Oas1基因中的突變的制作方法

專利名稱：Oas1基因中的突變的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測人或非人靈長類動物寡腺苷酸合成酶基因中的突變的方法，和具有至少一處氨基酸修飾的OAS 1蛋白。
2．
背景技術：
迄今為止已鑒別出其中人群中存在天然的感染抗性的多種疾病。A 1 t er和Moyer， ，彳cqu，，． Immune．Defic．Syndr．．Hum Retrovirol．1 8 Supp 1．1S 6—1 0(1 9 9 8)報導在諸如注射藥物使用者的高危群組中的丙型肝炎病毒感染(HCV)率高達9 0％。然而，尚未有文獻確認剩余的1 0％明顯對抗感染的機制。在HCV感染中起作用的蛋白包括2一、5一，寡腺苷酸合成酶。0AS是干擾素誘導蛋白，其特征為能催化2一、5一’腺苷寡聚物(2—5A)的合成。Hovanes s i an等，EMBO 61 2 7 3—1 2 8 0(1 9 8 7)發現，經干擾素處理的人類細胞含有數種對應于4 0(0Asl)、4 6(0AS 1)、6 9及1 0 0kD的蛋白的OAS。Ma r i e等，刀，oohom．曰jophys．月es．Commun．160580—587(1989)制備了高度特異性的抗p69(69-kDOAS)多克隆抗體。通過以抗一p6 9抗體篩選經干擾素處理的人類細胞表達文庫，Ma r i e和H0vane s s i an，，曰fD J『．餳e歷．2 6 79 9 3 3—9 9 39(1 9 9 2)分離出了部分OAS 2 cDNA。他們以該部分cDNA篩選其它文庫，并回收了編碼兩個0AS 2同種型的cDNA。較小的同種型由3_，非翻譯區長度不同的兩種mRNA編碼。
RNA印跡分析揭示，OAS 2在人類細胞中表達為四種由干擾素誘導的mRNA。預測的OAS 2蛋白具有共同的6 8 3一氨基酸序列和不同的3一’末端。根據體外轉錄／翻譯產物的SDS—PAGE，兩個同種型的分子質量為6 9和7 1 kD。兩個同種型在體外均顯示出OAS活性。序列分析表明，0AS2含有兩個由富含脯氨酸的推定連接區所分隔的OAS卜同源域。
N末端及C末端域分別與0AS1有41 %和53%同一性。
通過熒光原位雜交和通過包含于作圖克隆(mapped clones )之內， Hovanian等，Ce層/" 52: 267-277 (1998)確定0AS1 、 0AS2和0AS3 基因與12q24. 2上的130-kb區域簇集在一起。2 — 5A會結合至降解病 毒及細胞RNA的RNA酶I，并將它激活，從而導致細胞蛋白合成的抑 制和病毒復制的削弱。
被稱為0ASL的第四種人類0AS基因與0AS1、0AS2和0AS3的不同 在于0ASL缺乏酶活性。0ASL基因編碼雙域蛋白，后者由融合至與泛 素的串聯重復同源的164個氨基酸C末端域的OAS單元組成。 (Eskildsen等，Nuc. Acids Res. 31: 3166-3173 ， 2003; Kakuta 等，J. Interferon & Cytokine Res. 22: 981-993， 2002.)
由于它們在抑制病毒復制和病毒感染中的作用，本領域需要與 0AS1活性有關的抑制病毒復制的方法和組合物，包括十分需要抑制 HCV復制的基于抑制劑的療法。

發明內容
本發明涉及檢測與丙型肝炎抗性有關的突變，所述突變可以表征 為寡腺苷酸合成酶1基因中的突變。
在一個實施方案中，包括遺傳篩查方法。該方法包含，測定從人 或非人靈長類動物分離的核酸樣品中是否存在寡腺苷酸合成酶1基因 突變，該突變造成所有寡腺苷酸合成酶l(OASl)形式(包括但不限于 SEQ IDN0: l)在下述一個或多個位置處的氨基酸修飾1， 24， 25， 28， 31， 36， 47, 53， 54， 64， 69， 74， 104， 108， 112， 113， 114， 115， 116， 117， 118， 119， 127， 130， 139， 142， 160， 161， 162， 166， 175, 179， 226， 242， 246， 248, 250， 254， 274, 279， 282， 284， 288， 289, 292， 295， 314， 315和335。
在另一個實施方案中，包括遺傳篩查方法。該方法包含，測定從 人或非人靈長類動物分離的核酸樣品中是否存在寡腺苷酸合成酶1基 因突變，該突變造成與Genbank登錄號NP_002525. 1在羧基末端同源的所有寡腺苷酸合成酶1形式(包括但不限于SEQ ID NO: 3)在位置363 處的氨基酸修飾。
在另一個實施方案中，包括遺傳篩查方法。該方法包含，測定從 人或非人靈長類動物分離的核酸樣品中是否存在寡腺苷酸合成酶1基 因突變，該突變造成與Genbank登錄號NP—058132. 1在羧基末端同源 的所有寡腺苷酸合成酶1形式(包括但不限于SEQ ID N0:2)在下述一 個或多個氨基酸位置處的氨基酸修飾347， 350， 352， 353， 354， 356， 357， 361， 363， 364， 365， 369， 371， 373， 374， 375， 378， 379， 382， 388， 389或394。
在另一個實施方案中，包括遺傳篩查方法。該方法包含，測定從 人或非人靈長類動物分離的核酸樣品中是否存在寡腺苷酸合成酶1基 因突變，該突變造成與Genbank登錄號NP-001027581. 1在羧基末端同 源的所有寡腺苷酸合成酶1形式(包括但不限于SEQ ID N0:4)在下述 一個或多個氨基酸位置處的氨基酸修飾347， 361, 364， 372， 384， 385或399。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種蛋白，其具有在所有寡 腺苷酸合成酶1 (OASl)形式(包括但不限于SEQ ID NO:l)的位置1， 24， 25， 28， 31， 36， 47， 53， 54， 64， 69， 74, 104， 108， 112， 113， 114， 115， 116, 117, 118， 119， 127， 130， 139， 142， 160， 161， 162， 166， 175， 179, 226， 242， 246， 248， 250， 254， 274, 279， 282， 284， 288， 289， 292， 295, 314， 315和335處的至少一 處氨基酸修飾，和所述蛋白在制備對病毒感染、優選黃病毒感染、最 優選丙型肝炎感染的抗性的診斷劑中的應用。在具體的實施方案中， 所述診斷劑是抗體。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種0AS1蛋白，其具有與 Genbank登錄號NP-002525. l在羧基末端同源的所有寡腺苷酸合成酶l 形式(包括但不限于SEQ ID N0:3)的位置363處的氨基酸修飾，和所 述蛋白在制備對病毒感染、優選黃病毒感染、最優選丙型肝炎感染的 抗性的診斷劑中的應用。在具體的實施方案中，所述診斷劑是抗體。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種0AS1蛋白，其具有與 Genbank登錄號NP—058132. 1在羧基末端同源的所有寡腺苷酸合成酶1 形式(包括但不限于SEQ ID NO:2)的位置347， 350， 352， 353， 354, 356， 357， 361， 363， 364， 365， 369， 371， 373, 374， 375, 378， 379， 382, 388， 389和394處的至少一處氨基酸修飾，和所述蛋白在 制備對病毒感染、優選黃病毒感染、最優選丙型肝炎感染的抗性的診 斷劑中的應用。在具體的實施方案中，所述診斷劑是抗體。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種0AS1蛋白，其具有與 Genbank登錄號NP-001027581. l在羧基末端同源的所有寡腺苷酸合成 酶1形式(包括但不限于SEQ ID NO: 4)的位置347， 361， 364， 372， 384， 385或399處的至少一處氨基酸修飾，和所述蛋白在制備對病毒 感染、優選黃病毒感染、最優選丙型肝炎感染的抗性的診斷劑中的應 用。在具體的實施方案中，所述診斷劑是抗體。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種用于預防或抑制病毒感 染、優選黃病毒感染、最優選丙型肝炎病毒感染的治療化合物，其中 所述治療化合物是具有至少一處根據本發明的氨基酸修飾的蛋白。在 其它實施方案中，所述治療化合物是編碼該蛋白的多核苷酸，例如DNA 或RM。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種用于預防或抑制病毒感 染、優選黃病毒感染、最優選丙型肝炎病毒感染的治療化合物，其中 所述治療化合物是本發明的0AS1編碼的具有至少一處或多處所公開 的氨基酸修飾的蛋白。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種用于預防或抑制病毒感 染、優選黃病毒感染、最優選丙型肝炎病毒感染的治療化合物，其中 所述治療化合物會模擬至少 一種本發明突變的有益作用。所述治療化 合物可以是小分子，蛋白，肽，DNA或RNA分子，或抗體。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種用于預防或治療癌癥、 優選前列腺癌的治療化合物，其中所述治療化合物是具有至少一種本 發明突變的0AS1基因編碼的蛋白。在其它實施方案中，所述治療化合
物是編碼該蛋白的多核苷酸，例如DNA或RNA。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種用于預防或治療癌癥、 優選前列腺癌的治療化合物，其中所述治療化合物是0AS1蛋白，其具 有至少 一 處本發明的氨基酸修飾。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種用于預防或治療癌癥、 優選前列腺癌的治療化合物，其中所述治療化合物會模擬至少一種本 發明突變的有益作用。所述治療化合物可以是小分子，蛋白，肽，DNA 或RNA分子，或抗體。
在其它實施方案中，所述治療化合物能抑制0AS1或完整蛋白的至 少一個亞區或子功能的活性，這樣的化合物由能特異性地結合0AS1 多核苷酸的反義分子、核酶和RNAi分子代表，也由能特異性地結合 0AS1蛋白和多肽的抗體和其片段代表。
在另一個實施方案中，本發明提供了 0AS1的抑制劑。本發明的抑 制劑包括但不限于，反義分子，核酶，RNAi，抗體或抗體片段，蛋白或 多肽以及小分子。示例性的反義分子包含編碼具有至少一處本發明氨 基酸修飾的0AS1的多核苷酸的至少10、 15或20個連續核苷酸，或 會在嚴格條件下與所述多核苷酸雜交的連續核苷酸。
在另一個實施方案中，預見到0AS1的抑制劑，其會特異性地結合 具有本發明氨基酸修飾的0AS1多肽限定的蛋白區域。本發明的抑制劑 包括但不限于抗體，抗體片段，小分子，蛋白，或多肽。
在另一個實施方案中，預見到0AS1的抑制劑，其包含反義或RNAi 分子，其會特異性地結合或雜交編碼具有至少一處本發明氨基酸修飾 的0AS1蛋白的多核苷酸。
在其它實施方案中，提供了組合物，其包含在藥學可接受的載體 中的一種或多種0AS1抑制劑。
其它實施方案提供了降低0AS1基因表達或生物活性的方法。
其它實施方案提供了特異性地增加或減少具有至少一個本發明所 公開突變的某些形式0AS1基因的表達的方法。
本發明提供了包含至少一處經修飾的核苷間鍵合的反義寡核苷酸。
本發明還提供了具有硫代磷酸鍵合的反義寡核苷酸。
本發明還提供了包含至少一個修飾的糖部分的反義寡核苷酸。
本發明也提供了包含至少一個修飾的糖部分的反義寡核苷酸，所述修飾的糖部分是2' -O-甲基糖部分。
本發明還提供了包含至少一個修飾的核酸堿基(nucleobase)的 反義寡核普酸。
本發明還提供了具有一個修飾的核酸堿基的反義寡核苷酸，其中 所述修飾的核酸堿基是5-甲基胞嘧啶。
本發明也提供了反義化合物，其中所述反義化合物是嵌合寡核苷酸。
本發明提供了抑制人細胞或組織中人0AS1的表達的方法，其包含，使細胞或組織體內接觸靶向編碼人0AS1的核酸分子的反義化合物 或核酶(長度為8-35核苷酸)，從而抑制人0AS1的表達。
本發明還提供了使用反義或RNAi化合物或核酶，減少或增加特 定形式的0AS1體內表達的方法，這樣的形式由具有至少一個在根據本 發明的位置處的突變來定義。
本發明還提供了調控癌細胞的生長的方法，其包含，使癌細胞體 內接觸耙向編碼人0AS1的核酸分子的反義化合物或核斷長度為8-35 核苷酸)，從而抑制人0AS1的表達。
本發明還提供了 0AS1多核苷酸靶區的鑒別。本發明也提供了標記 的探針，其用于通過原位雜交鑒別0AS1多核苷酸。
本發明提供了根據本發明的0AS1抑制劑在制備用于預防或抑制 HCV感染的藥物中的應用。
本發明還提供了將0AS1抑制劑導向0AS1蛋白的特定區域或該蛋白的特定功能。
本發明也提供了一種用于抑制0AS1的表達的藥物組合物，其包含 與生理上可接受的載體或稀釋劑相混合的根據本發明的反義寡核苷 酸。
本發明還提供了一種能特異性切割0AS1 RNA的核酶，和包含該核 酶的藥物組合物。
本發明也提供了 0AS1的小分子抑制劑，其中所述抑制劑能降低 0AS1的活性，或減少或阻止0AS1 mRNA的表達。
本發明還提供了 0AS1的抑制劑，其會修飾該蛋白的除合成2'-5' 寡腺苷酸以外的特定功能，這樣的功能包括與其它蛋白(例如丙型肝 炎病毒NS5A蛋白)的相互作用。
本發明還提供了改變0AS1的翻譯后修飾的化合物，所述翻譯后修 飾包括但不限于糖基化和磷酸化。
