專利名稱：：提高植物對低氧條件抗性的方法提高植物對低氧條件抗性的方法本發明提供用于提高植物對低氧或無氧條件抗性的方法。這類方法可用于促進植物根穿透生長培養基或土壤。本發明的方法可包括對植物基因組的修飾，所述修飾通過對植物提供外源脅迫耐受性基因或對應于這類外源基因的內源基因的脅迫耐受性變體。本發明的方法也可包括對植物或其生境，或對其細胞或種子使用新煙堿類化合物(neonicotinoidcompound),例如但不限于吡蟲啉(imidacloprid)、烯咬蟲胺(nitenpyram)、咬蟲脒(acetamiprid)、蓉蟲啉(thiacloprid)、噢蟲漆(thiamethoxam)、可尼丁(clothianidin)和呋蟲胺(dinotefuran)。特別有效的新煙堿類化合物是包含氯吡咬(chloropyridine)側鏈的新煙堿類化合物，例如吡蟲啉、烯咬蟲胺、咬蟲脒和噻蟲啉，特別是其在植物中的降解能夠釋放6-氯煙酸(6-chloronicotinincacid，6-CNA)的那些新煙堿類化合物，像例如吡蟲啉和瘞蟲啉。植物或其生境也可直接用6-CNA處理。
背景技術：
：改造為脅迫耐受的植物為本領域所已知。植物細胞和植物的脅迫耐受性可例如通過降低內源聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)或聚(ADP-核糖)糖原水解酶(PARG)的活性或水平實現，其分別描述于WO00/04173和WO04/0卯140中。歐洲專利申請No.04077624.7描述了使用下述核苷酸序列例如在植物中過表達來實現植物和植物細胞的脅迫耐受性，所述核苷酸編碼參與NAD補救合成途徑和/或NAD從頭合成途徑的酶。然而，這些文件均沒有公開使用其中提到的脅迫耐受性基因在植物細胞和植物中獲得對低氧或無氧條件的耐受性的可能性。它們也沒有公開其中所述脅迫耐受性基因用于下述目的的用途允許植物的根系更深地穿透進入生長培養基或土壤中。除昆蟲控制外，新煙堿類化合物在植物中其他目的的應用也是本領域已知的(WO01/26468，WO03/096811)。WO01/26468公開了改善植物生長的方法，其包括向植物或其所在地應用至少一種選自新煙堿類的化合物。WO03/096811描述了在下述地點的農學植物的產量和/或活力可以通過用新煙堿類化合物處理植物的種子來提高或改進，所述地點中蟲害水平低于所指示的需要使用殺蟲劑用于昆蟲控制目的的水平。所述方法被認為適用于非轉基因植物和具有外源基因的植物，所述外源基因編碼經修飾的蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)8-內毒素蛋白質的產生。然而，這些文件均未描述為了提高植物細胞或植物對低氧或無氧條件的耐受性，或允許植物的根系更深地穿透進入生長培養基或土壤的目的，將新煙堿類化合物用于植物的用途。因此，本領域仍未涉及增加植物根系或根進入生長培養基或土壤的穿透深度，或提高植物細胞或植物對低氧或無氧脅迫條件的耐受性的方法，所述方法如下文在不同的實施方案和權利要求中所述使用脅迫耐受性基因，或通過對植物或其細胞使用新煙堿類化合物。發明概述本發明的一個實施方案提供提高植物細胞或植物對低氧或無氧條件耐受性的新方法，所述方法包括向植物細胞或植物提供脅迫耐受性增強轉基因，其中所述脅迫耐受性增強轉基因選自-能夠降低植物內源PARP基因表達的脅迫耐受性增強轉基因，特別是其中所述轉基因編碼PARP抑制性RNA分子；-能夠降低植物內源PARG基因表達的脅迫耐受性增強轉基因，特別是其中所述轉基因編碼PARG抑制性RNA分子；或-編碼煙酰胺腺噤呤二核苷酸補救合成途徑的植物功能酶的脅迫耐受性增強轉基因，所述酶選自煙酰胺酶、煙酸鹽/酯磷酸核糖基轉移酶(nicotinatephosphoribosyltransferase)、煙酸單核苦酸腺噤呤基轉移酶或煙酰胺腺噤呤二核苷酸合成酶。在另一實施方案中，本發明涉及這類脅迫耐受性增強轉基因促進植物根穿透生長培養基(包括土壤)的用途。本發明的另一實施方案提供用于提高植物細胞或植物對低氧或無氧條件耐受性的方法，其包括向植物細胞、植物，或將長成此類植物的種子或其生境使用有效量的新煙堿類化合物。在另一實施方案中，本發明涉及這類化合物促進植物根穿透生長培養基(包括土壤)的用途。本發明還涉及用于提高植物細胞或植物對低氧或無氧條件耐受性的方法，包括將有效量的6-氯煙酸提供給所述植物的細胞的步驟。本發明還涉及6-CNA用于促進植物根穿透進入生長培養基中的用途。圖1:測量生長于瓊脂溶液中的植物根深的測定法的示意圖。用透明的或半透明的生長培養基(3)填充帶有封口(2)的容器(l)，所述生長培養基為例如0.4%的瓊脂-水或0.7%的瓊脂-水，其中可添加額外的測試化合物。向管中加入一粒預萌發的種子，并允許其生長三周。在垂直位置生長三周后，從培養基頂部到根的最低點測量植物(4)的根深(5)。圖2:擬南芥(Arabidopsisthaliana)cv,Col-0植物根深(mm)的箱狀圖示，所述植物與非轉基因擬南芥植物(Col-O)相比包含轉基因，所述轉基因編碼能夠降低內源PARP2基因表達的dsRNA分子。分析以下種群Col-0:數據指示野生型擬南芥抹系427-16:數據指示對強光脅迫條件具有弱耐受性的包含抗PARP2基因的擬南芥轉基因林系427-20:數據指示對強光脅迫條件具有弱耐受性的包含抗PARP2基因的擬南芥轉基因抹系427-20:數據指示對強光脅迫條件具有中等耐受性的包含抗PARP2基因的擬南芥轉基因抹系該圖左側表示了各組值的代表性箱狀圖(或箱狀圖和須盒圖)，所述值總結了以下的統計學測量-中位數-上四分位和下四分位數-最小和最大數據值。另外，在各組數值的右邊，指示這些數值的均值和均值標準差。箱狀圖解釋如下-箱自身包含中間50%的數據。箱的上緣(接合處)指出數據集的第75百分位數，下接合處指出第25百分位數。中間兩個四分位數的范圍已知為四分位數間距。-箱中的線指示數據的中位值。-須的末端指示最大和最小的數據值，存在異常值(oiitlier)的情況除夕卜，在這種情況下須延伸至在1.5倍四分位數間距的范圍內最近的值點。圖3:擬南芥cv.Col-O植物根深(mm)測量值的箱狀示意圖和均值標準差，所述植物包含轉基因，所述轉基因編碼能夠降低內源PARP基因表達的dsRNA分子。分析以下種群Col-0:數據指示野生型擬南芥林系427-22:數據指示對強光脅迫條件具有高耐受性的包含抗PARP2基因的擬南芥轉基因林系427-24:數據指示對強光脅迫條件具有低耐受性的包含抗PARP2基因的擬南芥轉基因林系圖4:擬南芥cv.C24植物根深(mm)測量值的箱狀示意圖和均值標準差，所述植物包含轉基因，所述轉基因編碼能夠降低內源PARP基因表達的dsRNA分子。分析了以下種群C24:數據指示野生型擬南芥林系1599:數據指示對強光脅迫條件具有高耐受性的包含抗PARP2基因的擬南芥轉基因林系1463:數據指示對強光脅迫條件具有中等耐受性的包含抗PARP2基因的擬南芥轉基因林系1681:數據指示對強光脅迫條件具有中等耐受性的包含抗PARP1基因的擬南芥轉基因林系1690:數據指示對強光脅迫條件具有中等耐受性的包含抗PARP1基因的擬南芥轉基因株系圖5:對待分離抗PARP2轉基因的擬南芥Col-0種群測量的根深(mm)測量值的箱狀示意圖和均值標準差。分析了以下的種群不成對的(Azygous):數據指示來自不含有抗PARP2基因的種群的擬南芥植物*轉基因的數據指示來自含有抗PARP2基因的種群的擬南芥植物圖6:用多種濃度的吡蟲啉處理的擬南芥cv.C24植物與未處理的擬南芥cv.C24植物相比，根深(mm)測量值的箱狀示意圖和均值標準差。分析了以下的種群0:未處理的擬南芥C24植物50:用50毫克/升吡蟲啉處理的擬南芥C24植物100:用100毫克/升吡蟲啉處理的擬南芥C24植物圖7:用多種濃度的6-氯煙酸處理的擬南芥cv.C24植物與未處理的擬南芥cv.C24植物相比，根深(mm)測量值的箱狀示意圖和均值標準差。分析了以下的種群0:未處理的擬南芥C24植物1:用l亳克/升6-氯煙酸處理的擬南芥C24植物5:用5毫克/升6-氯煙酸處理的擬南芥C24植物發明詳述本發明基于以下的認識包含脅迫耐受性基因(例如編碼下述dsRNA的嵌合基因，所述dsRNA目的在于使植物parpl或parp2基因的表達沉默)的植物產生了下述根系，所述根系的根與對照植物的根相比伸入生長培養基中更深。