白I的抗體染色。這些結果示于圖1。實施例2基質膠涂布表面上的三因子直接分化取1等份生長因子還原的基質膠(之前用冷的KnockoutDMEM1:2稀釋并儲存于-20°C)。該基質膠溶液進一步用冷的KnockoutDMEMl:15稀釋。用稀釋的基質膠溶液涂布6孔平板的空孔，每孔lml，并將平板在室溫下孵育4-5小時。除去基質膠溶液，按上文的描述接種人ES細胞，無需對孔進行預沖洗。接種未分化的hES細胞供隨后分化通過a)除去培養基；b)用PBS沖洗各孔1次；和c)加入lml0.05。/。胰蛋白酶/500mMEDTA溶液將6孔平板l個孔中的未分化的hES細胞解離。將各孔在37'C的培養箱中培養10分鐘。用移液管研磨細胞直到細胞完全解離。加入2ml含20。/。FBS的培養基(例如，含20%FBS的KnockoutDMEM)以滅活胰蛋白酶。對細胞計數，該數目被用來以所需密度接種衍生自其余孔的細胞。除去其余孔中的培養基。以lml/孔在各孔中加入膠原酶溶液(200單位/毫升)，并將各孔在37。C孵育10分鐘。除去膠原酶溶液，并加入MEF條件化培養基和8ng/mlbFGF。用吸管刮擦各孔直到細胞分離(形成小的集落)；無需進行進一步的研磨。將細胞稀釋至所需密度并接種到如上所述制備的6孔平板(每孔接種5ml共1,850,000個細胞)。每天除去用過的培養基并更換成新鮮的MEF-CM+8ng/mlbFGF以飼養接種的hES細胞(但第二天不這樣做)。生長因子處理如上所述生長6天后，除去細胞培養基并更換成RPMI+IXB27添加物+50ng/ml活化素A。18-24小時后除去培養基并更換成RPMI+IXB27添加物+50ng/mlBMP-4，其中不含活化素A。在含BMP-4的培養基中總共培養4天后除去培養基并更換成不含活化素或BMP的RPMI+IXB27添加物+50ng/mlIGF-1。每2-3天除去用過的培養基并更換成新鮮的不含活化素或BMP的RPMI+IXB27添加物+50ng/mlIGF-1。對細胞計數并通過FACS分析心肌鈣蛋白I的表達，其過程如下FACS分析一吸出培養物中的培養基。各孔用5ml不含鈣/鎂的PBS沖洗。在各孔加入lml0.25%胰蛋白酶/500mMEDTA溶液，并將細胞在37"C孵育5分鐘。將用胰蛋白酶分離的細胞轉移到15ml的圓錐管中并再在37"C孵育15-20分鐘。用移液管研磨細胞直到獲得單細胞懸液。加入2ml含20%FBS的培養基(含20%FBS的KnockoutDMEM)終止胰蛋白酶消化。通過計數估算細胞濃度，每次染色(EMA、同種型、cTnl、cTnl+EMA;都含在15ml圓錐管中)使用約500,000個細胞。將含有細胞的試管400xg離心5分鐘。吸出培養基并將細胞團重懸于1ml染色緩沖液(PBS+2%熱滅活的胎牛血清和0.1%疊氮化鈉)。為進行EMA染色，在細胞中加入EMA使其終濃度為5微克/毫升。將這些樣品在黑暗中于冰上培育15分鐘，然后按上文所述離心。將經EMA處理的樣品重懸于1mlPBS并在光下暴露10分鐘。在EMA處理的樣品中加入1ml4。/。低聚甲醛并在黑暗中室溫培育15分鐘。將未加入EMA但隨后用抗體染色的樣品按上文所述離心，重懸于500微升PBS，然后加入500微升4%低聚甲醛，然后在黑暗中室溫培育15分鐘。將所有樣品按上文所述離心并重懸于100微升PBS。然后在所有樣品中加入900微升冰冷的100%甲醇并在冰上培育30分鐘。在所有樣品中加入1ml染色緩沖液(PBS+2%熱滅活的胎牛血清和每0.5><106個細胞0.2微克大鼠抗小鼠Fc片段(BD))并按上文所述離心。吸出上清液并將細胞以約500,000細胞/100微升的密度重懸于封閉緩沖液(PBS+20%正常山羊血清和0.1%疊氮化鈉)。將樣品在4'C培育10-15分鐘。對于各染色樣品，取100微升等份細胞加入單獨的12x75mm聚苯乙烯管。在要染色的各份樣品中加入20微升心肌鈣蛋白I抗體(光譜診斷公司)或同種型對照(各管中抗體的最終含量為1.2微克)。將樣品在4"培育30分鐘。加入4ml染色緩沖液，然后按上文所述離心樣品。除去第二次的洗滌上清液后將樣品重懸于50微升用PBS配制的含0.25微克第二抗體的5%正常山羊血清溶液，在黑暗中于4。C培育30分鐘，再用4ml染色緩沖液洗滌并按上文所述離心。潷出上清液并將樣品重懸于300微升染色緩沖液+0.5%低聚甲醛以便在FACScalibur儀上流動獲取。結果用Flojo軟件分析。在該實驗中，胰蛋白酶解離后有69%的細胞存活。在這些存活的細胞中有8.9%被抗心肌細胞特異性蛋白質心肌鈣蛋白I的抗體染色(見圖2)。