本發明還提供了用于鑒別寡腺苷酸合成酶基因突變的人遺傳篩查 方法，其包含(a)在擴增條件下，用聚合酶鏈式反應(PCR)引物對處 理來自人的基因組DNA樣品，以擴增含有至少一個根據本發明的0AS1 基因突變的人基因組DNA區域，所述處理會產生含有所述區域的擴增 產物；和(b)檢測步驟(a)的擴增產物中是否存在在本發明的核苷酸 位置處的核苷酸突變，從而鑒別所述突變。
本發明也涉及檢測人中包含突變的丙型肝炎感染抗性疾病等位基 因的方法，所述突變包含，在與寡腺苷酸合成酶(0AS1)基因編碼的 0AS1蛋白中本發明氨基酸修飾相對應的核苷酸位置處，用非野生型核 苷酸置換野生型核苷酸，該方法包含(a)通過在PCR緩沖液中混合 來自所述人的基因組DNA樣品和寡腺苷酸合成酶基因-特異性的PCR 引物對，形成聚合酶鏈式反應(PCR)混合物；(b)對該PCR混合物進行 多個PCR熱循環，生產寡腺苷酸合成酶基因擴增產物；和(c)在雜交條 件下，用能檢測所述突變的探針，處理在步驟(b)中生成的產物。
也提供了分離的0AS1抑制劑，其選自反義寡核苷酸，核酶，小 抑制RNA (RNAi)，蛋白，多肽，抗體和小分子。所述分離的抑制劑可 以是反義分子或其互補物，其包含與本發明氨基酸置換相關的0AS1 基因突變相對應的多核苷酸序列的至少15個連續核酸。
分離的0AS1抑制劑可以選自抗體和抗體片段。也提供了組合物， 其包含在藥學可接受的載體中的治療有效量的至少一種0AS1抑制劑。
本發明也涉及抑制哺乳動物細胞中0AS1表達的方法，其包含，給 所述細胞施用選自下述的0AS1抑制劑反義寡核苷酸，核酶，蛋白， RNAi,多肽，抗體和小分子。
本發明還涉及抑制受試者中0AS1基因表達的方法，其包含，給 所述受試者施用在藥學有效載體中的一定量的反義寡核苷酸，其能有 效地特異性雜交源自所述0AS1基因的選定靶核酸序列的全部或一部分。
本發明還涉及預防對黃病毒感染易感的人受試者中黃病毒感染的 方法，其包含，給所述人受試者施用選自下述的0AS1抑制劑反義 寡核苷酸，核酶，RNAi，蛋白，多肽，抗體和小分子，其中所述0AS1 抑制劑會預防所述黃病毒的感染。
附圖簡述


圖1是治療形式的0AS1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)。
圖2是在所有治療形式的0AS1中有用的氨基酸置換的列表。
圖3是在治療形式的0AS1中有用的靈長類動物0AS1氨基酸修 飾的列表。標有*的位置表示與Genbank登錄號NP-002525. 1在羧基末 端同源的0AS1形式。標有+的位置表示與Genbank登錄號NP-0581321 在羧基末端同源的0AS1形式。標有A的位置表示與Genbank登錄號 NP-001027581. 1在羧基末端同源的0AS1形式。
圖4中的圖表標明了靈長類動物0AS1基因的突變位置和對應的 氨基酸修飾。
圖5列出了本發明的其它0AS1同種型，包括人和非人靈長類動 物形式。也提供了靈長類動物同種型的突變。這些同種型無論是單獨 還是與在本發明中鑒別出的任何突變一起，都可以用于本文所述的診 斷、治療、和其它目的。
發明詳述
本發明涉及寡腺苷酸合成酶1基因中的新突變，這些突變在診斷 對病毒感染的易感性或抗性中的應用，具有根據本發明的突變的基因 編碼的蛋白，和使用所述蛋白、抗體和相關核酸預防或抑制病毒感染。 這些突變與載體對黃病毒感染、尤其丙型肝炎病毒感染的抗性有關。
許多當前的醫學研究集中于鑒別引起或促成疾病的突變和缺陷。 所述研究意在產生針對疾病狀態的化合物和治療方法。對于盡管暴露較少關注。本發明代表了發明者所研發的方法的成功應用，由此確定 并分析人受試者的特定群體，以便揭示賦予對疾病的抗性的遺傳變異 或突變。對具有對特定疾病或生物學狀況的天然抗性的亞群體部分的 鑒別，進一步使得能鑒別對于藥物干預、診斷評估或預防(諸如預防性 接種)為適合耙標的基因和蛋白。
先前在共同未決申請系列號10/972, 135中，鑒別和公開了亞群體 部分，其包含盡管反復暴露于丙型肝炎病毒(HCV)但是仍保持血清陰性 (而同類者已受感染(血清陽性))的個體。所研究的群體包括經受反 復輸血的血友病患者，和由于共用針頭及其它危險因素而暴露的靜脈內藥物使用者。
本公開內容提供了在非人靈長類動物0AS1基因中鑒別出的突 變，如實施例1所述。
申請系列號10/972， 135提供了與以下有關的公開內容HCV感染;定義；發明的實現方式；多核苷酸分析；多核苷酸引物的制備；聚合 酶鏈式反應；核酸序列分析；膜固定化的靶序列的檢測；用于檢測 堿基置換的掃描技術；用于恢復和/或增強0AS1功能的治療劑；抑制 0AS1功能的治療劑；核酶；RNAi;蛋白和多肽；小分子；評價0AS1抑 制劑功效的方法；和藥物組合物。申請系列號10/972， 135在此整體通 過參考并入本文。
作為它們的天然功能的一部分，本發明的多肽能跨細胞膜轉導， 并在沒有遞送載體或表達介質的情況下介導它們的抗病毒作用。以前 已經描述了堿性的帶正電荷的蛋白的細胞轉導性質，且是本領域技術
人員眾所周知的(Ryser 和 Hancock ， Science. 1965 Oct 22; 150 (695): 501-3)。
在多肽制備成液體制劑并通過注射給藥的情況下，優選溶液為含 有140mM氯化鈉和10mM釣的pH值為7. 4的等滲鹽溶液。例如可以以 治療有效量給予注射，考慮到給藥途徑、患者健康狀況等因素，優選 的劑量為每日約l lug/kg體重至約5mg/kg體重。
本發明的多肽可與合適的藥用栽體聯合使用。這樣的組合物包含 治療有效量的蛋白和藥學可接受的載體或賦形劑。所述栽體包括但不 限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其組合。制劑應適 于給藥模式。
本發明的多肽也可通過將多肽化學連接至一個或多個部分或綴合 物而進行修飾，以增強多肽的活性、細胞分布或細胞攝入。所述部分 或綴合物包括脂質諸如膽固醇、膽酸、硫醚、脂族鏈、磷脂及其衍生 物，多元胺，聚乙二醇(PEG)，棕櫚基部分和其它，例如于美國專利 5, 514, 758 ， 5, 565, 552 ， 5， 567， 810 , 5, 574,142， 5, 585, 481 ， 5, 587, 371， 5， 597， 696和5, 958, 773中公開的。
也可修飾本發明的多肽，以靶向于特定疾病適應癥的特定細胞類 型，包括但不限于丙型肝炎感染情況中的肝細胞。如本領域技術人員 所能了解的，已經描述了達成所述靶向目標的適當方法，這些方法包 括但不限于脂質體靶向、受體介導的胞吞作用和抗體一抗原結合。在 一個實施方案中，可通過將半乳糖部分加到多肽，將脫唾液酸糖蛋白 受體用于靶向肝細胞。在另一個實施方案中，可將甘露糖部分綴合到 多肽上，以便靶向存在于巨噬細胞和肝細胞上的甘露糖受體。如本領 域技術人員已知的，可以組合多種遞送和靶向方法。例如，通過包封 在脂質體內，本發明的多肽可以靶向肝細胞，這樣的脂質體綴合到用 于靼向脫唾液酸糖蛋白受體的半乳糖上。
本發明也提供了一種藥物包或試劑盒，其包含一個或多個容器， 其中裝有本發明藥物組合物的一種或多種成分。所述容器可伴隨有管理藥品或生物產品的制備、使用或銷售的政府機構規定形式的公告，
此公告反映該機構對用于人給藥的制備、使用或銷售的批準。另外， 本發明的多肽可與其它治療性化合物聯合使用。
當本發明的多肽用作藥物時，其可在適當介質中施用給哺乳動物。 當本發明的多肽用作如上所述的藥物時，考慮到給藥途徑、患者健康狀況等因素，其例如以每日約10jug/kg體重至約10 mg/kg體重的治 療有效劑量來給藥。給藥量優選地足以實現預防或抑制病毒感染、優 選黃病毒感染、最優選RSV和HCV感染，預防或治療癌癥、炎癥、糖 尿病、或其它疾病。
蛋白、它們的片段或其它衍生物、或其類似物、或表達它們的細 胞，可以用作免疫原來生產抗它們的抗體。這些抗體可以是，例如， 多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈、Fab片段或Fab表達文 庫的產物。本領域已知的多種方法可用于產生多克隆抗體。
通過將多肽直接注射進動物，或通過將多肽施用給動物(優選為非 人類)，可獲得針對本發明的多肽而產生的抗體。由此獲得的抗體隨后 將結合多肽本身。以此方式，甚至僅編碼多肽片段的序列也可用于產 生結合整個天然多肽的抗體。此外，也可以使用對大量多肽特異性的 一組這樣的抗體。
關于單克隆抗體的制備，可以使用通過連續細胞系培養物產生抗 體的任何技術。實例包括雜交瘤沖支術(Kohler和Milstein， 1975， Y""re, 256: 495-597)、三源雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術(Kozbor 等，1983， T/M7"/ o/^/7b&7 4: 72)和用以生產人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(Coe等,1985 , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, AlanR. Liss， Inc.第77-96頁)。
用于產生單鏈抗體所述的技術(美國專利第4,946, 778號)可適 于產生抗本發明的免疫原性多肽產物的單鏈抗體。
所述抗體可用于涉及本發明的蛋白序列定位和活性的方法中，例 如，用于這些蛋白的成像、測量其在適當生理樣品中的水平等。
本發明提供了與圖1-5的多肽有1-34個氨基酸的差異的多肽，這 樣的差異可以包括置換，插入，缺失，修飾的氨基酸或氨基酸衍生物
的摻入，從多肽的C-末端或N-末端添加或刪除氨基酸。本發明提供了 這些多肽的治療性和預防性應用，包括但不限于治療病毒感染、肺瘤、 癌癥、糖尿病，和促進細胞生長和分化和組織再生。本發明提供了編 碼本發明多肽的多核苷酸和其應用，包括但不限于在生產所述多肽中 的應用，用作基因治療，用作診斷工具等。
藥物組合物
本發明提供了所述多肽作為活性成分的用于治療應用的藥物組合 物。這些組合物也可以用于本發明的方法中。 一般而言，用于抑制哺 乳動物或受試者的病毒感染、癌癥、腫瘤、炎癥或其它疾病的藥物組 合物，包含有效量的至少一種用于實施本發明所需的上述多肽，或其 顯示出具有相同作用的片段，和藥學和生理上可接受的載體或稀釋劑。 根據本發明，藥物組合物可以包含組合的2種或多種圖1-5多肽。藥 物組合物還可以包含單一多肽，后者在連續(contiguous)分子內含 有一處或多處圖1-5的修飾。
組合物可以經口地、皮下地、或腸胃外地施用，后者包括靜脈內 的，動脈內的，肌肉內的、腹腔內的和鼻內的給藥以及根據需要使用 鞘內和輸注技術。藥學可接受的載體、稀釋劑、輔劑和介質以及植入 載體通常指不與本發明活性成分反應的惰性的、無毒的固體或液體填 充劑、稀釋劑或包封材料。在組合物中也可以包含陽離子脂質，以促 進多肽攝入。化合物的埋植劑也是有用的。 一般而言，藥物組合物是 無菌的。
本發明涉及多肽的組合物，所述多肽上結合有檢測標記，例如熒 光、化學發光或放射性分子。
另 一個實例是使用已知材料通過已知技術可以配制的藥物組合 物，參見，Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co. ， Easton， Pa. 18042) pp. 1435-1712， 其通過參考并入本文。通常，配方將取決于許多因素，例如給藥、穩 定性、生產問題和其它因素。圖1-5的多肽可以注射給藥，或通過吸入進行肺給藥。也可以使用腸劑型，因此經口給藥可能是有效的。本 發明的多肽可以插入脂質體或其它微載體中遞送，且可以配制在凝膠 或其它用于持續釋放的組合物中。盡管優選的組合物會隨組合物的目 標用途而異， 一般而言，對于本發明的多肽，優選的藥物組合物是為 皮下注射或通過吸入進行肺給藥而制備的組合物，盡管每種類型的給 藥的特定制劑取決于特定多肽的特征。
本發明的多肽或多肽綴合物的治療性制劑通常在組合物中施用， 所述組合物包含一種或多種藥學可接受的載體或賦形劑。這樣的藥物 組合物可以以本領域本身已知的方式制備，以產生保藏上足夠穩定的 且適合施用給人或動物的多肽藥物。
本發明多肽或多肽綴合物可以"原樣，，和/或以其鹽形式使用。合 適的鹽包括但不限于，與堿金屬或堿土金屬的鹽，例如鈉、鉀、鉀和 鎂以及例如鋅鹽。這些鹽或復合物可以作為晶體和/或無定形結構存 在。
"藥學可接受的，，指在使用的劑量和濃度不會對施用的患者造成 任何不良反應的載體或賦形劑。這樣的藥學可接受的載體和賦形劑是本領域眾所周知的(參見Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版，A. R. Gennaro, Ed. ， Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer和L. Hovgaard， Eds. ， Taylor & Francis (2000);和Handbook of Pharmaceutical Excipients， 第 3版，A. Kibbe， Ed. ， Pharmaceutical Press (2000))。
本發明的組合物可以單獨施用，或與其它治療劑聯合施用。例如， 已經證實，利巴韋林和干擾素a在聯合使用時，會有效地治療HCV感 染。它們的聯合功效超過了單獨使用任一種藥物產品時的功效。本發 明的組合物可以單獨施用，或與干擾素、利巴韋林和/或針對病毒靶物 (病毒蛋白酶，病毒聚合酶，病毒復制復合物的裝配)和宿主靶物(病毒 加工所需的宿主蛋白酶，病毒靶物(例如NS5A)磷酸化所需的宿主激 酶和有效利用病毒IRES所需的宿主因子的抑制劑)開發的許多小分子
18
聯合施用。細胞因子可以共同施用，例如IL-2， IL-12, IL-23， IL-27， 或IFN-y。這些試劑可以作為同一藥物組合物的一部分而摻入，或可 以與本發明的多肽或綴合物分開施用，無論是同時并行還是根據另一 個治療方案。另外，本發明的多肽、多肽綴合物或組合物可以用作其 它治療的輔助。