如現有技術所述，包含脅迫耐受性基因的植物根穿透更深的現象仍未被注意，并需要開發如本文所述的具體測定法用于統計學分析根進入培養基的穿透性。盡管不意圖將本發明限制于具體的作用方式，仍認為脅迫耐受性基因提高植物細胞的耐受性(包括根的植物細胞對低氧和無氧條件的耐受性)，從而允許包含這類脅迫耐受性基因的根在較不良好的氧條件下生長，如可在生長培養基的更深區域或更深的土壤層中發現，那里氧張力更低。植物根系進入更深土壤層的提高的穿透性部分地解釋了在野外條件下對含有本文所述脅迫耐受性基因(例如下述dsRNA，所述dsRNA編碼使內源parpl或parp2基因表達沉默的基因)所觀察到的植物提高的干旱抗性。添加新煙堿類化合物或6-氯煙酸后，可在所述測定法中觀察到根伸長的類似效應。新煙堿類的使用對根生長深度的效應與昆蟲的存在無關，所述昆蟲是上述新煙堿類的靶標。因此，該效應也與植物或植物細胞或長成植物的種子的脅迫耐受性(特別是與低氧或無氧相關的脅迫耐受性)的生物化學改良相關。因此，在第一個實施方案中，本發明指向脅迫耐受性增強轉基因提高植物細胞、植物或種子對低氧或無氧條件的耐受性的用途。本文使用的"低氧或無氧條件"是指植物細胞、植物或這類植物的部分所暴露的條件，其中氧的可用性低或非常低。無氧條件是指幾乎不能獲得氧的條件。一般地，溶解氧濃度低于約2亳克/升的條件被稱為低氧(0.1毫克/升到2毫克/升)，溶解氧低于O.l亳克/升，特別是低于0.05毫克/升的條件被稱為無氧。水中正常溶解的氧濃度為約8毫克/升。土壤中的低氧條件是指氧張力低的條件，特別是土壤大氣中氧降至低于5%的條件。低氧條件可發生于植物或植物部分被淹沒時。低氧條件還可發生于氧消耗高時，例如在包含大量微生物代謝過程中的有機碎屑的土壤層中。另外，低氧條件發生于生長培養基的較深層，其中氧從表面發生擴散。低氧條件還發生于土壤較深層，因為氧擴散和導致的氧張力比表面降低。氧減少的速率取決于土壤的緊密度(compactness)(土壤越緊密，存在的土壤大氣越少)、分解中的有機材料的存在、水含量等。本文使用的"脅迫耐受性增強轉基因"是指這樣的轉基因，即當所述轉基因被引入植物細胞或植物中，或在植物細胞或植物中表達時，給細胞或植物提供更好的脅迫耐受性，所述脅迫耐受性例如通過使用化合物(除草劑、殺真菌劑、殺蟲劑、植物生長調節劑、佐劑、肥料)、暴露于非生物脅迫(例如干旱、水澇、淹沒、強光條件、強UV輻射、提高的過氧化氫水平、極端(高或低)溫度、臭氧及其他大氣污染物、土壤鹽度或重金屬、低氧、無氧等等)或生物脅迫(例如病原體或害蟲感染，包括真菌感染、病毒感染、細菌感染、昆蟲感染、線蟲感染、支原體感染和支原體樣生物感染等)而被賦予植物。這類脅迫耐受性增強轉基因可以是如WO00/04173或EP04077984.5(在本文引用作為參考)中所述的，能夠降低植物細胞或植物中多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)基因的表達和/或活性的轉基因。多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)也稱為多聚(ADP-核糖)轉移酶(ADPRT)(EC2.4.2.30)，是發現于多數真核生物中的核酶，所述真核生物包括脊推動物、節肢動物、軟體動物、粘菌類(slimemould)、溝編藻類(dinoflagellates)、真菌和除酵母外的其他低等真核生物。所述酶活性也已在大量植物中得到證明(Payne等人，1976;Willmitzer和Wagner，1982;Chen等人，1994;O'Farrell，1995)PARP主要催化來自NAD+的ADP-核糖部分向靶蛋白中谷氨酸殘基的羧基的轉化，以及隨后的ADP-核糖聚合作用。主要的靶蛋白是PARP自身，但是組蛋白、高遷移率類染色體蛋白質(highmobilitygroupchromosomalprotein)、拓樸異構酶、內切核酸酶和DNA聚合酶也顯示為可受到此l務飾。作為具體的實施方案，脅迫耐受性增強轉基因可包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)被轉錄后得到下述RNA分子的DNA區，所述RNA分子(PARP抑制性RNA分子)能夠降低植物的內源PARP編碼基因的表達；c)參與轉錄終止和多聚腺苷酸化的DNA區。所述DNA區轉錄后可產生所謂的反義RNA分子，所述反義RNA分表達，所述反義RNA分子包含至少20或21個連續的核苷酸，所述連續核苷酸與所述植物細胞或植物中存在的PARP編碼基因核苦酸序列的互補序列具有至少95%到100%的序列同一性。所述DNA區還可產生所謂的有義RNA分子，所述有義RNA分子以轉錄方式或轉錄后方式降低靶植物或靶植物細胞中PARP編碼基因的表達，所述有義RNA分子包含至少20或21個連續的核普酸，所述連續核少95%到100%的序列同一性。然而，約20nt的PARP編碼區的反義或有義RNA區的最小核苷i^f列可以包含在更大的RNA分子中，所述更大RNA分子的大小在20nt到與靶基因尺寸相等的長度間變化。因此，所述反義或有義核苷酸區可以是約21nt到約5000nt長，例如長度為21nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、500nt、1000nt、2000nt或甚至約5000nt或更長。另外，本發明的目的不要求所使用的抑制性PARPRNA分子的核苷酸序列或轉基因的編碼區與內源PARP基因完全相同或互補，所述內源PARP基因的表達被靶向以在植物細胞中降低。序列越長，對整體序列同一性的要求越不嚴格。因此，有義或反義區可以具有與內源PARP基因或其互補序列的核苷^列約40%或50%或60%或70%或80%或卯％或100%的整體序列同一性。然而如前文所述，反義或有義區應當包含20個連續核苷酸的核苷酸序列，其與內源PARP基因的核苷酸序列具有約100%的序列同一性。優選地，約100%序列同一性的一段序列應當是約50、75或100nt。就本發明的目的而言，以百分比表示的兩個相關核苷酸序列的"序列同一性，，是指兩個最佳比對的序列中具有相同殘基的位置數除以所比較的位置數(xl00M)。空位被認為是具有不相同殘基的位置，即一個序列存在殘基而另一個序列中不存在該殘基的比對中的位置。兩個序列的比對通過Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch1970)計算才幾輔助序列比對進行，可使用標準軟件程序如GAP(其為WisconsinPackage10.1版本(GeneticsComputerGroup,Madison,Wisconsin,美國)的一部分)，4吏用默認評分矩陣(空位產生罰分50和空位延伸罰分3)來便利地進行。應當明白一旦參照相應DNA分子的核苷酸序列定義RNA分子的核苷酸序列時，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)應當用尿嘧啶(U)代替。本申請的上下文會明確是參照用RNA還是DNA。上述轉基因降低內源PARP基因表達的效力可以通過包含DNA元件而被進一步增強，所述DNA元件導致異常的、未多聚腺苷酸化的PARP抑制性RNA分子的表達。適用于該目的的一個這類DNA元件為如WO00/01133Al中所述的編碼自我剪接核酶的DNA區。如WO99/53050Al中所述，上述轉基因降低植物細胞內源PARP基因表達的效力還可通過如下方式進一步增強在一個植物細胞中同時包括本文所述編碼反義PARP抑制性RNA分子的轉基因和本文所述編碼有義PARP抑制性RNA分子的轉基因，其中所述反義和有義PARP抑制性RNA分子能夠通過所述至少20個連續核苷酸之間的堿基配對形成雙鏈RNA區。如在WO99/53050Al中所進一步描述的，能夠形成雙鏈RNA區的有義和反義PARP抑制性RNA區可以存在于一個RNA分子中，優選地被間隔區分離。間隔區可包含內含子序列。這類轉基因可如下所述便利地構建將反向重復序列中包含來自分離的或鑒定的內源PARP基因的至少20個核苷酸的DNA片段(其表達被耙向降低)與植物可表達的啟動子和參與轉錄終止和多聚腺苷酸化的3，末端形成區有效地連接。