實施例3采用四階段離心分離法富集的例子使H7系的hES細胞形成胚狀體4天，然后在明膠涂布的平板上增殖17天(未使用5-氮雜-脫氧-胞苷和生長因子)，以此產生心肌細胞。然后用膠原酶B解離細胞，將其重懸于分化培養基。然后將細胞懸液加在不連續珀可梯度上并1500g離心30分鐘。收集到4種組分I.上表面；11.40.5%層；III.下表面；IV.58.5%層。洗滌細胞并重懸于分化培養基。將要進行免疫染色的細胞接種到腔式載玻片中，每孔104個細胞，培育2或7天，然后固定并染色。結果示于表3。計算從每種組分三復孔獲得的30張圖像中的細胞數目以確定MHC陽性細胞的百分比，結果表示為3個孔的細胞的平均值土標準差。表3:珀可分離組分細胞數搏動細胞被MHC染色的百分比第2天第7天分離前+17±4.4%15±4%I9.0x106±2.6±0.5%2.5±3.0%II1.6x106+4.5±1.5%2.4±0.9%III++35.7±2.7%28.3±9.4%IV+++69.0±5.0%52.2±14.5%最高百分比。通過間接免疫細胞化學確定的細胞表型示于表4。表4:分離的細胞群的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>可利用對cTnl和MHC的染色來辨別通過密度梯度離心分離的心肌細胞群。不存在對肌細胞生成蛋白、甲胎蛋白或p-微管蛋白m的染色表示不存在骨骼肌、內胚層細胞類型和神經元。缺乏對SSEA-4和Tra-l-81的染色證實不存在未分化的hES細胞。a-平滑肌肌動蛋白(SMA)據說存在于胚胎和胎兒心肌細胞中，但不存在于成人心肌細胞中(Leor等，Circulation97:11332，1996;Etzion等，Mol.CellCardiol.33:1321，2001)。實際上，在心肌細胞分化過程中獲得的所有cTnl-陽性細胞和cTnl陰性細胞亞組對SMA呈陽性，說明它們處于早期階段并能夠增殖。重新接種組分III和IV的細胞并再培育2天。43±4%的MHC陽性細胞表達BrdU，這說明它們處于細胞周期的S期。在另一個實驗中，發現cTnl陽性細胞的一個亞組表達Ki-67。這些結果顯示，群體中約20%或40%的心肌細胞正經歷活躍增殖。通過制造心臟小體富集收縮細胞的例子該實施例例舉了隨后將心肌細胞集落培養成心臟小體以富集具有治療用途和其它目的所需特征的細胞。如上所述，用3個燒瓶(燒瓶體積為225cm、的H7系未分化hES細胞來產生胚狀體。將各燒瓶的EB重懸于75mL培養基并轉移至3個低粘附性6孔平板(每孔4mL細胞懸液)，總共得到9個EB懸液平板。1天后將新形成的EB轉移至50mL圓錐管(每管一個平板)，不要攪拌使EB在室溫下靜置10-20分鐘，然后除去培養基并更換成新鮮的培養基(每管25mL)，以此重新懸浮飼養EB。將EB送回它們原來的低粘附性平板并在含20%FBS的培養基中再懸浮培養3天，然后轉移至總共3個明膠涂布的225ci^組織培養燒瓶中。轉移至明膠涂布的燒瓶2天后，除去培養基并在各燒瓶中加入75mL含20%FBS的培養基重新培養。在第8、11、13、15和18天進行類似的重新培養。在第20天時用混合酶(Blendzyme)(羅氏應用科技公司(RocheAppliedSciences),彭滋伯格(Penzberg)，德國)分離分化的培養物并如上所述在不連續珀可梯度上分層。回收組分IV(密度最高的組分)并計數，得到約3.7><106個單個細胞和小的集落。將組分IV的細胞重懸于約6.5mL含20%FBS的培養基，轉移至15mL圓錐管，不要攪拌在室溫下靜置IO分鐘。除去培養基(含2.8^106個細胞，其中大多數是單個細胞)并更換成新鮮的培養基。將細胞懸液轉移至一個低粘附性6孔平板(每孔約4mL細胞懸液)。每48小時用類似方法重新飼養(轉移至50mL試管，靜置10分鐘，除去培養基并更換培養基)。圖3顯示了通過實時PCR測得的肌節基因aMHC和心肌鈣蛋白I的表達。相對于在明膠上培養20天后的表達，通過珀可梯度分離細胞使組分IV細胞的表達提高了2-5倍。除去單個細胞并收集集落使表達提高了5-20倍。將細胞培養8天使其成為心臟小體后，表達比未分離的細胞高100至500倍。存在大片自發收縮的細胞。為用于動物試驗，可直接植入心臟小體或使其分散成單細胞懸液。實施例5如實施例1所述分化H7hES細胞，但分化在24孔平板而非6孔平板上進行，且各因子的體積為每孔1ml。此外，所用BMP-2和BMP-4的濃度為25ng/ml、50ng/ml和100ng/ml。各濃度一式三份進行。圖4顯示了結果，其表示為占對照的相對倍數，對照也采用上述過程但未加入活化素、BMP或IGF-I。