用于本發明目的的"患者"包括人和其它哺乳動物。因而，該方法 適用于人治療和獸醫應用。
包含本發明的多肽或綴合物的藥物組合物可以配制成多種形式， 例如，液體，凝膠，低壓凍干，或壓縮固體。優選的形式取決于待治 療的具體適應癥，且是本領域技術人員顯而易見的。
本發明的制劑的施用可以以多種途徑進行，包括但不限于，經口 地，皮下地，靜脈內地，大腦內地，鼻內地，透過皮膚地，腹腔內地， 肌肉內地，肺內，鞘內地，陰道地，直腸地，眼內地，或以任何其它 可接受的方式。盡管快速推注是可接受的，制劑可以通過輸注連續施 用，其中使用本領域眾所周知的技術，例如泵(例如，皮下滲透泵)或 植入。在有些情況下，制劑可以作為溶液或噴霧劑直接應用。
藥物組合物的一個實例是設計用于腸胃外給藥的溶液。盡管在許 多情況下，藥物溶液制劑以適合立即使用的液體形式提供，這樣的腸 胃外制劑也可以以冷凍或低壓凍干形式提供。在前一種情況下，組合 物必須在使用前融化。后一種形式經常用于提高組合物中包含的活性 化合物在更寬范圍的保藏條件下的穩定性，如本領域技術人員所認識 到的，低壓凍干制品通常比它們的液體對應物更穩定。通過加入一種 或多種合適的藥學可接受的稀釋劑，例如無菌注射用水或無菌生理鹽 水溶液，在使用前重配這樣的低壓凍千制品。
根據需要，通過混合具有希望純度的多肽和一種或多種藥學可接 受的本領域常用的載體、賦形劑或穩定劑(它們都稱作"賦形劑")，例 如緩沖劑、穩定劑、防腐劑、等滲劑、非離子型去污劑、抗氧化劑和/ 或其它各種添加劑，可以制備作為低壓凍干制劑或含水溶液保藏的腸
胃外制劑。
緩沖劑有助于將PH維持在接近生理條件的范圍內。它們通常以約 2 mM至約50 mM的濃度存在。用于本發明的合適的緩沖劑包括有機和 無機酸和其鹽，例如檸檬酸鹽緩沖劑(例如，檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉 混合物，檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物，檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)， 琥珀酸鹽緩沖劑(例如，琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物，琥珀酸-氫氧化鈉 混合物，琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)，酒石酸鹽緩沖劑(例如，酒石 酸-酒石酸鈉混合物，酒石酸-酒石酸鉀混合物，酒石酸-氫氧化鈉混合 物等)，延胡索酸緩沖劑(例如，延胡索酸-延胡索酸單鈉混合物，延胡 索酸-延胡索酸二鈉混合物，延胡索酸單鈉-延胡索酸二鈉混合物等)， 葡糖酸鹽緩沖劑(例如，葡糖酸-葡糖酸鈉混合物，葡糖酸-氫氧化鈉混 合物，葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)，草酸鹽緩沖劑(例如，草酸-草酸 鈉混合物，草酸-氫氧化鈉混合物，草酸-草酸鉀混合物等)，乳酸鹽緩 沖劑(例如，乳酸-乳酸鈉混合物，乳酸-氫氧化鈉混合物，乳酸-乳酸 鉀混合物等)和醋酸鹽緩沖劑(例如，醋酸-醋酸鈉混合物，醋酸-氫氧 化鈉混合物等)。其它可能性是磷酸鹽緩沖劑，組氨酸緩沖劑和三甲胺 鹽例如Tris。
加入防腐劑來阻止微生物生長，通常加入量是約0. 2%-1% (w/v)。 用于本發明的合適的防腐劑包括苯酚，苯曱醇，間曱酚，對羥基苯曱 酸曱酯，對羥基苯曱酸丙酯，氯化十八烷基二甲基節基銨，千烷銨卣化 物(例如苯扎氯銨，苯扎溴銨或苯扎碘銨)，氯己雙銨，對羥基苯甲酸 烷基酯例如對羥基苯甲酸甲酯或對鞋基苯甲酸丙酯，兒茶酚，間苯二 酚，環己醇和3-戊醇。
加入等滲劑來確保液體組合物的等滲性，包括多羥基糖醇，優選 三羥基或更高的糖醇，例如丙三醇，赤蘚醇，阿拉伯糖醇，木糖醇， 山梨醇和甘露醇。考慮其它成分的相對量，多元醇可以以0. 1%-25%(按 重量計)、通常1% -5%的量存在。
穩定劑指一大類賦形劑，其功能范圍從填充劑到溶解治療劑或有 助于防止變性或與容器壁粘附的添加劑。典型的穩定劑可以是多羥基 糖醇(上文列舉的)；氨基酸如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、L-亮氨酸、2-笨丙氨酸、谷氨 酸、蘇氨酸等，有機糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、 山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括環醇如 環己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，如脲、谷胱甘肽、 硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、a-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分 子量多肽(即<10個殘基)；蛋白如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明 膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；單糖如木糖、甘 露糖、果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖， 和多糖如葡聚糖。基于活性蛋白重量計算，穩定劑通常的存在范圍為 0. 1-10000重量份。
可以存在非離子表面活性劑或去污劑(也稱作"潤濕劑")，以有 助于溶解治療劑以及保護治療性多肽避免攪拌誘導的聚集，其也允許 制劑暴露于剪切表面應力而不導致多肽變性。合適的非離子表面活性 劑包括聚山梨酯(polysorbates) (20， 80等)、泊洛沙姆(polyoxamer ) (184， 188等)、Pluronic⑧多元醇、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚 (Tween⑧-20, Tween⑧-80等)。
其它各種賦形劑包括膨脹劑或填充劑(如淀粉)、螯合劑(如 EDTA)、抗氧化劑(如抗壞血酸、甲硫氨酸、維生素E)和共溶劑。
活性組分也可以包裹在通過例如凝聚(coascervat ion )沖支術或通 過界面聚合所制備的微嚢中，如羥曱基纖維素、明膠或聚-(甲基丙烯 酸曱酯)微嚢中，包裹在膠體態藥物運送體系(例如脂質體、白蛋白微 球、微乳、納米顆粒和納米膠囊)中，或包裹在粗滴乳劑中。在 Remington's Pharmaceutical Sciences (同上)中公開了這些技術。
在本發明的一個方面，組合物是液體組合物，例如含水組合物， 且包含磺烷基醚環糊精衍生物。
用于體內給藥的腸胃外制劑必須是無菌的。這可以容易地實現，例如，通過無菌過濾膜過濾。
持續釋放制劑的合適實例包括含有多肽或綴合物的固體疏水聚合 物的半透基質，基質具有合適形式如膜或微囊。持續釋放基質的實例
包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、 聚交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙 烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease⑧^t術或Lupron Depot (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構成的可注射微球)、 和聚-D- (-)-3-羥基丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能 長時間釋放分子，如長達或超過100天，而某些水凝膠釋放蛋白時間 較短。當包封的多肽長時間保留在體內時，它們可因暴露于371C潮濕 環境中而變性或聚集，導致生物活性喪失和可能的免疫原性改變。合 理的穩定策略可根據所涉及的機理設計。例如，如果發現聚集機理是 通過巰基-二硫化物互換形成分子間S--S鍵，那么可通過修飾巰基、 從酸性溶液凍干、控制含濕量、使用適宜的添加劑和開發特定的聚合 物基質組合物來實現穩定作用。
肽和肽綴合物的口服給藥是本發明的預期實踐。對于口服給藥， 藥物組合物可以是固體或液體形式，例如，以膠嚢、片劑、懸液、乳 劑或溶液的形式。藥物組合物優選以含有給定量活性成分的劑量單位 的形式制備。用于人或其它哺乳動物的合適的每日劑量可根據病人的 情況和其它因素大幅度變化，但本領域的技術人員可使用常規方法確 定。
口服用藥的固體劑型可包括膠囊，片劑，栓劑，粉末和顆粒。在 該固體劑型中，活性化合物可與至少一種惰性稀釋劑(例如蔗糖，乳 糖或淀粉)混合。如正常實踐中，該劑型還可包含添加物質，例如潤 滑劑，如硬脂酸鎂。對于膠囊、片劑和九劑，劑型還可包含緩沖劑。 片劑和丸劑還可制備有腸衣。
所述多肽或綴合物可與輔劑混合，所述輔劑例如乳糖，蔗糖，淀 粉粉末，鏈烷酸的纖維素酯，硬脂酸，滑石，硬脂酸鎂，氧化鎂，磷 酸和硫酸的鈉和釣鹽，阿拉伯膠，明膠，藻酸鈉，聚乙烯-吡咯烷，和 /或聚乙烯醇，并作成片劑或包成膠囊用于常規給藥。或者，它們可 溶于鹽水，水，聚乙二醇，丙二醇，乙醇，油類(例如玉米油，花生油， 棉子油或芝麻油)，黃芪膠，和/或各種緩沖液中。其它輔劑和給藥方式是制藥領域熟知的。載體或稀釋劑可包括時間延遲材料，例如單獨 或與蠟一起的甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，或者本領域熟知的
其它材料。
可對藥物組合物進行諸如滅菌的常規制藥操作，和/或藥物組合 物可含有常規輔劑，例如防腐劑，穩定劑，潤濕劑，乳化劑，緩沖劑， 填充物等，例如在本文別處所述。
口服用藥的液體劑型可包括含有諸如水的本領域常用惰性稀釋劑 的可藥用乳劑、溶液、懸液、糖漿和酏劑。該組合物還可包含輔劑， 例如潤濕劑，甜味劑，調味劑和香味劑。
適用于肺部給藥的制劑也是本發明的一部分。適合用噴射噴霧器 或者超聲噴霧器使用的制劑通常包含溶于水的多肽或綴合物，其濃度
為，例如每mL溶液含有約0. Ol到25 mg綴合物，優選約0. 1 - 10mg/mL。 制劑還可包括緩沖劑和單糖(例如，用于蛋白穩定化和滲透壓調節)， 和/或濃度范圍從0. 1到10mg/ml的人血清白蛋白。可使用的緩沖劑 的實例是乙酸鈉，檸檬酸鹽和甘氨酸。優選地，緩沖劑具有適于將溶 液調到pH 3-9范圍的組成和摩爾濃度。 一般來說，從lmM到50 mM 的緩沖劑摩爾濃度適合于該目的。可使用的糖類的實例是乳糖，麥芽 糖，甘露糖醇，山梨糖醇，海藻糖，和木糖，通常的含量范圍是制劑 重量的1%到10%。
噴霧制劑還可含有表面活性劑，以降低或防止在形成氣溶膠時由 溶液的霧化引起蛋白質發生表面誘導的聚集。可使用各種常規表面活 性劑，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇以及聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸 酯。其含量范圍一般為制劑重量的0. 001%和4%之間。用于本發明目 的的特別優選的表面活性劑是聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯。
具體制劑和產生本發明液體顆粒合適分散體的方法，在W0 94/20069，美國專利號5，915， 378，美國專利號5， 960， 792，美國專利 號5, 957, 124，美國專利號5,934, 272，美國專利號5， 915， 378，美國 專利號5， 855， 564，美國專利號5， 826， 570和美國專利號5， 522， 385 中描述，它們在此通過參考并入本文。
與計量劑量吸入器裝置一起使用的制劑一般包含細碎的粉末。該 粉末可通過凍干然后磨制液體綴合物制劑來生產，且還可含有穩定劑，
例如人血清白蛋白(HSA)。 一般來說，加入超過0. 5% (w/w)的HSA。 另外，如果需要，可向制劑中加入一種或多種糖或糖醇。實例包括乳 糖，麥芽糖，甘露糖醇，山梨糖醇，山梨糖，海藻糖，木糖醇，和木 糖。加入制劑中的量的范圍可從占綴合物含量的約0. Ol到200% (w/ w)，優選從約1到50%。然后低壓凍干該制劑，并磨制成所需的顆粒 大小。
然后將合適大小的顆粒借助于表面活性劑懸浮于推進劑中。推進 劑可以是用于該目的的任何常規材料，例如氯氟烴，氫氯氟烷，氫氟 烷，或碳氫化合物，包括三氯氟曱烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇， 和1，1，1，2-四氟乙烷，或其組合。合適的表面活性劑包括山梨聚糖三 油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性劑。然后將該混合物裝 入遞送裝置中。適用于本發明的商業上可荻得的計量劑量吸入器的實 例是由Glaxo Inc. ， Research Triangle Park, N. C. ， USA生產的 Ventolin計量劑量吸入器。
用于粉末吸入器的制劑包含含有多肽或多肽綴合物的細碎的干 粉，且還可包括膨脹劑，例如乳糖，山梨糖醇，蔗糖，或甘露糖醇， 其含量可幫助粉末從裝置中散布，例如，占制劑重量的50%到90%。 粉末顆粒在肺中應具有空氣動力學特性，相應于密度約1 g/cm2具有 小于IO微米的中間粒徑(優選在0. 5-5微米之間，最優選在1. 5-3. 5 微米之間)的顆粒。根據本文的教導適用的粉末吸入器的實例是由 FisonsCorp. ， Bedford, Mass., USA生產的Spinhaler粉末吸入器。 以美國專利號5, 997, 848 ，美國專利號5, 993, 783，美國專利號 5,985, 248,美國專利號5， 976， 574，美國專利號5， 922， 354，美國專 利號5， 785， 049和美國專利號5， 654， 007公開的方法，可產生和/或 遞送這些裝置中的粉末。