為了實現這類轉基因的構建，可使用WO02/059294Al中描述的載體。現有的命名法將經典的含鋅指的聚合酶稱作PARP1蛋白質(和相應的parpl基因)，而結構上非經典的PARP蛋白質現在被稱為PARP2(和相應的parp2基因)，本文使用的"PARP編碼基因"可指二者中的任一類型。以下的實驗性鑒定證實的和假定的多聚ADP-核糖聚合酶蛋白質序列、其部分或同源序列的數據庫登錄號(在本文引用作為參考)可以根據本發明4吏用BAD53855(稻(Oryzasativa));BAD52929(稻)；XP一477671(稻)；BAC84104(稻)；AAT25850(玉米(Zeamays));AAT25849(玉米)；NP_197639(擬南芥)；NP_850165(擬南芥)；NP—188107(擬南芥)；NP—850586(擬南芥)；BAB09119(擬南芥)；AAD20677(擬南芥)；Q11207(擬南芥)；C84719(擬南芥)；T51353(擬南芥)；T01311(擬南芥)；AAN12901(擬南芥)；AAM13882(擬南芥)；CAB80732(擬南芥)；CAA10482(擬南芥)；AAC79704(玉米)AAC19283(擬南芥)；CAA10888(玉米)；CAA10889(玉米);CAA88288(擬南芥)。作為本發明具體的實施方案，降低PARP基因表達的基因可包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)-f皮轉錄后產生RNA分子的DNA區，所述RNA分子包含a.反義核苷酸序列，其包含至少約20個連續的核苷酸，所述連續的核苷酸與選自以下的約20個連續核苷酸的核苷酸序列具有約96%的序列同一性SEQID1(擬南芥parpl編碼區)、SEQID2(擬南芥parp2編碼區)、SEQID3(玉米parpl編碼區)、SEQID4(另一玉米parpl編碼區)、SEQID5(玉米parp2編碼區)或SEQID6(棉花parp2部分cDNA)的核苷酸序列或編碼蛋白質的核苷酸序列，所述蛋白質具有與所述核苷酸序列編碼的氨基酸序列相似或相同的氨基酸序列。b.有義核苷酸序列，其包含至少約20個與反義核苷酸序列互補的核苷酸。因此，有義核苷酸序列可包含至少約20個連續核苷酸的序列，所述序列與選自以下的約20個連續核苷酸的核苷酸序列具有約96%的序列同一性SEQID1(擬南芥parpl編碼區)、SEQID2(擬南芥parp2編碼區)、SEQID3(玉米parpl編碼區)、SEQID4(另一玉米parpl編碼區)、SEQID5(玉米parp2編碼區)或SEQID6(棉花parp2部分cDNA)的核苷酸序列或編碼蛋白質的核苷酸序列，所述蛋白質具有與所述核苷酸序列編碼的M酸序列相似或相同的M酸序列；其中有義和反義核苷酸序列能夠形成雙鏈RNA分子(dsRNA);c)用于轉錄終止和多聚腺苷酸化的DNA區。然而，應當明白可使用如WO00/04173或EP04077984.5中描述的其他降低PARP基因表達的基因。在本發明的另一實施方案中，脅迫耐受性增強轉基因可以是能夠降低植物或植物細胞的PARG編碼基因表達和/或活性的轉基因，如WO加(M/0卯MO(在本文引用作為參考)中所述。PARG(多聚(ADP-核糖)糖原水解酶；E.C.3.2.1.143)通過其外切糖苷酶和內切糖苷酶活性(PARG)將聚(ADP-核糖)聚合物轉化為游離的ADP-核糖。在植物中，通過基于基因圖鐠對野生型基因的克隆而鑒定了聚(ADP-核糖)糖原水解酶在突變體中失活，所述突變體受到擬南芥中時鐘控制基因轉錄和從植物性生長到開花的光周期依賴性轉換(tej)的影響。該基因的核苷酸序列可以在登錄號AF394690(Panda等人，2002Dev.Cell.3，51-61;SEQIDNo7)下從核苷酸數據庫中獲得。離其他PARG編碼基因及其變體的方法可見于WO2004/090140A2，該核苷絲列例如來自馬鈴薯(Solanumtuberosum)的PARG基因(SEQIDNo8);稻(SEQIDNo9)或玉米(SEQIDNo10)。因此，在一個實施方案中，被改造為抗脅迫的植物或植物細胞可包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)當被轉錄后產生抑制性RNA分子的DNA區，所述RNA分子包含i.反義核苷酸區，其包含至少約20個連續的核苷酸，所述連續的核苷酸與選自以下的約20個連續核苷酸的核苷酸序列具有至少96%的序列同一性編碼植物PARG蛋白的核苷酸序列(例如SEQID7、SEQID8、SEQID9或SEQID10的核苷酸序列)的互補序列，或編碼蛋白質的核苷酸序列，所述蛋白質具有與所述核苷酸序列相似或相同的M酸序列；或ii.有義核苷酸區，其包含至少約20個選自以下的連續核苷酸編碼植物PARG蛋白質的核苷財列(例如SEQID7、SEQID8、SEQID9或SEQID10的核苷酸序列)，或編碼蛋白質的核普酸序列，所述蛋白質具有與所述核苷^列相似或相同的M酸序列；或iii.如i)或ii)所述的反義和有義核苷酸序列，其中所述反義和有義核苷酸序列能夠形成雙鏈RNA分子；c)參與轉錄終止和聚腺苷酸化的DNA區。本領域技術人員將立刻可以明白，有義和反義核苷酸序列或dsRNA分子的長度，以及ParG抑制性RNA分子的序列同一性的其他參數可如上所述用于PARP抑制性RNA分子。本發明的另一實施方案中，脅迫耐受性增強轉基因可以是編碼煙酰胺腺噤呤二核苷酸補救合成途徑的植物功能酶的轉基因。因此，脅迫耐受性增強基因可包含以下如EP04077624.7中所述(在本文引用作為參考)的有效連接的DNA分子a)植物可表達的啟動子；b)編碼煙酰胺腺噤呤二核苷酸補救合成途徑的植物功能酶的DNA區，所述酶選自煙酰胺酶、煙酸鹽/酯磷酸核糖基轉移酶、煙酸單核苷酸腺噤呤基轉移酶或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶；和c)參與轉錄終止和聚腺苷酸化的3，末端區。本文使用的"煙酰胺腺噪呤二核苷酸補救合成途徑的植物功能酶"是這樣的酶，即當將其引入植物中、與合適的調控元件(例如植物可表達的啟動子和終止子區)連接后能夠在植物細胞中被轉錄并翻譯而產生有功能的NAD補救合成途徑的酶。該酶包括得自植物來源的來自NAD補救合成的酶(和編碼基因)，以及得自酵母(釀酒酵母(Saccharomycescereviseae))或得自其他酵母或真菌的酶。認為后面的蛋白質甚至可更適用于本發明的方法，因為它們較不可能受到酶反饋調節等，而類似的來自植物的酶可受到所述調節。參與NAD補救合成途徑的酶包括以下-煙酰胺酶(EC3.5.1.19),其催化煙酰胺的酰胺基水解，從而釋放煙酸才艮和NH3。該酶也已知為煙酰胺脫氨酶、煙酰胺酰胺酶、YNDase或煙酰胺酰胺水解酶；國煙酸鹽/酯磷酸核糖基轉移酶(EC2.4.2.11)，其也已知為煙酸核糖核苷酸酶、煙酸單核苷酸糖原水解酶；煙酸單核苷酸焦磷酸化酶；煙酸砩酸核糖基轉移酶；其催化以下反應煙酸鹽/酯-D-核糖核苷酸+二磷酸鹽=煙酸鹽/酯+5-磷酸-a-D核糖1-二磷酸鹽誦煙酸核苷酸腺苷酰基轉移酶(EC2.7.7.18)也已知為去酰胺-NAD+焦磷酸化酶；煙酸單核苷酸腺苷酰基轉移酶；去酰胺煙酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷酸化酶；NaMT-ATase;煙酸單核苷酸腺苷酰基轉移酶；其催化以下反ATP+煙酸核糖核苷酸-二磷酸鹽+去酰胺基-入0+國NAD-合酶(EC6.3.1.5),也已知為NAD合成酶；NAD+合酶；煙酰胺腺噤呤二核苷酸合成酶；二砩酸吡咬核苷酸合成酶；其催化以下反應去酰胺基-NAD++ATP+NH3=AMP+二磷酸鹽+NAD+在本發明的一個實施方案中，編碼NAD補救合成途徑的植物功能酶的DNA區可包含來自SEQIDNoll、12、13、14或15的核香酸序列或編碼下述蛋白質的核苷酸序列，所述蛋白質具有與上述核苷酸序列所編碼的蛋白質相似或相同的M酸序列。如Hunt等，2004所述，這些酶的植物同源物已被鑒定，且這些DNA序列可被用于相似的效應(Hunt等人，2004，NewPhytologistl63(l):31-44)。