由圖可見，BMP-2在分化過程中也是有效的。實施例6用2mlPBS洗滌生長至匯合的H7hES細胞的6孔平板。然后在各孔中加入2ml用PBS配制的0.5mMEDTA，并將平板在37。C孵育10分鐘。將EDTA溶液替換成1ml小鼠胚胎成纖維細胞條件化培養基(MEF-CM)+8ng/mlbFGF("培養基A")。上下吸取2-3次以分離未分化的ES細胞，然后以400,000細胞/孔將細胞接種于24孔平板中的培養基A中。將細胞在37"C孵育2天。為誘導hES細胞分化，將24孔平板每個孔內的培養基A替換成0.5mlB27:RPMI(1:50)(兩種試劑都來自因維曲根公司)+100ng/ml活化素A(R&D系統)("培養基B")。將細胞培育24小時。然后將培養基B替換成含10ng/mlBMP-4(R&D系統)的1:50B27:RPMI("培養基C")，在24孔平板的每個孔中加入1ml。將細胞培育4天。將24孔平板每個孔中的培養基C替換成1ml1:50B27:RPMI，并將平板培育15天。所得細胞如實施例2所述通過FACS分析，但用0.25%胰蛋白酶/500mMEDTA溶液培育細胞5分鐘而非實施例2中所采用的20分鐘。約36%的細胞表達cTnl。權利要求1.一種從人胚胎干(hES)細胞獲得心肌細胞系細胞的方法，所述方法包括a)在存在活化素A而不存在BMP時培養所述hES細胞；和b)然后在存在BMP時培養所述細胞。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述BMP是BMP-2、BMP-4或BMP-7。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述BMP是BMP-2。4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述BMP是BMP-4。5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述BMP是BMP-7。6.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述存在BMP時的培養是在不存在活化素時進行的。7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述hES細胞在存在活化素A時培養約1天，然后在存在BMP時培養約4天。8.如權利要求l所述的方法，其還包括在BMP培養步驟后，用不含活化素A或BMP的培養基進行的培養步驟。9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，該進一步的培養步驟進行至少l周。10.如權利要求8所述的方法，其特征在于，該進一步的培養步驟進行至少2周。11.如權利要求8所述的方法，其特征在于，該進一步的培養步驟用含有IGF-I或IGF-II的培養基進行。12.如權利要求ll所述的方法，其特征在于，該進一步的培養步驟用含有IGF-I的培養基進行。13.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法不包括形成胚狀體的步驟。14.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在BMP培養步驟之后從培養物中收獲細胞以及富集收獲的細胞群中的心肌細胞系細胞。15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述收獲的細胞群通過珀可梯度法富集。16.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述富集包括形成心臟小體。17.—種從hES細胞中獲得富集的心肌細胞系細胞群的方法，所述方法依次包括以下步驟a)在存在活化素A而不存在BMP時用無血清培養基培養hES細胞約1天；b)然后在存在BMP而不存在活化素時用無血清培養基培養約4天；c)從培養物中收獲細胞；和d)富集收獲的細胞群中的心肌細胞系細胞。全文摘要本申請描述了使靈長類多能干細胞分化成心肌細胞系細胞的新方法。該方法采用某些生長因子依次培養靈長類多能干細胞以產生心肌細胞系細胞。在本發明的某些實施方式中，進一步富集這種依次培養產生的細胞群中的心肌細胞系細胞以產生較高百分比的那些細胞。文檔編號C12N5/00GK101228264SQ200680022866公開日2008年7月23日申請日期2006年6月20日優先權日2005年6月22日發明者J·D·戈德,M·哈薩尼波申請人:杰龍公司