設計用于治療產品的肺部遞送的機械裝置包括但不限于噴霧器， 計量劑量吸入器，和粉末吸入器，所有這些都是本領域的技術人員所
熟悉的。適用于本發明實踐的商業上可獲得的裝置的具體實例是由Mallinckrodt， Inc., St. Louis, Mo. ， USA生產的Ultravent噴霧 器；由Marquest MediCal Products, Englewood, Colo. ， USA生產 的Acorn II噴霧器.，由Glaxo Inc. ， Research Triangle Park, N. C.， USA生產的Ventolin計量劑量吸入器；由Fisons Corp., Bedford, Mass. ， USA生產的Spinhaler粉末吸入器；Nektar Therapeutics, Inc. ， San Carlos, Calif. ， USA的"standing cloud"裝置；Alker邁es， Cambridge, Mass. ， USA生產的AIR吸入器；和Aradigm Corporation, Hayward， Calif. ， USA生產的AERx肺部藥物遞送系統。
本發明也提供了試劑盒，其包含本發明的多肽、綴合物、多核苷 酸、表達載體、細胞、方法、組合物和系統，和裝置。本發明的試劑 盒任選地包含本發明的下述至少一種(1)本文所述的裝置、系統、 系統組分、或裝置組分；(2)至少一種包含本發明的多肽或綴合物或 多核苷酸的試劑盒組分；編碼本發明多肽的質粒表達載體；表達本發 明多肽的細胞；或包含至少一種任何這類組分的組合物；(3)關于實 現本文所述任何方法(包括治療或預防方法)的說明書，關于使用在 (2)中所述的任何組分、或任何這樣的組分的任意組合物的說明書；和/ 或關于操作本文所述任何裝置、系統或組分的說明書；(4)用于容納 所述至少一種這樣的組分或組合物的容器；和(5)包裝材料。
在另一個方面，本發明提供了上面和本文所述的任何裝置、組分、 組合物、或試劑盒的應用，本文所述任何方法或測定的實施，和/或任 何裝置、組分、組合物、或試劑盒在實施本文所述任何測定或方法中 的應用。
化學修飾，綴合物和融合體
本發明的任何多肽可以作為更大多肽序列例如融合蛋白的一部分 而存在，所述融合蛋白例如在添加一個或多個用于穩定或檢測或純化 所述多肽的域或亞序列后產生。多肽純化亞序列可以包括，例如，表 位標記，FLAG標記，多組氨酸序列，GST融合體，或本領域已知的任何其它檢測/純化亞序列或"標記"。這些附加域或亞序列對本發明多肽 的活性具有微小影響或無影響，或可以通過合成后加工步驟來去除， 例如通過用蛋白酶處理、包含內蛋白等。
本發明包括融合蛋白，其包含本發明的多肽(例如如本文所述)，該多肽融合到Ig分子上，例如，人IgG Fc ("可結晶的片段，"或結 合補體的片段)鉸鏈，CH2域和CH3域；和編碼這樣的融合蛋白的核 苷酸序列。Fc是負責結合細胞上的抗體受體和補體的Clq組分的抗體 部分。這些融合蛋白和它們的編碼核酸可以用作預防和/或治療藥物或 診斷工具(也參見，例如，Challita-Eid， P.爭(1998) J. Immunol 160: 3419-3426; Sturmhoefel , K. 爭 (1999) Cancer Res 59:4964-4972)。本發明也包括融合蛋白，其包含本發明的多肽，該多 肽融合到白蛋白分子例如人血清白蛋白(HSA)上，如例如美國專利號 5，876， 969所述；和編碼該融合蛋白的核苷酸序列。Ig和白蛋白融合 蛋白可以表現出增加的多肽血清半衰期和/或功能體內半衰期，減少的 多肽抗原性，提高的多肽保藏穩定性，或增加的生物利用度，例如增 加的AUCS。，因而可以用作預防和/或治療藥物。
本發明的所有多肽都具有跨細胞膜轉導和影響細胞內的治療功能 的內在固有能力。本發明因此提供了本發明多肽增強任何其它分子的 細胞滲透性或轉導能力的用途。本發明還提供了本發明多肽的任何片 段或亞片段增強任何其它分子的細胞滲透性的用途，這樣的片段或亞 片段的長度是約5個氨基酸，約10個氨基酸，例如15個氨基酸，例 如約20個氨基酸，約25個氨基酸，約30個氨基酸，例如35個氨基 酸，約35-50個氨基酸，約50-100個氨基酸，例如75個氨基酸，例 如100-125個氨基酸。
本發明的任何多肽也可以包含一個或多個修飾的氨基酸。修飾的 氨基酸可以是，例如，糖基化的氨基酸，PEG化的氨基酸，法尼基化 的氨基酸，乙酰化的氨基酸，生物素化的氨基酸，綴合到脂類部分上 的氨基酸，或綴合到有機衍生劑上的氨基酸。修飾的氨基酸的存在， 可以有利地用于，例如(a)增加多肽血清半衰期和/或功能體內半衰
期，(b)減少多肽抗原性，(c)增加多肽保藏穩定性，或(d)增加生 物利用度，例如增加AUCs。。氨基酸在例如重組生產過程中與翻譯同時 或在翻譯后被修飾(例如，在哺乳動物細胞中表達過程中，在N-X-S/T 基序處的N-連接的糖基化)，或通過合成方式修飾。
術語"綴合物"(或可互換的"多肽綴合物"或"綴合的多肽")意指 由一種或多種本發明的多肽共價連接到一個或多個非多肽部分上形成 的異質(復合的含義)分子。術語"共價連接"的意思是，多肽和非多 肽部分直接彼此共價連接，或者通過諸如橋接、間隔物或連接部分等 的一個或多個間插部分間接地彼此共價連接。優選地，綴合的多肽在 相關濃度和條件下是可溶的，即在諸如血液等生理學液體中是可溶的。 本發明綴合的多肽的實例包括糖基化的和/或PEG化的多肽。術語"非 綴合的多肽"可以用于指綴合的多肽的多肽部分。
術語"非多肽部分"意指能與多肽的連接基團綴合的分子。非多 肽部分的優選實例包括聚合物分子，糖部分，親脂性化合物，或有機 衍生劑，尤其是聚合物分子或糖部分。應當理解，非多肽部分經由多 肽的連接基團而與該多肽連接。除了與多肽連接的非多肽部分(例如 聚合物分子)的數目被特別指明的情況，每次提及與多肽連接的或本 發明中其它使用的"非多肽部分"均應指與多肽連接的一個或多個非 多肽部分。
術語"聚合物分子"定義為由兩個或多個單體共價連接形成的分 子，其中沒有一個單體是氨基酸殘基。術語"聚合物"可與術語"聚 合物分子"互換使用。
術語"糖部分"意指通過體內或體外糖基化(例如N—或0—糖基 化)連接的碳水化合物分子。"N-糖基化位點"具有序列N-X-S/T/C， 其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，N是天冬酰胺，S/T/C是絲氨 酸、蘇氨酸或半胱氨酸，優選絲氨酸或蘇氨酸，最優選蘇氨酸。"0-糖基化位點"包含絲氨酸或蘇氨酸殘基的0H-基。
術語"連接基團"意指能偶聯到相關非多肽部分(諸如聚合物分 子或糖部分)上的氨基酸殘基基團。
對于體內N—糖基化而言，術語"連接基團"以非常規的方式使 用，指組成N-糖基化位點(具有序列N-X-S/T/C，其中X是除脯氨酸外 的任何氨基酸殘基，N是天冬酰胺，S/T/C是絲氨酸，蘇氨酸或半胱氨 酸，優選絲氨酸或蘇氨酸，且最優選蘇氨酸)的氨基酸殘基。盡管N— 糖基化位點的天冬酰胺殘基是糖部分在糖基化期間所連接的殘基，但 除非存在N-糖基化位點的其它氨基酸殘基，否則將不能實現該連接。 因此，當非多肽部分是糖部分，且綴合是通過N-糖基化實現時，與本 發明多肽的氨基酸序列的改變關聯使用的術語"含有非多肽部分連接 基團的氨基酸殘基"應理解為，組成N-糖基化位點的一個、兩個或所 有氨基酸殘基將以下述方式改變，即將功能性N-糖基化位點導入氨基 酸序列，從所述序列中去掉該位點，或在所述氨基酸序列中保留了功 能性N-糖基化位點(例如，通過用蘇氨酸殘基置換已經構成N-糖基化 位點的一部分的絲氨酸殘基，反之亦然)。
術語"導入"(即，導入的"氨基酸殘基，氨基酸殘基的"導入") 主要是指現有氨基酸殘基被置換為另 一氨基酸殘基，但也可指插入另 外的氨基酸殘基。
術語"去除"(即，"去除的"氨基酸殘基，氨基酸殘基的"去除") 主要是指待去除的氨基酸殘基被置換為另 一氨基酸殘基，但也指待去 除的氨基酸殘基的缺失(沒有置換)。
術語"含有非多肽部分連接基團的氨基酸殘基"是指與非多肽部
分結合的氨基酸殘基(對于導入的氨基酸殘基而言)，或否則會與非多 肽部分結合的氨基酸殘基(對于去除的氨基酸殘基而言)。
術語"功能體內半衰期"使用其通常的含義，即在機體/靶器官 中仍存在50%多肽生物活性的時間，或者多肽的活性為最初值的50 %的時間。功能體內半衰期可在實驗動物(諸如大鼠，小鼠，兔，犬 或猴)中測定。優選地，功能體內半衰期在非人靈長類動物(諸如猴) 中測定。此外，可對已經靜脈內或皮下施用的樣品測定功能體內半衰 期。
作為測定功能體內半衰期的替代方案，可測定"血清半衰期"，即，50%的多肽在被清除之前在血漿或血流中循環的時間。血清半衰 期的測定常常比功能體內半衰期的測定簡單，并且血清半衰期的大小 通常可以很好地指示功能體內半衰期的大小。血清半衰期的其它可替 換術語包括"血漿半衰期，，、"循環半衰期，，、"血清清除"、"血 漿清除"和"清除半衰期"。
多核苦酸和誘變方法
技術領域：
本發明包括編碼本發明多肽的核酸和多核苷酸。本發明包括用限 制性內切核酸酶、RNA酶、或DNA酶消化一種或多種本發明的任何多 核苷酸所生成的組合物(例如，以在本說明書其它地方的某些重組形式 進行的)；和通過機械方式(例如，超聲處理，渦旋等)斷裂或剪切一種或 多種本發明的多核苷酸所生成的組合物，其也可以用于為本文所述方 法中的重組提供底物。本發明也提供了通過切割至少一種本發明的任 何多核苷酸所生成的組合物。切割可以包含機械的、化學的、或酶的 切割，酶切割可以包含用限制性內切核酸酶、RNA酶、或DNA酶切割。
本發明還包括通過包括在有三磷酸核糖核苷酸或三磷酸脫氧核糖 核苷酸和核酸聚合酶的存在下溫育一種或多種斷裂的本發明的多核苷 酸的方法而產生的組合物。所得組合物形成重組混合物，可用于上述 多種重組形式。核酸聚合酶可以是RNA聚合酶，DNA聚合酶或RNA-指 導的DNA聚合酶(例如"逆轉錄酶")；聚合酶可以是例如熱穩定的DNA 聚合酶(例如VENT， TAQ等)。
類似地，含有多組對應于一種以上本發明核酸的寡核苷酸的組合 物也可用作重組底物，并且也是本發明的特征。為了方便起見，將這 些經斷裂、經剪切的或寡核苷酸合成的混合物稱為斷裂的核酸集合。
本發明還提供了編碼多肽的分離的或重組的核酸，其通過突變或 重組至少一種本發明的多核苷酸產生。
可根據已知的合成方法，通過標準的固相方法制備本發明的多核 苷酸、寡核苷酸、和核酸片段。典型地，單獨合成最高達約IOO個堿 基的片段，然后將它們連接起來(例如，通過酶促或化學連接法，或聚合酶介導的重組方法)，以形成基本上任何所需的連續序列。例如，本 發明的多核苷酸和寡核苷酸可通過化學合成制備，其使用例如Beaucage等(1981) Tetrahedron Letters 22:1859-69所述的經典 亞磷酰胺法，或Matthes等(1984) EMB0 J 3: 801-05所述的方法， 例如通常在自動合成方法中實施的。根據亞磷酰胺法，在例如自動化 的DNA合成儀中合成寡核苷酸，然后進行純化，退火，連接，并克隆 入適當的載體。
另外，基本上任何多核苷酸都可從多種商業來源中的任何一家訂 購4尋到，諸:i口 0peron Technologies Inc. (Alameda, Calif.)和^艮多 其它的公司。類似地，肽和抗體也可從多個商家中的任何一家訂購得到，例如( Celtek Peptides (Nashville, Term.); Washington Biotechnology ， Inc. (Baltimore Md.); Global Peptide Services(Ft. Collin Colo.)和很多其它的公司。
也可通過使用寡核苷酸探針篩選cDNA文庫(例如通過在典型遞推 序列重組法中重組同源核酸而產生的文庫)，得到本發明的某些多核苷 酸，所述寡核苷酸探針可以雜交或PCR-擴增編碼OAS多肽和這些多肽 的片段的多核普酸。篩選和分離cDNA克隆的方法是本領域技術人員眾 所周知的。這些才支術描述于，例如Berger和Kimmel， Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymol. Vol. 152， Acad. Press, Inc., San Diego， Calif. ("Berger"; J. Sambrook 和D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3 版.Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY ， ("Sambrook");和F. M. Ausubel 等(1987—2005) Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience， New York, NY ( "Ausubel")。 一些本發明的多核苷酸可通過改變(例如通過誘 變，遞推序列重組(例如改組)，或寡核苷酸重組)天然存在的序列而獲 得。在其它情況下，所述多核苷酸可在計算機中(in silico)制備， 或通過本文引用的參考文獻所述的寡核苷酸重組方法制備。
如本文所詳述，本發明的多核苷酸包括編碼本發明多肽的多核苷