經鑒定的DNA序列具有以下的登錄號煙酰胺酶為At5g23220(SEQIDNo16);At5g23230(SEQIDNo17)和At3gl6190(SEQIDNo18);煙酸鹽/酉旨砩酸核糖基轉移酶為At4g36940(SEQIDNo19)、At2g23420(SEQIDNo20)，煙酸單核苷酸腺嘌呤基轉移酶為At5g55810(SEQIDNo21)，NAD合成酶為Atlg550卯(SEQIDNo22)。然而，應當明白被改造為抗脅迫的植物也可包含這些核苷酸序列的變體，其包括插入、缺失和取代。同樣的，可使用來自除釀酒酵母以外物種的所述核苷酸序列的同源物。這些包括但不僅限于來自植物的核苷酸序列，和編碼具有相同M酸序列的蛋白質的核苷酸序列，以及這類核苷酸序列的變體。所述核苷酸序列的變體與經鑒定的核苷酸序列(其編碼來自NAD補救補救途徑的酶，例如序列表中鑒別的序歹ij)應具有優選至少約80%,或85%或卯％或95%的序列同一性。優選這些變體將編碼功能性蛋白質，其具有與來自NAD補救途徑的酶相同的酶活性。閱讀上文對脅迫耐受性增強轉基因提高植物細胞、植物或種子對低氧或無氧條件耐受性的本發明用途的描述后，本領域技術人員會立刻明白可使用對應這類脅迫耐受性增強轉基因的內源基因的變體獲得相似的效應，所述變體使得帶有這類變體的植物細胞或植物有更高的脅迫耐受性。舉例而言，植物內源parp2基因的變體(其具有更低的表達水平，并給具有該變體的植物提供提高的脅迫耐受性)可以以與降低內源parp2基因表達的轉基因相似的方式使用。這類變體基因可通過育種技術被引入植物細胞或植物。本領域技術人員也會明白不同脅迫耐受性增強基因或轉基因的表達可可1起一群不同的事件，這顯示不同的效應分布——從幾乎沒有效應到非常顯著的效應。然而，本領域技術人員顯然能夠區分、鑒別或分離最適應需要的群體代表。另一實施方案本發明提供用于促進植物根穿透進入生長培養基或土壤的方法，其包括對植物提供脅迫耐受性增強轉基因或這些脅迫耐受性增強轉基因的內源變體，如本文在其不同的實施方案中所述的那些。本文使用的"植物根伸長，，或"植物根穿透進入生長培養基或土壤，，是指從生長培養基表面到根的最低點所測量的根在固體生長培養基(包括土壤)中生長的深度(也參見圖1)。通常，"植物根伸長或穿透的提高"是指從培養基表面到根生長的最低點所測量的生長培養基中根生長深度的至少統計學顯著的提高，其也可測量為野生型參照植物根深與被改造為脅迫耐受的植物根深的比較中的差異，或測量為用特別的化合物處理的植物根深與未處理植物根深的比較中的差異。為了正確理解本發明，明白以下內容是重要的通過本發明方法達到的植物根系更深地穿透進入生長培養基或土壤中不等于根系在體積或干重或鮮重上的提高。事實上，根系的體積可被顯著提高，但是根全部處在生長培養基或土壤表面下非常淺表處。相反，根據本發明處理的植物根在尺寸、體積、重量或甚至長度上可以是相等的，但是更深地伸入生長培養基或土壤的表面下。本文使用的"生長培養基"旨在涉及適用于植物生長的任何培養基，包括土壤。這類培養基包括固化的或凝膠化的液體，例如水-瓊脂、泥炭(peat)、草炭(turf)、不同類型的土壤等。在另一實施方案中，本發明指向新煙堿類化合物提高植物細胞、植物或種子對低氧或無氧條件耐受性的用途。因此，本發明提供用來提高植物細胞、植物或種子對低氧或無氧條件耐受性的方法，其包括對植物細胞、植物、種子或植物的生境或對生長培養基使用有效量的式(I)的新煙堿類化合物的步驟。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>(I)其中Het表示雜環，所述雜環在各情況下任選被氟、氯、甲基或乙基單取代或多取代，所述雜環選自下組雜環吡咬-3-基、吡啶-5-基、3-吡啶基(pyridinio)、l-氧化-5-吡咬基(l隱oxido-5-pyridinio)、1-IU匕-5-p比1^、四氫p夫喃國3畫基、塞喳畫5-基，A表示d-O烷基、-N(R"(R2)或S(R2)，其中W表示氫、cvcv烷基、苯基-d-cv烷基、cvcv環烷基、cvcv鏈烯基或C2-cv炔基，且R2表示d-O烷基、C2-CV鏈烯基、CrCV炔基、-<:(=0)-013或爺基，R表示氫、d-cv烷基、C2-cv鏈烯基、cvcv炔基、-<:(=0)-<:113或節基，或與W—起表示以下基團-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-0-CH2-、-CH2-S-CH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-N(CH3)-CH2-，且X表示關02、N-CN或CH-跳。在每種情況下，只要可能，飽和的或不飽和的烴基(例如烷基或鏈烯基)可以是直鏈的或支鏈的，其包括與雜原子組合例如烷氡基。這些化合物已知具有殺昆蟲的活性(參閱例如EP-A1-192606、EP-A2畫580533、EP畫A2畫376279、EP陽A2-235725)。可以被提到的式(I)的化合物為"ThePesticideManual",第13版，2003(BritishCropProtectionCouncil)中所列的新煙堿類。一種化合物為例如從EPA10192060已知的式的p比蟲淋。另一種化合物為例如從EPA20302389已知的式的烯啶蟲胺。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>另一種化合物為從例如WOA191/04965已知的式I"^Y"Yy'、^CH3Cl""、N,的咬蟲昧。另一種化合物為例如從EPA20235725已知的式N=s/Y、CN的蓉蟲淋。另一種化合物是例如從EPA20580553已知的式〃o,s,飛T丫、、02的蓉蟲P秦。另一種化合物是例如從EPA20376279已知的式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>、。2的可尼丁。另一種化合物是例如從EPA10649845已知的式M、叫的呋蟲胺。特別適用于本發明的是式(2)的化合物，其中取代基"Het"表示氯吡啶基，例如吡蟲啉、烯咬蟲胺、咬蟲脒和瘞蟲啉al//(2)。特別優選的化合物是吡蟲啉和蓬蟲啉。在上述帶有6-氯煙酸基團的新煙堿類(例如吡蟲啉、烯啶蟲胺和噻蟲啉)的降解中，6-氯煙酸可被釋放。例如，吡蟲啉被逐步降解為初級代謝產物6-氯煙酸，其最后降解為二氧化碳。發現該代謝物也促進植物或植物細胞或長成此類植物的種子的脅迫耐受性和健康，所述植物或植物細胞或長成此類植物的種子被改造為耐脅迫，并也可根據本發明的方法使用。確定上述新煙堿類在植物中或特定植物中降解時是否釋放6-CNA的一種方法由Placke和Weber描述(Pflanzenschutz-NachrichtenBayer46/1993,2109-182)。因此，在本發明的另一實施方案中，描述了可用于提高植物細胞或植物或其部分對低氧或無氧條件耐受性的方法，所述方法包括步驟對所述植物，對植物細胞或對長成所述植物的種子提供有效量的式(3)的6-氯煙酸(煙酸，CASNO:5326-23-8)。可通過向植物細胞、植物、種子和/或其生境直接應用式(3)的化合物來向植物細胞、植物或種子提供有效量的6-氯煙酸。然而，也可通過提供化合物(例如上述化合物)向植物提供6-CNA,所述化合物可被植物代謝產生代謝物6-CNA。應當立刻明白上述化合物也可被用于提高植物根穿透進入生長培養基或土壤中，其包括步驟向植物細胞、植物或種子或向植物的生境或向生長培養基提供有效量的式(I)的新煙堿類化合物(例如包含氯吡啶側鏈的式(I)的新煙堿類化合物，特別是能夠在植物中被代謝產生6-can，包含氯吡咬側鏈的式(I)的新煙堿類化合物，包括吡蟲啉或瘞蟲啉)，或向植物細胞、植物或種子或向植物的生境或向生長培養基提供6-CNA。本發明的優點之一在于本發明化合物和包含所述化合物的組合物的全身性特性，即用這些組合物處理植物的種子就足夠促進萌發中的植物和萌發后產生的植物的根伸長。在本發明的另一實施方案中，描述了適用于促進植物根伸長的方法，其包括向所述植物和/或其生境、向植物細胞或長成所述植物的種子應用有效量的組合物，所述組合物包含式(I)的化合物。因此，本發明還涉及組合物，所述組合物包含用于本發明的這類組合物用途的式(I)化合物。式(I)的化合物也可用于與其他活性化合物(例如商業有用制劑形式的或從這類制劑制備的應用形式的殺蟲劑、殺細菌劑、殺螨劑、殺真菌劑等)的混合物中。