30酸，與這些多核苷酸序列互補的多核苷酸序列，和在至少嚴格條件下 與本文定義的序列雜交的多核苷酸。編碼序列是指編碼特定多肽或所 述多肽的結構域、區域、或片段的多核苷酸序列。本發明的多核苷酸可以是RNA的形式，或者是DNA的形式，且包括mRNA， cRNA,合成的 RNA和DNA,和cDNA。多核苷酸可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，則 可以是編碼鏈或非-編碼(反義，互補)鏈。本發明的多核苷酸包括本發 明多肽的編碼序列的(i)分離形式，(ii)與一種或多種其它編碼序列聯 合，以編碼例如融合蛋白、前-蛋白、前蛋白原等，(Hi)與能在適宜 宿主中有效表達編碼序列的非編碼序列聯合，例如內含子，控制元件， 例如啟動子(例如，天然存在的或重組的或改組的啟動子)，終止元件， 或5'和/或3'非翻譯區，和/或(iv)在載體、細胞或宿主環境中，在 其中編碼序列是異源基因。
本發明多核苷酸還可與核酸常見組合物制劑聯合，包括存在栽體、 緩沖劑、輔劑、賦形劑等，如本領域技術人員所已知的。多核苷酸片 段通常包含至少約200個核苷酸堿基，諸如至少約250， 300， 350， 400， 450， 460, 470或更多個堿基。本發明的多核苷酸的核苷酸片段 可在高嚴格條件下與本文所述多核苷酸序列雜交，和/或編碼具有本 文所述本發明多肽的至少一種特性的氨基酸序列。
本發明的多核苷酸具有許多用途，例如，用于本發明多肽的重組 生產(即，表達)，通常通過包含編碼所述多肽或其片段的序列的質粒 表達載體的表達；用作治療劑；用作預防劑；用作診斷工具；用作免 疫原；用作佐劑；用作判斷互補或部分互補的核酸是否存在的診斷探 針(包括檢測野生型寡腺苷酸合成酶核酸)；用作其它反應的底物， 所述其它反應例如遞推序列重組反應或突變反應，以生產新的和/或改 進的變體等。
表達載體，生產方法，基因治療
本文描述了用于生產和分離本發明多肽的重組方法。除了重組生 產以外，可以使用固相技術，通過直接的肽合成來生產多肽(參見，例
如，Stewart等(1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co ， San Francisco; Merrifield J. (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154)。肽合成可以使用手工技術或通過自動化來進行。自動 化的合成可以4吏用例如Applied Biosystems 431A肽合成4義(Perkin Elmer, Foster CUy， Cal if.)根據生產商提供的說明書來實現。例如， 可以使用化學方法，分別化學合成亞序列并合并，以提供全長多肽或 其片段。或者，可以從許多專門生產多肽的公司定制這樣的序列。最 常見地，通過表達編碼核酸和回收多肽，例如，如下文所述，可以生 產本發明的多肽。
也包括生產本發明多肽的方法。 一種這樣的方法包括，向一群細 胞中導入本發明的任何核酸，所述核酸可操作地連接到能有效地生產 編碼的多肽的調控序列上，在培養基中培養細胞以表達多肽，和從細 胞或培養基中分離多肽。使用足以促進細胞攝入(轉染)和/或表達多肽 的量的核酸。通過本領域已知的任何遞送方法，包括例如注射、基因 槍、被動攝入等，將核酸導入這樣的細胞。如本領域技術人員會認識 到的，所述核酸可以是載體的一部分，所述載體例如重組表達載體， 包括DNA質粒載體或本領域已知的任何載體。通過本領域已知的標準 的重組DNA技術和分離方法，可以制備和配制核酸或包含本發明核酸 的載體。可以將這樣的核酸或表達載體體內地導入哺乳動物細胞群體 中，或可以從哺乳動物取出選定的哺乳動物細胞(例如，腫瘤細胞)， 將核酸表達載體以足以攝入和表達編碼的多肽的量離體地導入這樣的 細胞群中。或者，使用培養的細胞，體外生產核酸或包含本發明核酸 的栽體。在一個方面，生產本發明多肽的方法包含，向一群細胞中導 入包含本文所述本發明任何核酸的重組表達載體，其量和形式允許攝 入該載體和表達編碼的多肽；通過本文所述的任何的導入/遞送形式， 將表達載體施用進哺乳動物；和從所述哺乳動物或哺乳動物副產物分 離所述多肽。
本發明提供了編碼本發明多肽的分離的或重組的核酸(在本文中 也稱作多核苷酸)，它們統一稱作"本發明的核酸(或多核苷酸)"。本發
明的多核苷酸可以用于許多應用。如上所述，所述多核苷酸可以用于 生產本發明的多肽。另外，可以將本發明的多核苷酸摻入用于基因治療、DNA疫苗接種、和免疫治療的表達載體中，如本申請其它地方所 述。
本發明的任何多核苷酸(包括上述那些)可編碼包含至少一種其它 氨基酸序列的融合蛋白，所述其它序列例如分泌/定位序列，用于增 溶或固定(例如，用于細胞表面展示)多肽的序列，用于檢測和/或純 化多肽的序列(例如，多肽純化亞序列，諸如表位標記，多組氨酸序列 等)。另一方面，本發明提供了包含一種或多種本發明多核苷酸的細胞。 所述細胞可以表達一種或多種由本發明多核苷酸編碼的多肽。
本發明還提供了包含本發明任何多核苷酸的載體。所述載體可包 含質粒，粘粒，噬菌體，病毒，或病毒片段。所述載體可包含表達載 體，如有需要，核酸可操作地連接于啟動子上，包括此處或以下描述的。此外，另一方面，本發明提供了組合物，其包含賦形劑或載體和 至少一種本發明的任何多核苷酸，或載體，細胞，或包含所述核酸的宿主。所述組合物可以是藥物組合物，且賦形劑或載體可以是藥學可 接受的賦形劑或栽體。
本發明還包括組合物，其包含兩種或多種本發明的核酸，或其片 段(例如，作為重組底物)。該組合物可包含重組核酸的文庫，其中文 庫包含至少2種，至少3種，至少5種，至少10種，至少20種，至 少50種，或至少IOO種或更多種上述核酸。所述核酸可任選地克隆至 表達載體中，來提供表達文庫。
本發明的多核苷酸及其片段，以及包含所述多核苷酸的載體，可 與適宜的載體(諸如藥用載體)聯用，用于治療性或預防性用途。所 述組合物包含治療上和/或預防上有效量的化合物，以及可藥用的載 體或賦形劑。所述載體或賦形劑包括(但不限于)鹽水，緩沖的鹽水， 葡萄糖，水，甘油，乙醇，及其組合。制劑應與給藥模式相適應。施 用核酸、多肽和蛋白的方法是本領域眾所周知的。
描述用于本文的分子生物學技術(包括栽體、啟動子的使用，和
許多其它相關的主題)的一般教科書，包括Berger，同上；Sambrook (1989)，同上和Ausubel，同上。足以指導技術人員完成體外擴增方 法(包括聚合酶鏈式反應(PCR)，連接酶鏈式反應(LCR) ， Q P -復制 酶擴增和其它RNA聚合酶介導的技術(例如，NASBA))(例如用于生產 本發明的同源核酸)的技術實例，參見Berger， Sambrook和Ausubel， 都同上，以及Mullis等 (1987)美國專利號4, 683, 202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis等，編.) Academic Press Inc. San Diego, Calif. (1990) ("Innis"; Arnheim & Levinson (Oct. 1， 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81-94; (Kwoh等(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:1173-1177; Guatelli等(1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:1874-1878; Lomeli等 (1989) J Clin Chem 35:1826-1831; Landegren等(1988) Science 241:1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291-294; Wu和Wallace (1989) Gene 4:560-569; Barringer等(1990) Gene 89: 117-122和Sook畫an和Malek (1995) Biotechnology 13:563-564。改進的克隆體外擴增的核酸的方法，描 述于Wallace等，美國專利號5， 426， 039。改進的PCR擴增大核酸的 方法，總結在Cheng等(1994) Nature 369:684-685和其中的參考 文獻中，其中制備了最高達40千堿基(kb)的PCR擴增子。技術人員 會明白，使用反轉錄酶和聚合酶，可以將基本上任何的RNA轉化成適 用于限制酶消化、PCR擴增和測序的雙鏈DNA。參見Ausubel, Sambrook 和Berger，都同上。
在哺乳動物宿主細胞中，可以使用許多表達系統，例如基于病毒 的系統。在腺病毒用作表達載體的情況下，任選將編碼序列連接至腺 病毒轉錄/翻譯復合物中，所述復合物由晚期啟動子和三聯前導序列組 成。插入病毒基因組中非必需的El或E3區域，會產生能在被感染的 宿主細胞中表達本發明多肽的活病毒(Logan和Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655-3659)。另外，可使用轉錄增強子如勞 斯肉瘤病毒(RSV)增強子來增加在哺乳動物宿主細胞中的表達。宿主細胞、培養基、表達系統和制備方法包括已知用于克隆和表達多種哺乳 動物蛋白的那些。通過包含適合所使用的細胞系統的增強子，可以提
高表達效率(參見，例如，Scharf D.等(1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62;和Bittner等 (1987) Methods in Enzymol 153:516-544)。
特定的起始信號可有助于本發明多核苷酸編碼序列和/或其片段 的有效翻譯。這些信號包括例如ATG起始密碼子和鄰接的序列。當將 編碼序列、其起始密碼子和上游序列插入適當表達載體時，可無需其 它的翻譯控制信號。然而，當僅插入編碼序列(如成熟蛋白編碼序列) 或其一部分時，必須提供外源核酸轉錄控制信號，包括ATG起始密碼 子。另外，起始密碼子必須位于正確的讀碼框內，以確保整個插入物 的轉錄。外源轉錄元件和起始密碼子可以是多種不同的來源，可以是 天然的和合成的。
通過磷酸釣轉染，DEAE—葡聚糖介導的轉染，電穿孔，基因或疫 苗槍、注射或其它用于體內、離體或體外方法的普通技術(參見，例如， Davis, L. ， Dibner， M.和Battey， I. (1986) Basic Mehthods in Molecular Biology)，可將構建體導入宿主細胞。
如上所述，可以得到許多關于許多細胞的培養和生產的文獻，包 括細菌、植物、動物(尤其哺乳動物)和古細菌來源的細胞。參見，例 如，Sambrook， Ausubel和Berger (都同上)，以及Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 第3版， Wiley-Liss， New York和其中引用的參考文獻；Doyle和Griff iths (1997) Mammalian Cel1 Culture: Essential Techniques John Wiley 和Sons, New York; Humason (1979) Animal Tissue Techniques, 第4版W. H. Freeman和Company;和Ricciardelli等(1989) In vitro Cell Dev Biol 25:1016-1024。關于植物細胞培養和再生，參 見，例如，Payne等(1992) Plant Cel 1 and Tissue Cul ture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, N.Y.; Gamborg和 Phillips (編.)(1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture;Fundamental Methods Springer Lab Manual , Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Plant Molecular Biology (1993) R， R. D. Croy (ed.) Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6。細胞培養基總地描述于At las and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton， Fla。關于細胞培養的其它信息，參見可商業得到的文獻，例 如來自 Sigma-Aldrich ， Inc (St Louis, Mo.) 的 Life Science Research Cell Culture Catalogue ("Sigma-LSRCCC"),和例如也來 自Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, Mo.)的Plant Culture Catalogue 和增刊("Sigma-PCCS")。
可通過本領域眾所周知的多種方法中的任一種，從重組細胞培養 物中回收和純化本發明的多肽，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀， 酸提取，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水相互作用 層析，親和層析(例如，使用本文所述的任何標記系統)，羥基磷灰石 層析和凝集素層析。需要時，在完成成熟蛋白或其片段的構型時，可 以利用蛋白重折疊步驟。最終，在最后的純化步驟中可以使用高效液 相層析(HPLC)。除了上文提及的參考文獻外，多種純化方法是本領域 眾所周知的，包括例如下述文獻所述的那些Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bo 1 lag等(1996) Protein Methods, 2. sup. nd Edition Wiley-Liss， New York; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, New Jersey; Harris 和 Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris 和Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford ， Oxford ， England; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3. sup. rd Edition Springer Verlag， New York; Janson和 Ryden (1998) Protein Purification: Principles ， High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH， New York;和Walker (1998)
Protein Protocols on CD-R0M Humana Press, New Jersey。
適用于生物體體內轉導和表達的許多病毒栽體是已知的。這樣的 載體包括逆轉錄病毒載體(參見，例如，Miller, Curr Top Microbiol Immunol (1992) 158:1-24; Salmons和Gunzburg (1993) Human Gene Therapy 4:129-141; Miller等 (1994) Methods in Enz，logy 217: 581-599)和腺伴隨病毒載體(綜述見Carter (1992) Curr Opinion Biotech 3:533-539; Muzcyzka (1992) Curr Top Microbiol Immunol. 158:97-129)。使用的其它病毒載體包括腺病毒載體，皰滲病毒載體和 新培斯病毒載體， 一般描述見，例如，Jolly (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64; Latchman (1994) Molec Biotechnol 2:179-195; 和Johanning等(1995) Nucl Acids Res 23:1495-1501。
在一個方面，可使用痘病毒栽體。用編碼本發明的多肽的多核苷 酸序列轉染痘病毒載體，并用于需要增強免疫應答(諸如增加的或改 善的T細胞增殖)的預防性、治療性和診斷性應用中。參見在例如， Berencsi等，J Infect Dis (2001) 183 (8): 1171-9; Rosenwirth等， Vaccine 2001 February 8; 19 (13-14): 1661-70; Kittlesen等，J Immunol (2000) 164 (8): 4204-11; Brown 等 Gene Ther 2000 7 (19): 1680-9; Kanesa—thasan等，Vaccine (2000) 19 (4-5): 483-91; Sten (2000) Drug 60 (2): 249-71中所討論的病毒載體。包含所迷載 體和可接受的賦形劑的組合物也是本發明的特征。
基因治療和基因疫苗提供了方法來抵抗慢性感染性疾病(例如 HIV感染，病毒性肝炎)，以及非-感染性疾病，包括癌癥和一些形式 的先天性缺陷，如酶缺陷，所述方法可使用本發明的多核苷酸，包括， 例如，包含所述多核苷酸的載體和細胞。已使用了數種方法來體內、 離體和體外地將核酸和載體導入細胞，所述方法可用于本發明的多核苷酸和包含所述多核苷酸的載體。這些方法包括基于脂質體的基因 遞送(Debs和Zhu (1993) WO 93/24640和美國專利號5, 641, 662; Mannino和Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6 (7):682-691; Rose,美國專利號5, 279, 833; Brigham (1991) WO 91/06309;和
Feigner等(1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 7413-7414; Brigham 等(1989) Am J Med Sci 298:278-281; Nabel等(1990) Science 249:1285-1288; Hazinski等(1991) Am J Resp Cell Molec Biol 4: 206-209;和Wang和Huang (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 7851-7855);腺病毒載體介導的基因遞送，例如，用于治療癌癥(參 見，例如，Chen等(1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:3054-3057; Tong等 (1996) Gynecol Oncol 61:175-179; Clayman等 (1995) Cancer Res. 5:1-6; (VMalley等(1995) Cancer Res 55: 1080-1085; Hwang等(1995) Am J Respir Cell Mol Biol 13:7-16; Haddada等 (1995) Curr Top Microbiol Immunol. 1995 (Pt. 3) :297-306; Addison等(1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:8522-8526; Colak 等 (1995) Brain Res 691:76-82; Crystal (1995) Science 270:404-410; Elshami等 (1996) Human Gene Ther 7:141-148; Vincent等(1996) J Neurosurg 85: 648-654)和許多其它方法。還 已使用復制-缺陷型逆轉錄病毒載體，其含有治療性的多核苷酸序列作 為逆轉錄病毒基因組的一部分，特別是簡單的MuLV載體。參見例如 Miller等(1990) Mol Cell Biol 10:4239 (1990); Kolberg (1992) J NIH Res 4: 43和Cornetta等(1991) Hum Gene Ther 2:215)。另 外，還使用了與配體一特異性的、基于陽離子的轉運系統相偶聯的核 酸轉運(Wu和Wu (1988) J Biol Chem， 263:14621-14624)。也已描 述了棵DNA表達載體(Nabel等(1990)，同上)；Wolff等(1990) Science, 247:1465-1468)。通常，通過將編碼本發明多肽的核酸摻入 適當載體中，可以使這些方法適用于本發明。
描述基因治療方案(其可以通過將本發明的核酸導入患者而適用 于本發明)的普通教科書包括，例如，Robbins (1996) Gene Therapy Protocols ， Humana Press ， New Jersey 和 Joyner (1993) Gene Targeting: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England。
抗病毒治療
本發明的多核苷酸和多肽可以治療性地或預防性地用于治療或預防病毒感染。示例性的病毒包括但不限于，黃病毒科的病毒，例如， 丙型肝炎病毒，黃熱病病毒，西尼羅病毒，日本腦炎病毒，登革熱病毒和牛病毒性腹竭病毒；肝DM病毒科的病毒，例如，乙型肝炎病毒； 小核糖核酸病毒科的病毒，例如，腦炎心肌炎病毒，人鼻病毒和甲型 肝炎病毒；逆轉錄病毒科的病毒，例如，人免疫缺陷病毒，猴免疫缺 陷病毒，人嗜T淋巴細胞病毒和勞斯肉瘤病毒；冠狀病毒科的病毒， 例如，SARS冠狀病毒；彈狀病毒科的病毒，例如，狂犬病病毒和水泡 性口膜炎病毒，副粘病毒科的病毒，例如，呼吸道合胞體病毒和副流 感病毒，乳頭瘤病毒科的病毒，例如，人乳頭瘤病毒，和皰滲病毒科 的病毒，例如，單純皰滲病毒。
本發明的另一個目的是，提供綴合物，所述綴合物包含一個或多 個連接到本發明多肽上的非多肽部分，該綴合物會表現出抗病毒性質， 且其任選地表現出其它希望的性質，例如與非綴合的多肽相比提高的 血清半衰期和/或功能體內半衰期，和/或降低的抗原性。與參照寡腺 苷酸合成酶相比，有些這樣的綴合物可以表現出增強的從受病毒感染 的細胞清除病毒的功效。與參照寡腺苷酸合成酶相比，有些這樣的綴 合物還可以具有降低的毒性。
本發明的另一個目的是，提供抑制病毒感染的細胞中的病毒復制 的方法，該方法包含，給病毒感染的細胞施用能有效抑制所述細胞中 病毒復制的量的本發明的多肽或綴合物。本發明也提供了減少病毒感 染的細胞中的病毒拷貝數的方法，其包含給病毒感染的細胞施用能有 效減少所述細胞中的病毒拷貝數的量的本發明的多肽或綴合物。細胞 可以是培養的，或以其它方式從哺乳動物分離(即，體外或離體)，或 可以是體內的，例如，在受試者中，在哺乳動物中，在靈長類動物中， 或在人類中。
抗癌和炎癥治療
已經證實，本發明多肽可以使某些細胞類型和細胞系發生細胞凋 亡或影響所述細胞系或細胞類型的生長延遲。在示例性的實施方案中， 這樣的細胞系或細胞類型包括源自前列腺和乳腺的那些。
本發明提供了抑制細胞群體增殖的方法，其包含使細胞群體接觸 能有效降低所述細胞群體增殖的量的本發明多肽。細胞群體可以是培 養的，或以其它方式從哺乳動物分離(即，體外或離體)，或可以是體 內的，例如，在受試者中，在哺乳動物中，在靈長類動物中，或在人 類中。
本發明提供了使用本發明的多肽和多核苷酸治療癌癥和腫瘤性疾
病。示例性的癌癥和腫瘤性疾病包括但不限于腎上腺皮質癌，AIDS 相關的癌癥，例如，卡波西肉瘤，AIDS-相關的淋巴瘤，肛門癌，星形 細胞瘤，基底細胞癌，膽管癌例如肝外性質的那些，膀胱癌，骨癌， 例如骨肉瘤和惡性纖維組織細胞瘤，腦干神經膠質瘤，腦腫瘤例如神 經膠質瘤，星形細胞瘤，惡性神經膠質瘤，室管膜瘤，成神經管細胞 瘤和神經母細胞瘤，幕上原發性神經外胚層瘤，視通路和下丘腦神經 膠質瘤，乳腺癌，支氣管腺瘤，伯基特淋巴瘤，類癌瘤，中樞神經系 統淋巴瘤，子宮頸癌，白血病例如毛細胞性白血病，急性成淋巴細胞 性白血病，急性髓細胞性白血病，慢性淋巴細胞性白血病和慢性髄細 胞性白血病，慢性骨髓增生陣礙，結腸直腸癌，皮膚T-細胞淋巴瘤， 子宮內膜癌，食管癌，尤因家族腫瘤，顱外生殖細胞肺瘤，性腺外生 殖細胞腫瘤，眼癌例如眼內黑素瘤和視網膜母細胞瘤，膽嚢癌，胃癌， 妊娠性滋養層細胞瘤，頭頸癌，肝細胞癌，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金 淋巴瘤，原發性CNS淋巴瘤，鼻咽癌，胰島細胞癌，腎(腎細胞)癌， 喉癌，唇和口腔癌，肝癌，肺癌，例如非小細胞和小細胞肺癌，瓦爾 登斯特倫巨球蛋白血癥，梅克爾細胞癌，間皮瘤，轉移性鱗狀頸癌， 多發性內分泌瘤病，多發性骨髓瘤，漿細胞腫瘤，萆樣肉芽腫病，骨 髓增生異常綜合征，骨髓增生性疾病，鼻腔和鼻旁竇癌，卵巢癌例如 生殖細胞和上皮性低惡性潛能卵巢腫瘤，胰腺癌，甲狀旁腺癌，陰莖 癌，嗜鉻細胞瘤，垂體肺瘤，胸膜肺母細胞瘤，前列腺癌，橫紋肌肉 瘤，唾液腺癌，肉瘤，塞扎里綜合征，皮膚癌例如黑素瘤和鱗狀上皮 細胞癌，睪丸癌，胸腺瘤，胸腺癌，甲狀腺癌，移行細胞癌，滋養層 細胞瘤，尿道癌，子宮癌，陰道癌，外陰癌和腎母細胞瘤。
本發明還提供了使用本發明的多肽和多核苷酸治療自身免疫病和
炎癥，所述自身免疫病和炎性疾病包括但不限于哞喘，克羅恩病， 格林-巴利綜合征，多發性硬化，重癥肌無力，視神經炎，銀屑病，類 風濕性關節炎，格雷夫斯病，橋本病(甲狀腺炎)，0rd氏曱狀腺炎， 糖尿病，糖尿病(拉)，萊特爾氏綜合征，自身免疫性肝炎，原發性 膽汁性肝硬變，肝硬化，肝纖維化，抗磷脂抗體綜合征，視性眼陣攣 肌陣攣綜合征，顳動脈炎，急性播散性腦脊髓炎，肺出血腎炎綜合征， 韋格納氏肉芽腫病，腹部疾病，天皰瘡，多關節炎，warm自身免疫性 溶血性貧血，大動脈炎，冠狀動脈疾病，子宮內膜異位，間質性膀胱 炎，神經性肌強直，硬皮病，白癜風，外陰痛，查加斯病，結節病， 慢性疲乏綜合征，急性呼吸窘迫綜合征，腱炎，滑囊炎，風濕性多肌 痛，炎性腸病，慢性阻塞性肺病，變應性鼻炎，心血管疾病，慢性膽嚢 炎，支氣管擴張，塵肺病例如硅肺病，骨關節炎，動脈粥樣硬化，家 族性自主神經機能異常，強直性脊柱炎，急性前色素層炎，系統性紅 斑狼瘡，胰島素依賴型糖尿病，尋常型天皰瘡，實驗性變應性腦脊髄 炎，實驗性自身免疫性uveorenitis，混合性結締組織病，Sjorgen 氏綜合征，自身免疫性溶血性貧血，自身免疫性血小板減少性紫癜， 急性風濕熱，混合性特發性冷球蛋白血癥，青少年類風濕性關節炎， 退行性關節病，強直性脊柱炎，銀屑病關節炎，神經痛，滑膜炎，腎 小球腎炎，血管炎，作為流感、普通感冒和其它病毒感染的后遺癥發
生的炎癥，痛風，接觸性皮炎，腰背部和頸部疼痛，痛經，頭痛，牙 痛，扭傷，勞損，肌炎，燒傷，損傷，以及受試者手術和牙科操作之 后的疼痛和炎癥。
細胞生長和組織再生治療
已經證實，本發明多肽會刺激特定細胞類型和細胞系(例如，Huh7 肝癌細胞和MRC5胎兒肺成纖維細胞)中的促有絲分裂的、促進細胞生 長的程序。使用表達微陣列分析和以本發明多肽處理的細胞和細胞系 的細胞存活力測定，可以鑒別該促有絲分裂程序。本發明提供了本發 明多肽在體外、體內和離體刺激細胞生長和組織再生的應用，其中使用源自受試者或哺乳動物的組織和細胞。
本發明多肽的衍生物