可進行混合以獲得下述組合物，所述組合物除了根據本發明促進植物根伸長外，也抗可能存在的害蟲。可以使用的殺蟲劑為例如有機磷劑、氨基甲酸酯劑、羧化物類化學品、氯化烴類化學品、通過微生物產生的殺蟲物質等。在許多情況下，這引起協同效應，即混合物的活性超出單個成分的活性。這類制劑和應用形式在商業和生態學上是特別有用的，因為通常可以使用更低量的活性成分。但是，增效劑本身不必須有活性，只要其能夠增強活性化合物的作用即可。與其他已知活性化合物(例如除草劑)或與安全劑、肥料和生長調節劑的混合物也是可能的。通過常規處理方法允許化合物對其周邊、環境或儲存空間起作用，所述常規處理方法例如通過浸入、噴霧、蒸發、霧化、分散、涂抹，和在繁殖材料的情況下(特別是在種子的情況下)還通過應用一層或多層涂層。活性化合物可以被轉化為常規制劑，例如溶液劑、乳劑、可濕性散劑、混懸劑、粉劑、粉塵、糊劑、可溶性散劑、顆粒劑、懸浮液-乳劑濃縮物、浸漬過活性化合物的天然和合成材料，以及聚合物物質中的孩t膠嚢。本發明活性化合物在商業有用制劑或應用形式中的含量可在寬泛的范圍內變化。從商業制劑制備的使用形式的活性化合物含量可在寬泛的限定內變化。這些制劑以已知的方式提供，例如通過將活性化合物與補充劑(即液體溶劑和/或固體載體)混合，任選地使用表面活性劑(即乳化劑和/或分散劑)和成泡劑。如果使用的補充劑為水，也可能使用例如有機溶劑作為助溶劑。本質上，合適的液體溶劑為芳香劑(如二甲苯、甲苯或烷基萘)，氯化的芳香劑或氯化的脂肪烴如氯苯、氯乙烯或二氯甲烷；脂肪烴如環己烷或石蠟，例如石油級分、礦物質和植物油；醇如丁醇或二醇及其醚和酯；酮如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮或環己酮；強極性溶劑如二甲基甲酰胺和二甲基亞砜，以及7jC。合適的固體載體為例如銨鹽和地面天然礦物質如高嶺土、粘土、滑石、白堊、石英、石絨、蒙脫土或硅藻土，以及地面合成礦物質如高度分散的二氧化硅、氧化鋁和硅酸鹽；用于顆粒的合適固體載體為例如被壓碎并分級的天然石頭如方解石、大理石、浮石、海泡石和白云石，還有無機和有機粉的合成顆粒，以及有機材料(如鋸屑、椰殼、玉米棒子和煙草莖)的顆粒；合適的乳化劑和/或成泡劑為例如非離子的和陰離子的乳化劑如聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚例如烷基芳基聚乙二醇醚、烷基磺酸鹽、烷基J克酸酯、芳基磺酸酯，還有蛋白質水解產物；合適的^:劑為例如亞硫酸化木素廢液和甲基纖維素。制劑中可以使用增粘劑，如羧甲基纖維素和粉末、顆粒或乳液狀的天然和合成的聚合物(如阿拉伯樹膠、聚乙烯醇和聚乙酸乙烯酯)以及天然砩月旨(如腦磷脂和卵磷脂)和合成的磷脂。其他添加物可以是礦物質和植物油。可能使用著色劑如無機色素(例如氧化鐵、二氧化鈦和普魯士藍)和有機染料(如茜素染料、偶氮染料和金屬酞菁染料)，和微量營養(如鐵、錳、硼、銅、鈷、鉬和鋅的鹽)。制劑通常包含0.1wt。/。和98wt。/。之間的活性化合物，優選在0.1wt%和90wt%之間，特別優選在0.5wt%和70wt%之間的活性化合物。在某些應用率下，新煙堿類化合物和6-CNA對根生長深度的影響特別強烈顯著。然而，活性化合物的應用率可在相對寬泛的范圍內變化。通常應用率為每7>項1g到1600g活性化合物，優選每公項10g到800g活性化合物，特別優選每公項10g到600g活性化合物。如前文所述，本發明涉及適用于促進植物根伸長進入生長培養基中或提高對低氧條件耐受性的方法，所述方法包括對植物繁殖材料(包括長成植物的種子)使用有效量的包含式(I)化合物的組合物。可在種植前處理植物的繁殖材料，例如可在播種前處理(dress)種子。本發明的化合物也可通過下述方式使用于種子粒上:用液體制劑浸漬種子粒或用固體制劑包被種子粒。當繁殖材料#皮種植時，例如在播種時，也可將組合物應用于種植部位。就處理植物繁殖材料(如種子)而言，偏好的應用率通常為每100kg待處理材料用0.1到1000g，特別是1到800g，優選10到500g的新煙堿類化合物之一或6-CNA。所有的植物和植物部分可根據本發明被處理。植物部分應當被理解為所有地上和地下部分，和植物器官(如枝、葉、花和根)，可以提到的實例為葉、針葉、柄、莖、花、子實體、果實、種子、根、塊莖和根莖。植物部分也包括收獲的材料和營養繁殖材料和有性繁殖材料，例如插條、塊莖、根莖、短匍莖和種子。它們還包括植物細胞，例如可用于或得自根據本發明對植物細胞的轉化。也可能將上述化合物應用于土壤上或土壤中，例如在種植或播種前應用以達到所述效應，例如增強種植后的植物和萌發的植物的脅迫耐受性，所述萌發的植物是從被播種進經處理土壤中的種子生長而來。也應立即明白本發明的方法(包括使用脅迫耐受性增強轉基因或脅迫耐受性增強內源變體)可以與本發明的方法(包括使用新煙堿類化合物或6-CNA)組合，在提高對低氧或無氧條件耐受性的方面，或在提高生長培養基或土壤中植物根深的方面產生額外的和協同的效應。本發明的方法可適合于任何植物——雙子葉和單子葉植物，包括但不限于棉花、蕓苔屬(Brassica)植物、歐洲油菜、小麥、谷物或玉米、大麥、向曰葵、稻、燕麥、甘蔗、大豆、蔬菜(包括菊苣、萵苣、番茄)、煙草、馬鈴薯、甜菜、木瓜、菠蘿、芒果、擬南芥，但是也包括用于園藝、花卉或林業的植物，谷物植物包括小麥、燕麥、大麥、黑麥、稻、草碎草、高粱、粟或甘蔗植物。本發明的方法也可用于任何植物，包括但不僅限于棉花、煙草、油菜、歐洲油菜、大豆、蔬菜、馬鈴薯、浮萍屬物種(Lemnaspp.)、煙草屬物種(Nicotianaspp.)、甘薯、擬南芥、苜蓿、大麥、豆類、谷物、棉花、亞麻、豌豆、油菜、稻、黑麥、紅花、高粱、大豆、向曰葵、煙草、小麥、天門冬屬、甜菜、花莖甘藍、巻心菜、胡蘿卜、花椰菜、芽菜、黃瓜、茄子、萵苣、洋蔥、歐洲油菜、胡椒、馬鈴薯、西葫蘆、蘿卜屬、菠菜屬、南瓜、番茄、美洲南瓜(zucchini)、扁桃、蘋果、杏屬、香蕉、黑莓、越桔屬、可可樹、櫻桃、椰子、大果越桔、海棗、葡萄屬、葡萄柚、番石榴屬、獼猴桃樹、檸檬、來檬、芒果、瓜(melon)、油桃、橙、番木瓜屬、西番蓮果、桃、花生、梨、菠蘿、阿月渾子(pistachio)、李子(plum)、覆盆子(raspberry)、草莓、柑橘、胡桃和西瓜。將本文使用的"包含"解釋為說明所述被涉及的特征、整體、步驟或成分的存在，但是不排除存在或添加一種或多種特征、整體、步驟或成分或其集合。因此，例如包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白質可包含除事實上引用的核苷酸或氨基酸之外的更多核苷酸或氨基酸，即位于更大的核酸或蛋白質中。包含功能或結構上定義的DNA區的轉基因可包含額外的DNA區等。除非在實施例中另有說明，所有的重組DNA技術根據如Sambrook等人(1989)MolecularCloning:ALaboratoryMa腿l，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY和Ausubel等人(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols,美國的第1巻和第2巻中所述的標準方案完成。用于植物分子操作的標準材料和方法由R.D.D.Croy描述于PlantMolecularBiologyLabfax(1993)，其由BIOSScientificPublicationsLtd(英國)和BlackwellScientificPublications,英國聯合出版。用于標準分子生物學技術的其他參考資料包括Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual，第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY,Brown(1998)MolecularBiologyLabFax,第二版，AcademicPress(英國)的第I巻和第II巻。