本發明提供了與圖1-5的任何多肽差別在于1-34個氨基酸的多 肽，這樣的差別可以包括置換，插入，缺失，修飾的氨基酸或氨基酸 衍生物的摻入，從多肽的C-末端或N-末端添加或刪除氨基酸。根據例 如，置換組(例如，保守置換組)，例如下述的組，可以對本發明多肽 進行一個或多個氨基酸置換。或者，或此外，可以在多肽中進行一個 或多個氨基酸置換，以導入或去除包含非多肽部分連接基團的氨基酸 殘基。實例包括，導入一個或多個N-糖基化位點，導入一個或多個半 胱氨酸殘基或賴氨酸殘基，去除一個或多個N-糖基化位點和/或去除 一個或多個賴氨酸或組氨酸。有些這樣的多肽會表現出寡腺苷酸合成 酶活性。保守置換組包括組l，丙氨酸(A)甘氨酸(G)絲氨酸(S) 蘇氨酸(T)，組2，天冬氨酸(D)谷氨酸(E)，組3，天冬酰胺(N) 谷氨酰胺(Q)，組4，精氨酸(R)賴氨酸(K)組氨酸(H)，組5, 異亮氨酸(I)亮氨酸(L)蛋氨酸(M)纈氨酸(V)，和組6，苯丙氨 酸(F)酪氨酸(Y)色氨酸(W)。可以預見到其它氨基酸置換組。例 如，根據類似的功能或化學結構或組成(例如，酸性的，堿性的，脂族 的，芳族的，含疏的)，可以將氨基酸分組。例如，脂族組可以包含甘 氨酸(G),丙氨酸(A)，纈氨酸(V)，亮氨酸(L)，異亮氨酸(I)。 含有被視作可以彼此保守置換的氨基酸的其它分組包括芳族組苯 丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W);含硫組蛋氨酸(M)，半胱 氨酸(C);堿性組精氨酸(R)，賴氨酸(K)，組氨酸(H);酸性組 天冬氨酸(D),谷氨酸(E)，天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)。關于氨 基酸的其它分組，也參見Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman 和Company。本文多肽序列的列表，以及上述置換組，提供了所有保 守置換的多肽序列的特別列表。
在一個方面，本發明提供了分離的或重組的多肽，其各自包含與 圖5任何一種多肽具有至少90%序列同一性(例如，至少約91%，至少 約92%,至少約93%，至少約94%，至少約95%,至少約96%,至少約97%，至少約98%，或至少約99%氨基酸序列同一性)的序列。在有些 情況下，所述多肽表現出寡腺苷酸合成酶活性。
序列(多肽或核酸)彼此相似的程度，提供了 2個序列的類似結構 和功能性質的指標。因此，在本發明的上下文中，具有與任何給定示 例序列相似序列的序列，是本發明的特征。更具體地，具有下面定義 的序列同一性百分比的序列，是本發明的特征。可以使用許多確定序 列關系的方法，包括手工比對、計算機輔助的序列比對和分析。可以 得到許多用于進行序列比對的計算機程序，或技術人員可以手工進行 比對。
如上所述，在本發明中使用的多肽和核酸的序列不需要與本發明 多肽或本發明核酸的對應序列相同，但是可以基本上相同。例如，本 發明多肽可以發生多種不同的變化，例如一個或多個氨基酸插入、缺 失、和/或置換，保守或非保守的，包括例如這樣的變化可能提供在它 們應用中的某些優點，例如，在它們的治療性或預防性用途或給藥或 診斷應用中。本發明的核酸也可以發生多種不同的變化，例如在一個 或多個密碼子中一個或多個核酸的一處或多處置換，使得特定密碼子編碼相同或不同的氨基酸，導致沉默變異(如本文所定義的)或非沉默 變異，或序列中一個或多個核酸(或密碼子)的一處或多處缺失。也可 以修飾核酸，以包含一個或多個在表達系統(例如，細菌或哺乳動物) 中提供最適表達的密碼子，如果需要，所述一個或多個密碼子仍然編 碼相同的氨基酸。這樣的核酸變化可能提供在它們的治療性或預防性 用途或給藥或診斷應用中的某些優點。可以以許多方式修飾核酸和多 肽，只要它們包含與本發明各相應核酸或多肽的序列基本上同一 (如下 所定義)的序列。
在2個或多個核酸或多肽序列的上下文中，術語"同一的"或"同 一性"指，當比較和對比最大相似性時，使用序列對比算法或通過目檢 測得，2個或多個序列是相同的，或具有指定百分比的相同氨基酸殘 基或核苷酸。
主題序列與參照(即查詢)序列的"百分比序列同 一性"("％同 一性")指，主題序列在對比長度上與查詢序列的同一性(即，對于多肽序列，以逐個氨基酸為基礎；或對于多核苷酸序列，以逐個核苷酸為基礎) 是指定的百分比。
定點誘變來創建本發明的多肽
使用任何定點誘變的標準方法，可以改造本發明多肽。使用特異性的寡核苷酸引物和高保真度DNA聚合酶，可以合成與本發明多肽相 對應的核酸序列。靼序列包含在從曱基化-感受態大腸桿菌菌林分離的 雙鏈質粒中。合成含有目標突變的互補寡核苷酸，并使用聚丙烯酰胺 凝膠電泳進行純化。使用熱循環儀來控制下述交替循環的溫度雙鏈 質粒模板的變性(94C 30秒)，寡核苷酸引物的退火(55X: 1分鐘) 和用高保真度聚合酶延伸引物(68X: l分鐘/kb質粒長度)。約15個循 環后，用對甲基化的殘基特異性的限制酶(Dpn I)處理新合成的和輸入 的DNA的混合物，以消化親本質粒。將得到的DNA導入化學或電感受 態的細菌菌林中，用于篩選和分離含有目標突變的質粒。從轉化體分 離質粒DNA，并通過熒光染料-終止子測序進行篩選，以證實突變序列。
大批藥物產物表達，發酵和純化
用編碼與一種或多種本發明多肽相對應的核酸序列的、含有IPTG-誘導型啟動子的細菌表達載體，轉化含有入DE3溶素原、并因此 攜帶在lacUV5啟動子控制下的T7RNA聚合酶基因的染色體拷貝的大 腸桿菌菌林。在37*C，在添加了 34 ng/mL氯霉素和15 jj g/mL卡 那霉素的luria肉湯培養基中培養。當OD600達到>0. 4時，將溫度降 至18'C，用0. 5 mM IPTG誘導細胞17小時。然后，將細菌細胞重新 懸浮于緩沖液中，所述緩沖液含有50mMNaH2PO4， pH 8， 300 mMNaCl， 20 mM 。米哇，10%甘油，0.1% NP40， 2 mM DTT和蛋白酶抑制劑(VWR)， 在Gaulin勻漿器中裂解，離心去除細胞碎片，然后進行蛋白純化。
在一個實施方案中，使用在氨基末端的多組氨酸標記，可進行本 發明多肽的純化。在多組氨酸標記的親和純化中，使用鎳柱，例如， 對于從4 L大腸桿菌制備的裂解物，使用5mL柱。將裂解物裝栽到柱 上，然后用緩沖液A (50 mM NaH2P04, 300 mMNaCl， 30°/。甘油，20 mM 咪唑，2 mM DTT， pH 7. 5)洗滌。然后，分步洗脫(step elution) 到7%緩沖液B (50 mM NaH2P04， 300 mM NaCl， 30%甘油，2 M咪唑， 2mMDTT， pH 6. 8)，進行3. 2倍柱體積。然后，經3倍柱體積實現梯 度到1005緩沖液B。然后，可以將本發明多肽凝膠過濾到緩沖液C (50 mMNaH2P04， 150 mM NaCl， 40%甘油，1 mM EDTA， 2 mM DTT， pH 6. 8) 中，并裝載上陽離子交換柱，用于進一步純化。裝載蛋白后，用緩沖 液C洗滌柱，其后是分步洗脫到75%緩沖液D (50mMNaH具，lMNaCl， 40%甘油，1 mM EDTA， 2 mM DTT， pH 6.8)，然后是5倍柱體積梯度至100%緩沖液D。然后將蛋白凝膠過濾到緩沖液E (50 mM NaH2P04， 300 mM NaCl， 40%甘油，1 mM EDTA， 2 mM DTT, pH 6， 8)中，并保 藏在-20℃。
本發明多肽的不同實施方案(包括但不限于缺少多組氨酸標記 的多肽，具有多精氨酸標記的多肽，具有減小的半胱氨酸含量的多肽， 具有設計用于使藥物候選物更熱穩定的氨基酸序列變化的多肽，具有 用于增強或減小藥物候選物的特定活性的修飾的多肽)，可能需要其 它備選純化策略。缺少多組氨酸標記的多肽藥物候選物的實施方案， 例如，可以直接應用于陽離子交換柱上。可以使用其它步驟，例如疏 水相互作用層析的應用，其中將蛋白置于緩沖液F (50 mM NaH2P04， 300 mMNaCl， 1M(肌)肌,30%甘油，lmMEDTA， 2mMDTT， pH 6. 8) 中，并運行IO倍柱體積梯度至100y。緩沖液E。可以使用其它親和柱或 區分大小的柱，來純化多肽藥物候選物的不同實施方案。
替代技術也可以用于緩沖液的交換、藥物候選物的濃縮和藥物候 選物的純化。它們包括但不限于，超濾，正切流動過濾和滲濾，用于濃縮藥物候選物和交換緩沖液。也可以使用諸如用(NH山S04或有些其 它化學試劑沉淀藥物候選物的技術。也可以在脲或有些其它變性劑中 使藥物候選物變性，并重新折疊它。
用含有鹽的賦形劑，可以穩定化本發明多肽；在300 mMNaCl穩 定的溶液，可以在150 mM NaCl開始沉淀。鑒于該原因，賦形劑混合物將有利于這些穩定鹽濃度，這包括但不限于磷酸鈉，氯化鈉，氯化
鉀和氯化鎂。
已經證實，加入基于氨基酸的賦形劑，例如精氨酸，會穩定本發
明的多肽。10%蔗糖溶液會使本發明多肽在1 mg/mL穩定，加入2^w/v 精氨酸會使多肽的有些實施方案在3 mg/mL穩定。鑒于該原因，可以
使用其它基于氨基酸的化合物(包括但不限于組氨酸，谷氨酰胺，甘 氨酸和人白蛋白)作為賦形劑。
加入賦形劑(例如甘油)會穩定本發明的多肽。例如，在一個實 施方案中，10%甘油(v/v)會使多肽具有1 mg/mL的最大濃度；而在 40%甘油，藥物候選物保持穩定最高達12 mg/mL。預見到含有具有類 似化學性質的化合物的賦形劑混合物，它們包括但不限于多元醇例如 甘露醇，木糖醇和山梨醇。已經發現二糖(例如蔗糖)在10% w/v起 穩定作用；也可以使用其它二糖，包括但不限于麥芽糖和海藻糖。在 本發明中也可以使用單糖。聚山梨酯、聚乙二醇和類似的化合物，也 可以用于實現本發明。
如本領域技術人員會認識到的，也可以使用抗氧化劑和防腐劑， 來確保保藏過程中多肽的穩定性。抗氧化劑，包括但不限于檸檬酸鈉， 可以發揮穩定作用使本發明多肽長期保藏。防腐劑，包括但不限于苯 曱醇，也可以在保藏過程中穩定多肽，且可以用于最后的賦形劑混合 物中。
多肽的寡腺苷酸合成酶活性的測量
根據以前公開的方法(Justesen ， J.等Nuc Acids Res. 8: 3073-3085， 1980)，測量本發明多肽的寡腺苷酸合成酶活性。簡而 言之，用在含有20 mM Tris-HCl pH 7. 8、 50 mM Mg (0Ac) 2、 1 mM DTT、 0.2 mM EDTA、 2.5 mM ATP、 ot ["P]ATP、 0.5 mg/ml BSA、和10%甘油 的緩沖液中的200jug/ml聚肌苷酸聚胞苷酸，激活蛋白。反應在37 C進行30分鐘至24小時，通過加熱至90TC 3分鐘終止。將2-4 ji 1 反應混合物點到PEI-纖維素薄層平板上。干燥后，用0. 4MTris-HC1， 30mMMgCl2， pH8. 7將平板顯影。將平板干燥，通過磷成像儀分析進 行觀察。或者，可以使反應化合物與0. 05 U/ " 1小牛腸磷酸酶進一步
溫育，以去除末端磷酸。使用0.76 M KH2P04, pH 3. 6顯影緩沖系統， 進行薄層色譜分離。然后干燥平板，通過磷成像儀分析進行觀察。
多肽的抗病毒活性的測量
使用鼠腦炎心肌炎病毒(EMCV， ATCC林VR-129B)感染模型，證
實了本發明多肽保護培養的細胞免受細胞毒性病毒的能力。其它體外 病毒感染模型包括但不限于黃病毒例如牛腹瀉病毒，西尼羅病毒和
GBV-C病毒，其它RNA病毒例如呼吸道合胞體病毒和HCV復制子系統
(例如Blight, K. J.等2002. J. Virology, 76:13001-13014)。在抗
病毒測定中，可以使用對病毒復制感受態的任何適當的培養細胞。
以1 x 104細胞/孔的密度，將人Huh7肝癌細胞接種進96孔培 養板，在完全培養基(含有10%胎牛血清的DMEM)中溫育過夜。次日 早晨，將培養基替換為含有0-10 juM蛋白或等同量的蛋白稀釋緩沖 液的完全培養基。當需要時，加入濃度為100 IU/ml的oc-干擾素。在 病毒感染之前，預處理細胞2-8小時。預處理后，向孔中加入相等體 積的培養基，其中含有EMC病毒在完全培養基中的稀釋液。在本文所 述實驗中，每個孔中加入范圍為50-500的噬斑形成單位(pfu)。
使病毒感染持續過夜(約18小時)，使用任何可得到的細胞存活 力或細胞毒性試劑，計算存活細胞的比例。使用測量活細胞中四唑鹽 化合物[3- (4， 5-二甲基-2-基)-5- (3-羧甲氧基苯基)-2- (4-硫代苯 基)-2H-四唑鹽，內鹽；MTS]向有色曱肼化合物的轉化的細胞存活力測 定，得到本文所述的結果。在492 nm吸光度，在96-孔平板讀數器中 檢測MTS向甲廉的轉化。將得到的光密度直接繪圖，以估計細胞存活 力，或通過對照處理樣品標準化，以計算處理后存活細胞的百分比。
多肽PEG化；巰基
通過以0.5-10:1的摩爾比，混合不含二硫蘇糖醇(DTT)的純化的 多肽和活化的mPEG-MAL (Nektar Therapeutics)，實現聚乙二醇(PEG) 向本發明多肽的綴合。反應在室溫進行5分鐘至2小時，通過加入2 mM DTT來淬滅。使用線性的20kDa和分支的40kDa PEG (圖6A和6B)， 在多個半胱氨酸位點進行綴合。使用本領域技術人員已知的許多色語
方法，可以將非-PEG化形式和含有一個或多個PEG的形式彼此分離。 在本發明的示例性實施方案中，可以使用單獨的或彼此組合的離子交 換柱、疏水相互作用柱、凝膠過濾和大小排阻層析，來分離不同的PEG形式。
多肽PEG化；N-末端
可以在N-末端胺處，PEG化本發明的多肽。向多肽中加入5-倍過 量的mPEG butyrALD-40K，所述多肽在含有20 mM氰基硼氫化鈉的50 mM NaH2P04、 300 mM NaCl、 30%甘油、1 mM EDTA、 2 mM DTT、 pH 5 中，并在冰浴中攪拌。使反應進行最長達1O小時，然后通過加入50-倍過量的甘氨酸來淬滅。通過SDS-PAGE,分析反應產物。
提供下面的實施例來進行解釋，而不是限制。
實施例
實施例1
非人靈長類動物0AS1蛋白中的氨基酸修飾
對來自非人靈長類動物的0AS1基因測序，并與在人0AS1基因中 發現的突變相對比。這樣的突變會提供關于0AS1基因和蛋白的進化的 另外洞察。進化保守的氨基酸提示著對于0AS1功能或酶活性重要的或 關鍵的位點。相反地，最近突變的(例如僅在人類中)或在靈長類動 物中表現出多種氨基酸置換的0AS1氨基酸位點，指示著對于功能或酶 活性不太關鍵的位點。在0AS1蛋白的特定基序內突變的位點的豐度， 與該功能域對修飾的耐受性相關。優化這樣的位點和基序，以提高蛋 白功能或比活性。類似地，假定類似于0AS1的具有免疫或病毒防御功 能的基因和蛋白中的突變，源自病毒感染的歷史攻擊。在此基礎上， 假定靈長類動物0AS1蛋白中的突變會提高抗病毒功效，且是優化人治 療性0AS1蛋白的機會。
在一個示例性的實施方案中，可以將0AS1內特定位點的祖先靈長 類動物氨基酸恢復成人治療形式的0AS1蛋白，以優化蛋白比活性或抗 病毒功效。在其它實施方案中，將在非人靈長類動物0AS1中識別出 的、但是不一定在祖先中保守的備選氨基酸，置換到人治療形式的
0AS1中，以便提高蛋白比活性或抗病毒功效。編碼天然靈長類動物蛋 白以及靈長類動物-人雜種形式的DNA和mRNA序列是新的，且具有效 用。它們的效用的幾個實例是用作用于檢測它們各自的DNA或mRNA 對應物的試劑；用于在治療性蛋白的制備中使用的表達載體中；和用 于檢測結合各mRNA的新化合物中。
圖l提供了一種治療形式的0AS1 (SEQ IDN0:1)。使用至少一種 圖2提供的氨基酸修飾，對該形式進行修飾，以便提供其它治療形式。 如圖2所示， 一種有用的修飾是，從SEQIDN0:1和其它形式的0AS1， 去除原始蛋氨酸。如圖3所示進行其它修飾。圖2和3所示的前述修 飾也適用于圖5提供的其它治療性0AS1同種型。圖3也提供了與 Genbank登錄號NP—002525. 1在羧基末端同源的0AS1蛋白(例如，SEQ ID N0:3)的特異性修飾，與Genbank登錄號NP-0058132. 1在羧基末 端同源的0AS1蛋白(例如，SEQ IDNO: 2)的特異性修飾，和與Genbank 登錄號NP-001027581. 1在羧基末端同源的0AS1蛋白(例如，SEQ ID NO: 4)的特異性修飾。在圖4中列出了在非人靈長類動物(包括大猩猩， 黑猩猩，猩猩和獼猴)中鑒別出的示例性突變。圖5中列出了可以用 于本發明的診斷和治療目的的其它人和非人靈長類動物0AS1同種 型，以及本發明所述的特定靈長類動物突變。
實施例2
cDNA的制備和測序
從來自具有丙型肝炎抗性表型的患者的經培養的淋巴母細胞或成 纖維細胞，純化總細胞RNA。如Chomczynski等，Anal. Biochem.， 162: 156 —159 (1987)所述，執行純化程序。在10毫升(ml)含有4. 0 M 硫氰酸胍、pH值為7. 5的0. 1M Tris-HCl和0. 1M 巰基乙醇的變 性溶液中，將所述細胞均質化，形成細胞裂解物。隨后將十二烷基肌 氨酸鈉混合至細胞裂解物中，直至最終濃度為0.5%，其后將混合物 在室溫以5000Xg離心10分鐘。將所得含有總RNA的上清液鋪到pH 值為7. 5的5. 7 M氯化銫和0. 01 M EDTA緩沖墊上，并離心沉淀。將
所得RNA沉淀溶解于含有0. 1 %十二烷基硫酸鈉(SDS)的PH值為7. 6 的10 mM Tris — HCl與lmM EDTA (TE)的溶液中。在苯酚氯仿提取和乙 醇沉淀之后，通過測量260nm的光密度，估計純化的總細胞RNA濃度。
以上制備的總RNA用作使用逆轉錄酶進行第 一鏈合成的cDNA合成 的模板，并使用設計的寡核苷酸引物進行PCR，以便擴增cDNA(以命 名為5'和3'片段的兩個重疊片段)。按照廠商說明書，在Applied Biosystems 381A DNA合成儀上合成用于實施本發明的寡核苷酸。使 用本領域已知的方法進行PCR。 PCR擴增方法詳細描述于美國專利號 4， 683， 192， 4， 683， 202， 4， 800， 159和4， 965， 188中，且至少描述于 若干教科書中,包括PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich， ed. ， Stockton Press ， New York (1989);和PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis等人編，Academic Press, San Diego, Calif. (1990)，和基 于編碼本文公開的氨基酸修飾區域的核苷酸序列的引物。
分析直接從來自有或無HCV感染的患者的經PCR擴增的DNA測定 的序列。在盡管反復暴露于病毒但仍呈HCV血清陰性的患者中可檢測 到OAS基因編碼區上游突變的存在。
上述包括特定實施方案和實施例的說明書，用以闡明而非限制本 發明。在不偏離本發明的真實精神和范圍的情況下，可進行許多其它 改變和修改。引用的所有專利、專利公開和非專利出版物都通過參考 并入本文。
權利要求
1.用于鑒別寡腺苷酸合成酶基因(OAS1)突變的人遺傳篩查方法，其包含，檢測核酸樣品中OAS1突變的存在，其中所述突變會導致所編碼的OAS1蛋白中的至少一處氨基酸修飾。
2. 寡腺苷酸合成酶1蛋白，其包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸 序列的多肽，例外是在位置1, 24， 25， 28， 31， 36， 47， 53， 54， 64, 69， 74， 104， 108, 112， 113， 114, 115， 116， 117， 118， 119, 127， 130， 139， 142， 160， 161， 162， 166， 175, 179， 226, 242， 246， 248， 250， 254， 274， 279， 282， 284， 288， 289， 292， 295, 314， 315和335處具有至少一處氨基酸修飾。
3. 寡腺苷酸合成酶1蛋白，其包含具有與Genbank登錄號 NP-002525. 1在羧基末端同源的0AS1蛋白的氨基酸序列的多肽，所述 氨基酸序列具有在位置363處的氨基酸修飾。
4. 寡腺苷酸合成酶1蛋白，其包含具有與Genbank登錄號 NP-058132. 1在羧基末端同源的0AS1蛋白的氨基酸序列的多肽，例外 是在位置347， 350， 352， 353, 354, 356, 357， 361， 363， 364， 365， 369， 371， 373， 374， 375， 378， 379， 382， 388， 389和394處具有 至少一處氨基酸修飾。
5. 寡腺苷酸合成酶1蛋白，其包含具有與Genbank登錄號 NP-001027581. 1在羧基末端同源的0AS1蛋白的氨基酸序列的多肽， 例外是在位置347， 361， 364, 372, 384， 385和399處具有至少一處 氨基酸修飾。
6. 寡腺苷酸合成酶1蛋白，其包含具有SEQ ID NO: 2的氨基酸 序列的多肽，例外是在位置1, 24， 25， 28， 31， 36， 47， 53， 54， 64， 69， 74， 104， 108， 112, 113， 114， 115, 116， 117， 118， 119, 127, 130， 139， 142， 160， 161, 162， 166， 175， 179， 226， 242， 246， 248， 250， 254， 274, 279， 282， 284， 288, 289， 292， 295， 314， 315， 335， 347， 350, 352， 353， 354, 356, 357, 361， 363，364， 365， 369, 371， 373， 374， 375， 378， 379， 382， 388， 389和 394處具有至少一處氨基酸修飾。
7. 寡腺苷酸合成酶1蛋白，其包含具有SEQ ID NO: 3的氨基 酸序列的多肽，例外是在位置l， 24, 25， 28， 31， 36， 47， 53， 54， 64， 69， 74， 104， 108， 112， 113， 114， 115, 116， 117, 118， 119， 127， 130， 139， 142， 160， 161， 162， 166， 175， 179， 226， 242， 246， 248， 250， 254， 274， 279, 282， 284, 288， 289， 292， 295， 314， 315， 335和363處具有至少一處氨基酸修飾。
8. 寡腺苷酸合成酶1蛋白，其包含具有SEQ ID NO: 4的氨基 酸序列的多肽，例外是在位置l， 24， 25， 28， 31， 36， 47， 53， 54， 64, 69， 74， 104, 108， 112, 113， 114， 115， 116， 117， 118， 119, 127， 130， 139， 142， 160， 161， 162， 166, 175， 179， 226， 242， 246， 248， 250， 254， 274， 279， 282， 284， 288， 289， 292， 295， 314, 315， 335， 347， 361， 364, 372， 384, 385和399處具有至少 一處氨基酸修飾。
9. 寡腺苷酸合成酶1蛋白，其包含具有SEQ ID NO:5-16中任 一的氨基酸序列的多肽
10. 多核苷酸，其編碼權利要求2-9中任一項的多肽。
11. 用于治療或預防哺乳動物中病毒感染的治療組合物，其中所 述組合物是與藥學可接受的栽體在一起的權利要求2-9中任一項的多 肽。
12. 權利要求11的治療組合物，其中所述病毒是黃病毒。
13. 權利要求12的治療組合物，其中所述病毒是丙型肝炎病毒。
14. 用于治療哺乳動物癌癥的治療組合物，其中所述組合物是與 藥學可接受的載體在一起的權利要求2-9中任一項的多肽。
15. 權利要求14的治療組合物，其中所述癌癥是前列腺癌。
16. 用于治療或預防哺乳動物中病毒感染的治療化合物，其中所 述化合物是權利要求2-9中任一項的多肽的活性的抑制劑。
17. 權利要求16的治療化合物，其中所述治療化合物是反義分子。
18. 權利要求16的治療化合物，其中所述治療化合物是RNAi分子。
19. 權利要求16的治療化合物，其中所述治療化合物是核酶。
20. 權利要求16的治療化合物，其中所述治療化合物是抗體。
21. 用于測定對病毒感染的抗性的診斷試劑盒，其包含至少一種 權利要求2-9中任一項的多肽。
22. 權利要求21的診斷試劑盒，還包含下述一種或多種(a) 關于使用至少一種多肽用于篩選、診斷、預測、治療監測或 這些應用的任意組合的說明書；和(b) 指示對用于篩選、診斷、預測或治療應用或其任意組合的政 府批準的標簽或插入物。
23. 權利要求21的診斷試劑盒，其中所述至少一種多肽被可檢測 地標記。
24. 治療哺乳動物受試者的病毒性疾病的方法，其包含，給需要 這種治療的受試者提供權利要求11的治療組合物。
25. 權利要求24的方法，其中所述病毒性疾病選自黃病毒科， 小核糖核酸病毒科，肝DNA病毒科，冠狀病毒科，副粘病毒科，逆轉 錄病毒科，彈狀病毒科，乳頭瘤病毒科，皰滲病毒科。
26. 權利要求25的方法，其中所述病毒性疾病選自丙型肝炎病 毒，黃熱病病毒，西尼羅病毒，日本腦炎病毒，登革熱病毒，牛病毒 性腹瀉病毒，乙型肝炎病毒，腦炎心肌炎病毒，人鼻病毒，甲型肝炎 病毒，人免疫缺陷病毒，猴免疫缺陷病毒，人嗜T淋巴細胞病毒，勞 斯肉瘤病毒，SARS冠狀病毒，狂犬病病毒，水泡性口膜炎病毒，呼吸 道合胞體病毒，副流感病毒，人乳頭瘤病毒和單純皰滲病毒。
27. 治療哺乳動物受試者的癌癥的方法，其包含，給需要這種治 療的受試者提供權利要求14的治療組合物。
28. 權利要求27的方法，其中所述癌癥選自腎上腺皮質癌， AIDS相關的癌癥，卡波西肉瘤，AIDS-相關的淋巴瘤，肛門癌，星形細胞瘤，基底細胞癌，膽管癌，膀胱癌，骨癌，骨肉瘤，惡性纖維組織 細胞瘤，腦干神經膠質瘤，腦腫瘤，神經膠質瘤，星形細胞瘤，惡性 神經膠質瘤，室管膜瘤，成神經管細胞瘤，神經母細胞瘤，幕上原發 性神經外胚層瘤，視通路和下丘腦神經膠質瘤，乳腺癌，支氣管腺瘤， 伯基特淋巴瘤，類癌瘤，中樞神經系統淋巴瘤，子宮頸癌，白血病， 毛細胞性白血病，急性成淋巴細胞性白血病，急性髓細胞性白血病， 慢性淋巴細胞性白血病和慢性髓細胞性白血病，慢性骨髓增生障礙，結腸直腸癌，皮膚T-細胞淋巴瘤，子宮內膜癌，食管癌，尤因家族腫 瘤，顱外生殖細胞肺瘤，性腺外生殖細胞腫瘤，眼癌，眼內黑素瘤， 視網膜母細胞瘤，膽嚢癌，胃癌，妊娠性滋養層細胞瘤，頭頸癌，肝 細胞癌，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，原發性CNS淋巴瘤，鼻咽 癌，胰島細胞癌，腎(腎細胞)癌，喉癌，唇和口腔癌，肝癌，肺癌， 非小細胞和小細胞肺癌，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥，梅克爾細胞癌， 間皮瘤，轉移性鱗狀頸癌，多發性內分泌瘤病，多發性骨髓瘤，漿細 胞腫瘤，萆樣肉芽腫病，骨髓增生異常綜合征，骨髓增生性疾病，鼻 腔和鼻旁竇癌，卵巢癌例如生殖細胞和上皮性低惡性潛能卵巢腫瘤， 胰腺癌，曱狀旁腺癌，陰莖癌，嗜鉻細胞瘤，垂體腫瘤，胸膜肺母細 胞瘤，前列腺癌，橫紋肌肉瘤，唾液腺癌，肉瘤，塞扎里綜合征，皮 膚癌例如黑素瘤和鱗狀上皮細胞癌，睪丸癌，胸腺瘤，胸腺癌，曱狀 腺癌，移行細胞癌，滋養層細胞瘤，尿道癌，子宮癌，陰道癌，外陰 癌和腎母細胞瘤。
全文摘要
本發明提供了非人靈長類動物中OAS1蛋白的經修飾的氨基酸序列，和與其相關的基因。
文檔編號C12N9/12GK101203604SQ200680022089
公開日2008年6月18日 申請日期2006年5月3日 優先權日2005年5月4日
發明者A·奧爾森, C·A·謝勒, C·L·馬格內斯, P·C·費林, S·P·伊多納托, T·哈根 申請人:伊盧米根生物科學公司