用于聚合酶鏈式反應的標準材料和方法可見于Dieffenbach和Dveksler(1995)PCRPrimer:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress和McPherson等人(200t))PCR-Basics:FromBackgroundtoBench，第一版，SpringerVerlag，德國。在說明書和實施例全文中參考以下序列SEQIDNo.1SEQIDNo.2SEQIDNo.3SEQIDNo.4SEQIDNo.5SEQIDNo.6來自擬南芥的parpl編碼區來自擬南芥的parp2編碼區來自玉米的parpl編碼區1來自玉米的parpl編碼區2來自玉米的parp2編碼區來自棉花的parp2部分編碼區SEQIDNo.7:來自擬南芥的parG編碼區SEQIDNo.8:來自馬鈴薯(Solanumtuberosum)的parG編碼區SEQIDNo.9:來自稻的parG編碼區SEQIDNo.10:來自玉米的parG編碼區SEQIDNo.11:來自釀酒酵母的煙酰胺酶(PNCl)的核苦酸序列SEQIDNo.12:來自釀酒酵母的煙酸鹽/酯磷酸核糖基轉移酶(NPTl)的核苷酸序列(互補序列)SEQIDNo.13:來自釀酒酵母的煙酸單核苷酸腺噤呤基轉移酶l(NMAl)的核苷酸序列SEQIDNo.14:來自釀酒酵母的煙酸單核普酸腺嘌呤基轉移酶2(NMA2)的核苷酸序列SEQIDNo.15:來自釀酒酵母的NAD合成酶(QNSl)的核苷酸序列SEQIDNo.I6:來自擬南芥的煙酰胺酶的核苷酸序列(同種型1)SEQIDNo.17:來自擬南芥的煙酰胺酶的核苦餅歹'j(同種型2)SEQIDNo.18:來自擬南芥的煙酰胺酶的核苷^列(同種型3)SEQIDNo.19:來自擬南芥的煙酸鹽/酯磷酸核糖基轉移酶的核苷酸序列(同種型1)SEQIDNo.20:來自擬南芥的煙酸鹽/酯磷酸核糖基轉移酶的核苷酸序列(同種型2)SEQIDNo.21:來自擬南芥的煙酸單核苷酸腺嘌呤基轉移酶的核苷酸序列SEQIDNo.22:來自擬南芥的NAD合成酶的核苷酸序列實施例實施例l:用于測量生長培養基中擬南芥根生長深度的方案培養基萌發培養基一半濃度的Murashige和Skoog鹽；維生素B5;1.5%蔗糖；pH5.8;0.4。/。Difco瓊脂。擬南芥植物擬南芥種子滅菌70%乙醇2分鐘；漂白劑(6%活性氯)+1滴Tween20配成20ml溶液10分鐘；用無菌自來水洗滌5次；在2ml」微量離心管中進行滅菌。擬南芥種子沉到管底，允許借助于lml自動移液器去除液體。種子預萌發在含有10ml無菌自來水的9厘米Optaux培養皿(Falcon)中弱光過夜至24小時。擬南芥植物生長:將種子播種于含士34ml萌發培養基的具有天然(透明)有色蓋子(SigmaC5791)的25x150毫米玻璃管(SigmaC5916)中1個種子/管。將管置于40管的試管架(VWRnalg5970-0025)外面兩行中，用鋁箔包好使得根能夠在黑暗中生長。植物在23。C培養。30-50nEinsteins4nT2。12小時光照-12小時黑暗。(見圖1)。測量才艮深三周后，從培養基表面到根生長的最深點測量根深。(見圖1)。實施例2:包含了增強脅迫耐受性的轉基因的擬南芥植物根生長深度的分析如實施例1中所述培養包含如WO00/04173Al中所述(例如在其實施例8中)的轉基因的擬南芥植物，所述轉基因編碼dsRNA分子，所述dsRNA分子能夠降低內源PARP1或PARP2基因的表達。三周后，測量轉基因植物的根深并與以相似方式培養的非轉基因對照植物或非轉基因同基因植物的根深比較。在第一個實驗中，將包含轉基因的擬南芥cv.Col-0植物的多種種群與非轉基因擬南芥cv.Col-0植物的非轉基因種群比較，所述轉基因編碼dsRNA分子，所述dsRNA分子能夠降低內源PARP2基因的表達(林系427-16和427-20顯示對強光脅迫的弱耐受性，林系427-19顯示對強光脅迫的中等耐受性)。對測量結果進行統計學分析，概括在表1中，表l也表示了均值、標準偏差和置信區間。與非轉基因擬南芥cv.CoM)對照植物相比，對強光脅迫條件具有最高耐受性的轉基因擬南芥植物(林系427-19)的根統計學顯著地伸入生長培養基中更深(99%置信水平)(見圖2和表1)。表l:與非轉基因擬南芥cv.Col-O植物比較，包含轉基因的擬南芥cv.Col-O植物的根深(mm)，所述轉基因編碼dsRNA分子，所述dsRNA分子能夠降低內源PARP2基因的表達<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>*p<0.01在另一實施方案中，將包含轉基因并對強光脅迫有耐受性的轉基因擬南芥cv.Col-0植物的種群(林系427-22)與含有相似的轉基因但是對強光脅迫敏感的轉基因林系(抹系427-24)，以及非轉基因擬南芥cv.Col-0對照植物比較，其中所述轉基因編碼dsRNA分子，所述dsRNA分子能夠降低內源PARP2基因的表達。對測量結果進行統計學分析，總結在表2中，表2也表示了均值、標準偏差和置信區間。與擬南芥cv.Col-0對照植物的根和脅迫敏感的轉基因擬南芥Col-0植物林系(林系427-24)的根相比，脅迫耐受的轉基因林系(抹系427-22)的轉基因擬南芥cv.Col-0植物的根伸入生長培養基(包含0.7%(代替0.4%)的Difco瓊脂而)中更深(見圖3和表2)。表2:與非轉基因擬南芥cv.Col-O植物比較，包含轉基因的擬南芥cv.Col-O植物的根深(mm)，所述轉基因編碼dsRNA分子，所述dsRNA分子能夠降低內源PARP2基因的表達Col國0427-22427-24均值18.29133921.14615417.384058標準偏差2.9286775.3689812.740149標準誤差0.2598780.665940.32987595%置信0.5145581.331880.6597599%置信0.6801011.771401*0.877468*p<0.01在另一實施方案中，分析以下種群C24:野生型擬南芥林系；林系1599:包含抗-PARP2轉基因的對強光脅迫條件具有高耐受性的擬南芥轉基因林系；抹系1463:包含抗-PARP2轉基因的對強光脅迫條件具有中等耐受性的擬南芥轉基因林系；林系1681:包含抗-PARPl基因的對強光脅迫條件具有中等耐受性的擬南芥轉基因抹系；和抹系1690:包含抗-PARPl基因的對強光脅迫條件具有中等耐受性的擬南芥轉基因林系。林系1599的脅迫耐受性非常高，林系1463、1681和1690的脅迫耐受性從中等到高等變化。將測量結果進行統計學分析，并總結于表3中，表3表示均值、標準偏差和置信區間。與非轉基因擬南芥cv.C24對照植物相比，包含轉基因的轉基因擬南芥cv.C24植物的根伸入生長培養基中更深，其中所述轉基因編碼dsRNA分子，所述dsRNA分子能夠降低內源PARP1基因(林系1681和1690)或PARP2基因(林系1599和1463)的表達(見圖4和表3)。表3:與非轉基因擬南芥cv.C24植物相比，包含轉基因的擬南芥cv.C24植物的根深(mm)，所述轉基因編碼dsRNA分子，所述dsRNA分子能夠降低內源PARP1或PARP2基因的表達<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>*p<0.01在另一實施方案中，分析包含轉基因并對強光脅迫具有高度耐受性的轉基因擬南芥cv.Col-0林系的1:1分離群體，其中所述轉基因編碼dsRNA分子，所述dsRNA分子能夠降低內源PARP2基因的表達。轉基因的存在通過PCR分析證實。與來自林系427-19的不成對的擬南芥cv.Col-0植物相比，包含轉基因的植物具有伸入生長培養基中更深的根(見圖5和表4)。表4:與不成對的擬南芥cv.Col-O植物相比，包含轉基因的擬南芥cv.Col-O植物的根深(mm)，所述轉基因編碼dsRNA分子，所述dsRNA分子能夠降低內源PARP2基因的表達<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>實施例3:應用吡蟲啉后擬南芥植物根生長深度的分析如實施例1所述將擬南芥cv.C24植物在包含多種濃度吡蟲啉(O、50和100毫克/升)的萌發培養基(含0.7%(代替0.4%)的Difco瓊脂)上培養。三周后測量用50和100毫克/升吡蟲啉處理的植物根的深度，并與以相同方式培養的未處理植物的根的深度比較。與未處理的擬南芥植物的根相比，經處理擬南芥植物的根伸入生長培養基中更深(見圖6和表5)。表5:與未用吡蟲啉處理的擬南芥cv.C24植物相比，用50和100毫克/升吡蟲啉處理的擬南芥cv.C24植物的根深(mm)_<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>*p<0.01實施例4:應用6-氯煙酸(6-CNA〗后擬南芥植物根生長深度的分析如實施例1所述將擬南芥cv.C24植物在包含多種濃度6-CNA(0、1和5亳克/升)的萌發培養基上培養。三周后測量用1和5亳克/升6-CNA處理的植物根的深度，并與以相同方式培養的未用6-CNA處理的植物的根的深度比較。與未處理的擬南芥植物的根相比，經處理植物的根伸入生長培養基中更深(見圖7和表6)。表6:與未用6-CNA處理的擬南芥cv.Col-O植物相比，用l和5毫克/升6-CNA處理的擬南芥cv.C24植物的根深(mm)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>權利要求1.用于提高植物細胞或植物對低氧或無氧條件耐受性的方法，其包括步驟a)對所述植物細胞或所述植物的細胞提供脅迫耐受性增強轉基因；其中所述脅迫耐受性增強轉基因選自i.能夠降低植物內源PARP基因表達的脅迫耐受性增強轉基因，特別是其中所述轉基因編碼PARP抑制性RNA分子；ii.能夠降低植物內源PARG基因表達的脅迫耐受性增強轉基因，特別是其中所述轉基因編碼PARG抑制性RNA分子；或iii.編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸補救合成途徑的植物功能酶的脅迫耐受性增強轉基因，所述酶選自煙酰胺酶、煙酸鹽/酯磷酸核糖基轉移酶、煙酸單核苷酸腺嘌呤基轉移酶或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶。2.用于促進植物根穿透進入生長培養基的方法，其包括步驟a)對所述植物細胞或所述植物的細胞提供脅迫耐受性增強轉基因；其中所述脅迫耐受性增強轉基因選自i.能夠降低植物內源PARP基因表達的脅迫耐受性增強轉基因，特別是其中所述轉基因編碼PARP抑制性RNA分子；ii.能夠降低植物內源PARG基因表達的脅迫耐受性增強轉基因，特別是其中所述轉基因編碼PARG抑制性RNA分子；或iii.編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸補救合成途徑的植物功能酶的脅迫耐受性增強轉基因，所述酶選自煙酰胺酶、煙酸鹽/酯磷酸核糖基轉移酶、煙酸單核苷酸腺噤呤基轉移酶或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶。3.根據權利要求1或2的方法，其中所述脅迫耐受性增強基因編碼PARP抑制性RNA分子。4.根據權利要求3的方法，其中所述轉基因包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)編碼PARP抑制性RNA分子的DNA區，其包含選自SEQIDNo1的核苷,列、SEQIDNo2的核苷餅列、SEQIDNo3的核苷絲歹寸、SEQIDNo4的核苷酸序列、SEQIDNo5的核苷酸序列或SEQIDNo6的核苷酸序列的20個連續核苷酸中的至少19個；和c)轉錄終止和多聚腺苷酸化DNA區。5.根據權利要求3的方法，其中所述轉基因包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)編碼PARP抑制性RNA分子的DNA區，其包含選自SEQIDNo1的核苷酸序列、SEQIDNo2的核苷酸序列、SEQIDNo3的核苷酸序列、SEQIDNo4的核苷酸序列、SEQIDNo5的核苷酸序列或SEQIDNo6的核苷酸序列的互補序列的20個連續核苷酸中的至少19個；和c)轉錄終止和多聚腺苷酸化DNA區。6.根據權利要求3的方法，其中所述轉基因包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)編碼PARP抑制性RNA分子的DNA區，所述RNA分子包含i.有義核苷酸序列，其包含選自SEQIDNol的核苦酸序列、SEQIDNo2的核苷酸序列、SEQIDNo3的核普酸序列、SEQIDNo4的核苷酸序列、SEQIDNo5的核苷酸序列或SEQIDNo6的核香酸序列的20個連續核苷酸中的至少19個；和ii.反義核苷酸序列，其包含與所述有義核苷酸序列中所述至少20個連續核苷酸互補的核苷酸序列，其中所述有義和反義核苷酸序列能夠形成雙鏈RNA區；以及c)轉錄終止和多聚腺苷酸化DNA區。7.根據權利要求6的方法，其中所述反義核苷酸序列與所述有義核香酸序列具有約95%的序列同一性或完全相同。8.根據權利要求1或權利要求2的方法，其中所述轉基因編碼ParG抑制性RNA分子。9.根據權利要求8的方法，其中所述轉基因包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)編碼PARG抑制性RNA分子的DNA區，其包含選自SEQIDNo7的核苷酸序列、SEQIDNo8的核苷酸序列、SEQIDNo9的核苷酸序列或SEQIDNolO的核苷酸序列的20個連續核苷酸中的至少19個；和c)轉錄終止和多聚腺苷酸化DNA區。10.根據權利要求8的方法，其中所述轉基因包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)編碼PARG抑制性RNA分子的DNA區，其包含選自SEQIDNo7的核苷酸序列、SEQIDNo8的核苷酸序列、SEQIDNo9的核苷酸序列或SEQIDNo10的核苷酸序列的互補序列的20個連續核苦酸中的至少19個；和c)轉錄終止和多聚腺苷酸化DNA區。11.根據權利要求8的方法，其中所述轉基因包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)編碼PARG抑制性RNA分子的DNA區，所述RNA分子包含i.有義核苷酸序列，其包含選自SEQIDNo7的核苷酸序列、SEQIDNo8的核苷酸序列、SEQIDNo9的核香酸序列或SEQIDNo10的核苷酸序列的20個連續核苷酸中的至少19個；和ii.反義核苷酸序列，其包含與所述有義核苷酸序列中所述至少20個連續核苷酸互補的核香酸序列，其中所述有義和反義核香酸序列能夠形成雙鏈RNA區；和c)轉錄終止和多聚腺苷酸化DNA區。12.根據權利要求ll的方法，其中所述反義核苷酸序列與所述有義核苷酸序列具有約95%的序列同一性或完全相同。13.根據權利要求1或權利要求2的方法，其中所述轉基因編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸補救合成途徑的植物功能酶，所述酶選自煙酰胺酶、煙酸鹽/酯磷酸核糖基轉移酶、煙酸單核苷酸腺嘌呤基轉移酶或煙酰胺腺嘌呤二核苦酸合成酶。14.根據權利要求13的方法，其中所述轉基因包含下述核苷^列，所述核苷酸序列選自SEQID11的核苷酸序列、SEQID12的核苷酸序列、SEQID13的核苷酸序列、SEQID14的核苷酸序列、SEQID15的核苷酸序列、SEQID16的核苷酸序列、SEQID17的核苷酸序列、SEQID18的核苷酸序列、SEQID19的核苷酸序列、SEQID20的核苷酸序列、SEQID21的核苷酸序列或SEQID22的核苷酸序列。15.根據權利要求1到14中任一項的方法，其包括另一步驟，即對所述植物或其生境，或對所述植物的種子使用有效量的式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(1)，其中Het表示雜環，所述雜環在每種情況下任選被氟、氯、甲基或乙基單取代或多取代，所述雜環選自下組雜環吡咬-3-基、吡咬-5-基、3-吡咬基、l-氧化-5-吡咬基、l-氧化-5-吡咬基、四氫呋喃-3-基、噻唑-5-基，A表示d-CV烷基、-N(Ri)(R2)或S(R2),其中W表示氫、d-CV烷基、苯基-d-CV烷基、C3-CV環烷基、CrCV鏈烯基或CrC6-炔基，且r2表示d-o烷基、C2-o鏈烯基、CrC6-炔基、-<:(=0)-<:113或千基，R表示氫、d-C『烷基、CrCV鏈烯基、CVC6-炔基、《(=0)-<:113或節基，或與W—起表示以下基團一C!H2—GH2一,國C!H2一C!H2一GH2一、一GH2一O一C!E[2一、一GH2一S國dH2一、-CH2-NH-CH2-、-CH2-N(CH3)-CH2-，且X表示N-N02、N-CN或CH-N02。16.根據權利要求15的方法，其中所述式(I)化合物中由Het表示的所述雜環代表被氯取代的吡淀-3-基雜環。17.權利要求16的方法，其中所述(I)式的化合物是吡蟲啉或噻蟲啉。18.根據權利要求1到14中任一項的方法，其還包括步驟將有效量的6-氯煙酸提供給所述植物的細胞。19.用于提高植物細胞或植物對低氧或無氧條件耐受性的方法，其包括步驟a)對所述植物或其生境或對所述植物的種子使用有效量的式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中Het表示雜環，所述雜環在每種情況下任選被氟、氯、甲基或乙基單取代或多取代，所述雜環選自下組雜環吡咬-3-基、吡啶-5-基、l-氧化-5-吡咬基、l-氧化-5-吡梵基、四氫呋喃-3-基、噻唑-5-基，A表示d-CV烷基、-N(R"(R2)或S(R2),其中W表示氫、CrCV烷基、苯基-d-0烷基、<:3-<:6-環烷基、CrCV鏈烯基或C2-CV炔基，且R2表示d-cv烷基、C2-cv鏈烯基、C2-cv炔基、-<:(=0)-<:113或節基，R表示氫、CrCV烷基、C2-cv鏈烯基、<:2-<:6-炔基、-<:(=0)-0[13或節基，或與W—起表示以下基團CH2CH2-、CH2-CH2-CH2-、-CH2-OCH2-、-CH2-SCH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-N(CH3)-CH2-，且X表示N-N02、N-CN或CH-N02。20.用于促進植物根穿透進入生長培養基中的方法，其包括步驟a)對所述植物或其生境或對所述植物的種子使用有效量的式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中Het表示雜環，所述雜環在每種情況下任選被氟、氯、甲基或乙基單取代或多取代，所述雜環選自下組雜環吡啶-3-基、吡咬-5-基、3-吡咬基、l-氧化-5』比咬基、l-氧化-5-吡咬基、四氫呋喃-3-基、噻唑-5-基，A表示d-C『烷基、-]\(1^)(議2)或S(r2),其中W表示氫、Crcv烷基、苯基-CrCv烷基、<:3-<:6-環烷基、<:2-<:6-鏈烯基或QrC6-炔基，且r2表示Q-o烷基、C2-cv鏈烯基、C2-cv炔基、-<:(=0)-<:113或節基，r表示氫、d-CV烷基、CVC6-鏈烯基、C2-Qr炔基、-<:(=0)-<:^或節基，或與W—起表示以下基團CH2CH2-、-CH2CH2-CH2-、-CH2OCH2-、-CH2-S-CH2-、CH2-NH-CH2-、-CH2-N(CH3)-CH2-，且X表示N-N02、N-CN或CH-N02。21.權利要求19或權利要求20的方法，其中所述式(I)的化合物是新煙堿類化合物。22.權利要求19或權利要求20的方法，其中所迷式(I)化合物中由Het表示的所述雜環是被氯取代的吡咬-3-基雜環。23.權利要求22的方法，其中所述(I)式的化合物是吡蟲啉或噻蟲啉。24.用于提高植物細胞或植物對低氧或無氧條件耐受性的方法，其包括步驟將有效量的6-氯煙酸提供給所述^L物細胞或植物。25.用于促進植物根穿透進入生長培養基的方法，其包括步驟將有效量的6-氯煙酸提供給所述植物的細胞。26.根據權利要求24或權利要求25的方法，其中通過對所述植物或其生境或對所述植物的種子使用有效量的式(I)化合物而對所述植物細胞或植物提供所述6-氯煙酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中Het表示雜環，所述雜環在每種情況下任選被氯單取代或多取代，所述雜環選自下組雜環吡咬-3-基或吡啶-5-基，A表示d-CV烷基、-]\(1^)(112)或8(112)，其中W表示氫、d-C『烷基、苯基-d-CV烷基、C3-CV環烷基、CVC6-鏈烯基或CVCV炔基，且R2表示d-o烷基、C2-cv鏈烯基、C2-cv炔基、-<:(=0)-013或節基，R表示氫、d-cv烷基、C2-cv鏈烯基、<:2-<:6-炔基、-<:(=0)-<:113或節基，或與W—起表示以下基團-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-0-CH2-、-CH2-S-CH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-N(CH3)-CH2-，且X表示N-N02、N-CN或CH-N02。27.根據權利要求26的方法，其中包含氯吡啶側鏈的新煙堿類在植物降解過程中釋放所述6-氯煙酸。28.權利要求27的方法，其中所述新煙堿類是吡蟲啉或噻蟲啉。29.根據權利要求24或權利要求25的方法，其中將所述6-氯煙酸直接應用于所述植物或其所述生境、所述植物細胞或所述種子。30.以下物質用于促進植物根伸入生長培養基中的用途a)外源DNA，其包含脅迫耐受性增強轉基因或對應于這類脅迫耐受性增強轉基因的內源基因的變體，和/或b)6-氯煙酸或式(1)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中Het表示雜環，所述雜環在每種情況下任選被氟、氯、甲基或乙基單取代或多取代，所述雜環選自下組雜環吡啶-3-基、吡咬-5-基、l-氧化-5-吡咬基、l-氧化-5-吡咬基、四氫呋喃-3-基、蓉喳-5-基，A表示d-CV烷基、-N(Ri)(R2)或S(R2)，其中W表示氫、d-CV烷基、苯基-d-Cr烷基、C3-C『環烷基、CrCV鏈烯基或C2-CV炔基，且R2表示d-cv烷基、cvc6-鏈烯基、<:2-<:6-炔基、-<:(=0)-033或千基，R表示氫、d-CV烷基、C2-CV鏈烯基、CrC6-炔基、《(=0)-(:113或節基，或與W—起表示以下基團-CH2-CH2-、-CH2-CH2CH2-、-CH2OCH2-、CH2-S-CH2-、-CH2-NHCH2-、-CH2N(CH3)CH2-，且X表示關Oz、N-CN或CH隱N02。31.以下物質用于提高植物對低氧或無氧條件耐受性的用途a)外源DNA，其包含脅迫耐受性增強轉基因或對應于這類脅迫耐受性增強轉基因的內源基因的變體，和/或b)6-氯煙酸或式(1)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中Het表示雜環，所述雜環在每種情況下任選被氟、氯、甲基或乙基單取代或多取代，所述雜環選自下組雜環吡咬-3-基、吡啶-5-基、3-吡咬基、l-氧化-5-p比咬基、l-氧化-5-吡咬基、四氫呋喃-3-基、漆哇-5-基，A表示d-CV烷基、-N(R"(R2)或S(R2)，其中W表示氫、d-CV烷基、苯基-d-CV烷基、C3-CV環烷基、CVC6-鏈烯基或C2-CV炔基，且R2表示d-CV烷基、C2-CV鏈烯基、C2-CV炔基、-C(-0)-CH3或節基，R表示氫、d-CV烷基、CVQ-鏈烯基、CVC6-炔基、-<:(=0)-<:113或節基，或與W—起表示以下基團-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、CH2-OCH2-、-CH2S-CH2-、CH2-NH-CH2-、-CH2-N(CH3)CH2-，且X表示N-N02、N-CN或CH-N02。32.權利要求31的用途，其中通過暴露于水游、浸沒或淹沒將所述低氧或無氧條件帶給所述植物。全文摘要本發明提供用于提高植物對低氧或無氧條件抗性的方法。這類方法可被用于促進植物根在生長培養基中或進入土壤中的穿透。本發明的方法可包括提供有脅迫耐受性基因的植物。可通過對植物使用化合物，包括新煙堿類化合物來獲得相似的效應。文檔編號C12N15/82GK101218345SQ200680021382公開日2008年7月9日申請日期2006年6月6日優先權日2005年6月15日發明者M·德布洛克,M·梅茨拉夫申請人:拜爾生物科學公司